Download - Purifikasi Hasil PCR
-
5/28/2018 Purifikasi Hasil PCR
1/9
1. Purifikasi Hasil PCR4.1.Tujuan
Purifikasi hasil PCR adalah teknik yang bertujuan untuk memperoleh DNA hasil
PCR (DNA amplikon) yang murni.
4.2.Prinsip
Purifikasi hasil PCR merupakan suatu metode yang dilakukan untuk
membersihkan DNA dari PCRmaster mix, seperti sisa-sisa buffer, dNTPmix, primer,
nuklease, dan enzimDNA-Taqpolymerase. Pada makalah ini, kami akan membahas
tentang metode purifikasi hasil PCR menggunakan Geneaid Gel/PCR DNA
Fragments Extraction Kit.
4.3.Teori DasarSecara umum, purifikasi hasil PCR dapat dilakukan secara kualitatif ataupun
kuantitatif. Pemeriksaan purifikasi secara kualitatif dengan elektroforesis agaros gel
mini atau secara kuantitatif dengan spektrofotometer nanodrop. Purifikasi ini penting
terkait masalah reproduksibilitas karena dalam pemeriksaan atau diagnosis DNA atau
RNA yang digunakan harus dimurnikan terlebih dahulu. Setelah dilakukan PCR,
purifikasi amplikon DNA dapat dilakukan dengan metode atau kit berikut yaitu
Geneaid Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit. Purifikasi ini dimaksudkan guna
memperoleh DNA yang murni dengan sisa primer, primer dimer, nukleotida (sisa
dNTPs), enzim polymerase, dan garam-garam dengan menggunakan membran dan
sentrifugasi. Pengerjaan purifikasi DNA hasil PCR ini harus hati-hati dengan adanya
nuklease, yaitu enzim yang dapat mendegradasi DNA/RNA.
4.4.Alat dan Bahan
Alat:
1) Tabung mikro 1,5 ml (Tabung eppendorf)2) Vortex3) Inkubator4) Kolom DF5) Tabung penampung6) Sentrifugator
Bahan:
1) Genom DNA2) Loading buffer (Kristal
violet)
3) Gel agaros 1 %4) Buffer DF5) Wash buffer
-
5/28/2018 Purifikasi Hasil PCR
2/9
7) Freezer8) Filter kolom9) Spektrofotometri Nanodrop
6) Etanol7) Aquabidest
-
5/28/2018 Purifikasi Hasil PCR
3/9
4.5.Prosedur Kerja
Purifikasi menggunakan Geneaid Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit
mula-mula DNA hasil amplifikasi PCR sebanyak 20 l diambil dan dicampur dengan
5 l loading buffer (kristal violet) untuk dilakukan elektroforesis di gel agaros 1%.
Pita DNA yang diinginkan diiris pada gel tersebut dan dipindahkan ke dalam tabung
mikro 1,5 ml yang baru dan steril. Ke dalam irisan gel tersebut ditambahkan 300 l
dapar DF lalu divortex dan diinkubasi pada 55-60oC selama 10-15 menit hingga larut.
Campuran didiamkan pada suhu kamar. Kemudian campuran tersebut dipipet dan
dimasukkan ke dalam kolom DF yang terpasang pada tabung penampung. Lalu
disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 30 detik. Cairan yang tertampung dibuang dan
kolom DF ditempatkan kembali pada penampung. Pada tabung tersebut ditambahkan
600 l wash buffer yang telah ditambah etanol dan disentrifugasi kembali dengan
kecepatan yang sama selama 30 detik. Cairan yang terkumpul dibuang kembali dan
kolom DF dikemablikan pada tabung penampung, sentrifugasi kembali hingga
membran kolom mengering. Kolom DF yang telah kering dipindahkan ke tabung baru
dan steril 1,5 ml dan ditambahkan dengan 25 l aquabidest pada bagian tengah kolomDF. Hal ini untuk mencegah terjadinya pengendapan pada dinding kolom. Aquabidest
dibiarkan hingga terserap lalu disentrifugasi kembali selama 1 menit untuk
memperoleh DNA murni. DNA yang telah diperoleh disimpan pada suhu -20oC.
Setelah dilakukan PCR, DNA yang murni yang diperoleh tersebut dapat diamati
purifikasinya secara visual secara kualitatif dengan elektroforesis agaros gel mini atau
secara kuantitatif dengan spektrofotometer nanodrop. Secara kualitatif dapat
dibandingkan antara hasil elektroforesis DNA amplikon murni dengan penanda
ukuran molekul. Sedangkan untuk memperoleh data purifikasi secara kuantitatif dapat
digunakan nanodrop.
-
5/28/2018 Purifikasi Hasil PCR
4/9
BAB 2
Isolasi Plasmid dan Kloning DNA
1. Isolasi Plasmid1.1. Tujuan
Pada pembahasan kali ini isolasi/ekstraksi DNA plasmid bertujuan untuk
memperoleh DNA plasmid dengan kualitas kemurnian yang baik menggunakan
metode modifikasi Alkalin Lisis dan netralisasi.
1.2. PrinsipInti dari isolasi plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel sehingga
semua organel sel dapat keluar. Sehingga didapatkan DNA kromosomal serta DNA
ekstrakromosomal (plasmid). Untuk memperoleh plasmid saja perlu dilakukan
pemurnian dari debris mebran sel, organel sel, dan pengotor lainnya. Tahapan yang
digunakan untuk isolasi plasmid menggunakan PrepEase MiniSpin Plasmid Kit
ada 9 tahap, yaitu penyiapan kultur LB, Pemanenan sel bakteri, Sel lisis dan
netralisasi, Pemurnian hasil lisis, Penempelan plasmid ke kolom, Penyiapan
plasmid kolom, Pencucian kolom, Pengeringan kolom, dan Elusi.
1.3. Teori DasarPlasmid adalah molekul DNA ekstrakromosomal yang ukurannya bervariasi
antara 1 kb hingga lebih dari 200 kb. Pada umumnya plasmid berbentuk double-
stranded, covalend closed, sirkular yang dapat diisolasi dari sel bakteri dalam
bentuk superheliks. Ada berbagai macam kegunaan dari plasmid, dalam rekayasa
genetika, plasmid digunakan sebagai vektor untuk kloning DNA. Selain itu plasmid
juga banyak digunakan untuk perbanyakan jumlah DNA tertentu sehingga bisa
mengekspresikan gen tertentu. Alasan utama penggunaan plasmid ini adalah karena
plasmid memiliki peta restriksi, adanya marker sehingga dapat diketahui apakah
gen insert masuk atau tidak, memiliki copy number yang besar, dan mudah
dimodifikasi sesuai dengan tujuan tertentu.
1.4. Alat dan BahanAlat:
1) Sentrifuge mikroBahan:
1) Bakteri yang berisi plasmid
-
5/28/2018 Purifikasi Hasil PCR
5/9
2) Tabung mikro 1.5 mL3) Pipet mikro 1 mL, 200 L beserta
tip-nya
4) Beberapa beaker glass5) Rak tabung mikro6) Tabung reaksi steril7) Vortex mixer8) PrepEase MiniSpin Plasmid
Columns
9) PrepEase Collecting Tubes
2) Medium LB yang mengandungantibiotic yang sesuai
3) A1 buffer4) A2 buffer5) A3 buffer6) A4 buffer7) AW buffer8) AE buffer9) Etanol
1.5. ProsedurPenyiapan kultur LB dilakukan dengan cara diambil stok bakteri yang berisi
plasmid, diinokulasi ke dalam medium LB (5-10 ml) yang mengandung antibiotik
yang sesuai. Inkubasi semalaman sambil digoyang-goyangkan (12-16 jam).
Selanjutnya pemanenan sel bakteri dilakukan dengan cara memanen sebanyak 1-5
ml kultur LB lalu dimasukkan ke dalam tabung microcentrifuge 1,5 ml, lalu
lakukan sentrifugasi pada 1.000 rpm selama 30 detik , dan hati-hati membuang
supernatan. Ulangi seperlunya untuk mendapatkan pelet dari volume kultur yangdiinginkan. Langkah-langkah ini dilakukan pada suhu kamar, kecuali dinyatakan
lain.
Tahap selanjutnya adalah sel lisis dan netralisasi, pertama-tama resuspensikan
pelet sel bakteri dalam 250 l A1 buffer, lalu vortex kuat. Selanjutnya suspensinya
di lisis dengan menambahkan 250 l A2 buffer, dicampur secara lembut dengan
cara membalik-balikan tabung perlahan (6-8 kali). Inkubasi hasil lisis yang
dihasilkan selama 2-3 menit pada suhu kamar (max. 5 menit). Jangan divortex,
karena hal ini akan membuat kontaminasi kromosom DNA dari puing-puing selular
ke dalam suspensi. Selanjutnya netralisasi hasil lisis dengan menambahkan 300 l
A3 buffer, dicampur secara lembut dengan cara membalik-balikan tabung perlahan
(6-8 kali) atau sampai keputihan.
-
5/28/2018 Purifikasi Hasil PCR
6/9
Tahap berikutnya adalah pemurnian hasil lisis, memperjelas hasil lisis dengan
sentrifugasi pada 1.000 rpm selama 15 menit. Selanjutnya pelekatan plasmid ke
kolom dilakukan dengan cara tempatkan kolom PrepEase MiniSpin dalam 2 ml
tabung penampung, tambahkan hasil lisis ke tabung. Lalu lakukan sentrifugasi pada
1.000 rpm selama 1 menit. Buang cairan.
Selanjutnya pilihan pencucian menggunakan AW buffer dilakukan untuk
menghapus semua nuklease, dan khususnya untuk strain inang yang mengandung
nuclease tingkat tinggi. Tempatkan kolom PrepEase MiniSpin ke 2 ml tabung
pengumpul. Tambahkan 500 l AW buffer, lalu lakukan sentrifugasi pada 1.000
rpm selama 1 menit. Buang cairan
Selanjutnya pencucian kolom dilakukan dengan menempatkan kolom PrepEase
MiniSpin ke dalam 2 ml tabung pengumpul. Tambahkan 600 l A4 Buffer (lengkap
dengan etanol). Lalu lakukan sentrifugasi pada 1.000 rpm selama 1 menit. Buang
cairan. Selanjutnya untuk mengeringkan kolom, sekali lagi tempatkan Kolom
PrepEase MiniSpin kembali ke 2 ml tabung pengumpul. Lakukan sentrifugasi pada
1000 rpm selama 2 menit. Residual etanol wash bufferyang mungkin menghambat
reaksi enzimatik, dihilangkan dengan langkah ini. Tahap yang terakhir adalah elusi
yang dilakukan dengan menempatkan kolom PrepEase MiniSpin ke tabung
microcentrifuge1,5 ml. Lalu tambahkan 50 ml AE Buffer. Inkubasi 1 menit. Lalulakukan sentrifugasi pada 1000 rpm selama 1 menit. Supernatan berisi plasmid
yang telah dielusi.
2. Pemotongan/Digesti DNA Plasmid dengan Enzim Restriksi2.1. Tujuan
Pemotongan DNA plasmid dengan enzim restriksi bertujuan untuk
memperoleh fragmen DNA plasmid yang terpotong menjadi linier agar siap untuk
disisipi dengan fragmen DNA sisipan.
2.2. PrinsipPemotongan DNA plasmid dengan enzim restriksi bertujuan untuk
memperoleh fragmen DNA plasmid yang terpotong menjadi linier. Fragmen-
-
5/28/2018 Purifikasi Hasil PCR
7/9
fragmen DNA ini siap disisipi oleh fragmen DNA yang akan disisipkan, dan
digunakan untuk merekonstruksi DNA plasmid untuk disisipkan ke dalam DNA
target. Teknik digesti ini banyak dipakai untuk mengklon DNA asing ke vektor,
maupun pada verifikasi Plasmid DNA rekombinan.
2.3. Teori DasarPemotongan DNA dilakukan menggunakan enzim nuklease. Nuklease
merupakan enzim yang memotong molekul DNA dengan memutuskan ikatan
fosfodiester antara nukleotida satu dengan nukleotida berikutnya. Jenis nuklease ada
dua yaitu eksonuklease dan endonuklease. Endonuklease merupakan nuklease yang
memotong bagian internal DNA tepat pada ikatan fosfodiester. Hasil pemotongan
molekul DNA oleh enzim restriksi endonuklease tepat pada urutan tertentu dan
menghasilkan sekuens yang double-stranded, dengan demikian sekuens yang akan
dipotong dapat diprediksi urutan basa nitrogennya.
Dalam pemotongan DNA plasmid ini digunakan dua enzim restriksi
endonuklease, yaitu EcoRI dan BamHI. Enzim EcoRI diperoleh dari bakteri E.coli,
sedangkan enzim BamHI diperoleh dari enzim Bacillus sp. Enzim EcoRI memotong
molekul DNA pada urutan heksanukleotida 5-GAATTC-3 (5 overhang).
Sedangkan enzim BamHI memotong molekul DNA pada urutan heksanukleotida 5-
GGATCC-3 (5 overhang).2.4. Alat dan Bahan
Alat:
1) Pipet mikro 0-20 l2) Pipet mikro 20-200 l3) Tabung mikro 1,5 mL4) Rak tabung mikro5) Bak es dan es yang telah
dihancurkan untuk menjaga suhu
enzim restriksi agar enzim tidak
terpengaruh dengan suhu ruangan
yang tinggi
6) Inkubator
Bahan:
1) pUC19 (yang diisolasisebelumnya)
2) Enzim endonuklease restriksi(ER):BamHI, EcoRI
3) Buffer masing-masing ER4) dH2O steril (atau 1xTE pH8)5) Standar ukuan molekul DNA
-
5/28/2018 Purifikasi Hasil PCR
8/9
7) Dry bath8) Termometer9) Elektroforesis
2.5. ProsedurProses dimulai dengan pencampuran pUC19 dengan enzim RE EcoRI dan
BamHI pada tabung mikro yang berbeda dan diisikan dengan buffer bagi masing-
masing enzim dan pemberian aquadest.
DNA (l) 10xbuffer
(l)
EnzimRestriksi/
5 unit (l)
dH2O Steril
(l)
Total Volume
(l)
pUC19 (2) 2 0 16 20
pUC19 (2) 2 BamHI 15 20
pUC19 (2) 2 EcoRI 15 20
Masing-masing tabung mikro diinkubasikan dalam alat inkubator dengan suhu
37C selama minimal 2 jam. Dipilih suhu 37 C karena enzim restriksi yang
digunakan (BamHI danEcoRI) stabil dalam suhu ini. Namun, bila digunakan enzim
restriksi lain perlu diingat bahwa tidak semua enzim restriksi bekerja optimal pada
suhu 37C (contohnya: enzim restriksi yang diambil dari bakteri termofilik
memiliki suhu optimal 50-65 C, sedangkan enzim restriksi lainnya seperti SmaI
hanya memiliki waktu paruh hidup yang singkat dalam 37 C, sehingga harus
digunakan dalam suhu 25 C).
Setelah 2 jam, tabung ditambahkan loading buffer, lalu siapkan dry bath,
masukkan air pada lubang-lubang dry bath lalu letakkan termometer di tengahnya
tunggu hingga bersuhu 65oC, lalu masukkan tabung mikronya selama 5 menit.
-
5/28/2018 Purifikasi Hasil PCR
9/9
Gambar. Dry Bath
Setalah itu dimasukkan ke dalam sumur-sumur elektroforesis dengan urutan
sebagai berikut mulai dari yang paling kiri:
- Standar ukuran molekul (DNA ladder)
- pUC19BamH1
- pUC19EcoR1
- pUC19 utuh
Selanjutnya dibandingkan dengan standar ukuran molekul dan DNA yang tidak
di digesti.