-
OPTIMASI DAN VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR
BISFENOL A DALAM EKSTRAK AIR DAN EKSTRAK BOTOL AIR
MINUM MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA
TINGGI FASE TERBALIK
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Ina Juni Natasia
NIM : 098114023
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2013
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
i
OPTIMASI DAN VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR
BISFENOL A DALAM EKSTRAK AIR DAN EKSTRAK BOTOL AIR
MINUM MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA
TINGGI FASE TERBALIK
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Ina Juni Natasia
NIM : 098114023
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2013
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
Persetuj uan Pembimbing
OPTIMASI DAN VALIDASI METODE PENETAPAN KADARBISFENOL A DALAM EKSTRAK AIR DAN EKSTRAK BOTOL AIR
MINUM MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJATINGGI T'ASE TERBALIK
Skripsi yang diajukan oleh:
Ina Juni Natasia
hIIM : 098 114023
telah disetujui oleh:
Pembimbing
\*\ t\\i\"or
t, tt, $_*g= *s,tt----*:"
'' ii "'"F"*")*
t"h *24'd
(Prof. Dr. Sri Noegroh ati, Apt.) tanggal 16 Juli 20T3
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
Pengesahan Skripsi Berjudul
OPTIMASI DAI\[ VALIDASI METODE PEIIETAPAN KADARBISFENOL A DALAM EKSTRAK AIR DAII EKSTRAK BOTOL AIR
IVIINUM MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJATINGGI FASE TERBALIK
Oleh:
Ina Juni Natasia
NIM:098 114023
Dipertahankan dihadapan Panitia Penguj i Skipsi
Fahltas Farmasi
Universitas Sanata Dharma
Pada tanggal: 16 Juliz0n
Panitia penguji:
1. Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt.
2. Jeffry Julianus, M.Si.
3. Lucia Wiwid Wljayantio M.Si.
iii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
PERI\TYATAAN KEASLIAN KARYA
Saya menyatakan dengan sesungguhnya batrwa slcripsi yang saya tulis ini
tidak memuat karya abu bagian karya ofing lain, kecuali yang t€hh disebutkan
dalam kutipan dan daftarpustaka" sebagaimana layah,nyakarya ilmiah.
Apabila dikemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah ini,
maka saya bersedia menganggung segala sariksi sesuai peraturan
undangan yang berlaku
Yogyakarta,17 Juli }AnPenulis
dW(Ina Juni Natasia)
lv.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
LEMBAR PERIIYATAAI\T PERSETUJUAhI PT]BLIKASI KARYA ILMIAH
T]NTT]K KEPENTINGAI\ AKAI}EMIS
Yang bertanda tangan dibawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma:
Nama : Ina Juni NatasiaNomor Matrasiswa : 098114023
Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan
Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul:
OPTIMASI DAIY VALIDASI METODE PEIIETAPAI\I KAI}AR BISFENOL
A DALAM EKSTRAK AIR DAI\[ EKSTRA.K BOTOL AIR MIITT'MMENGGTJNAKAIT KROMATOGRAFI CAIR KIIVERJA TINGGI FASE
TERBALIK
Beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan
kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan,
mengalihkan dalam bentuk media lain" mengelolanya dalam bentuk pangkalan dat4
mendistribusikan secara terbatas, mempublikasikan di internet atau media lain
untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya ataupun memberi
royalti kepada saya selama tetap mencantumkan narna saya sebagai penulis.
Demikian pemyataan ini saya buat dengan sebenamya.
Dibuat di Yogyakarta
Pada tanggal : 17 Juli 2013
Yang menyatakan
ilW(Ina Juni Natasia)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
vi
HALAMAN PERSEMBAHAN
Bila gunung di hadapanku tak jua berpindah
Kau berikanku kekuatan untuk mendakinya
Kulakukan yang terbaikku, Kau yang selebihnya
Tuhan selalu punya cara
Membuatku menang pada akhirnya
-Lirik Lagu Tuhan Selalu Punya Cara-
Karya ini aku persembahkan untuk orang tua, keluarga,
sahabat, dan almamaterku tercinta
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
vii
PRAKATA
Puji dan syukur kepada Tuhan Yesus Kristus karena berkat kasih karunia-
Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi yang
berjudul “Optimasi dan Validasi Metode Penetapan Kadar Bisfenol A dalam
Ekstrak Air dan Ekstrak Botol Air Minum Menggunakan Kromatografi Cair
Kinerja Tinggi Fase Terbalik” dengan baik. Skripsi ini disusun untuk memenuhi
salah satu persyaratan mendapatkan gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) di Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Dalam pelaksanaan penelitian hingga penyusunan skripsi ini, penulis
banyak mendapatkan bantuan dan dukungan dari banyak pihak. Oleh karena itu,
penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada:
1. Ipang Djunarko, M.Sc., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta.
2. C.M. Ratna Rini Nastiti, M.Pharm., Apt., selaku Ketua Program Studi Fakultas
Farmasi Sanata Dharma Yogyakarta yang turut memberikan saran dan masukan
untuk penulis selama tahap penelitian.
3. Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt., selaku dosen pembimbing yang telah
memberikan pengarahan, bantuan, tuntunan, kritik, dan saran sejak awal
penelitian hingga akhir penyusunan skripsi ini.
4. Jeffry Julianus, M.Si. dan Lucia Wiwid Wijayanti, M. Si., selaku dosen penguji
atas segala masukan dan bimbingannya.
5. Rini Dwiastuti, M.Sc., selaku dosen pembimbing akademik dan atas segala
bantuan dalam perijinan penggunaan laboratorium.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
viii
6. Pak Sanjaya, atas segala ilmu dan bantuan yang diberikan selama proses
penelitian.
7. Segenap dosen yang telah berkenan membagikan ilmu kepada penulis selama
belajar di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
8. Teman seperjuangan skripsi, Topan dan Leo, untuk kerja sama, tawa, canda,
dan air mata yang dirasakan bersama.
9. Mas Bimo, Pak Parlan, Mas Kunto, Mas Kethul, Mas Ottok dan seluruh staf
laboratorium Fakultas Farmasi serta staf keamanan dan kebersihan Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta atas bantuan dan kerja samanya.
10. Teman satu bimbingan skripsi, Jimmy, Yuli, Rachel, Nety, dan Jo.
11. Teman seperjuangan di laboratorium Kimia Analisis Instrumental, Novia,
Agnes, Victor, Shinta, Shasya, Metri, Teti, Febrin, Wisnu, dan Ozy.
12. Teman-teman FST A 2009 dan seluruh angkatan 2009 atas dukungan dan suka
duka yang diberikan, semoga pengalaman yang telah kita lalui bersama bisa
menjadi bekal untuk perjuangan hidup kita kelak.
13. Teman sepermainan, Raisa, Ree, Ningsih, Chissa, Kenny, Wanda, Atin, Nopes,
Listya, Bee, Melisa, Agnes, Eva, Adit, Ana Boy, Frisca, dan Nonny.
14. Semua pihak yang telah membantu dan mendukung penulis dalam pelaksanaan
penelitian dan penyusunan skripsi.
Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penelitian dan
penyusunan skripsi ini karena keterbatasan dari kemampuan penulis. Oleh karena
itu, besar harapan penulis akan adanya kritik dan saran yang membangun dari
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
ix
semua pihak. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi pembaca dan berguna bagi
dunia ilmu pengetahuan.
Yogyakarta, 17 Juli 2013
Penulis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
x
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ................................................................................... i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ......................................... ii
HALAMAN PENGESAHAN ..................................................................... iii
PERNYATAAN KEASLIAN PENULIS ................................................... iv
LEMBAR PERNYATAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ......... v
HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................. vi
PRAKATA .................................................................................................. vii
DAFTAR ISI ............................................................................................... x
DAFTAR TABEL ....................................................................................... xiv
DAFTAR GAMBAR .................................................................................. xvi
DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... xix
INTISARI .................................................................................................... xxi
ABSTRACT............................................ .................................................... xxii
BAB I PENGANTAR ................................................................................. 1
A. Latar Belakang ..................................................................................... 1
1. Permasalahan ................................................................................ 6
2. Keaslian Penelitian........................................................................ 6
3. Manfaat Penelitian ........................................................................ 8
B. Tujuan Penelitian ................................................................................. 8
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA.......................................................... 9
A. Plastik Polikarbonat ............................................................................. 9
B. Bisfenol A ............................................................................................ 9
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
xi
C. Metode untuk Analisis Bisfenol A ....................................................... 11
1. Liquid chromatography – ultraviolet ............................................ 12
2. Liquid chromatography – fluorescence ........................................ 12
3. Liquid chromatography – mass spectrometry atau Liquid
chromatography – tandem mass spectrometry ............................. 12
4. Gas chromatography – MS ........................................................... 12
D. Spektrofotometri Ultraviolet ................................................................ 13
E. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ....................................................... 14
1. Definisi dan Instrumentasi ............................................................ 14
2. Pemisahan Puncak dalam Kromatografi ....................................... 21
F. Validasi Metode Analisis ..................................................................... 33
G. Landasan Teori ..................................................................................... 35
H. Hipotesis .............................................................................................. 38
BAB III METODOLOGI PENELITIAN.................................................... 39
A. Jenis dan Rancangan Penelitian ........................................................... 39
B. Variabel Penelitian ............................................................................... 39
1. Variabel bebas ............................................................................... 39
2. Variabel tergantung ....................................................................... 39
3. Variabel pengacau terkendali ........................................................ 39
C. Definisi Operasional ............................................................................ 40
D. Bahan Penelitian .................................................................................. 40
E. Alat Penelitian ...................................................................................... 41
F. Tata Cara Penelitian ............................................................................. 41
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
xii
1. Penyiapan fase gerak asetonitril : air ............................................ 41
2. Pembuatan seri larutan baku bisfenol A ....................................... 42
3. Penyiapan sampel.......................................................................... 43
4. Optimasi KCKT fase terbalik ....................................................... 43
5. Validasi Penetapan Kadar Bisfenol A dengan KCKT Fase
Terbalik ......................................................................................... 44
G. Analisis hasil ........................................................................................ 46
1. Analisis Hasil Optimasi ................................................................ 46
2. Analisa Hasil Validasi................................................................... 49
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................... 52
A. Preparasi Sistem Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ........................... 52
1. Penetapan Panjang Gelombang Maksimum Bisfenol A................ 52
2. Pembuatan Fase Gerak .................................................................. 56
3. Pembuatan Larutan Kerja untuk Optimasi .................................... 59
B. Optimasi Komposisi Fase Gerak dan Kecepatan Alir pada KCKT
untuk Penetapan Kadar Bisfenol A ..................................................... 60
C. Validasi Metode Penetapan Kadar Bisfenol A .................................... 82
1. Selektifitas ..................................................................................... 82
2. Pembuatan Kurva Baku dan Linearitas ......................................... 83
3. Akurasi........................................................................................... 87
4. Presisi............................................................................................. 90
5. Rentang .......................................................................................... 95
6. Limit of Detection (LOD) dan Limit of Quantitation (LOQ)......... 96
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
xiii
BAB V KESIMPULAN .............................................................................. 97
A. Kesimpulan .......................................................................................... 97
B. Saran .................................................................................................... 97
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. 98
LAMPIRAN ................................................................................................ 101
BIOGRAFI PENULIS ............................................................................... 173
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
xiv
DAFTAR TABEL
Tabel I. Nilai indeks polaritas beberapa pelarut pada KCKT fase
terbalik................................................................................. 16
Tabel II. Data yang diperlukan untuk uji validasi .............................. 34
Tabel III. Komposisi optimasi fase gerak ............................................ 41
Tabel IV. Persen perolehan kembali yang dapat diterima pada
beberapa tingkat konsentrasi analit berdasarkan Gonzales
and Herrador........................................................................ 50
Tabel V. Persen perolehan kembali yang dapat diterima pada
beberapa tingkat konsentrasi analit berdasarkan Horwitz
and AOAC PVM ................................................................. 51
Tabel VI. Serapan baku bisfenol A dalam pelarut metanol pada
panjang gelombang maksimum........................................... 54
Tabel VII. Komposisi fase gerak, indeks polaritas, dan pH .................. 56
Tabel VIII. Waktu retensi baku bisfenol A, sampel air, dan sampel
botol dengan beberapa komposisi fase gerak pada
kecepatan alir 1 mL/menit ................................................... 62
Tabel IX. Nilai tailing factor, resolusi, jumlah lempeng (N), HETP,
∝, dan k’ pada berbagai komposisi fase gerak dan
kecepatan alir ...................................................................... 64
Tabel X. Nilai koefisien variasi AUC dan waktu retensi baku
bisfenol A ............................................................................ 81
Tabel XI. Resolusi puncak bisfenol A pada baku dan sampel ............. 83
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
xv
Tabel XII. Hasil persamaan regresi linier baku bisfenol A ................... 84
Tabel XIII. Perhitungan perolehan kembali baku adisi pada sampel air 88
Tabel XIV. Perhitungan perolehan kembali baku adisi pada sampel
botol ..................................................................................... 89
Tabel XV. Persen perolehan kembali yang dapat diterima pada
beberapa tingkat konsentrasi analit berdasarkan Gonzales
and Herrador ........................................................................ 89
Tabel XVI. Persen koefisien variasi baku bisfenol A dan bisfenol A
dalam sampel air .................................................................. 91
Tabel XVII. Persen koefisien variasi baku bisfenol A dan bisfenol A
dalam sampel botol .............................................................. 92
Tabel XVIII. Persen perolehan kembali yang dapat diterima pada
beberapa tingkat konsentrasi analit berdasarkan Horwitz
and AOAC PVM ................................................................. 92
Tabel XIX. Persen perolehan kembali dan persen koefisien korelasi
adisi bisfenol A dalam ekstrak air dan ekstrak botol setelah
proses ekstraksi .................................................................... 94
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
xvi
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Struktur bisfenol A .............................................................. 10
Gambar 2. Proses kromatografi ............................................................. 15
Gambar 3. Diagram sistem KCKT ........................................................ 20
Gambar 4. Kromatogram yang menunjukkan waktu retensi (tR), waktu
kosong (t0), lebar dasar puncak (Wb), dan tinggi puncak
(h) ........................................................................................ 22
Gambar 5. Pengaruh k’, ∝, dan N pada pemisahan............................... 24
Gambar 6. Diagram yang menunjukkkan perhitungan tailing factor
(Tf) serta diagram yang menunujukkan fronting dan
tailing .................................................................................. 27
Gambar 7. Kurva persamaan van Deemter yang menunjukkan
hubungan antara HETP lawan kecepatan linear rata-rata ... 29
Gambar 8. Kurva persamaan van Deemter dengan tiga kolom kemas
ukuran partikel 10, 5, dan 3 µm .......................................... 30
Gambar 9. Hubungan log k’ vs % organic solvent modifier untuk
metanol, asetonitril, dan tetrahidrofuran ............................. 31
Gambar 10. Difusi Eddy .......................................................................... 31
Gambar 11. Distribusi aliran .................................................................. 32
Gambar 12. Pelebaran pita oleh difusi longitudinal ................................ 32
Gambar 13. Transfer massa ..................................................................... 33
Gambar 14. Kromofor dan auksokrom pada bisfenol A ......................... 53
Gambar 15. Bentuk spektra panjang gelombang maksimum bisfenol A 55
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
xvii
Gambar 16. Kurva absorbansi pada panjang gelombang maksimum vs
konsentrasi baku bisfenol A ................................................ 56
Gambar 17. Bentuk bisfenol A pada berbagai pH ................................... 57
Gambar 18. Bagian polar dan polar pada bisfenol A .............................. 61
Gambar 19. Kromatogram pada fase gerak asetonitril : air (75 : 25) dan
kecepatan alir 0,5 mL/menit ................................................ 68
Gambar 20. Kromatogram pada fase gerak asetonitril : air (75 : 25) dan
kecepatan alir 0,8 mL/menit ................................................ 69
Gambar 21. Kromatogram pada fase gerak asetonitril : air (75 : 25) dan
kecepatan alir 1 mL/menit ................................................... 70
Gambar 22. Kromatogram pada fase gerak asetonitril : air (80 : 20) dan
kecepatan alir 0,5 mL/menit ................................................ 72
Gambar 23. Kromatogram pada fase gerak asetonitril : air (80 : 20) dan
kecepatan alir 0,8 mL/menit ................................................ 73
Gambar 24. Kromatogram pada fase gerak asetonitril : air (80 : 20) dan
kecepatan alir 1 mL/menit ................................................... 74
Gambar 25. Kromatogram pada fase gerak asetonitril : air (70 : 30) dan
kecepatan alir 0,5 mL/menit ................................................ 76
Gambar 26. Kromatogram pada fase gerak asetonitril : air (70 : 30) dan
kecepatan alir 0,8 mL/menit ................................................ 77
Gambar 27. Kromatogram pada fase gerak asetonitril : air (70 : 30) dan
kecepatan alir 1 mL/menit ................................................... 78
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
xviii
Gambar 28. Perbandingan peak bisfenol A dari sampel air dengan
komposisi fase gerak (70 : 30) pada berbagai kecepatan
alir ....................................................................................... 80
Gambar 29. Perbandingan peak bisfenol A dari sampel botol dengan
komposisi fase gerak (70 : 30) pada berbagai kecepatan
alir ....................................................................................... 80
Gambar 30. Kurva hubungan AUC vs konsentrasi bisfenol A
menggunakan program Powerfit (Utrecht University
Faculteit Scheikunde), dengan tarap kepercayaan 95% ...... 85
Gambar 31. Kurva hubungan AUC vs konsentrasi bisfenol A
menggunakan program Powerfit (Utrecht University
Faculteit Scheikunde), dengan tarap kepercayaan 95%
pada rentang bawah (0,01 – 0,8 µg/mL) ............................. 85
Gambar 32. Kurva hubungan AUC vs konsentrasi bisfenol A
menggunakan program Powerfit (Utrecht University
Faculteit Scheikunde), dengan tarap kepercayaan 95%
pada rentang atas (1 - 11 µg/mL) ........................................ 86
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
xix
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Label standar bisfenol A (E. Merck) ................................... 102
Lampiran 2. Spektrum baku bisfenol A ................................................... 103
Lampiran 3. Absorbansi dan panjang gelombang maksimum bisfenol A
pada beberapa tingkat konsentrasi ...................................... 106
Lampiran 4. Kurva absorbansi vs konsentrasi bisfenol A ....................... 106
Lampiran 5. Perhitungan indeks polaritas fase gerak .............................. 107
Lampiran 6. Kromatogram baku bisfenol A dan bisfenol A pada ekstrak
air dan ekstrak botol air minum .......................................... 107
Lampiran 7. Nilai tailing factor, resolusi, N, HETP, ∝, dan k’ pada
berbagai komposisi fase gerak dan kecepatan alir .............. 117
Lampiran 8. Contoh perhitungan resolusi, tailing factor, N, HETP, ∝,
dan k’ ................................................................................... 119
Lampiran 9. Koefisien variasi AUC dan waktu retensi baku bisfenol A . 121
Lampiran 10. Rata-rata resolusi puncak bisfenol A pada baku, ekstrak
air, dan ekstrak botol ........................................................... 121
Lampiran 11. Kromatogram bisfenol A untuk pembuatan kurva baku,
penentuan linearitas, dan rentang, menggunakan fase
gerak dan kecepatan alir hasil optimasi .............................. 122
Lampiran 12. Konsentrasi dan AUC bisfenol A untuk kurva baku ........... 135
Lampiran 13. Perhitungan LOD................................................................. 140
Lampiran 14. Perhitungan Uji T untuk slope kedua kurva baku ............... 141
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
xx
Lampiran 15. Kromatogram bisfenol A dalam ekstrak air dengan adisi
baku untuk penentuan akurasi, presisi, dan LOQ ............... 142
Lampiran 16. Perhitungan persen perolehan kembali (recovery), persen
CV, dan LOQ untuk ekstrak air .......................................... 151
Lampiran 17. Kromatogram bisfenol A dalam ekstrak botol dengan adisi
baku untuk penentuan akurasi, presisi, dan LOQ ............... 155
Lampiran 18. Perhitungan persen perolehan kembali (recovery), persen
CV, dan LOQ untuk sampel botol ...................................... 165
Lampiran 19. Akurasi dan presisi adisi bisfenol A dalam ekstrak air dan
ekstrak botol sebelum diinjek ke KCKT ............................. 169
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
xxi
INTISARI
Bisfenol A merupakan monomer dari polikarbonat, bahan pembuat botol
minum, yang dapat terlepas dari botol akibat hidrolisis karena peningkatan suhu
dan degradasi oleh sinar ultraviolet. Bisfenol A dapat menghalangi aktivitas
hormon estrogen yang penting dalam sistem imunitas dan reproduksi. Tujuan
penelitian ini untuk mengetahui kondisi optimum dan validitas dari metode KCKT
sehingga dapat digunakan untuk penetapan kadar bisfenol A dalam ekstrak air dan
ekstrak botol yang telah diberi perlakuan dengan sinar matahari.
Jenis rancangan penelitian ini adalah eksperimental deskriptif. Sistem
KCKT fase terbalik dalam penelitian ini menggunakan fase diam C-18, detektor
UV pada λ 278 nm. Optimasi dilakukan pada komposisi fase gerak asetonitril : air
serta kecepatan alir.
Kondisi optimum yang diperoleh, yaitu komposisi fase gerak asetonitril :
air (70 : 30) dengan kecepatan alir 1 mL/menit yang memenuhi kriteria untuk
resolusi, tailing factor, N, HETP, ∝, dan k’. Metode ini pada kondisi yang optimum dapat memenuhi parameter validasi yang baik dengan selektifitas yang
baik (resolusi > 1,5); linearitas dengan r > 0,98; recovery 80,13 – 104,34%; CV
0,72 – 10,13%; rentang 0,3 – 5 µg/mL; LOD 0,0473 µg/mL; LOQ untuk ekstrak
air dan ekstrak botol, masing-masing 0,0063 µg/mL dan 8,4701 µg/g.
Kata kunci: bisfenol A, optimasi metode, validasi metode, KCKT fase terbalik
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
xxii
ABSTRACT
Bisphenol A is a monomer of polycarbonate, material for drinking bottle,
which can be released from the bottle because of the increased temperature due to
hydrolysis and degradation by ultraviolet ray. Bisphenol A can block the activity
of the hormone estrogen which is important in the immune and reproductive
systems. The purpose of this study is to determine the optimum conditions and the
validity of the HPLC method that can be used for the determination of bisphenol
A in water extract and bottle extract that had been treated with sunlight.
This research design is experimental descriptive. Reversed-phase HPLC
system in this study uses a C-18 stationary phase, UV detector at λ 278 nm.
Optimization is done on the mobile phase composition of acetonitrile : water and
flow rate.
The optimum conditions are obtained where mobile phase composition of
acetonitrile : water (70: 30) with a flow rate of 1 mL/minute those meet the
criteria for resolution, tailing factor, N, HETP, ∝, and k’. This method at optimum conditions has a good validation parameters with good selectivity (resolution >
1,5); linearity with r > 0,98; recovery 80,13 – 104,34%; CV 0,72 – 10,13%; range
of 0,3 - 5 µg/mL; LOD 0,0473 µg/mL; LOQ for water extract and bottle extract,
each of 0,0063 µg/mL and 8,4701 µg/mL.
Keywords: bisphenol A, method optimization, method validation, reversed-phase HPLC
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
1
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Wadah dari bahan plastik sangat luas digunakan pada saat ini, terutama
sebagai wadah makanan dan minuman. Bahan plastik diminati karena sifatnya
yang kuat, ringan, dan harganya yang relatif terjangkau. Biasanya bahan plastik
ini banyak digunakan sebagai bahan pembuat botol minum, karena sifatnya yang
ringan sehingga mudah dibawa. Namun tidak semua wadah plastik penyusun
botol minum itu aman. Jika tidak berhati-hati, materi yang berasal dari komponen
penyusun plastik akan berdampak buruk bagi kesehatan.
Plastik terdiri atas berbagai bahan kimia. Dalam kondisi tertentu, kontak
antara plastik dan makanan bisa menyebabkan migrasi bahan-bahan kimia dari
wadah ke makanan. Migrasi terjadi akibat pengaruh suhu panas makanan,
penyimpanan, atau proses pengolahannya. Semakin tinggi suhu maka semakin
tinggi kemungkinan terjadi migrasi. Lamanya waktu penyimpanan makanan juga
berpengaruh terhadap perpindahan materi berbahan kimia ini. Semakin lama
kontak antara minuman dengan kemasan plastik, semakin tinggi jumlah bahan
kimia yang bermigrasi ke minuman (Staples, et al., 1998).
Bisfenol A merupakan monomer dari polikarbonat yang biasa digunakan
sebagai bahan pembuat botol minum. Paparan bisfenol A pada manusia dapat
terjadi karena mengkonsumsi makanan atau minuman yang tercemar bisfenol A
akibat penggunaan wadah polikarbonat (atau yang mengandung monomer
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
2
bisfenol A). Bisfenol A memiliki struktur mirip dengan ekstrogen dalam tubuh
dan dapat mengganggu aktifitas hormon ekstrogen yang penting dalam sistem
imunitas dan reproduksi. Bisfenol A adalah endocrine discrupting chemical
(EDC) yang mengganggu produksi, pelepasan, transportasi, metabolisme,
pengikatan, aksi, dan eliminasi hormon alami manusia (US-FDA, 2008).
Pemejanan bisfenol A pada manusia salah satunya terjadi melalui minuman yang
mengandung bisfenol A yang terlepas dari botol. Lepasnya suatu monomer
bisfenol A dapat terjadi akibat hidrolisis yang disebabkan peningkatan suhu dan
degradasi oleh sinar ultraviolet. Matahari merupakan sumber panas dan dapat
memancarkan sinar ultraviolet yang diduga dapat menyebabkan lepasnya
monomer bisfenol A dari botol ke minuman di dalam botol.
Indonesia merupakan salah satu negara dengan iklim tropis di dunia. Hal
ini menyebabkan matahari bersinar sepanjang tahun dengan intensitas yang relatif
tinggi dibandingkan dengan negara-negara lainnya. Botol minum plastik yang
biasa dibawa ke mana pun orang-orang beraktifitas, memiliki kemungkinan besar
terpapar oleh radiasi sinar matahari, terutama jika beraktifitas di luar ruangan.
Paparan ini dapat menyebabkan putusnya ikatan polimer penyusun plastik.
Putusnya ikatan polimer ini menyebabkan monomer-monomer penyusunnya
meluruh dan bermigrasi menuju ke minuman yang ada di dalamnya dan terjadilah
pemaparan zat berbahaya tersebut ke dalam minuman.
Deteksi bisfenol A pada lingkungan, air minum, dan produk makanan
(sejak 1990), menarik minat para peneliti dan pada waktu yang sama, efek
negeatifnya pada manusia ditemukan. Pada tahun 1996, BPA diklasifikasikan oleh
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
3
European Commission sebagai zat yang berasal dari luar tubuh dengan efek yang
berbahaya bagi kesehatan manusia. Beberapa studi toksikologi dan biokimia
menegaskan bahwa bisfenol A memiliki sifat estrogenik dan efek agonis terhadap
reseptor estrogen. Dalam studi terbaru, bisfenol A diklasifikasikan sebagai
xenobiotik yang mengganggu keseimbangan hormonal pada manusia dan hewan
lainnya, sehingga disebut pengganggu endokrin. Bisfenol A terbukti memiliki
aktifitas estrogenik bahkan pada konsentrasi di bawah 1 ng L-1 (Rykowska and
Wasiak, 2006). Dosis perhari yang diperbolehkan (Tolerable daily intake/TDI)
dari bisfenol A telah ditetapkan oleh European Food Safety Authority adalah
sebesar 0,05 mg/kgBB/hari (EFSA, 2013). Negara besar lainnya juga menetapkan
TDI untuk bisfenol A, seperti Eropa 0,01 mg/kgBB/hari (SCF, 2012); Amerika
Serikat dan Kanada 0,025 mg/kgBB/hari (Health Canada, 2008); dan Jepang 0,05
mg/kgBB/hari (AIST, 2007). Oleh karena itu, perlu dilakukan penetapan kadar
bisfenol A pada air dalam botol plastik plikarbonat dan dari botol itu sendiri.
Penetapan kadar bisfenol A pada air telah pernah dilakukan oleh Olmo,
Gonzakez-Casado, Navas, dan Vilchez (1997) menggunakan kromatografi gas –
spektra massa dengan ektraksi air menggunakan diklormetan dalam medium
asam. Penetapan kadar bisfenol A dalam botol minum polikarbonat, makanan
kaleng, dan air menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik dengan
detektor fluoresence, fase gerak metanol : air (65 : 35) dan fase diam C-18 pernah
dilakukan oleh Chong, Aung, dan Leong (2011). Rykowska and Wasiak (2006)
pernah melakukan analisis bisfenol A yang terlepas dari botol susu bayi ke dalam
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
4
air dan susu akibat pemanasan dengan fase gerak asetonitril : air (75:25, v/v) dan
fase diam C-18.
Pada penelitian ini, peneliti akan melakukan penetapan kadar bisfenol A
pada ekstrak air dalam botol dan ekstrak botol air minum yang diberi pengaruh
penyinaran matahari tropis Indonesia dengan metode kromatografi cair kinerja
tinggi (KCKT) fase terbalik dengan fase gerak asetonitril : air dan fase diam C-
18. KCKT dipilih untuk analisis bisfenol A karena mampu memisahkan dari suatu
campuran sekaligus menentukan kadarnya, mudah, cepat, sensitif, serta bisfenol A
dapat dianalisis menggunakan KCKT secara langsung tanpa derivatisasi terlebih
dahulu. Detektor UV dipilih karena bisfenol A memiliki kromofor yang dapat
memberikan serapan di daerah UV.
Bisfenol A yang memiliki log Kow 3,40 merupakan senyawa yang
cenderung hidrofobik. Oleh karena itu, digunakan KCKT fase terbalik dimana
fase diam lebih non polar dibandingkan dengan fase geraknya sehingga bisfenol A
ini dapat berinteraksi dengan fase diam. Digunakan fase diam C-18 yang cocok
untuk menganalisis senyawa dengan kepolaran rendah, sedang, dan tinggi, serta
memiliki pH di antara 2,5-7,5. pH bisfenol A adalah ± 5 – 6. Fase diam C-18 ini
cocok digunakan untuk senyawa yang memiliki log Kow lebih dari 2, seperti
bisfenol A yang memiliki log Kow 3,40. Interaksi pada C-18 didasarkan pada
interaksi hidrofobik atau van der Waals. Bagian cincin benzen dari bisfenol A
merupakan bagian hidrofobik yang akan berinteraksi dengan fase diam. Untuk
dapat mengelusi bisfenol A, fase gerak air ditambahkan pelarut organik untuk
mengurangi kepolaran dari fase gerak. Digunakan pelarut organik asetonitril
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
5
karena memiliki kekuatan elusi yang cukup besar pada fase diam C-18. Bisfenol
A juga memiliki bagian polar (-OH) yang dapat berinteraksi dengan fase gerak
yang polar sehingga bisfenol A dapat terelusi melalui kolom. Diperlukan fase
gerak dengan kekuatan yang optimal agar dapat membuat bisfenol A tertahan
pada fase diam, kemudian dapat terpisah dari senyawa lainnya di dalam matrik,
dan kemudian dapat terelusi. Oleh karena itu, diperlukan optimasi komposisi fase
gerak yang digunakan agar dapat memisahkan bisfenol A pada matrik.
Ekstraksi bisfenol A dari air dilakukan dengan ekstraksi fase padat atau
solid phase extraction (SPE). SPE digunakan untuk clean-up sampel-sampel yang
kotor, misalnya sampel-sampel yang mempunyai kandungan matrik yang tinggi
seperti garam-garam, protein, polimer, resin, dan lain-lain (Watson, 2007).
Sementara itu, ekstraksi bisfenol A dari dalam botol dilakukan dengan cara
ekstraksi menggunakan diklormetan dan aseton. Ekstraksi ini dilakukan untuk
mengurangi pengotor pada matrik.
Adanya perbedaan perlakuan dan cara ekstraksi pada penelitian ini dari
penelitian yang pernah dilakukan sebelumnya, menyebabkan perlunya dilakukan
optimasi dan validasi untuk penetapan kadar bisfenol A pada ekstrak air dalam
botol plastik dan ekstrak botol air minum yang diberi pengaruh penyinaran
matahari tropis Indonesia karena metode yang dilakukan sebelumnya belum tentu
memberikan hasil yang optimal pada penelitian ini. Optimasi dilakukan juga
untuk memperoleh komposisi fase gerak dan kecepatan alir yang optimal sehingga
dapat menghasilkan pemisahan yang baik dilihat dari resolusi, N, ∝, k’, HETP,
dan tailing factor yang dihasilkan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
6
Metode KCKT fase terbalik untuk penetapan kadar bisfenol A pada air
minum dalam botol plastik dan botol air minum yang diberi pengaruh penyinaran
matahari tropis Indonesia dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi fase
terbalik dengan fase gerak asetonitril : air dan fase diam C-18 yang telah
optimum perlu dilakukan validasi metode analisis agar hasil yang diperoleh dapat
dipertanggungjawabkan serta memberikan jaminan bahwa metode telah
memenuhi persyaratan analisis. Beberapa parameter analisis yang harus
dipertimbangkan dalam validasi metode analisis anatara lain selektifitas,
linearitas, akurasi, presisi, rentang, Limit of Detection (LOD), dan Limit of
Quantitation (LOQ).
Penelitian ini merupakan penelitian pendahulu dari penelitian lain
mengenai penetapan kadar bisfenol A pada air dalam botol dan botol air minum
yang diberi pengaruh penyinaran matahari tropis Indonesia dengan metode
kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik dengan fase gerak asetonitril : air
dan fase diam C-18.
1. Permasalahan
Berdasarkan latar belakang di atas, dapat dirumuskan permasalahan
sebagai berikut.
a. Berapakah perbandingan fase gerak asetonitril : air dan kecepatan alir yang
optimal dalam pemisahan bisfenol A dari matrik sampel untuk penetapan
kadar bisfenol A dalam ekstrak air dan ekstrak botol air minum dengan
metode KCKT fase terbalik dengan fase diam C-18 dilihat dari dilihat dari
resolusi, N, ∝, k’, HETP, dan tailing factor yang dihasilkan?
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
7
b. Apakah metode KCKT fase terbalik menggunakan fase diam C-18 dengan
komposisi fase gerak asetonitril : air dan kecepatan alir yang optimal dalam
penetapan kadar bisfenol A dalam ekstrak air dan ekstrak botol air minum
memiliki validitas yang baik dilihat dari selektifitas, linearitas, akurasi, presisi,
rentang, LOD, dan LOQ yang dihasilkan?
2. Keaslian Penelitian
Sejauh pengamatan peneliti, penelitian mengenai penetapan kadar
bisfenol A dalam air maupun botol air minum telah pernah dilakukan sebelumnya.
Penetapan kadar bisfenol A pada air telah pernah dilakukan oleh Olmo,
Gonzakez-Casado, Navas, dan Vilchez (1997) menggunakan kromatografi gas –
spektra massa dengan ektraksi air menggunakan diklormetan dalam medium
asam. Penetapan kadar bisfenol A dalam botol minum polikarbonat, makanan
kaleng, dan air menggunakan KCKT fase terbalik dengan detektor fluoresence,
fase gerak metanol : air (65 : 35) dan fase diam C-18 pernah dilakukan oleh
Chong, Aung, dan Leong (2011). Rykowska and Wasiak (2006) pernah
melakukan analisis bisfenol A yang terlepas dari botol susu bayi ke dalam air dan
susu akibat pemanasan dengan KCKT fase terbalik dengan fase gerak asetonitril :
air (75:25, v/v) dan fase diam C-18. Namun, penelitian mengenai optimasi dan
validasi penetapan kadar bisfenol A dalam ekstrak air dan ekstrak botol air minum
yang diberi pengaruh penyinaran matahari tropis Indonesia dengan metode KCKT
fase terbalik dengan fase gerak asetonitril : air dan fase diam C-18 belum pernah
dilakukan sebelumnya.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
8
3. Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini nantinya diharapkan mempunyai manfaat sebagai
berikut.
a. Manfaat Teoritis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi
mengenai optimasi perbandingan fase gerak asetonitril : air dan kecepatan alir
serta parameter-parameter validitas dalam penetapan kadar bisfenol A dalam
ekstrak air dan ekstrak botol air minum dengan metode KCKT fase terbalik
dengan fase diam C-18.
b. Manfaat Praktis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan bagi
ilmu pengetahuan mengenai optimasi perbandingan fase gerak asetonitril : air
dan kecepatan alir serta parameter-parameter validitas dalam penetapan kadar
bisfenol A dalam ekstrak air dan ekstrak botol air minum dengan metode
KCKT fase terbalik dengan fase diam C-18.
B. Tujuan Penelitian
1. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kondisi optimum KCKT pada
pemisahan bisfenol A dalam matrik sampel (ekstrak air dan ekstrak botol air
minum) dilihat dari resolusi, N, ∝, k’, HETP, dan tailing factor yang dihasilkan.
2. Penetapan kadar bisfenol A dengan sistem KCKT yang optimal dapat
memenuhi parameter validasi metode analisis, yaitu selektifitas, linearitas,
akurasi, presisi, rentang, LOD, dan LOQ.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
9
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Plastik Polikarbonat
Plastik polikarbonat merupakan plastik yang ringan, kuat, jernih, tahan
terhadap suhu tinggi dan tahan terhadap pengaruh listrik. Karena sifat-sifat
tersebut, polikarbonat digunakan dalam berbagai produk seperti peralatan
elektronik, media digital (misalnya CD, DVD), mobil, kaca konstruksi, peralatan
kesehatan olahraga, dan alat kesehatan. Daya tahannya terhadap panas dan
sifatnya yang tidak mudah pecah menyebabkan polikarbonat menjadi pilihan ideal
untuk peralatan makan termasuk botol yang dapat digunakan kembali dan wadah
penyimpanan makanan yang dapat digunakan untuk penyimpanan di dalam kulkas
dan microwave (Polycarbonate/BPA Global Group, 2013).
Menurut penelitian oleh para peneliti dari Harvard School of Public
Health, ditemukan adanya bisfenol A dalam urin partisipan yang selama seminggu
minum dari botol polikarbonat. Hal ini menunjukkan bahwa wadah minum
polikarbonat dapat melepaskan bahan kimia penyusunnya ke dalam minuman
sehingga dapat ditemukan bisfenol A pada urin manusia (Harvard School of
Public Health, 2009).
B. Bisfenol A
Bisfenol A juga dikenal dengan 4,4’-(1-Methylethylidene)-bisphenol;
4,4’-isopropylidenediphenol; 2,2-bis(4-hydroxyphenyl)propane; dan nama
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
10
berdasarkan IUPAC 4-[2-(4-hydroxyphenyl)propan-2-yl]phenol (Chemaxon,
2013). Bisfenol A memiliki rumus C15H16O2; berat molekul 228,29 g/mol; C
78,92%; H 7,06%; O 14,02%. Diproduksi dari fenol dan aseton. Berbentuk kristal
atau serpihan. Berbau fenolik ringan. Titik leleh 150-155oC. Ttitik didih 220oC.
Praktis tidak larut dalam air. Larut dalam larutan basa, alkohol, aseton. Sedikit
larut dalam karbon tertraklorida (The Merck Index, 2001). Menurut Cousins et al.
(cit., WHO, 2006), bisfenol A memiliki koefisien partisi oktanol/air (Kow) 103,40
sehingga merupakan senyawa yang hidrofobik, namun sedikit polar karena
memiliki dua gugus hidroksil. Bisfenol A memiliki pKa 9,59-11,30. Kelarutan
bisfenol A dalam air adalah 120-300 mg/L pada 20-25oC (Staples, Dorn, Klecka,
O’Block, and Harris, 1998).
Gambar 1. Struktur bisfenol A (Wasiak and Rykowska, 2006)
Bisfenol A merupakan komponen penyusun yang penting pada plastik
polikarbonat. Sejumlah penelitian menunjukkan bahwa bisfenol A merupakan
pengganggu endokrin pada hewan, termasuk pada permulaan kedewasaan seksual
dini, merubah perkembangan dan organisasi jaringan kelenjar susu pada mamalia
dan menurunkan produksi sperma pada keturunannya. Bisfenol A dapat
bermigrasi ke dalam makanan dan minuman yang disimpan dalam wadah yang
mengandung bisfenol A (Harvard School of Public Health, 2009). Migrasi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
11
bisfenol A ini dapat diakibatkan degradasi oleh sinar ultraviolet, pengaruh pH,
turbulensi, dan sinar matahari (Staples, Dorn, Klecka, O’Block, and Harris, 1998).
Paparan bisfenol A pada manusia dapat terjadi karena mengkonsumsi
makanan atau minuman yang tercemar bisfenol A akibat penggunaan wadah
polikarbonat (atau yang mengandung monomer bisfenol A). Bisfenol A memiliki
struktur mirip dengan ekstrogen dalam tubuh dan dapat mengganggu aktifitas
hormon ekstrogen. Bisfenol A adalah endocrine discrupting chemical (EDC) yang
mengganggu produksi, pelepasan, transportasi, metabolisme, pengikatan, aksi,
dan eliminasi hormon alami manusia (US-FDA, 2008).
Dosis perhari yang diperbolehkan (Tolerable daily intake/TDI) dari
bisfenol A telah ditetapkan oleh European Food Safety Authority adalah sebesar
0,05 mg/kgBB/hari (EFSA, 2013). TDI di beberapa negara besar seperti Eropa
0,01 mg/kgBB/hari (SCF, 2012); Amerika Serikat dan Kanada 0,025
mg/kgBB/hari (Health Canada, 2008); dan Jepang 0,05 mg/kgBB/hari (AIST,
2007).
C. Metode untuk Analisis Bisfenol A
Bisfenol A dapat dianalisis menggunakan kromatografi cair secara
langsung tanpa derivatisasi terlebih dahulu saat preparasi sampel. Kromatografi
cair merupakan teknik yang paling banyak digunakan untuk analisis bisfenol A
pada makanan dan sampel biologis. Berbagai macam detektor, termasuk UV,
fluorosen, MS, dan tandem mass spectrometry (MS/MS), telah digunakan untuk
mendeteksi bisfenol A (Cao, 2010).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
12
1. Liquid chromatography – ultraviolet
Bisfenol A memiliki kromofor sehingga dapat dideteksi menggunakan
detektor UV. LOD pada analisis menggunakan detektor UV paling kecil 15 kali
lebih besar daripada yang dihasilkan menggunakan detektor fluoresen (Cao,
2010).
2. Liquid chromatography – fluorescence
Detektor fluoresen sering digunakan untuk analisis bisfenol A dalam
makanan dan sampel biologis dengan metode kromatografi cair. Bisfenol A dapat
dideteksi menggunakan detektor fluoresen karena memiliki elektron π
terkonjugasi pada dua cincin benzen (Cao, 2010).
3. Liquid chromatography – mass spectrometry atau Liquid chromatography –
tandem mass spectrometry
LC-MS atau LC-MS/MS juga sering digunakan untuk analisis bisfenol A
dalam makanan dan sampel biologis. Dengan kedua metode ini dapat diketahui
spektrum massa analit sehingga dapat membantu dalam identifikasi puncak analit
(Cao, 2010).
4. Gas chromatography – MS
GC-MS juga merupakan salah satu metode yang biasa digunakan untuk
analisis bisfenol A dalam makanan dan sampel biologis karena resolusinya lebih
besar dan LOD yang dihasilkan lebih kecil dibandingkan dengan metode LC-MS,
namun diperlukan derivatisasi terlebih dahulu (Cao, 2010).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
13
D. Spektrofotometri Ultraviolet
Sinar ultraviolet mempunyai panjang gelombang antara 200-400 nm. Jika
suatu molekul dikenai suatu radiasi elektromagnetik pada frekuensi yang sesuai
sehingga energi molekul tersebut ditingkatkan ke level yang lebih tinggi, maka
terjadi peristiwa penyerapan (absorpsi) energi oleh molekul. Untuk mengukur
banyaknya radiasi yang diserap oleh suatu molekul sebagai fungsi frekuensi
radiasi. Spektrum absorpsi merupakan suatu grafik yang menghubungkan antara
banyaknya sinar yang diserap dengan frekuensi (dengan panjang gelombang)
sinar. Allowed transtition untuk suatu molekul dengan struktur kimia yang
berbeda adalah tidak sama sehingga spektra absorpsinya juga berbeda. Dengan
demikian, spektra dapat digunakan sebagai bahan informasi yang bermanfaat
untuk analisis kualitatif. Banyaknya sinar yang diabsorpsi pada panjang
gelombang tertentu sebanding dengan banyaknya molekul yang menyerap radiasi,
sehingga spektra absorpsi juga dapat digunakan untuk analisis kuantitatif (Gandjar
dan Rohman, 2007).
Serapan cahaya molekul dalam daerah spektrum ultraviolet dan visibel
tergantung pada struktur elektronik dari molekul. Spektrofotometri ultraviolet dan
visibel dari senyawa-senyawa organik berkaitan erat dengan transisi-transisi
diantara tingkatan-tingkatan tenaga elektronik. Terdapat keuntungan yang selektif
dari serapan ultraviolet, yaitu gugus-gugus karakteristik dapat dikenal dalam
molekul yang sangat kompleks. Spektrum ultraviolet menggambarkan hubungan
antara panjang gelombang atau frekuensi serapan dengan intensitas serapan atau
absorbansi (Sastrohamidjojo, 2002)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
14
Kromofor merupakan ikatan rangkap terkonjugasi yang dapat menyerap
radiasi pada daerah UV dan visibel. Auksokrom merupakan gugus jenuh yang
terikat pada kromofor yang dapat mengubah panjang gelombang dan intensitas
serapan maksimum. Ciri auksokrom adalah gugus heteroatom yang langsung
terikat pada kromofor, seperti –OCH3, –Cl, –OH, dan –NH2. Pergeseran
batokromik merupakan pergeseran serapan ke arah panjang gelombang yang lebih
panjang karena substitusi atau pengaruh pelarut, sedangkan pergeseran
hipsokromik merupakan pergeseran serapan ke arah panjang gelombang yang
lebih pendek karena substitusi atau pengaruh pelarut. Auksokrom dapat
menyebabkan pergeseran batukromik (Sastrohamidjojo, 2001).
E. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
1. Definisi dan Instrumentasi
Kromatografi merupakan suatu proses pemisahan yang mana analit-analit
dalam sampel terdistribusi antara 2 fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Fase
diam dapat berupa bahan padat atau porus dalam bentuk molekul kecil, atau
dalam bentuk cairan yanng dilapiskan pada pendukung padat atau dilapiskan pada
dinding kolom. Fase gerak dapat berupa gas atau cairan. Jika gas digunakan
sebagai fase gerak maka prosesnya dikenal sebagai kromatogafi gas. Dalam
kromatografi cair dan juga kromatografi lapis tipis, fase gerak yang digunakan
selalu cair (Rohman, 2009).
Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan teknik pemisahan
fisik yang dilakukan dalam fase cair di mana sampel dipisahkan menjadi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
15
komponen penyusunnya (atau analit) dengan mendistribusikannya di antara fase
gerak (fase cair yang mengalir) dan fase diam (sorben yang dikemas dalam
kolom). Sebuah detektor secara online memonitor konsentrasi masing-masing
komponen yang dipisahkan dalam kolom limbah dan menghasilkan kromatogram.
KCKT adalah teknik analisis yang paling banyak digunakan untuk analisis
kuantitatif obat-obatan, biomolekul, polimer, dan senyawa organik lainnya (Ahuja
and Dong, 2005). KCKT merupakan salah satu metode kromatografi yang
digunakan untuk pemisahan dan analisis campuran kimia (Snyder, Kirkland, dan
Doland, 2010).
Gambar 2. Proses kromatografi. (1a) Proses kromatografi secara skematik yang
menunjukkan perpindahan pita komponen melewati kolom; (1b) Penggambaran secara
mikroskopik proses partisi molekul analit A dan B pada fase diam yang terikat pada
penyangga padat; (1c) Kromatogram yang menunjukkan sinyal dari detektor UV componen
A dan B yang telah terelusi (Dong, 2006)
Instrumentasi KCKT terdiri dari wadah fase gerak, pompa, alat untuk
memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung
buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam (Rohman,
2009).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
16
a. Wadah Fase Gerak dan Fase Gerak. Wadah fase gerak harus bersih dan
lembam (inert). Fase gerak atau eluen biasanya terdiri dari campuran pelarut
yang dapat bercampur yang berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya
elusi dan resolusi ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase
diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam
lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan
meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase gerak
lebih polar daripada fase diam), kemampuan elusi menurun dengan
meningkatnya polaritas pelarut (Rohman, 2009).
Tabel I. Nilai indeks polaritas beberapa pelarut pada KCKT fase terbalik (Snyder,
Kirkland, and Glajch, 2012).
Pelarut Indeks
Polaritas
Eluotropic Value UV Cut
off (nm) Alumina ODS Silika
Heksan 0,1 0,01 - 0,00 195
Sikloheksan 0,2 0,04 - - 200
Toluen 2,4 0,29 - 0,22 284
Tetrahidrofuran 4,0 0,45 3,7 0,53 212
Etil asetat 4,4 0,58 - 0,48 256
Aseton 5,1 0,56 8,8 0,53 330
Metanol 5,1 0,95 1,0 0,70 205
Asetonitril 5,8 0,65 3,1 0,52 190
Dimetilformamid 6,4 - 7,6 - 268
Dimetilsulfomid 7,2 0,62 - - 268
Air 10,2 - - - 190
Tabel I menunjukkan bahwa semakin besar eluotropic values dari
pelarut menunjukkan semakin mudah untuk mengelusi sampel dan semakin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
17
besar indeks polaritas yang dimiliki campuran pelarut maka semakin bersifat
polar pelarut yang digunakan. Namun juga terdapat nilai cutoff dalam tabel I
yang menunjukkan bahwa solven yang memiliki nilai cutoff lebih tinggi
dibandingkkan panjang gelombang sampel yang dianalisis maka solvent
tersebut tidak dapat digunakan (Snyder, Kirkland, and Glajch, 2012).
Fase gerak yang akan digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk
menghindari partikel-partikel kecil. Selain itu, gas dalam fase gerak juga
harus dihilangkan sebab gas dapat berkumpul dengan komponen lain
terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis
(Rohman, 2009).
Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak
tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak
berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan pemrograman suhu pada
kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi
campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas
yang luas (Rohman, 2009).
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan
fase terbalik adalah campuran larutan buffer dengan metanol atau campuran
air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang
paling sering digunakan adalah campurran pelarut-pelarut hidrokarbon
dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis
alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan
fase terbalik (Rohman, 2009).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
18
b. Pompa. Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang inert
terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas,
baja tahan karat, teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya
mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase
gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa
yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20
mL/menit (Rohman, 2009).
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak
adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara
tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada dua jenis pompa
dalam KCKT, yaitu pompa dengan tekanan konstan dan pompa dengan aliran
fase gerak yang konstan. Pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh
ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan
(Rohman, 2009).
c. Tempat Penyuntikan Sampel. Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan
secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju
kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat
dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal
atau eksternal (Rohman, 2009).
d. Kolom. Ada dua jenis kolom pada KCKT, yaitu kolom konvensional dan
kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian KCKT yang mana terdapat fase
diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit (Rohman, 2009).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
19
Kolom mikrobor mempunyai tiga keuntungan yang utama
dibandingkan dengan kolom konvensional, yaitu:
Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih
kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom
mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10-100
µL/menit)
Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom
mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrofotometer
massa
Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih
pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah
sampel terbatas misal sampel klinis (Rohman, 2009).
Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak
setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin
(Rohman, 2009).
Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi,
atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar
dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH) (Rohman,
2009).
Silika dapat dimodifikasi secara kimia dengan menggunakan reagen-
reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus
silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain
(Rohman, 2009).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
20
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling
banyak diguunkan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan
kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang
lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika
aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang
dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi
yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan
(Rohman, 2009).
e. Detektor. Detektor pada KCKT dikelompokkan menjadi dua golongan yaitu
detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat
spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor
spektrofotometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya
akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis,
detektor fluorosensi, dan elektrokimia (Rohman, 2009).
Gambar 3 . Diagram sistem KCKT. (a) Wadah fase gerak; (b) pompa; (c) autosampler
atau injektor; (d) kolom; (e) detektor; (f) sistem data (Synder, Kirkland and Dolan,
2010)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
21
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai
berikut: (1) mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel;
(2) mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada
kadar yang sangat kecil; (3) stabil dalam pengoperasiannya; (4) mempunyai
sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita; (5)
signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada
kisaran yang luas (kisaran dinamis linier); dan (6) tidak peka terhadap
perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak (Rohman, 2009).
2. Pemisahan Puncak dalam Kromatografi
Tujuan utama pada kromatografi adalah pemisahan suatu campuran. Ada
dua parameter yang digunakan untuk menilai kualitas pemisahan pada
kromatografi, yaitu banyaknya pelebaran puncak (efisiensi) dan tingkat
pemisahan puncak yang berdekatan (Gandjar dan Rohman, 2010). Kualitas
pemisahan dengan kromatografi kolom dapat dikontrol dengan melakukan
serangkaian uji kesesuaian sistem yang meliputi efisiensi kolom, resolusi atau
daya pisah, simetrisitas puncak, dan faktor retensi atau kapasitas kolom (Rohman,
2009).
Ada tiga faktor mendasar dalam KCKT, yaitu: retensi, selektifitas, dan
efisiensi. Ketiga faktor ini mengendalikan pemisahan (resolusi) dari analit.
Kemudian akan dibahas persamaan van Deemter dan menunjukkan bagaimana
diameter partikel bahan pengepakan dan laju alir mempengaruhi efisiensi kolom
(Ahuja and Dong, 2005).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
22
Gambar 4 menunjukkan kromatogram yang khas, yang mencakup sumbu
waktu, titik injeksi, dan puncak analit. Waktu antara titik injeksi sampel dan analit
mencapai detektor disebut waktu retensi (tR). Waktu retensi komponen yang tidak
tertahan (sering ditandai oleh baseline pertama yang disebabkan oleh elusi sampel
pelarut) disebut waktu void (t0). Waktu kosong berhubungan dengan volume
kosong kolom (V0), yang merupakan parameter penting yang akan diuraikan
kemudian. Puncak juga memiliki lebar (Wb) dan tinggi (h). Ketinggian atau
daerah di bawah puncak sebanding dengan konsentrasi atau jumlah komponen
tertentu dalam sampel. Waktu retensi digunakan untuk identifikasi puncak yang
tergantung pada laju aliran, dimensi kolom, dan parameter lainnya. (Ahuja and
Dong, 2005).
Sebuah istilah yang lebih mendasar yang mengukur tingkat retensi analit
adalah faktor kapasitas atau faktor retensi (k’), dihitung dengan waktu retensi
bersih (t’R, waktu retensi dikurang waktu kosong). Faktor kapasitas mengukur
berapa kali analit tertahan relatif terhadap komponen yang tidak tertahan (Ahuja
and Dong, 2005).
Gambar 4 . Kromatogram yang menunjukkan waktu retensi (tR), waktu kosong (t0), lebar
dasar puncak (Wb), dan tinggi puncak (h) (Ahuja and Dong, 2005)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
23
Nilai k’ nol berarti bahwa komponen tersebut tidak tertahan dan terelusi
dengan pelarut. Nilai k’ 1 berarti bahwa komponen sedikit ditahan oleh kolom
sementara k’ nilai 20 berarti bahwa komponen sangat dipertahankan dan
menghabiskan banyak waktu berinteraksi dengan fase diam. Dalam kebanyakan
tes, analit terelusi dengan k’ antara 1 dan 20 sehingga memiliki kesempatan yang
cukup untuk berinteraksi dengan fase diam yang mengakibatkan migrasi yang
berbeda. Puncak yang terelusi pada di k’ yang besar (> 20) bermasalah karena
jangka waktu panjang dan sensitifitas kecil yang dapat mengakibatkan puncak
yang lebar (Ahuja and Dong, 2005).
Pada KCKT fase terbalik digunakan fase diam hidrofobik seperti C-18
dan fase gerak yang hidrofilik seperti campuran metanol dan air), partisi yang
terjadi dianalogikan seperti ekstraksi cair-cair dua fase dalam corong pisah antara
larutan non-polar (misalnya heksan) dan larutan polar (misalnya air). Pada KCKT
fase terbalik, waktu retensi dipengaruhi oleh kekuatan atau polaritas fase gerak
(Ahuja and Dong, 2005).
Selektifitas (∝) atau faktor pemisahan adalah ukuran retensi diferensial
dua analit. Selektifitas didefinisikan sebagai rasio dari faktor kapasitas (k’) dari
dua puncak seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5. Selektivitas harus > 1,0
untuk pemisahan puncak. Selektivitas tergantung pada sifat dari fase diam dan
komposisi fase gerak (Ahuja and Dong, 2005). Menurut Snyder, Kirkland, and
Glajch (2012) nilai k’ harus memenuhi 0,5 < k’ < 20. Perhitungan selektifitas.
∝=𝑡𝑅𝐴 − 𝑡0
𝑡𝑅𝐵 − 𝑡0
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
24
Jika nilai k’ menjadi lebih kecil (terelusi lebih awal) maka resolusi
menjadi lebih buruk. Ketika k’ dibuat lebih besar, resolusi meningkat. Jika ∝
meningkat, Rs akan meningkat juga. Nilai N dipengaruhi oleh kecepatan alir,
panjang kolom, dan ukuran partikel (Snyder, Kirkland, and Glajch, 2012).
Perhitungan k’ dengan rumus.
𝑘′ =𝑡𝑅 − 𝑡0
𝑡0
Gambar 5 . Pengaruh k’, ∝, dan N pada pemisahan (Snyder, Kirkland, and Glajch, 2012)
Salah satu karakteristik sistem kromatografi yang paling penting adalah
efisiensi atau jumlah lempeng teoritis atau N (Rohman, 2009). Sebagian
kromatogram memiliki puncak yang cenderung berbentuk Gaussian dan melebar,
di mana Wb menjadi lebih besar dengan bertambahnya tR. Hal ini disebabkan oleh
efek pelebaran pita dalam kolom, dan merupakan dasar untuk semua proses
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
25
kromatografi. Jumlah lempeng (N) adalah ukuran kuantitatif dari efisiensi kolom
(Ahuja and Dong, 2005). Persamaan untuk menghitung N.
𝑁 = 5,54(𝑡𝑅
𝑊1/2𝐻)2
Konsep lempeng secara tradisional berasal dari proses penyulingan di
industri menggunakan kolom yang distilasi terdiri dari beberapa lempeng di mana
cairan kondensasi berada dalam kesetimbangan dengan uap yang naik. Dengan
demikian, semakin panjang kolom distilasi akan memiliki lebih banyak lempeng
atau terjadinya equilibrium. Demikian pula dalam kromatografi, tinggi setara
lempeng teoritis atau HETP (height equivalent theoretical plate) sama dengan
panjang kolom (L) dibagi dengan jumlah lempeng teoritis (N) (Ahuja and Dong,
2005). HETP merupakan panjang kolom kromatografi (dalam mm) yang
diperlukan sampai terjadinya satu kali kesetimbangan molekul analit dalam fase
gerak dan fase diam (Gandjar dan Rohman, 2010). HETP dihitung dengan rumus.
𝐻𝐸𝑇𝑃 =𝐿
𝑁
Nilai N yang tinggi disarankan untuk pemisahan yang baik yang nilainya
sebanding dengan semakin panjangnya kolom (L) dan semakin kecilnya nilai H.
Istilah H merupakan tinggi setara lempeng teoritis atau HETP (height equivalent
theoretical plate) (Rohman, 2009). Kolom yang baik akan mempunyai bilangan
lempeng yang tinggi dan nilai HETP yang rendah. Ukuran partikel berpengaruh
terhadap nilai H. Semakin kecil ukuran partikel maka semakin tinggi bilangan
lempeng teoritis (Rohman, 2009).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
26
Dalam sistem kromatografi, diharapkan memiliki bilangan lempeng (N)
yang tinggi yang menunjukkan efisiensi kolom yang tinggi. Beberapa parameter
yang dapat meningkatkan efisiensi kolom pada kromatografi cair, antara lain
ukuran partikel fase diam kecil, lapisan fase diam tipis, bentuk fase diam teratur,
temperatur tinggi, lapisan fase diam merata, ukuran partikel fase diam sama, serta
koefisien difusi yang tinggi pada fase diam dan fase gerak (Watson, 2003).
Menurut WHO, nilai N hendaknya ≥ 2000 (cit., Yin, 2011).
Kolom yang efisien akan mempunyai resolusi yang baik. Tingkat
pemisahan komponen dalam suatu campuran dengan metode kromatografi
digambarkan dalam kromatogram yang dihasilkan. Untuk hasil pemisahan yang
baik, puncak-puncak dalam kromatogram harus terpisah secara sempurna dari
puncak lainnya dengan sedikit tumpang tindih (overlapping) atau tidak ada
tumpang tindih sama sekali. Tingkat pemisahan antara puncak-puncak
kromatografi yang bersebelahan merupakan fungsi jarak antara puncak maksimal
dan lebar puncak yang berhubungan (Ahuja and Dong, 2005).
Dalam KCKT, resolusi didefinisikan sebagai perbedaan antara waktu
retensi dua puncak yang saling berdekatan (∆𝑡𝑅 = 𝑡𝑅2 − 𝑡𝑅1) dibagi dengan rata-
rata lebar puncak (𝑊1 + 𝑊2)1
2 .
Rumus unntuk menghitung resolusi adalah sebagai berikut.
𝑅𝑠 =2∆𝑡𝑅
𝑊1 + 𝑊2
Nilai Rs harus mendekati atau lebih dari 1,5 karena akan memberikan
pemisahan puncak yang baik (base line resolution) (Ahuja and Dong, 2005).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
27
Sesuai persamaan di atas, resolusi yang besar akan tercapai jika
perbedaan waktu retensi analit cukup besar dan lebar puncak analit dengan analit
yang lainnya adalah sekecil mungkin. Sebagaimana ditunjukkan oleh persamaan
tersebut, resolusi komponen-komponen dalam kromatografi tergantung pada
waktu retensi relatif pada sistem kromatografi tertentu dan lebar puncak (Ahuja
and Dong, 2005).
Pada kondisi ideal, puncak kromatografi akan memiliki bentuk puncak
Gaussian dengan simetri sempurna. Pada kenyataannya, sebagian besar puncak
cenderung mengalami fronting atau tailing. Seperti ditunjukkan dalam gambar 6,
tailing factor (Tf) seperti yang didefinisikan oleh USP merupakan ukuran puncak
asimetri. Dalam perhitungan ini, lebar puncak dihitung pada 5% puncak tinggi
(W0.05) (Ahuja and Dong, 2005).
Gambar 6 . Diagram yang menunjukkkan perhitungan tailing factor (Tf) serta diagram yang
menunujukkan fronting dan tailing (Ahuja and Dong, 2005)
Kebanyakan puncak memiliki nilai tailing factor antara 0,9 dan 1,4;
dengan nilai 1,0 mengindikasikan puncak yang simetris sempurna. Puncak yang
tailing biasanya disebabkan oleh adsorpsi atau interaksi kuat lainnya analit dengan
fase diam, sedangkan puncak fronting dapat disebabkan oleh kolom yang
overloading, reaksi kimia atau isomerisasi selama proses kromatografi (Ahuja and
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
28
Dong, 2005). Menurut WHO, nilai tailing factor yang masih memenuhi kriteria
penerimaan adalah ≤ 2 (cit., Yin, 2011).
Efektivitas pemisahan (Rs) dalam analisis HPLC tergantung pada kedua
faktor termodinamika (retensi dan selektifitas) dan faktor kinetika (lebar puncak
dan efisiensi kolom). Hubungan resolusi untuk parameter lain dapat dinyatakan
agak kuantitatif dalam persamaan resolusi: 𝑅𝑠 = (𝑘′
𝑘′+1) + (
∝−1
∝) + (
√𝑁
4)
Retensi Selektifitas Efisiensi
(Ahuja and Dong, 2005).
Dari persamaan resolusi tersebut menunjukkan bahwa Rs dikendalikan
oleh retensi, selektifitas, dan efisiensi. Untuk memaksimalkan Rs, k’ harus relatif
besar. Selektifitas dipengaruhi oleh kondisi kolom dan fase gerak. Jumlah
lempeng (N) dimaksimalkan dengan menggunakan kolom panjang atau
menggunakan kolom yang dikemas dengan partikel yang lebih kecil. Strategi
untuk meningkatkan resolusi adalah menemukan kekuatan pelarut yang mengelusi
semua zat antara k’ 1 dan 20 dan untuk memisahkan semua analit dengan
memvariasikan pelarut organik dan pengubah fase gerak lainnya. Jika cara ini
tidak berhasil, fase diam berbeda bisa dicoba (Ahuja and Dong, 2005).
Fenomena pelebaran pita dalam proses kromatografi gas pertama kali
dipelajari oleh van Deemter pada tahun 1950 dan menghasilkan persamaan van
Deemter, menghubungkan HETP atau tinggi piring dengan kecepatan aliran linear
(V).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
29
Gambar 7 . Kurva persamaan van Deemter yang menunjukkan hubungan antara HETP
lawan kecepatan linear rata-rata (Ahuja and Dong, 2005)
Gambar 7 menunjukkan bagaimana kurva van Deemter adalah kurva
yang berasal dari tiga istilah terpisah (A, B/V, dan CV) yang pada gilirannya
dikendalikan oleh faktor-faktor seperti ukuran partikel (dp), dan koefisien difusi
(Dm).
Istilah A merupakan "difusi eddy atau multi-path effect" dan sebanding
dengan (dp). B merupakan "difusi longitudinal" dan sebanding dengan (Dm).
Istilah C merupakan "resistensi terhadap transfer massa" dan sebanding dengan
(d2p/Dm). Persamaan van Deemter adalah yang paling terkenal dan muncul untuk
menjelaskan konsep pelebaran pita di HPLC meskipun dikembangkan untuk
kromatografi gas (Ahuja and Dong, 2005).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
30
Gambar 8 . Kurva persamaan van Deemter dengan tiga kolom kemas ukuran partikel 10, 5,
dan 3 µm (Ahuja and Dong, 2005)
Gambar 8 menunjukkan percobaan van Deemter kurva untuk tiga kolom
kemas dengan ukuran partikel 10, 5, dan 3 µm. Gambar tersebut menunjukkan
bahwa dp yang kecil menghasilkan HETP yang lebih rendah (atau kolom partikel
kecil memiliki efisiensi lebih per satuan panjang) karena istilah A sebanding
dengan dp (Ahuja and Dong, 2005).
Gambar 9 menunjukkan hubungan linear log k’ vs % konten pelarut
organik untuk tiga pelarut organik yang umum digunakan pada KCKT fase
terbalik. THF lebih kuat daripada ACN, yang juga lebih kuat daripada MeOH
pada KCKT fase terbalik (Ahuja and Dong, 2005).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
31
Gambar 9 . Hubungan log k’ vs % organic solvent modifier untuk metanol, asetonitril, dan
tetrahidrofuran (Ahuja and Dong, 2005)
Berikut penyebab terjadinya pelebaran pita akan dibahas satu per satu.
a. Difusi Eddy. Penyebab difusi Eddy adalah karena kolom diisi dengan partikel
fase diam yang kecil. Fase gerak membawa analit yang melewati kolom
sebagian akan terelusi terlebih dahulu meninggalkan yang lainnya karena
melewati jalur yang lurus di dalam kolom. Analit lain terelusi setelah itu
karena harus melewati beberapa penghalang di sepanjang kolom (Meyer,
2004).
Gambar 10 . Difusi Eddy (Meyer, 2004)
b. Distribusi aliran. Fase gerak mengalir diantara partikel fase diam. Aliran akan
lebih cepat pada bagian celah antara dua partikel daripada yang dekat dengan
partikel (Meyer, 2004).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
32
Gambar 11 . Distribusi aliran (Meyer, 2004)
c. Difusi longitudinal. Analit dalam fase gerak menyebar ke segala arah dengan
difusi. Difusi terjadi dengan arah yang sama atau berlawanan dengan aliran
fase gerak (Watson, 2003).
Gambar 12 . Pelebaran pita oleh difusi longitudinal (Meyer, 2004)
d. Transfer massa. Fenomena ini terjadi karena adanya pori pada partikel fase
diam. Fase gerak dapat masuk ke dalam pori dan kemudian molekul analit
masuk ke dalam pori yang dapat menyebabkan lamanya waktu yang
diperlukan analit tersebut untuk terelusi sehingga menyebabkan terjadinya
pelebaran pita (Meyer, 2004).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
33
Gambar 13 . Transfer massa. Atas = Struktur pori partikel fase diam; Bawah = Transfer
massa antara fase gerak dan fase diam (Meyer, 2004)
F. Validasi Metode Analisis
Validasi metode analisis adalah proses yang digunakan dalam penelitian
laboratorium, di mana karakteristik kinerja dari metode yang digunakan sesuai
dengan syarat ditentukan pada metode yang digunakan. Metode uji yang berbeda
memiiki ketentuan yang berbeda pula. Berikut kategori uji yang paling biasa
digunakan beserta data validasi yang diperlukan (The United States
Pharmacopeia, 2007).
Kategori I, metode analisis untuk kuantitasi komponen utama dari
senyawa obat atau senyawa aktif (termasuk pengawet) pada produk akhir sediaan
farmasi. Kategori II, metode analisis untuk menentukan pengotor dalam senyawa
obat atau senyawa degradasi pada produk akhir sediaan farmasi. Metode ini
termasuk uji kuantitatif dan uji batas. Kategori III, metode analisis untuk
menentukan karakteristik kinerja (contohnya kelarutan, pelepasan obat). Kategori
IV, uji identifikasi (The United States Pharmacopeia, 2007).
Untuk setiap kategori uji, diperlukan informasi analisis yang berbeda.
Tabel II menunjukkan data yang biasanya diperlukan pada setiap kategori uji.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
34
Tabel II. Data yang diperlukan untuk uji validasi
Parameter
Validasi Kategori 1
Kategori 2 Kategori 3
Kategori 4 Kuantitatif Uji Batas
Akurasi Ya Ya * * Tidak
Presisi Ya Ya Tidak Ya Tidak
Spesifisitas Ya Ya Ya * Ya
LOD Tidak Tidak Ya * Tidak
LOQ Tidak Ya Tidak * Tidak
Linearitas Ya Ya Tidak * Tidak
Rentang Ya Ya Tidak * Tidak
*mungkin diperlukan, tergantung sifat dari uji yang spesifik
Validasi metode analisis dapat diverifikasi hanya dengan penelitian di
laboratorium. Oleh karena itu, dokumentasi dari hasil penelitian yang berhasil
merupakan persyaratan dasar untuk menentukan apakah metode ini cocok untuk
aplikasi yang dimaksud. Dokumentasi yang sesuai harus menyertai setiap
proposal baru atau revisi prosedur analitis kompendial (The United States
Pharmacopeia, 2007).
Validasi metode analisis merupakan suatu proses tindakan penilaian
terhadap parameter tertentu, berdasarkan percobaan yang dilakukan di
laboratorium untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi
persyaratan untuk penggunaannya. Parameter-parameter tersebut antara lain
sebagai berikut.
a. Spesifisitas. Spesifisitas merupakan kemampuan suatu metode analisis untuk
mengukur analit yang diinginkan dalam matriks tanpa mengalami gangguan
dari analit lain (Gandjar dan Rohman, 2010).
b. Linearitas dan rentang. Linearitas merupakan kemampuan suatu metode (pada
rentang tertentu) untuk mendapatkan hasil uji yang secara langsung
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
35
proporsional dengan konsentrasi (jumlah) analit di dalam sampel. Rentang
adalah jarak antara level terbawah dan teratas dari metode analisis yang telah
dipakai untuk mendapatkan presisi, linearitas dan akurasi yang bisa diterima
(The United States Pharmacopeia, 2007).
c. Presisi dan repeatability. Presisi merupakan derajat keterulangan hasil uji
ketika metode dilakukan secara berulang pada sampel yang homogen dengan
beberapa kali sampling. Repeatability adalah ukuran keterulangan yang
dihasilkan dari prosedur analisis laboratorium dalam jangka waktu yang
pendek, oleh analis dan peralatan yang sama (The United States
Pharmacopeia, 2007).
d. Akurasi. Akurasi adalah kedekatan hasil uji yang diperoleh dengan nilai yang
sebenarnya (The United States Pharmacopeia, 2007).
e. LOD (Limit of Detection) dan LOQ (Limit of Quantitation). LOD merupakan
jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi dan masih
memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blangko. LOQ
merupakan konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan
dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional
metode yang digunakan (The United States Pharmacopeia, 2007).
G. Landasan Teori
Bisfenol A bahan yang digunakan untuk pembuatan polikarbonat yang
umum digunakan dalam pembuatan botol minum. European Commission (1996)
mengklasifikasikan bisfenol A sebagai zat yang berbahaya bagi kesehatan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
36
manusia karena merupakan endocrine discrupting chemical (EDC) yang
mengganggu produksi, pelepasan, transportasi, metabolisme, pengikatan, aksi,
dan eliminasi hormon alami manusia. Informasi terbaru mengenai dosis bisfenol
A harian yang dapat masuk ke dalam tubuh manusia menurut European Food
Safety Authority adalah sebesar 0,05 mg/kgBB/hari.
Pemaparan pada manusia terjadi akibat migrasi bisfenol A yang lepas
dari wadah plastik ke dalam makanan atau minuman. Lepasnya bisfenol A ini
salah satunya disebabkan oleh panas dan sinar ultraviolet. Oleh karena itu, perlu
dilakukan penetapan kadar bisfenol A dalam air minun yang diberi paparan sinar
matahari tropis Indonesia sebagai sumber panas yang juga mengandung
ultraviolet dan penetapan kadar bisfenol A yang meluruh dari botol akibat
perlakuan tersebut.
Pada penelitian ini, peneliti akan melakukan penetapan kadar bisfenol A
pada ekstrak air dalam botol dan ekstrak botol air minum yang diberi pengaruh
penyinaran matahari tropis Indonesia dengan metode kromatografi cair kinerja
tinggi (KCKT) fase terbalik dengan fase gerak asetonitril : air dan fase diam C-
18. KCKT dipilih untuk analisis bisfenol A karena mampu memisahkan dari suatu
campuran sekaligus menentukan kadarnya, mudah, cepat, sensitif, serta bisfenol A
dapat dianalisis menggunakan KCKT secara langsung tanpa derivatisasi terlebih
dahulu. Detektor UV dipilih karena bisfenol A memiliki kromofor yang dapat
memberikan serapan di daerah UV.
Digunakan fase diam C-18 karena fase diam ini cocok untuk senyawa
yang memiliki log Kow lebih dari 2, seperti bisfenol A yang memiliki log Kow
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
37
3,40; fase diam ini digunakan untuk menganalisis senyawa dengan kepolaran
yang rendah, sedang, maupun tinggi dan memiliki pH di antara 2,5-7,5. Bisfenol
A memiliki koefisien partisi oktanol/air (Kow) 103,40 sehingga merupakan senyawa
yang hidrofobik, namun sedikit polar karena memiliki dua gugus hidroksil serta
memiliki pH ± 5 – 6. Interaksi pada C-18 didasarkan pada interaksi hidrofobik
atau van der Waals. Bagian cincin benzen dari bisfenol A merupakan bagian
hidrofobik yang akan berinteraksi dengan fase diam. Untuk dapat mengelusi
bisfenol A, fase gerak air ditambahkan pelarut organik untuk mengurangi
kepolaran dari fase gerak. Digunakan pelarut organik asetonitril karena memiliki
kekuatan elusi yang cukup besar pada fase diam C-18. Bisfenol A juga memiliki
bagian polar (-OH) yang dapat berinteraksi dengan fase gerak yang polar sehingga
bisfenol A dapat terelusi melalui kolom.
Ekstraksi bisfenol A dari dalam minuman dilakukan dengan ekstraksi
fase padat atau solid phase extraction (SPE). Sementara itu, ekstraksi bisfenol A
dari dalam botol dilakukan dengan cara ekstraksi menggunakan diklormetan dan
aseton. Ekstraksi ini dilakukan untuk mengurangi pengotor pada matrik.
Penelitian mengenai pengaruh sinar matahari ini belum pernah dilakukan
sebelumnya oleh karena itu perlu dilakukan optimasi dan validasi metode
penetapan kadar terlebih dahulu untuk memperoleh data yang dapat dipercaya.
Optimasi dilakukan dengan mencari kompos