Pengaruh Kofaktor Logam Ca dan Mg Terhadap Aktivitas Hyalurodidase Streptococcus agalactie

Oleh:

Wendry Setiyadi Putranto

FAKULTAS PETERNAKAN UNIVERSITAS PADJADJARAN

2006

2

Pengaruh Kofaktor Logam Ca dan Mg Terhadap Aktivitas Hyalurodidase Streptococcus agalactie

Oleh : Wendry Setiyadi Putranto, SPt.,MSi

Mengetahui:

Kepala Laboratorium Teknologi Pengolahan Produk Peternakan Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran

Dr. Ir.Kusmajadi Suradi,MS. NIP. 130780570

3

I. PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Hyaluronidase merupakan enzim ekstraselluler yang menghidrolisa asam

hyaluronat, yaitu semen jaringan yang merekatkan sel-sel hidup menjadi satu.

Hyaluronidase dihasilkan oleh kebanyakan streptokokus,dan merupakan faktor

virulensi bakteri tersebut untuk melakukan invasi. Streptokokus Grup B (SGB)

atau Streptococcus agalactie telah diketahui sebagai patogen penting pada

manusia, antara lain menyebabkan abortus, ketuban pecah sebelum waktu

(KPSW), bayi berat lahir rendah (BBLR),dan infeksi neonatal (pneumonia,

septikemia,dan meningitis.

Asam hyaluronat merupakan glycosaminoglycan yang penting untuk

merekatkan sel hidup menjadi satu. Asam tersebut tersusun atas 250 25.000

rantai (1-4) yang tersusun atas D glucoronic dengan N- acetyl- D- glukosamine. Karakter ionik dari asam hyaluronat adalah dapat mengikat kuat

beberapa kation seperti K+, Na+, dan Ca2+. Menggunakan X-ray dapat terlihat

struktur Ca2+ hyaluronat yang merupakan kumparan tunggal terdiri dari tiga

disakarida tiap satu putarannya. Asam hyaluronat dan beberapa

glycosaminoglycan yang lain (chondroitin 4- sulfate, chondroitin 6 sulfate,

drenatan sulfate, keratan sulfate, dan heparin) dapat dipotong oleh enzim

hyaluronidase pada rantai (1-4). Hyaluronidase merupakan enzim yang mampu menghidrolisa asam

hyaluronat menghasilkan 2-acetamido-2-deoxy-3-0- ( - D gluco 4

4

enepyranosyluronic acid) D glucose. Enzim tersebut diaktifkan oleh beberapa

kofaktor logam, sehingga peneliti merasa tertarik untuk mengkaji pengaruh

kofaktor Kalsium dan Magnesim terhadap aktivitasnya.

1.2. Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan melakukan pemurnian dan mempelajari

karakterisasi biokimia dari hyaluronidase yang dihasilkan oleh Streptokokus

Grup B (SGB) yaitu tentang pengaruh kofaktor Kalsium dan Magnesium.

1.3. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Hewan dan

Biomedis PAU Bioteknologi IPB, Laboratorium Immunologi dan Produksi Bahan

Hayati, FKH IPB, dan Laboratorium Terpadu FKH IPB.

II. BAHAN DAN METODA

3.1. Test Agar Hyaluronidase (Christ,1989)

Uji ini bertujuan untuk menentukan isolat yang menghasilkan

hyaluronidase. Media tumbuh adalah terdiri dari 100 ml BHI ditambahkan 1 g

Nobel Agar, kemudian disteril dengan autoklaf. Selanjutnya ditambahkan 50 mg

asam hyaluronat dalam 25 ml akuades dan 1,25 g BSA, dituangkan dalam cawan.

Inkubasi selama 24 jam, 37 oC. Selanjutnya SGB diinokulasikan dalam media

tersebut dan diinkubasi selama 24 jam suhu 37 oC. Empat isolat SGB yang

digunakan merupakan koleksi dari Ibu dr.Zainatul Hayati,M.Kes.,Sp.MK.,

kemudian dilakukan penggenangan dengan asetat 2 M sebanyak 5 ml dan terlihat

zona bening disekitar koloni SGB (zona bening mengindikasikan isolat SGB

tersebut mengekskresikan hyaluronidase).

3.2. Isolasi Hyaluronidase pada Supernatan

Setelah diperoleh isolat SGB yang menghasilkan hyaluronidase maka

bakteri ditumbuhkan pada 50 ml THB , diinkubasi pada suhu 37 oC, selama

kurang lebih 5 jam (nilai absorbansi 0,8 pada 650 nm). Selanjutnya

diinokulasikan kembali dalam 500 ml THB (mengandung 0,2% asam hyaluronat),

dan diinkubasi semalam pada suhu 37 oC. Untuk mengamati pertumbuhan

Streptokokus Grup B, dilakukan pengamatan dengan melihat nilai optical density

( 650 nm) selama masa inkubasi. Dilakukan pengujian pula terhadap aktivitas

6

hyaluronidase dan kadar protein (Bradford 1976), sehingga berdasarkan data

tersebut dapat kita tentukan waktu produksi hyaluronidase dari SGB, sebagai

patokan untuk produksi selanjutnya.

Hyaluronidase diperoleh dengan memisahkan enzim dengan sel bakteri

SGB tersebut menggunakan sentrifugasi 4000 rpm, selama 15 menit , suhu 4 oC.

Supernatan merupakan enzim kasar hyaluronidase. Selanjutnya dilakukan

pengujian aktivitas hyaluronidase dan penentuan kadar protein enzim (Bradford,

1976).

3.3. Pengendapan dengan Amonium Sulfat

Pengendapan protein dengan amonium sulfat dilakukan dengan metoda

Scope (1982). Sebanyak 10 ml supernatan enzim ditambahkan amonium sulfat

dengan berbagai kadar berdasarkan kejenuhan (40%, 45%, 55%, 65%, 75%, 85%)

untuk mendapatkan kadar amonium sulfat yang optimum. Penambahan amonium

sulfat dilakukan sedikit demi sedikit dengan magnetic stirer pada suhu dingin.

Setelah semua amonium sulfat larut, didiamkan semalam pada suhu 4 oC.

Endapan yang terbentuk dipisahkan dari supernatan dengan sentrifius 4000 rpm,

15 menit, 4 oC. Endapan ditambahkan bufer pospat pH 6,4 satu kali volume.

Selanjutnya dilakukan pengujian aktivitas hyaluronidase dan kadar proteinnya.

Pengandapan amonium sulfat yang menghasilkan aktivitas tertinggi pada endapan

dan aktivitas yang rendah pada supernatan digunakan sebagai patokan untuk

pengendapan selanjutnya.

7

3.4. Pengukuran Konsentrasi Protein (Bradford, 1976)

Konsentrasi protein diukur dengan menggunakan standar protein Bovine

Serum Albumin (BSA) dengan konsentrasi 0,1 hingga 1 mg/ml. Setiap 100 l

konsentrasi BSA ditempatkan pada tabung reaksi dan ditambahkan 5 ml pereaksi

Bradford dan diinkubasi selama 5 menit, suhu 37 oC, kemudian diukur

absorbansinya pada 595 nm. Sehingga didapat kurva standar yang merupakan

persamaan garis regresi ( y = ax + b, dengan nilai r mendekati satu ) antara nilai

absorbansi sebagai ordinat dan konsentrasi protein BSA sebagai absis.

Dengan metoda yang sama untuk sampel hyaluronidase, yaitu sebanyak

100 l hyaluronidase ditambahkan 5 ml pereaksi Bradford dan diinkubasi 37 oC, 5

menit, dan dilihat nilai absorbansinya pada 595 nm. Selanjutnya untuk

mendapatkan kadar protein hyaluronidase tersebut, dengan memasukkan nilai

absorbansi tersebut ke dalam persamaan daris yang telah dibuat.

3.5. Pengukuran Aktivitas Hyaluronidase (Bergmeyer, 1987)

Aktivitas hyaluronidase diukur berdasarkan jumlah 2-acetamido-2-deoxy-

3-0- ( - D gluco 4 enepyranosyluronic acid) D glucose dari asam hyaluronat.

Bahan yang diperlukan:

1. Bufer phospat (67 mmol/liter, pH 6,4), pembuatannya dengan melarutkan

66 ml Na2HPO4 2H2O (11,876 g/liter) dengan KH2PO4 (9,078g/liter)

dalam volume 250 ml.

8

2. Sodium Chloride (0,15 mol/liter) dengan melarutkan 0,877 g NaCl dengan

100 ml air.

3. Perhloric acid (20%w/v) dengan melarutkan 13 ml HclO4 (70% w/v)

dengan 75 ml air.

4. Hyaluronate lyase standar ( 1 mg protein/ml; 100 U/litter) 7 mg enzim

dalam 7 ml larutan NaCl.

5. Asam hyaluronate 200 mg dalam 1000 ml bufer posat.

Tabel.1. Prosedur pengujian aktivitas hyaluronidase (Bergmeyer,1987) Larutan Sampel Standar Konsentrasi

Buffer phospat

Asam hyaluronat

Larutan NaCL

1ml

0,5 ml

0,5 ml

1,5 ml

0,5 ml

1 ml

37 mmol/liter

27,8 mg/liter

45,8 mmol/liter

Inkubasi pada 70 oC, selama 10 menit

Hyaluronidase 0,1 ml 0,1 ml 3 U/liter

Inkubasi pada 37 oC, selama 6 jam

Perkhlorit acid 0,5 ml 0,5 ml

Sentrifugasi 5000 g, selama 20 menit, selanjutnya dilihat absorbansinya pada 232 nm. Absorbansi sampel (A1) dan absorbansi standar (A2)

Aktivitas (U/ml) = A1 / A2 x 0,003 U/ml

3.6. Pengaruh Kation Ca 2+ dan Mg2+

Pengaruh kation Ca2+(CaCl2) dan Mg2+(MgCl2) masing-masing 1 dan 5

mM dalam campuran raksi, selanjutnya diukur pada pH dan suhu optimum.

III. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Pengaruh Kofaktor Logam Ca dan Mg

Merupakan salah satu sifat khas dari enzim yaitu membutuhkan tambahan

komponen kimia untuk aktivitasnya. Senyawa tersebut disebut kofaktor

(merupakan senyawa anorganik) atau koenzim (merupakan suatu molekul

organik). Dalam penelitian ini digunakan dua kofaktor logam (Ca2+ dan

Mg2+).Ion kalsium terletak dipermukaan enzim dan memiliki fungsi untuk

mempertahankan kestabilan panas enzim (Dahiquist,et al. 1976). Berdasarkan

data yang diperoleh menunjukkan bahwa hyaluronidase diaktifkan oleh kofaktor

Ca2+ dan Mg2+.

0.0075 0.008 0.012

0.0782

0.10020.1162

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0 1 5Konsentrasi Ca (mM)

Akt

ivita

s hy

alu

ron

idas

e (U

/ml)

Aktivitas hyaluronidase pada supernatan (U/ml)Aktivitas hyaluronidase hasil pengendapan amoinum sulfat 45% (U/ml)

Gambar 1. Pengaruh kofaktor Ca2+ terhadap aktivitas hyaluronidase

10

0.009 0.013

0.07820.086

0.122

0.0075

0

0.020.04

0.06

0.08

0.10.12

0.14

0 1 5Konsentrasi Mg (mM)

Akt

ivita

s hy

alu

ron

idas

e (U

/ml)

Aktivitas hyaluronidase pada supernatan (U/ml)Aktivitas hyaluronidase hasil pengendapan amoinum sulfat 45%(U/ml)

Gambar.2. Pengaruh kofaktor Mg2+ terhadap aktivitas hyaluronidase

IV. KESIMPULAN

Hyaluronidase dari Streptokokus Grup B (SGB) merupakan enzim

ekstraseluler diaktifkan oleh kofaktor logam (Ca2+ dan Mg2+). Berdasarkan hasil

karakterisasi dapat memberikan informasi untuk penelitian lebih jauh dalam

bidang kesehatan.

DAFTAR PUSTAKA

Bradford,MM.1976. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantitaties of protein in utilizing the principle of protein-dye binding.Anal.Biochem.72:248-254.

Bergmeyer,H.U.1987.Method of Enzymatic Analysis. VCH.Vol.IV:45-49.

Christ.D.1989,Untersuchungen an Streptococcus uberis unter besonder Berucksichtigung mutmaBlicher pathogenitatsfatoren. Aus der professur fur Bakteriologie und immunologie der Justus-Universitat GiBen.33-34.

Dahlquist FW,Long JW, Bigbec WL.1976. Role of Calcium in The Thermal Stability of Thermolysin.Biochemistry 15:1103-1111.

Hynes.W.L.,Dixon.A.R, Walton S.R. Aridgides.L.J .2000.The Extracellular hyaluronidase gene (hyl A) of Streptococcus pyogenes. FEMS Microbiology Letter 184.109-112.

Scopes RK.1987. Protein Purification Principles and Practice. Edisi ke-2. New York: SpringerVerlag.

13