![Page 1: Isolasi dan Pemurnian Protein - Universitas Brawijayaasep.lecture.ub.ac.id/files/2011/12/Isolasi-protein.pdf · 2011. 12. 23. · Pemisahan protein (molekul bermuatan berdasarkan](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022052409/609a4609b36a753e2a7a1c22/html5/thumbnails/1.jpg)
Isolasi dan
Pemurnian Protein
![Page 2: Isolasi dan Pemurnian Protein - Universitas Brawijayaasep.lecture.ub.ac.id/files/2011/12/Isolasi-protein.pdf · 2011. 12. 23. · Pemisahan protein (molekul bermuatan berdasarkan](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022052409/609a4609b36a753e2a7a1c22/html5/thumbnails/2.jpg)
Tujuan
Mempelajari fungsi enzim/protein
Menentukan urutan asam amino
Mempelajari struktur
![Page 3: Isolasi dan Pemurnian Protein - Universitas Brawijayaasep.lecture.ub.ac.id/files/2011/12/Isolasi-protein.pdf · 2011. 12. 23. · Pemisahan protein (molekul bermuatan berdasarkan](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022052409/609a4609b36a753e2a7a1c22/html5/thumbnails/3.jpg)
Sel mengandung ribuan protein
Prosedur pemurnian harus membedakan
protein yang diinginkan dari protein yang
lain
Sifat protein merupakan kunci dalam
merancang protokol pemurnian
![Page 4: Isolasi dan Pemurnian Protein - Universitas Brawijayaasep.lecture.ub.ac.id/files/2011/12/Isolasi-protein.pdf · 2011. 12. 23. · Pemisahan protein (molekul bermuatan berdasarkan](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022052409/609a4609b36a753e2a7a1c22/html5/thumbnails/4.jpg)
Sifat Protein
Muatan disebabkan oleh rantai samping
COO- dan NH3+
Berat molekul protein bervariasi
Titik isoelektrik, pI, pH ketika muatan
total protein nol
Jika protein dengan pI tertentu berada
dalam larutan dengan pH tertentu, maka
pH < pI < pHNet+ Net-
![Page 5: Isolasi dan Pemurnian Protein - Universitas Brawijayaasep.lecture.ub.ac.id/files/2011/12/Isolasi-protein.pdf · 2011. 12. 23. · Pemisahan protein (molekul bermuatan berdasarkan](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022052409/609a4609b36a753e2a7a1c22/html5/thumbnails/5.jpg)
Prosedur pemurnian protein dapat dilakukan
karena adanya variasi:
Kelarutan, ukuran, muatan, binding
specificity (affinity),sifat hidrofobik/hidrofilik
![Page 6: Isolasi dan Pemurnian Protein - Universitas Brawijayaasep.lecture.ub.ac.id/files/2011/12/Isolasi-protein.pdf · 2011. 12. 23. · Pemisahan protein (molekul bermuatan berdasarkan](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022052409/609a4609b36a753e2a7a1c22/html5/thumbnails/6.jpg)
Sel
LisisOsmosisFreeze/ThawFrench pressGrinding glass beadsSonication (bakteri)
Sentrifugasi
Pelet Supernatan
Debris selProtein terlarut
Isolasi Protein
![Page 7: Isolasi dan Pemurnian Protein - Universitas Brawijayaasep.lecture.ub.ac.id/files/2011/12/Isolasi-protein.pdf · 2011. 12. 23. · Pemisahan protein (molekul bermuatan berdasarkan](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022052409/609a4609b36a753e2a7a1c22/html5/thumbnails/7.jpg)
Nama Jenis Inhibitor Target Protease
PMSF
(Phenylmethylsulfonyl fluoride)
Ireversibel Ser (+Cys) protease: terikat
pada pusat aktif Ser/Cys
Benzamidine Reversibel Ser dan Cys protease: inhibitor
kompetitif
EDTA Reversibel Metalo enzim: chelate metals
Pestatin (pentapeptida + gugus
organik)
Reversibel Asp’acidic’ protease: inhibitor
kompetitif (target: pepsin, HIV
protease)
Aprotinin (58-mer peptida) Reversibel Serin protease, esterase:
inhibitor kompetitif (target:
tripsin, kimotripsin, plasmin)
Leupeptin (Ac-leu-leu-Arg) Reversibel Ser dan Cys protease: inhibitor
kompetitif
Inhibitor Protease: inaktivasi protease yang
dibebaskan selama lisis sel
![Page 8: Isolasi dan Pemurnian Protein - Universitas Brawijayaasep.lecture.ub.ac.id/files/2011/12/Isolasi-protein.pdf · 2011. 12. 23. · Pemisahan protein (molekul bermuatan berdasarkan](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022052409/609a4609b36a753e2a7a1c22/html5/thumbnails/8.jpg)
Stabilisasi: Ketika berada diluar lingkungan aslinya
(native), protein menjadi kurang stabil. Meskipun
organisme hidup pada temperatur 37oC, pemurnian
dilakukan pada temperatur 4oC
![Page 9: Isolasi dan Pemurnian Protein - Universitas Brawijayaasep.lecture.ub.ac.id/files/2011/12/Isolasi-protein.pdf · 2011. 12. 23. · Pemisahan protein (molekul bermuatan berdasarkan](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022052409/609a4609b36a753e2a7a1c22/html5/thumbnails/9.jpg)
Solubility (Salting Out)
Garam berkompetisi
dengan air
Protein mengalami
agregasi melalui interaksi
van der Waals dan
hidrofobik dan
mengendap dalam
bentuk native
1-4 M (NH4)2SO4
![Page 10: Isolasi dan Pemurnian Protein - Universitas Brawijayaasep.lecture.ub.ac.id/files/2011/12/Isolasi-protein.pdf · 2011. 12. 23. · Pemisahan protein (molekul bermuatan berdasarkan](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022052409/609a4609b36a753e2a7a1c22/html5/thumbnails/10.jpg)
Strategi Pemurnian
Muatan: Kromatografi Penukar Ion
Kepolaran: Kromatografi Interaksi
Hidrofobik
Ukuran: Dialisis, Ultrafiltrasi, Gel
elektroforesis, Kromatografi Filtrasi Gel,
Ultrasentrifugasi
Spesifisitas: Kromatografi afinitas
![Page 11: Isolasi dan Pemurnian Protein - Universitas Brawijayaasep.lecture.ub.ac.id/files/2011/12/Isolasi-protein.pdf · 2011. 12. 23. · Pemisahan protein (molekul bermuatan berdasarkan](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022052409/609a4609b36a753e2a7a1c22/html5/thumbnails/11.jpg)
Ion-exchange Chromatography (IEX)
Cation exchangers
contain negatively
charged polymer
Anion exchangers
contain positively
charged polymer.
Is effected by pH
![Page 12: Isolasi dan Pemurnian Protein - Universitas Brawijayaasep.lecture.ub.ac.id/files/2011/12/Isolasi-protein.pdf · 2011. 12. 23. · Pemisahan protein (molekul bermuatan berdasarkan](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022052409/609a4609b36a753e2a7a1c22/html5/thumbnails/12.jpg)
Gel Filtration/Size Exclusion
Chromatography
![Page 13: Isolasi dan Pemurnian Protein - Universitas Brawijayaasep.lecture.ub.ac.id/files/2011/12/Isolasi-protein.pdf · 2011. 12. 23. · Pemisahan protein (molekul bermuatan berdasarkan](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022052409/609a4609b36a753e2a7a1c22/html5/thumbnails/13.jpg)
Kromatografi Interaksi
Hidrofobik Protein mempunyai ‘daerah’
hidrofobik dipermukaan yang dapat berinteraksi dengan resin
Resin yang mengandung gugus fenil atau alifatik mengikat protein: protein yang paling hidrofobik akan terikat paling kuat
Elusi dilakukan dengan pelarut yang kurang polar atau dengan menurunkan [garam]
![Page 14: Isolasi dan Pemurnian Protein - Universitas Brawijayaasep.lecture.ub.ac.id/files/2011/12/Isolasi-protein.pdf · 2011. 12. 23. · Pemisahan protein (molekul bermuatan berdasarkan](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022052409/609a4609b36a753e2a7a1c22/html5/thumbnails/14.jpg)
![Page 15: Isolasi dan Pemurnian Protein - Universitas Brawijayaasep.lecture.ub.ac.id/files/2011/12/Isolasi-protein.pdf · 2011. 12. 23. · Pemisahan protein (molekul bermuatan berdasarkan](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022052409/609a4609b36a753e2a7a1c22/html5/thumbnails/15.jpg)
![Page 16: Isolasi dan Pemurnian Protein - Universitas Brawijayaasep.lecture.ub.ac.id/files/2011/12/Isolasi-protein.pdf · 2011. 12. 23. · Pemisahan protein (molekul bermuatan berdasarkan](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022052409/609a4609b36a753e2a7a1c22/html5/thumbnails/16.jpg)
![Page 17: Isolasi dan Pemurnian Protein - Universitas Brawijayaasep.lecture.ub.ac.id/files/2011/12/Isolasi-protein.pdf · 2011. 12. 23. · Pemisahan protein (molekul bermuatan berdasarkan](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022052409/609a4609b36a753e2a7a1c22/html5/thumbnails/17.jpg)
Schematic of HisLink and His-tag Interaction
Two site are available for His-tag binding are rapidly coordinatedwith histidine in the presence of a His-tagged polypeptide
![Page 18: Isolasi dan Pemurnian Protein - Universitas Brawijayaasep.lecture.ub.ac.id/files/2011/12/Isolasi-protein.pdf · 2011. 12. 23. · Pemisahan protein (molekul bermuatan berdasarkan](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022052409/609a4609b36a753e2a7a1c22/html5/thumbnails/18.jpg)
![Page 19: Isolasi dan Pemurnian Protein - Universitas Brawijayaasep.lecture.ub.ac.id/files/2011/12/Isolasi-protein.pdf · 2011. 12. 23. · Pemisahan protein (molekul bermuatan berdasarkan](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022052409/609a4609b36a753e2a7a1c22/html5/thumbnails/19.jpg)
![Page 20: Isolasi dan Pemurnian Protein - Universitas Brawijayaasep.lecture.ub.ac.id/files/2011/12/Isolasi-protein.pdf · 2011. 12. 23. · Pemisahan protein (molekul bermuatan berdasarkan](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022052409/609a4609b36a753e2a7a1c22/html5/thumbnails/20.jpg)
Aktivitas Vs. Aktivitas Spesifik
![Page 21: Isolasi dan Pemurnian Protein - Universitas Brawijayaasep.lecture.ub.ac.id/files/2011/12/Isolasi-protein.pdf · 2011. 12. 23. · Pemisahan protein (molekul bermuatan berdasarkan](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022052409/609a4609b36a753e2a7a1c22/html5/thumbnails/21.jpg)
Elektroforesis SDS-PAGE
Pemisahan protein
(molekul bermuatan
berdasarkan ukuran
dalam medan listrik
Protein didenaturasi
dengan detergen anion
![Page 22: Isolasi dan Pemurnian Protein - Universitas Brawijayaasep.lecture.ub.ac.id/files/2011/12/Isolasi-protein.pdf · 2011. 12. 23. · Pemisahan protein (molekul bermuatan berdasarkan](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022052409/609a4609b36a753e2a7a1c22/html5/thumbnails/22.jpg)
Penentuan Massa Molekul Protein
![Page 23: Isolasi dan Pemurnian Protein - Universitas Brawijayaasep.lecture.ub.ac.id/files/2011/12/Isolasi-protein.pdf · 2011. 12. 23. · Pemisahan protein (molekul bermuatan berdasarkan](https://reader033.vdokumen.com/reader033/viewer/2022052409/609a4609b36a753e2a7a1c22/html5/thumbnails/23.jpg)
Analisa Tingkat Kemurnian dengan
SDS-PAGE
1. Ekstrak kasar2. Pengendapan dengan garam3. Kromatografi penukar ion 4. Kromatografi filtrasi gel5. Kromatografi afinitas
10μg protein/lajur