saintek.uin-malang.ac.idsaintek.uin-malang.ac.id/wp-content/uploads/2017/02/... · web viewuji...
TRANSCRIPT
PETUNJUK PRAKTIKUMBIOKIMIA II
Oleh :Tim Biokimia
LABORATORIUM BIOKIMIAJURUSAN KIMIA
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGIUNIVERSITAS ISLAM MAULANA MALIK IBRAHIM MALANG
2017
KATA PENGANTAR
Alhamdulillah, segala puji bagi Allah SWT. yang telah melimpahkan rahmat,
taufiq dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penyusunan Diktat
petunjuk Praktikum Biokimia. Diktat ini disusun untuk mempermudah proses
penyelenggaraan kegiatan Praktikum Biokimia II. Tujuan umum dari praktikum ini adalah
untuk memberikan bekal kemampuan bagi mahasiswa dalam rangka persiapan
pelaksanaan penelitian tugas akhir. Sedangkan tujuan khusus adalah pengaplikasian
teori biokimia yang sudah diperoleh mahasiswa di bangku kuliah.
Laboratorium Biokimia berusaha untuk mengatasi segala kesulitan yang
dihadapi pada saat persiapan dan pelaksanaan Praktikum biokimia. Persiapan ini
meliputi pembekalan atau breafing asisten dan praktikan. Diktat petunjuk praktikum ini
masih terdapat kekurangan di sana sini, untuk itu kritik dan saran yang bersifat
konstruktif selalu kami harapkan demi lebih sempurnanya diktat petunjuk praktikum
selanjutnya. Akhir kata, kami mengucapkan selamat bekerja dan mencoba. Semoga
diktat ini dapat memberikan manfaat bagi kita semua, Amin.
Malang, Februari 2017
Penulis
2
DAFTAR ISI
Kata Pengantar................................................................................................3
Daftar Isi........................................................................................................ ...4
Percobaan 1 Uji Aktivitas Enzim Amilase.......................................................5
Percobaan 2 Uji Aktivitas Enzim Proteolitik....................................................9
Percobaan 3 Uji Aktivitas Enzim Lipase.......................................................10
Percobaan 4 Uji Aktivitas Enzim Katalase....................................................16
Percobaan 5 Elektroforesis SDS PAGE.......................................................20
Percobaan 6 Uji Amilase dalam air Liur...................................................... 25
Percobaan 7 Pemeriksaan Glukosa dan Protein pada Urine ….…………. .28
Lampiran........................................................................................................ 32
3
PERCOBAAN IUJI AKTIVITAS ENZIM AMILASE
A. Tujuan PercobaanPercobaan ini bertujuan untuk melakukan deteksi bakteri penghasil amilase secara
kualitatif dan menguji aktivitas enzimnya.
B. Dasar Teori Amilase merupakan enzim pendegradasi pati. Enzim ini mendegradasi dengan
cara memutuskan ikatan glikosidik pada pati. Produk yang dihasilkan dapat berupa
oligosakarida rantai pendek, glukosa, maltose dan maltriosa. Amilase banyak terdapat
pada mikroorganisme, tanaman dan hewan. Enzim ini dapat dengan mudah diisolasi dari
bakteri seperti Bacillus subtilis dan jamur seperti Aspergillus oryzae. Amilase adalah
kompleks enzim yang terdiri dari tiga jenis enzim yaitu α-amilase, β-amilase, dan
glukoamilase.
Aktivitas amilase dapat ditentukan baik secara kualitatif dan kuantitatif. Analisis
amilase secara kualitatif dapat dilakukan dengan penambahan larutan iodin. Sedangkan
analisis secara kuantitatif dilakukan dengan metode dinitrosalisilat (DNS). Metode ini
didasarkan pada kemampuan enzim menghidrolisis substrat (polisakarida) menjadi
monosakarida dalam bentuk gula reduksi. Adanya aktivitas amilase ditunjukkan dengan
interaksi produk (gula reduksi) dan DNS untuk menghasilkan warna oranye hingga merah
kecoklatan. Satu unit enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan 1 μmoL
produk (gula reduksi) per menit. Sebagaimana sifat enzim pada umumnya, akivitas enzim
amilase dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain konsentrasi substrat, pH, suhu, dan
kofaktor.
4
C. Alat dan Bahan Alat
Gelas beker Erlenmeyer Tabung reaksi Pipet tetes Cawan petri Shaker incubator Pipet ukur Spektrofotometer Bola hisap Neraca analitik
Bahan Larutan iodin Larutan bufer pH 4, 5 dan 6 Kapas Reagen DNS (asam 3,5-dinitrosalisilat) Media starch agar KNa-Tatrat 40% Pati terlarut 1% Akuades Media cair
D. Cara Kerja
1. Deteksi produksi amilase secara kualitatifIsolat bakteri digoreskan pada media starch agar yang telah ditentukan dan
diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam. Larutan iodin ditambahkan pada koloni
bakteri. Koloni yang mampu menghasilkan amilase akan membentuk zona bening di
sekitar biakan. Amati perubahan warna yang terjadi.
2. Ekstraksi enzim amilaseBakteri diambil sebanyak 1 ose dan masukkan ke dalam 25 mL media cair. Kultur
bakteri diinkubasi pada shaker incubator selama 18 jam pada suhu 37 °C. Kultur
disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 10 menit. Filtrat yang diperoleh
merupakan ekstrak kasar amilase.
3. Uji aktivitas amilase
5
Penentuan aktivitas amilase dilakukan secara kuantitatif dengan metode DNS.
Filtrat sebanyak 1 mL dimasukkan dalam tabung reaksi. Kemudian, ditambahkan 1 mL
pati terlarut (telah dilarutkan dalam pH 4, 5, 6). Mulut tabung ditutup dengan aluminium
foil. Tabung reaksi diinkubasi pada suhu 37 °C selama 30 menit. Setelah itu, tambahkan
1 mL DNS dan kocok menggunakan vortex. Tabung reaksi dipanaskan dalam air
mendidih selama 15 menit hingga larutan berwarna merah kecoklatan. Selanjutnya,
ditambahkan 1 mL larutan KNa-Tatrat 40%. Tabung reaksi didinginkan, ditambahkan
aquades hingga volumenya menjadi 10 mL dan dihomogenkan. Larutan sampel diukur
absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm.
Aktivitas enzim amilse dapat dihitung menggunakan rumus berikut.
Dimana, AE adalah aktivitas enzim (U/mL), C adalah konsentrasi glukosa, BM adalah
berat molekul glukosa, 180 gr/mol, t adalah waktu inkubasi (menit), H adalah volume total
enzim substrat (mL), dan E adalah volume enzim (mL).
4. Pembuatan Kurva Standar Glukosa Larutan glukosa dibuat dengan berbagai konsentrasi yaitu 0, 200, 400, 600, 800
dan 1000 ppm. Diambil 1 mL larutan glukosa dengan berbagai konsentrasi dan
masukkan dalam tabung reaksi. Kemudian, ditambahkan 1 mL DNS dan dihomogenkan.
Mulut tabung reaksi ditutup dengan aluminium foil dan dipanaskan dalam dari mendidih
selam 15 menit hingga larutan berwarna merah kecoklatan. Setelah itu, tambahkan 1 mL
KNa-Tatrat 40%. Tabung reaksi didinginkan, ditambah akuades hingga volumenya
menjadi 10 mL dan dihomogenkan. Larutan sampel diukur absorbansinya pada panjang
gelombang 540 nm menggunakan spektofotometer.
Daftar Pustaka6
Aiyer, P.V. (2005): Amylases and Their Applications, Afr. J. Biotechnol., 4, 1525-1529.
Miller, G. L. (1959): Use of Dinitrosalicyclic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar, Anal. Chem., 31, 426-428.
Sauza, P.M., dan Magalhaes, P.O. (2010): Application of Microbal α-Amylase in Industry– A Review, Brazilian J. Microbiol., 41, 850-861.
7
PERCOBAAN IIUJI AKTIVITAS ENZIM PROTEOLITIK
A. Tujuan PercobaanPercobaan ini bertujuan untuk menentukan aktivitas enzim proteolitik (papain).
B. Dasar teoriEnzim proteolitik merupakan kelompok enzim yang memiliki kemampuan untuk
menghidrolisis ikatan peptida. Enzim ini juga disebut sebagai peptidase, protease atau
proteinase. Protease terdapat pada semua makhluk hidup seperti manusia, hewan,
tanaman, dan mikroba (bakteri, jamur dan virus). Berdasarkan mekanisme kerjanya,
protease dapat dibagi menjadi exopeptidase dan endopeptidase. Exopeptidase
mengkatalisis proses hidrolisis ikatan peptide pada ujung rantai, sedangkan
endopeptidase menghidrolisis ikatan peptide pada tengah rantai.
Gambar 1 Hidrolisis enzim endopeptidase
Papain adalah salah satu enzim protease yang berperan aktif dalam proses hidrolisis
ikatan peptida. Enzim ini banyak ditemukan pada seluruh bagian pohon pepaya yang
meliputi daun, buah, getah dan akarnya. Papain merupakan enzim sederhana yang
terdiri dari 212 asam amino dengan 4 ikatan disulfide. Papain banyak digunakan
diberbagai bidang industri terutama industri farmasi.
C. Alat dan Bahan Alat
8
Waterbath Gelas beker 250 mL Buret Pipet volume 10 mL Neraca analitik Pengaduk Erlenmeyer Pipet tetes Gelas ukur 50 ml Blender Corong Penyangga + statif Bola hisap Neraca analitik
Bahan Buah pepaya muda Akuades Susu skim 5% Indikator pp Formaldehida NaOH 0,1 N Kertas saring
D. Cara Kerja1. Ekstraksi enzim papain
Lima puluh gram buah pepaya dipotong kecil-kecil ditambahkan 100 mL akuades.
Setelah itu, dihaluskan menggunakan blender dan diambil filtratnya. Filtrat yang diperoleh
merupakan ekstrak kasar enzim papain. Filtrat dibuat tiga konsentrasi yang berbeda yaitu
20%. 30% dan 40%.
2. Uji Aktivias Enzim PapainSusu skim 5% dimasukkan ke dalam empat erlenmeyer (E1, E2, E3 dan E4) yang
masing-masing berisi 40 mL larutan. Kemudian, tiga buah erlenmeyer (E1, E2, E3)
dimasukkan dalam waterbath pada suhu 37 °C selama 10 menit, sedangkan erlenmeyer
sisa (E4) dibiarkan pada suhu ruang. Ketiga erlenmeyer (E1, E2 dan E3) masing-masing
ditambahkan 10 mL ekstrak kasar enzim papain, sedangkan erlenmeyer sisa (E4)
ditambahkan 10 mL akuades. Semua erlenmeyer diinkubasi pada suhu 37 C selama 1
jam dan ditambah 2 mL formaldehida. Kemudian, ditambahkan 3 tetes indikator pp dan
dititrasi menggunakan NaOH 0,1 N.
Aktivitas enzim dapat ditentukan menggunakan persamaan berikut.
9
Dimana, ts adalah titrasi sampel, tb = titrasi blanko (E4), berat sampel adalah berat susu
skim dalam gram, Fp adalah faktor pengenceran.
Daftar PustakaAmri, E., dan Mamboya, F. (2012): Papain, a Plant Enzyme of Biological Importance: A Review, American Journal of Biochemistry and Biotechnology, 8(2), 99-104.
Hitesh, P., Manjobhai, B., Mayuri, B., Ashvinkumar, D., dan kiraben, D. (2012): Extraction and Application of Papain Enzyme on Degradation of Drug, Research Article Pharmaceutical Sciences, 2(3), 113-115.
Jisha, N.V., Smitha, R.B., Pradep, S., Sreedevi, S., Unni, K.N., Sajith, S., Priji, P., Josh, M.S., dan Benjamin, S. (2013): Versatility of Microbial Proteases, Advances in Enzyme Research, 1 (3), 39-51.
Macalood, J.S., Vicente, H.J., Boniao, R.D., Gorospe, J.G., dan Roa, E.C. (2013): Chemical Analysis of Carica papaya L. Crude Latex. American Journal of Plant Science, 4, 1941-1948.
Motyan, J.A., Toth, F., dan Tozser, J. (2013) Research Applications of Proteolytic Enzymes in Molecular Biology, Biomolecules, 3, 923-942.
10
PERCOBAAN IIIUJI AKTIVITAS ENZIM LIPASE
A. Tujuan percobaanPercobaan ini bertujuan untuk menentukan aktivitas lipase dari dedak padi dan kacang
tanah.
B. Dasar teoriLipase (triacylglycerol acylhydrolase) termasuk dalam keluarga hydrolase. Lipase
mengkatalisis hidrolisis trigliserida menjadi gliserol dan asam lemak bebas. Produk hasil
hidrolisis yang lain adalah monogliserida dan digliserida. Enzim ini larut dalam air dan
menghidrolisis substrat yang tidak larut menjadi produk yang lebih polar. Enzim lipase
diproduksi oleh tanaman, hewan dan mikroorganisme. Lipase banyak diaplikasikan di
berbagai bidang industri, seperti industri makanan, deterjen, kertas, dan kosmetik. Reaksi
hidrolisis trigliserida oleh lipase adalah sebagai berikut.
Penelitian lipases telah banyak dilakukan dari berbagai sumber. Beberapa sumber
lipase diantaranya dedak padi dan kacang tanah. Lipase dari kacang tanah banyak
tersimpan dalam biji selama masa perkecambahan, sedangkan lipase pada padi banyak
terdistribusi pada kulit padi (dedak).
C. Alat dan Bahan
11
Alat Corong Pipet volume 10 mL Magnetik stirer Bola hisap Sentrifugasi Gelas ukur 50 ml Mortar Gelas beker 250 ml Waterbath Buret Erlenmeyer 100 mL Pengaduk Neraca analitik Pipet tetes Inkubator Shaker incubator
Bahan Dedak padi Akuades Kacang tanah Etano Susu sapi segar Indikator pp Petroleum eter NaOH 0,1 N Bufer fosfat 50 mM pH 7 Kertas saring Bufer fosfat 50 mM pH 6,5
D. Cara Kerja 1. Ekstraksi enzim lipase dari dedak padi
Sebanyak 5 gr dedak padi ditambah 25 mL petroleum eter dan diaduk-aduk untuk
melarutkan lemak. Saring campuran tersebut dan ambil bagian ampasnya. Ampas yang
diperoleh ditambah dengan 20 mL bufer fosfat 50 mM pH 7. Campuran tersebut dishaker selama 30 menit. Selanjutnya, disaring campuran tersebut dan disentrifugasi pada
kecepatan 5000 rpm selama 5 menit. Supernatan yang diperoleh merupakan ekstrak
kasar enzim lipase.
2. Ekstraksi enzim lipase dari kacang tanahKacang tanah sebanyak 2,5 gram dihaluskan menggunakan mortar. Kemudian,
ditambahkan dengan 25 mL petroleum eter sambil diaduk-aduk. Campuran tersebut
disaring dan diambil bagian residu (ampas). Residu ditambahkan 25 mL bufer fosfat 0,1
M pH 6,5. Campuran tersebut diaduk menggunakan shaker selama 10 menit, disaring
12
dan disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 5000 rpm. Filtrat yang diperoleh
merupakan ekstrak kasar enzim lipase.
3. Uji aktivitas enzim lipaseSusu sapi segar dipanaskan suhu 100 oC selama 10 menit. Susu hasil pemanasan
diambil sebanyak 4 mL dan dimasukkan dalam erlenmeyer dan diseimbangkan suhu air
dalam waterbath 37 oC. Sampel ditambahkan 1 mL ekstrak kasar enzim dan diinkubasi
pada suhu 37 oC selama 30 menit. Setelah itu, ditambahkan 20 mL etanol.
Blanko dibuat dengan mengambil 4 mL susu hasil pemanasan ditambah 2 mL
bufer fosfat (pH disesuaikan dengan sampel). Setelah itu, ditambah 20 mL etanol tanpa
dilakukan proses inkubasi. Masing-masing sampel dan blanko ditambah 2 tetes indikator
pp dan dititrasi menggunakan NaOH 0,1 N hingga berubah warna menjadi merah muda.
Aktivitas enzim dinyatakan dalam µmoL/menit mL enzim atau Unit/mL. Adapun
penentuan aktivitas enzim dilakukan menggunakan persamaan berikut.
Dimana, ts adalah volume titrasi sample, tb adalah volume titrasi blanko, t adalah waktu
inkubasi (menit). Angka 1000 merupakan hasil dari konversi 1 mmol menjadi 1000 μmol.
Daftar Pustaka
13
Bhardwaj, K., Raju, A., dasn Rajaseharan, R. (2001): Identifikasi, purification, and characterization of a thermally stable lipase from Rice bran. A New member of the (Phospho) Lipase Family, Plant Physiology, 127, 1728-1738.
Huang, A.H., dan Moreau, R.A. (1978): Lipases in the storage tissues of peanut and other oil seeds during germination, Planta, 141(1), 111-116.
Lason, E., dan Ogonowski, J. (2010): Lipase - Characterization, applications and methods of immobilization, CHEMIK 2010, 64(2), 97-102.
Sharma, M.K. (2011): Aqueous Two phase extraction - of Lipase from Rice Bran, Advance in Applied Science Research, 2(2), 265-271.
Sharma, R., Chisti, Y., dan Banerjee, U.C. (2001): Production, purification, characterization and applications of lipases, Biotechnology Advances, 19, 627-662.
Thakur, S. (2012): Lipase, Its Sources, Properties and Applications: A Review, International Journal of Scientific & Engineering Research, 3(7), 1-29.
Tseng, C.G. (2005): Characterization of Rice Bran Lipase and Its Application, Journal of Engineering Technology and Education, 2(4), 413-426.
14
PERCOBAAN IVUJI AKTIVITAS ENZIM KATALASE
A. Tujuan PercobaanPercobaan ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas enzim katalase secara kualitatif.
B. Dasar Teori Katalase adalah enzim yang memiliki kemampuan sebagai antioksidan karena
enzim ini dapat mendegradasi hidrogen peroksida (H2O2). Enzim ini terdapat pada
peroksisom sel mamalia, seperti manusia dan hewan. Selain itu, enzim katalase dapat
diisolasi dari tanman dan mikroorganisme seperti bakteiri dan jamur. Di dalam makhluk
hidup, katalase dapat menguraikan zat-zat oksidatif yang berbahaya seperti fenol, asam
format, alkohol dan H2O2. Hidrogen peroksida merupakan produk yang biasa dihasilkan
dari metobelisme sel. Enzim katalase bertanggung jawab untuk mempercepat
pemecahan hidrogen peroksida menjadi air (H2O) dan oksigen (O2). Reaksi kimia yang
ditunjukkan dalam persamaan berikut.
2 H2O2 2 H2O + O2
Saat ini beberapa metode penentuan aktivitas katalase baik kualitatif maupun
kuantitatif sudah banyak dilakukan. Salah satu metode kualitatif yang paling sederhana
dalam menentukan keberadaan katalase pada kultur bakteri adalah dengan
menggunakan H2O2. Senyawa ini akan dipecah menjadi gelembung O2 oleh katalase.
Identifikasi adanya enzim katalase didasarkan pada terbentuknya gelembung oksigen
pada waktu reaksi terjadi.
15
katalase
C. Alat dan bahan Alat
Tabung reaksi Kaki tiga + kasa Rak tabung reaksi Pembakar spiritus Gelas ukur 10 mL Pipet Tetes Gelas beker 50 mL Pipet volume 1 mL Gelas beker 250 mL Hole punch Bola hisap Stopwatch Kaca lengkung Pipa karet
Bahan Ekstrak hati Ekstrak kunyit Ekstrak jantung Ekstrak daun pepaya Kultur bakteri/jamur Kertas saring H2O2 3% Es batu Akuades NaOH 1 M HCl 1 M
D. Cara Kerja1. Uji aktivitas katalase dengan kertas saring
Kertas saring direndam dalam kultur bakteri selama 2 menit. Kemudian, kertas
saring diambil dan ditempatkan pada bagian dasar gelas beker yang berisi 25 mL larutan
H2O2 3%. Amati dan hitung waktu ketika kertas saring mulai naik ke permukaan larutan.
Ulangi perlakuan diatas sebanyak 3 kali. Ulangi langkah diatas pada sampel A, B , dan
C.
Keterangan: Larutan A (1:4) = campuran 5 mL larutan H2O2 3% dan 20 mL air
Larutan B (1:9) = campuran 2,5 mL larutan H2O2 3% dan 22.5 mL air
Larutan C (1:49) = campuran 0,5 mL larutan H2O2 3% dan 24.5 mL air
Tabel 1. Aktivitas katalase dengan kertas saring
Sampel Waktu yang diperlukan kertas saring naik ke permukaan gelas (s)1 2 3 Rata-rata
16
H2O2 3% (kontrol)A (1:4)B (1:9)C (1:49)
Buat grafik antara konsentrasi pada sumbu x dan waktu pada sumbu y.
2. Uji aktivitas katalase terhadap berbagai kondisiSiapkan dua buah tabung reaksi dan dimasukkan masing-masing 10 mL akuades.
Pada tabung 1 ditambahkan 1 mL akuades. Tabung ini akan digunakan sebagai kontrol.
Pada tabung 2 ditambahkan 1 mL ekstrak hati. Setelah itu, rangkai alat seperti pada
gambar berikut.
Larutan H2O2 3% sebanyak 2 mL ditambahkan ke dalam kedua tabung reaksi dan
sesegera mungkin ditutup. Biarkan selama 3 menit sambil dihitung jumlah gelembung
yang terbentuk. Ulangi perlakuan diatas sebanyak 2 kali.
Ulangi langkah diatas pada sampel lain dengan berbagai kondisi berbeda.
Pada kondisi asam : sampel + 3 tetes HCl 1 M
Pada kondisi basa: sampel + 3 tetes NaOH 1 M
Pada kondisi suhu rendah: sampel direndam dalam air es
17
Pada kondisi suhu tinggi: sampel direndam dalam air mendidih
No. Jenis Ekstrak + H2O2
Jumlah gelembung
pH netral Kondisi asam
Kondisi basa
Kondisi suhu rendah
Kondisi suhu tinggi
1. Ekstrak Hati2. Ekstrak Jantung3. Ekstrak Daun Pepaya4. Ekstrak Kunyit
Tabel 2. Uji aktivitas katalase terhadap berbagai kondisi
Daftar PustakaAlfonso-Prieto, M., Biarnes, X., Vidossich, P., dan Rovira, C. (2009): The Molecular Mechanism of the Catalase Reaction, J. Am. Chem. Soc., 131(33), 11751-11761.
Anonim (2016): Investigating the effects of temperature on enzyme activity, http://www.mayfieldschools.org. Diakses tanggal 16 Februari 2016.
Iwase, T., Tajima, A., Sugimoto, S., Okuda, K., Hironaka, I., Kamata, Y., Takada, K dan Mizunoe, Y. (2013): A Simple Assay for Measuring Catalase Activity: A Visual Approach, Scientific Reports, 3, 3081-3084.
Scibior, D., dan Czeczot, H. (2006): Catalase: Structure, Properties, Functions, Postepy Hig Med Dosw, 60, 170-180.
St. Rosemary Educational Institution. "Factors Affecting the Activity of Catalase and Amylase Lab Answers." http://schoolworkhelper.net/. St. Rosemary Educational Institution, Last Update: 2016. Web. Diakses pada: Rabu 16 Februari 2016. http://schoolworkhelper.net/factors-affecting-the-activity-of-catalase-and-amylase-lab-answers/.
18
PERCOBAAN VELEKTROFORESIS SDS PAGE
A. Tujuan PercobaanPercobaan ini bertujuan untuk mengetahui karakterisasi protein dari kecambah
menggunakan SDS PAGE (Sodium Dedocyl Sulphate Polyacrilamide Gel
Electrophoresis)
B. Dasar Teori Elektroforesis adalah teknik untuk memisahkan molekul yang memiliki muatan
listrik pada sebuah matriks (misalnya gel) menggunakan medan listrik
sebagai tenaga penggerak molekulnya. Untuk elektroforesis protein, ada beberapa teknik
yang digunakan, yaitu proteinnya yang dibuat terdenaturasi (SDS PAGE) atau tidak
(NATIVE PAGE).
Pada teknik SDS-PAGE, proteinnya dibuat terdenaturasi (dengan menambahkan
larutan SDS) sehingga bermuatan negatif, protein tersebut bergerak dari negatif ke positif
dan kecepatan pergerakannya hanya dipengaruhi oleh ukuran molekul. Protein yang
terdenaturasi sempurna akan mengikat SDS dalam jumlah yang setara dengan
berat molekul protein tersebut (Dunn,1989). Denaturasi protein dilakukan dengan
merebus sampel dalam buffer yang mengandung β-merkaptoetanol (berfungsi untuk
mereduksi ikatan disulfide), gliserol dan SDS (Wilson dan Walker,2000). Muatan
asli protein akan digantikan oleh muatan negatif dari anion yang teikat sehingga
kompleks protein-SDS memiliki rasio muatan per berat molekul yang konstan.
(Hames, 1987).
Sampel-sampel enzim yang diinjeksikan ke dalam sumur gel diberi warna
dengan bromphenol biru yang dapat terionisasi. Fungsi pewarna adalah untuk
membantu memonitor jalannya elektroforesis. Berat molekul protein dapat diketahui
dengan membandingkan Rf protein dengan protein standar yang berat molekulnya
telah diketahui (Wilson dan Walker,2000).19
Pada teknik yang native, pergerakan molekul protein selain dipengaruhi oleh faktor
ukuran, juga oleh besarnya muatan molekul. NATIVE PAGE digunakan untuk
mempelajari konformasi, self-asosiasi atau agregasi, dan pengikatan protein oleh
senyawa lain.
C. Alat dan bahan Alat
Seperangkat alat elektroforesis vertikal Mikropipet Penangas air Gelas beker 250 mL Pipet ukur 10 mL Pipet ukur 5 mL Sentrifuge Vortex Blender
Bahan Kecambah UGB Metanol p.a. TEMED Kloroform APS 10% Etanol 95% RSB Aquabidest Running buffer T-akrilamid 30% Marker LGB Larutan staining Kertas saring Larutan destaining
D. Cara Kerja3. Isolasi Protein dari Kecambah
Kecambah ditimbang sebanyak 10 gram dan ditambahkan dengan 100 mL
aquabidest kemudian diblender. Hasilnya diambil 7 mL kemudian di sentrifuge dan
diambil bagian supernatan sebanyak 5 mL. Supernatan tersebut ditambahkan 4 mL 20
etanol, 2 mL kloroform, dan 3 mL aquabidest kemudian divortex. Setelah itu disentrifuge
dengan kecepatan 3500 rpm selama 5 menit. Dari hasil sentrifugasi tersebut, lapisan
atas dibuang sedangkan lapisan bawah ditambah dengan 3 mL methanol kemudian di
vortex kembali. Larutan disentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm selama 5 menit.
Hasilnya, supernatan dibuang dan endapan ditambahkan dengan etanol ±3 mL dan siap
untuk diuji.
4. Uji Kualitatif Protein Hasil Isolasi dengan SDS PAGE1. Disiapkan dan dijepitkan 2 plate kaca elektroforesis pada penjepit elektroforesis
2. Dicek kebocoran plate dengan cara mengaliri air perlahan-lahan pada plate
3. Dibuat larutan separating gel 12% dengan ketentuan :
a. Dipipet dan dimasukkan 1700 µL dH2O
b. Dipipet dan dimasukkan 2000 µL T-acrylamid 30%
c. Dipipet dan dimasukkan 1300 µL LGB
d. Divortex ketiga komposisi diatas ± 5 menit
e. Dipipet dan dimasukkan 70 µL APS (dibuat dalam keadaan fresh),
(APS 10% dibuat dengan cara 10 mg APS dilarutkan dalam 100 µL ddH2O)
f. Divortex keempat komposisi diatas ± 5 menit
g. Dipipet dan dimasukkan 7 µL TEMED
h. Divortex kelima komposisi diatas ± 5 menit
i. Dimasukkan separating gel dalam plate dan ditunggu hingga mengeras
4. Dibuat larutan stacking gel 3% dengan ketentuan :
a. Dipipet dan dimasukkan 812 µL dH2O
b. Dipipet dan dimasukkan 220 µL T-acrylamid 30%
c. Dipipet dan dimasukkan 344 µL UGB
d. Divortex ketiga komposisi diatas ± 5 menit
e. Dipipet dan dimasukkan 8,25 µL APS (dibuat dalam keadaan fresh),
(APS 10% dibuat dengan cara 10 mg APS dilarutkan dalam 100 µL ddH2O)21
f. Divortex keempat komposisi diatas ± 5 menit
g. Dipipet dan dimasukkan 5,5 µL TEMED
h. Divortex kelima komposisi diatas ± 5 menit
i. Dimasukkan separating gel dalam plate dan ditunggu hingga mengeras
5. Dimasukkan stacking gel 3% dalam plate, 1500 µL
6. Dimasukkan sisir, ditunggu hingga mengeras
7. Dipindahkan dan dimasukkan plate dalam bak elektroforesis berisi running buffer
8. Dipanaskan sampel+RSB (1:1) dalam oven 95oC, selama 3 menit (kapasitas
setiap well maksimal 15 µL), begitu pula dengan marker. Jika sampel berbentuk
padatan, maka sampel ditambahkan aquabidest (ddH2O). Komposisi RSB
adalah sebagai berikut (BIO-RAD) :
a. B-mercaptoethanol 25 µL
b. Stock Sampel Buffer 475 µL
Sedangkan komposisi stock sampel buffer adalah sebagai berikut (BIO-RAD) :
a. Distilled Water 4,8 mL
b. 0,5 M Tris-HCl pH 6,8 1,2 mL
c. Glycerol 1,0 mL
d. 10% (w/v) SDS 2,0 mL
e. 0,1% (w/v) Bromophenol Blue 0,5 mL
9. Didinginkan sampel + RSB hasil pada langkah 8.
10. Dimasukkan sampel + RSB ke dalam setiap well (maksimal 15 µL/well), kecuali
marker protein, yakni 5 µL/well
11. Dirunning dengan tegangan konstan 100 volt, selama ± 80 menit.
12. Diambil dan diwarnai gel selama 1 jam dengan larutan staining (dilakukan pada
mesin penggoyang atau shaker)
13. Dilakukan destaining selama 24 jam, destaining dihentikan ketika larutan destaining jernih
22
14. Gel dibungkus dengan mika dan diamati profil protein yang terdapat pada gel
dengan cara discan.
Komposisi Larutan Staining :a. Comasie brilliant blue = 0,25 g
b. Metanol absolut = 45,4 mL
c. Asam Asetat Glasial = 9,2 mL
d. ddH2O = 100 mL
Komposisi Larutan Destaininga. Metanol absolut = 70 mL
b. Asam Asetat Glasial = 70 mL
c. ddH2O = 1 L
PERCOBAAN VIUJI ENZIM AMILASE DALAM AIR LIUR
A. Tujuan PercobaanPercobaan ini bertujuan untuk mempelajari kondisi daya cerna enzim amilase dalam air
liur.
B. Dasar TeoriAmilase merupakan enzim yang berfungsi memecah pati dan glikogen. Enzim ini
banyak terdapat dalam hasil tanaman dan hewan. Disamping itu amilase juga dapat
diisolasi dari mikroorganisme, misalnya Aspergillus oryzae dan Bacillus subtilis. Enzim
amilase dapat dikelompokkan menjadi tiga golongan yaitu: α-amilase, β-amilase dan
glukoaminase. Kerja enzim sangat khusus dan spesifik. Artinya, suatu enzim hanya 23
menjalankan satu fungsi saja. Misalnya adalah enzim α-amilase yang bekerja spesifik di
dalam mulut, enzim ini terdapat bersama dengan air liur (saliva), enzim α-amilase
berperan dalam melakukan hidrolisis awal makanan terutama yang mengandung pati.
Disamping kerjanya sangat spesifik, kerja enzim juga sangat dipengaruhi oleh faktor-
faktor lain. Diantaranya adalah konsentrasi substrat pH, suhu, kofaktor. Karena organism
di alam, termasuk manusia dapat mencerna pati, maka enzim α-amilase secara alamiah
banyak ditemukan, seperti dalam air liur manusia dan system sekresi pankreas.
C. Alat dan BahanAlat Gelas ukur Termometer Tabung reaksi Penangas air Penjepit tabung Kertas saring Glass wool Pipet tetes
Bahan Air liur (saliva) Air es Asam asetat encer HCl Aquadest Na Karbonat 0,1% Larutan kanji 1% Kertas pH universal Reagen iodine Reagen biuret Reagen benedict Reagen Molisch
D. Cara Kerja1. Persiapan Air Liur
Rongga mulut dibersihkan dengan cara berkumur berkali-kali. Air liur dikumpulkan
sekitar 30 mL, disaring dengan glass wool. Sifat dan susunan air liur diuji dengan
mengukur pH dan mereaksikan dengan dengan berbagai pereaksi yaitu biuret dan
molish.
2. Uji Biuret dan Molisch
24
Disiapkan 2 tabung reaksi masing-masing diisi dengan 10 tetes air liur. Tabung 1
ditambahkan 15 tetes reagen biuret dan tabung 2 ditambahkan 5 tetes reagen molish.
3. Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas Amilase Air LiurDisiapkan 4 tabung reaksi masing-masing diisi dengan 2 mL air liur dan 2 mL
akuades kemudian dikocok. Tabung 1 diletakkan pada air es, tabung 2 pada suhu ruang,
tabung 3 pada suhu 37oC dan tabung 4 pada suhu 85oC selama 15 menit. Setelah itu
setiap tabung diisi dengan 2 mL larutan kanji, dikocok dan direaksikan pada masing-
masing kondisi suhu selama 10 menit. Isi tabung dipindahkan menjadi 2 bagian, satu
bagian diuji dengan reagen iodium dan satu bagian dengan reagen benedict.
4. Pengaruh pH terhadap Aktivitas Amilase Air Liur Disiapkan 4 tabung reaksi masing-masing diisi dengan 2 mL HCl, 2 mL asam
asetat, 2 mL akuades dan 2 mL Na-karbonat dan diukur pH nya. Setiap tabung
ditambahkan 2 mL larutan kanji dan 2 mL air liur, dikocok dan diletakkan di penangas air
37oC selama 15 menit. Isi tabung dipindahkan menjadi 2 bagian, satu bagian diuji dengan
reagen iodium dan satu bagian dengan reagen benedict.
.
25
PERCOBAAN VIPEMERIKSAAN GLUKOSA DAN PROTEIN PADA URINE
A. Tujuan PercobaanPercobaan ini bertujuan untuk menentukan adanya glukosa dan protein pada urine
secara kualitatif.
B. Dasar TeoriUrine atau air kencing merupakan cairan sisa yang diekskresikan oleh ginjal
kemudian dikeluarkan dari dalam tubuh melalui proses urinasi. Eksreksi urine diperlukan
untuk membuang molekul-molekul sisa dalam darah yang disaring oleh ginjal dan untuk
menjaga homeostasis cairan tubuh. Urine disaring di dalam ginjal, dibawa melalui ureter
menuju kandung kemih, dan akhirnya dibuang keluar tubuh melalui uretra. Urine normal
biasanya berwarna kuning, berbau khas jika didiamkan berbau ammoniak, pH berkisar
4,8 – 7,5 dan biasanya 6 atau 7. Berat jenis urine berkisar antara 1,002 – 1,035. Volume
normal perhari 900 – 1400 mL.
Warna urine biasanya dipengaruhi oleh jenis makanan yang dimakan, jenis
kegiatan atau dapat pula disebabkan oleh penyakit. Namun biasanya warna urine normal
berkisar dari warna bening sampai warna kuning pucat. Urine mengandung berbagai zat
yaitu air sebanyak 95 %, urea, asam ureat, ammonia, zat warna empedu (Bilirubin dan
Biliverdin), dan garam mineral, terutama NaCl. Selain itu, urine juga mengandung zat-zat
bersifat racun seperti sisa obat dan hormon.
26
C. Alat dan BahanAlat Tabung reaksi Lampu spiritus Rak tabung reaksi Pipet tetes Centrifuge dan tabungnya Gelas ukur Penjepit
Bahan Urine Glucotest strip CuSO4.5H2O Akuades Natrium sitrat Asam asetat 10% Na2CO3 anhidrat Natrium asetat Sitrat karbornat Asam asetat glasial
D. Cara Kerja1. Pembuatan Reagen Benedict
CuSO4.5H2O sebanyak 1,73 g dilarutkan dengan 10 mL akuades. Larutan tersebut
ditambahkan 17,3 g natrium sitrat dan 10 g Na2CO3 anhidrat dalam 60 mL akuades
dengan pemanasan, kemudian disaring. Perlahan-lahan dengan adukan yang konstan
tambahkan larutan sitrat karbonat. Bersihkan seluruh CuSO4 dengan akuades dan
tambahkan aquadest hingga mencapai volume 100 mL.
2. Uji Glukosa dalam UrineReagen benedict dimasukkan 2,5 mL kedalam tabung reaksi dan ditambahkan
0,25 mL (4 tetes) urine dan campurkan. Campuran tersebut diletakkan dalam air
mendidih selama 2-3 menit. Angkat tabung reaksi dan amati perubahan yang terjadi.
Warna yang terjadi adalah simbol jumlah glukosa yang terkandung dalam urine.
a. Biru tidak ada endapan (-) 0,0 – 0,1 g/dL
27
b. Hijau dengan endapan kuning (+) 0,5 – 1,0 g/dL
c. Kuning (++) 1,0 – 1,5 g/dL
d. Orange (+++) 1,5 – 2,5 g/dL
e. Merah (++++) 2,5 – 4,0 g/dL
3. Uji Glukosa dengan Glucotest StripCelupkan strip ke dalam urine selama 30 detik. Baca hasil tersebut dengan
membandingkan warna yang didapat dengan warna standard.
4. Uji Protein dalam UrineTabung reaksi diisi urin sebanyak ¾ nya dan dididdihkan selama 1-2 menit.
Kemudian tambahkan 3 tetes asam asetat 10% secara perlahan dalam keadaan
mendidih. Amati dan catat perubahan yang terjadi.
Kekeruhan yang dihasilkan menandakan banyak sedikitnya protein dalam urine.
a. Tidak ada kekeruhan (-)
b. Kekeruhan sedikit sekali (±)
c. Kekeruhan sedikit (+) 10-50 mg %
d. Kekeruhan jelas (++) 50-200 mg %
e. Kekeruhan hebat (+++) 200-500 mg %
f. Kekeruhan menggumpal (++++) >500 mg %
5. Uji Protein dengan Metode BangReagen bang dibuat dengan melarutkan natrium asetat 2,36 g dan 5 mL asam
asetat glasial. Campuran tersebut ditambahkan akuades sampai volumenya 20 mL. Lima
milliliter urine dimasukkan dalam tabung reaksi dan ditambah 0,5 mL reagen Bang.
28
Setelah itu, dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit. Amati perubahan yang
terjadi. Terbentuknya kekeruhan pada sampel menunjukkan adanya protein dalam urine.
6. Uji Protein dengan Metode Heller’sHNO3 2 M sebanyak 2 mL dimasukkan dalam tabung reaksi. Kemudian,
ditambahkan 2 mL urine secara perlahan. Terbentuknya gumpalan berwarna putih
menunjukkan adanya protein dalam urine.
Daftar PustakaBCM 101 Biochemistry Week 9 Pratical “Urine Analysis”. Diakses tanggal 18 Februari
2016 dari http://www.pua.edu.eg/Version2/Courses2/Dentistry%20Courses/Freshmen
/Spring/BCM101/Practical/Week%209%20Practical%20_Urine%20analysis_.pdf
29
LAMPIRANLampiran 1. Format Laporan
SAMPUL LAPORAN
BAB I PENDAHULUAN1.1 Latar Belakang1.2 Tujuan
BAB II TINJAUAN PUSTAKA2.1 Dasar Teori (teori-teori baku yang menunjang pembahasan)
2.2 Tinjauan Bahan (MSDS bahan yang digunakan)
BAB III METODE PERCOBAAN3.1 Alat3.2 Bahan3.3 Cara kerja (ditulis dalam bentuk paragraf)
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN4.1 Data Hasil Pengamatan4.2 Analisis prosedur dan analisa hasil
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN
DAFTAR PUSTAKA min. 5 referensi, 2 atau lebih diantaranya dari artikel penelitian.
LAMPIRAN Lampiran berisi diagram alir, data-data mentah, tabel pengamatan, dan perhitungan.
30
Lampiran 2. Contoh Cover Laporan Praktikum
ISOLASI ASAM NUKLEAT(...............judul percobaan.............)
Disusun Oleh:
Nama : Moh. TaufiqNIM : 03530014Jurusan : KimiaAsisten : Taufiq HidayatKelompok : VI
LABORATORIUM BIOKIMIAJURUSAN KIMIA
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGIUNIVERSITAS ISLAM NEGERI MAULANA MALIK IBRAHIM MALANG
2016
31
Lampiran 3. Limbah Praktikum Biokimia II
Percobaan Jenis Limbah Kategori WadahI Larutan iodine + bakteri +
enzim amilaseOrganik halogen Kuning
Reagen DNS + bakteri Asam basa Putih Reagen DNS + Glukosa Asam basa Putih
II Enzim papain + susu skim + pp + NaOH
Asam basa Putih
III Dedak padi /kacang tanah+ petroleum eter + buffer
Organik Hijau
Susu + Enzim lipase + pp + NaOH
Asam basa Putih
IV Kertas saring + kultur bakteri + H2O2
Asam basa Putih
Aquadest + H2O2 + HCl Asam basa Putih Aquadest + H2O2 + NaOH Asam basa Putih Aquadest + H2O2 Asam basa Putih
V Gel akrilamid + protein Organik HijauVI Air liur + biuret/molisch Organik Hijau
Air liur + aquadest + iodium
Organik Hijau
Air liur + aquadest + benedict
Organik halogen Kuning
Air liur + HCl / NaOH/ asam asetat + iodium
Asam basa Putih
Air liur + HCl / NaOH/ asam asetat + iodium
Asam basa Putih
VII Benedict + urine Logam MerahAsam asetat + urine Asam basa PutihReagen Bang + urine Asam basa PutihHNO3 + urine Asam basa Putih
32