diagnosa penyakit mycobakteriosis, … · memiliki tingkat virulensi paling tinggi untuk digunakan...

969 Diagnosa penyakit Mycobakteriosis ... (Uni Purwaningsih)

ABSTRAK

Penyakit mycobakteriosis terutama yang disebabkan oleh infeksi bakteri Mycobacterium fortuitum merupakansalah satu penyakit potensial pada budidaya ikan gurame (Osphronemus gouramy), mengakibatkan kematiansecara persisten hingga mencapai 40% dengan pola kronik. Kesulitan utama dalam upaya pengendalianpenyakit tersebut antara lain adalah teknik diagnosa yang memerlukan waktu selama 3–4 minggu untukmengetahui patogen penyebab secara definitif, sehingga upaya pengendaliannya sering terlambat. Tujuanpenelitian ini yaitu pengembangan teknik diagnosa penyakit tersebut dengan Polymerase Chain Reaction(PCR) diharapkan dapat digunakan sebagai perangkat diagnosa yang cepat dan tepat. Pada riset ini, dilakukanmodifikasi terhadap teknik deteksi DNA bakteri Mycobacterium spp. yang telah dikembangkan oleh beberapapeneliti. Dua pasang primer, yaitu M1: T39 (GCGAACGGGTGAGTAACACG) dan T13 (TGCACACAGGCCACAAGGGA);dan primer M2: PreT43 (AATGGGCGCAAGCCTGATG); dan T531 (ACCGCTACACCAGGAAT) digunakan padapenelitian ini. Sensitivitas teknik diagnosa terhadap bakteri target, selanjutnya dibandingkan dengan teknikdiagnosa melalui uji bio-kimia dan histopatologis. Deteksi DNA bakteri target dilakukan terhadap sampelyang diambil dari organ hati, limpa dan darah. Isolasi dilakukan dengan menggunakan media selektifShouten Agar dan Lowenstain–Jenssen, sedangkan preparat histopatologi diambil dari organ hati, ginjal, danlimpa. Hasil penelitian menunjukkan metode PCR dapat mendeteksi penyakit mycobakteriosis secara definitifdalam waktu 2–4 hari hingga level spesies. Hasil analisis sekuensing dengan gen 16S rRNA menunjukkansimilarity 99% dengan Mycobacterium fortuitum.

KATA KUNCI: mycobakteriosis, Mycobacterium fortuitum, gurame, dan polymerase chain reaction

PENDAHULUAN

Ikan gurame (Osphronemus gouramy) adalah salah satu komoditas ikan air tawar yang telah lamadibudidayakan secara meluas dan komersial. Kolam-kolam yang tersebar di seluruh kawasan baiksebagai kolam pekarangan, kolam irigasi maupun kolam tadah hujan merupakan basis pemasokprotein hewani asal ikan budidaya bagi berjuta-juta masyarakat Indonesia baik di pedesaan maupunperkotaan. Salah satu kendala yang semakin kompleks sejalan dengan perkembangan budidaya ikangurame adalah gangguan penyakit, baik yang bersifat infeksius maupun non-infeksius. Beberapajenis penyakit yang sering dihadapi pada budidaya ikan air tawar memiliki tingkat virulensi yangtinggi dan bersifat per akut, sehingga sering mengakibatkan kematian total. Salah satu jenis penyakityang cukup serius banyak menyerang budidaya ikan gurame adalah mycobakteriosis yang disebabkanoleh bakteri Mycobacterium sp.

Mycobakteriosis atau fish Tuberculosis adalah penyakit yang ditimbulkan oleh Mycobacterium sp.di Amerika Serikat bakteri ini menjadi penting karena dapat menimbulkan kerugian sangat besarterutama di perbenihan. Akibat serangan bakteri ini reproduksi ikan terganggu, produksi benihmenurun dan benih yang dihasilkan kondisinya lemah. Dalam beberapa tahun terakhir di Indonesiabakteri ini menjadi penting karena menimbulkan kerugian yang cukup besar terutama pada petanigurame. Gejala klinis yang ditimbulkan antara lain mata menonjol (exopthalmia atau pop eye),pembengkakan vena dan luka pada tubuh. Pada ikan dewasa terjadi hambatan seksual, penurunanfekunditas, pertumbuhan terhambat, warna pucat, lordosis, skoliosis, ulcer, dan sirip rusak. Padaorgan dalam terjadi bintil (nodular) atau tuberkel berwarna putih keabu-abuan antara lain pada hati,ginjal, dan limpa.

Mycobakteriosis merupakan penyakit yang mendapat perhatian karena: 1) menyebabkan kematiankronik pada ikan dengan tingkat mortalitas rendah hingga sedang tetapi berlangsung terus-menerus,

DIAGNOSA PENYAKIT MYCOBAKTERIOSIS, Mycobacterium fortuitum PADAIKAN GURAME (Osphronemus gouramy) DENGAN TEKNIK

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Uni Purwaningsih dan Taukhid

Balai Riset Perikanan Budidaya Air TawarJl. Raya Sempur No. 1, Bogor

E-mail: [email protected], [email protected]

Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2010 970

2) Mycobacterium tidak dapat diobati, dan 3) ikan yang terinfeksi memungkinkan menularkannyakepada manusia (Irianto, 2005).

Kajian terhadap bakteri Mycobacterium sp. dalam dunia perikanan di Indonesia belum dilakukansecara mendalam sehingga penelitian ini benar-benar merupakan sesuatu yang penting di Indone-sia. Kondisi geografi perairan Indonesia yang berada di daerah tropis, memungkinkan bakteri Myco-bacterium sp. hidup dan berkembang di wilayah ini. Dugaan ini didukung fakta masih tingginyakejadian mycobakteriosis di Indonesia (Nugroho, 2008). Diagnosis laboratorik mycobakteriosis sampaisaat ini masih dikembangkan untuk memperoleh metode yang cepat dan akurat.

Tujuan dari penelitian ini adalah pengembangan teknik diagnosa penyakit tersebut dengan Poly-merase Chain Reaction (PCR) diharapkan dapat digunakan sebagai perangkat diagnosa yang cepat dantepat. Dengan teknik konvensional, diagnosa definitif akibat infeksi bakteri tersebut memerlukanwaktu 4 minggu; namun dengan teknik PCR diharapkan sudah diketahui dalam 2–4 hari.

BAHAN DAN METODE

Riset ini dilakukan pada skala laboratorium dengan prosedur pelaksanaan secara garis besar terdiriatas dua tahap yaitu sebagai berikut:

Tahap Awal

Ikan uji yang digunakan adalah ikan gurame dengan ukuran 100–200 g. Pakan diberikan 3% daribiomassa per hari dengan frekuensi pemberian 3 kali sehari. Wadah yang digunakan bak fiber dengankapasitas 300 L.

Postulat Koch

Isolat Mycobacterium sp. yang merupakan culture colection laboratorium patologi – BRPBAT danhasil survai lapang. Bakteri tersebut diinfeksikan secara intra peritoneal (kelompok A) dan intramus-cular (Kelompok B) ke ikan uji. Ikan yang menunjukkan gejala klinis dinekropsi, kemudian organtarget infeksi Mycobacterium sp. diambil untuk selanjutnya dilakukan isolasi bakteri dari organ tersebut.

Uji Virulensi

Ikan uji diinfeksi bakteri Mycobacterium sp. dengan dosis 0,2 cc per ekor menggunakan isolat-isolat Mycobacterium sp. yang diperoleh dari postulat. Masing-masing perlakuan menggunakan ikanuji sebanyak 10 ekor dengan 3 kali ulangan. Tujuan dari ini adalah untuk menentukan isolat yangmemiliki tingkat virulensi paling tinggi untuk digunakan pada uji utama.

Tahap Utama

Ikan uji yang digunakan adalah ikan gurame yang berasal dari populasi homogen dan diasumsikanSpecific Pathogen Free (SPF) Mycobacterium sp., selanjutnya populasi tersebut dibagi dalam duakelompok. Kelompok pertama adalah populasi ikan gurame yang diinfeksi dengan isolat bakteriMycobacterium sp. yang diperoleh dari uji virulensi melalui injeksi intra peritoneal (i.p). Sedangkankelompok kedua adalah populasi ikan gurame SPF yang diinjeksi dengan Phosphate Buffered Saline(PBS) sebagai pembanding. Masing-masing perlakuan menggunakan ikan gurame sebanyak 25 ekordan diulang 3 kali.

Sampling dan Pengamatan

Pengamatan terhadap masa inkubasi patogen serta gejala klinis yang muncul dilakukan setiaphari. Sampel untuk keperluan diagnosa penyakit dilakukan secara selektif dari masing-masingkelompok, terutama terhadap spesimen yang menunjukkan tingkah laku, gejala klinis (anatomis–patologis). Sampling secara acak akan diberlakukan apabila selama periode pengamatan tidak dijumpaiadanya tanda-tanda yang spesifik. Sampling rutin ada atau tidak adanya gejala klinis tetap dilakukansetiap 2 minggu sekali.


Diagnosa Bakteriologi

Dilakukan melalui isolasi, pemurnian, dan karakterisasi. Isolasi menggunakan media selektif yaituShouthen Agar dan Lowenstain–Jenssen. Untuk karakterisasi antara lain dilakukan uji reduksi nitrat,pewarnaan tahan asam, pertumbuhan pada sukrose, hidrolisa tween, dan kemampuan tumbuh padasuhu 37°C.

Diagnosa histopatologi

Dilakukan dengan mengambil organ target hati, ginjal, dan limpa pada saat sampling. Proseshistologi mengikuti metode Gurr (1956) yang terdiri atas enam proses yaitu fiksasi, clearing, embed-ding, blocking, cutting, dan staining. Sampel organ yang diambil difiksasi dengan menggunakan larutanfiksatif Neutral Buffer Formalin (NBF) 10%. Organ yang telah difiksasi sekurang-kurangnya 24 jamdipotong setebal 3–5 mm dan 1 cm x 1 cm, selanjutnya jaringan tersebut dimasukkan dalam etanolbertingkat. Kemudian jaringan dimasukkan dalam xylene lalu parafin untuk dilakukan proses block-ing. Jaringan dipotong dengan mikrotom rotary dengan ketebalan 3–5 μm dan diletakkan pada gelasobjek. Setelah proses tersebut di atas tahap selanjutnya dilakukan proses pewarnaan denganmenggunakan Hematoksilin–Eosin. Selanjutnya preparat diamati di bawah mikroskop untuk mengamatiperubahan jaringan yang terjadi.

Diagnosa Polymerase Chain Rection (PCR)

Sampel yang digunakan untuk deteksi PCR antara lain organ hati, limpa, bakteri isolasi, dandarah. Modifikasi teknik deteksi secara molekuler dilakukan dengan mengacu pada metode yangtelah dikembangkan oleh Talaat et al. (1997) dan Nugroho (2008).

Ekstraksi

Ekstraksi untuk organ hati, limpa, dan sampel darah dengan atau tanpa antikoagulan dilakukanmenggunakan DNeasy®Tissue Kit (Qiagen, Germany) dengan inkubasi pada suhu 56°C selama 1–2jam untuk organ dan 10 menit untuk darah. Untuk sampel hasil isolasi bakteri terlebih dahuludilakukan persiapan sampel sebagai berikut: 2 ose bakteri dimasukkan ke dalam 1,5 mL PBS+Tween0,05% (Sigma) kemudian disentrifus 10 menit dengan kecepatan 5.000 rpm, supernatan dibuangkemudian ditambahkan lysis buffer atau TE buffer sebanyak 180 μL ke dalam pelet diinkubasikanselama 1 jam pada suhu 37°C, lalu dipanaskan pada suhu 60°C selama 10 menit, selanjutnya mengikutiprosedur dari DNeasy®Tissue Kit (Qiagen, Germany) hingga tahap ekstraksi.

Amplifikasi

Amplifikasi menggunakan dua primer yaitu M1 yang terdiri atas T39 (GCGAACGGGTGAGTAACACG)dan T13 (TGCACACAGGCCACAAGGGA) dan M2 yang terdiri atas PreT43 (AATGGGCGCAAGCCTGATG) danT531 (ACCGCTACACCAGGAAT) (Talaat et al., 1997). Amplifikasi dilakukan untuk masing-masing primerdengan formulasi yang sama. Formulasi untuk amplifikasi PCR masing-masing primer yaitu 12,5 μLmastermix (MBI Fermentas), 9,5 μL aquades, Primer M1 1 μL, dan Primer M2 1 μL dan ditambahkan10 μL DNA template. Program amplifikasi PCR yang digunakan adalah predenaturasi 1 siklus pada94°C selama 10 menit kemudian 40 siklus denaturasi pada 94°C selama 1 menit, annealing pada 58°Cselama 1 menit dan elongation pada 72°C selama 3 menit dan dilanjutkan dengan 1 siklus finalelongation pada 72°C selama 7 menit. Visualisasi hasil dilakukan dengan mencampur 10 μL amplikondengan 2 μL loading dye solution (MBI Fermentas, Germany), selanjutnya diseparasi dengan 2% gelagarose elektroforesis. Marker yang digunakan 100 bp DNA ladder, pewarna menggunakan ethidiumbromide 0,5% dan gambar didokumentasikan dengan menggunakan UV trans-illuminator.

Restriksi

Produk PCR sebanyak 10 μL ditambah DDH20, 10x Buffer O dan enzim Apa 1 atau BshN 1 sesuaiprosedur penggunaan enzim tersebut (MBI Fermentas, Germany). Kemudian dicampur perlahan dandiinkubasi pada suhu 37°C selama 16 jam.


HASIL DAN BAHASAN

Banyak kasus kejadian Mycobakteriosis kadang tidak teridentifikasi yang menyebabkan salahdiagnosa (mis-diagnosis). Diagnosa Mycobakteriosis berdasarkan pada gejala klinis, perubahanhistopatologi, dan identifikasi bakteri penyebab. Isolasi dan karakterisasi bakteri dapat menjadidiagnosa definitif namun membutuhkan waktu cukup lama dan biaya bahan uji yang mahal. Perubahanmakroskopik dan mikroskopik pada target organ yang ditandai dengan adanya nekrogranulomaberbagai ukuran menunjukkan tingkat keparahan penyakit Mycobakteriosis juga dapat menjadi acuandiagnosa tetapi lagi-lagi untuk hal tersebut membutuhkan waktu yang lama. Morfologi sel dankoloni Mycobacterium sp. juga tidak dapat menjadi acuan utama. Karena berbagai alasan tersebutmaka metode Polymerase Chain Reaction (PCR) diharapkan menjadi metode alternatif yang tepat untukdiagnosa penyakit tersebut.

Isolat Mycobacterium sp. yang digunakan dalam penelitian ini telah melalui tahap uji virulensi,reisolasi Koch’s postulat, dan uji karakterisasi. Berdasarkan uji karakterisasi, isolat M2G definitifterhadap Mycobacterium fortuitum dengan hasil uji sebagai berikut yaitu tumbuh pada suhu 37°C,sucrose (+), uji reduksi nitrat (+), non motil, acid fast, tumbuh 3–7 hari pada media Shouten danmedia Lowenstein–Jenssen serta mampu menghidrolisa tween. Hal ini sesuai dengan pendapat Cowan(1974) bahwa M. fortuitum memiliki ciri-ciri karakteristik tersebut di atas.

Ikan gurame uji yang diinjeksi dengan isolat tersebut secara intraperitoneal menunjukkan mortalitaspada hari ke–5 pasca infeksi, gejala luka borok pada permukaan tubuh terlihat setelah 1 minggupasca infeksi, pendarahan pada organ hati, ginjal, dan limpa terlihat pada minggu ke–6 pasca infeksi,exophtalmia dan peradangan pada mata terjadi pada minggu ke–8 pasca infeksi (Gambar 1). Myco-bacterium merupakan agen infeksi yang bersifat kronik, oleh sebab itu membutuhkan waktu yangcukup lama berkisar antara 2 bulan hingga bertahun-tahun untuk dapat menimbulkan gejala klinisdan kerusakan jaringan.

Hasil pemeriksaan histopatologi menunjukkan adanya multifokal granuloma pada organ hati,ginjal, dan limpa. Mycobacterium kaya akan lipid, terutama asam mikolat (asam lemak rantai panjangC78–C90), lilin, dan fosfatida. Dalam sel, lipid sebagian besar terikat pada protein dan polisakarida(Jewetz et al., 1996). Granuloma merupakan kerusakan jaringan yang terjadi akibat dipeptida muramilyang merupakan salah satu jenis protein yang dimiliki oleh jaringan terikat kompleks dengan asammikolat yang dihasilkan oleh bakteri Mycobacterium sp. Granuloma terlihat sebagai kumpulan sel-selepiteloid yang berasal dari histiosit. Nekrosis ditemukan di daerah sentral granuloma. Di dalamgranuloma juga ditemukan jaringan ikat fibrosit dan sejumlah limfosit (Gambar 2).

Hasil pemeriksaan dengan metode PCR dari sampel hati, limpa ,darah, dan bakteri isolasi denganmenggunakan primer M1 yang terdiri atas T39, T13, dan M2 yang terdiri atas PreT43 dan T531(Talaat et al., 1997) dari hasil amplifikasi pertama (Step ke–1) terbaca pada band 600 bp kemudiansetelah dilanjutkan dengan amplifikasi ke–2 (Step ke–2) terbaca pada band 300 bp. Untuk sampelorgan yang difiksasi terlebih dahulu dengan alkohol 95% dan sampel segar (tidak difiksasi) tidakmenunjukkan perbedaan hasil (Gambar 3). Untuk sampel isolasi bakteri yang di pre-treatment denganlysis buffer ataupun TE buffer menunjukkan perbedaan hasil di mana sampel yang menggunakan lysisbuffer memberikan ekspresi band lebih jelas dibanding TE buffer (Gambar 4 dan 5). Hal yang sama

Gambar 1. Ikan gurame yang diinfeksi Mycobacterium menunjukkan luka borok padapermukaan tubuh (kiri), perdarahan organ (tengah), dan exopthalmia(kanan)


terjadi pada sampel darah tanpa antikoagulan menunjukkan ekspresi band yang lebih jelas dibandingdarah yang ditambah antikoagulan (Gambar 4).

Hasil pemeriksaan sampel isolasi bakteri yang di pre-treatment dengan TE buffer diamplifikasilangsung dengan primer M2 pada step ke–1 menunjukkan hasil positif pada band 300 bp tetapi jikadilakukan pada step ke–2 tidak memberikan hasil. Penggunaan primer M1 pada sampel isolasi bakteriyang di pretreatment dengan lysis buffer maupun TE buffer tidak memberikan hasil (Gambar 5).

Gambar 2. Fotomikrograf jaringan limpa (kiri), ginjal (tengah), dan hati (kanan) pada ikangurame uji yang diinfeksi dengan Mycobacterium menunjukkan granuloma (G)dengan berbagai ukuran dan stadium dan terlihat necrosis dan peradanganpada bagian granuloma tersebut, (pewarnaan H&E, 100x)

M A B C D E F G H I M A B C D E F G H i

Gambar 3. Hasil diagnosa dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) dari sampel organ ikangurame uji yang diinfeksi Mycobacterium, hasil amplifikasi ke–1 (kiri) dan hasil amplifikasike–2 (kanan); M = marker, A = hati (fixatif alkohol), B = Limpa (fiksatif alkohol), C =kontrol positif (fiksatif alkohol), D = kontrol positif (tanpa fiksatif), E = hati (tanpafiksatif), F = Limpa (tanpa fiksatif), G = Sampel B, H = Sampel E, I = DNA D2

Gambar 4. Hasil diagnosa dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) sampel isolat bakteridan darah dari ikan gurame uji yang diinfeksi Mycobacterium, hasil amplifikasike–1 (kiri) dan hasil amplifikasi ke–2 (kanan). M = marker, A = isolasi bakteridarI ikan A1, B = isolasi bakteri dari ikan B1, C = isolasi bakteri dari ikan C1, D= isolasi bakteri dari ikan D1, E = isolasi bakteri dari ikan E1, F = isolasibakteri dari ikan A2, G = isolasi bakteri dari ikan B2, H = isolasi bakteri dariikan C2, I = isolasi bakteri dari ikan D2, J = isolasi bakteri dari ikan E2, K =darah dengan antikoagulan, L = darah tanpa antikoagulan

G

G

G G

G G

G

M A B C D E F G H I J K L M A B C D E F G H I J K L


Analisis restriksi dari produk PCR nested menunjukkan hasil band terpecah menjadi 2 fragmenyaitu pada 210 bp dan 90 bp (Gambar 6) dengan menggunakan enzim restriksi BshN1, ini berartibahwa isolat yang digunakan dalam penelitian ini definitif terhadap Mycobacterium fortuitum. MenurutTalaat et al. (1997), bahwa restriksi dengan menggunakan enzim BshN1 pada M. fortuitum akanmenyebabkan terbentuk 2 fragmen yaitu 210 bp dan 90 bp. Tetapi jika menggunakan enzim Apa 1band tidak menyebabkan fragmentasi, hal ini disebabkan enzim Apa 1 tidak mampu mensintesisatau memotong komponen rantai basa yang terkandung pada DNA bakteri tersebut atau dapat jugadisebabkan Apa 1 tidak dapat mengenali lokasi pemotongan yang khas dari DNA tersebut. MenurutSchlegel & Schmidt (1994), enzim restriksi adalah enzim yang bekerja memetilasi atau mengglukosilasibasa-+basa tertentu dari DNA-nya, sehingga mampu memotong DNA berheliks rangkap.

Hasil pengamatan menunjukkan bahwa metode PCR memiliki tingkat sensitivitas lebih tinggidibanding 2 metode yang lain. Sementara dari metode isolasi dapat diketahui bahwa media lowenstain-Jenssen memiliki tingkat sensitivitas lebih tinggi dibanding menggunakan media Shouten Agarsebaliknya nilai spesifisitasnya rendah. Diagnosa histopatologi pada organ limpa dan ginjal memilikinilai sensitivitas lebih tinggi dibanding histopatologi dari organ hati. Hal ini dimungkinkan karenalimpa merupakan organ yang berperan dalam mekanisme pertahanan tubuh terhadap infeksi patogensehingga akumulasi patogen di jaringan tersebut lebih banyak dibanding organ dalam lainnyasedangkan pada ginjal terjadi akibat patogen masuk menginvasi ke jaringan secara aktif dan terus-

Gambar 5. Hasil diagnosa dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) sampel isolat bakteridari ikan gurame uji yang diinfeksi Mycobacterium Step 1. M = Marker, A =Bakteri Myco D1 (pretreatment dengan lysis buffer), B = Bakteri Myco D2 (pre-treatment dengan lysis buffer), C = Bakteri Myco D1 (pretreatment dengan TEbuffer), D = Bakteri Myco D2 (pretreatment dengan TE buffer), E = Negatif Kontrol,F = positif kontrol, G = darah + antikoagulan, H = Bakteri D1 (pretreatmentdengan TE buffer) dgn primer M2, I = Bakteri D2 (pretreatment dengan TE buffer)dengan primer M2, J = Bakteri D1 (pretreatment dengan lysis buffer) nested, K =Bakteri D2 (pretreatment dengan lysis buffer) nested, L = Negatif kontrol nested

M A B C D E F G H I J K L

M A B C D E F G H I Gambar 6. Hasil restriksi M = marker, A = hati (Apa 1), B = Limpa

(Apa 1), C = kontrol positif (Apa 1), D = kontrol positif(Apa 1), E = hati (BshN1), F = Limpa (BshN1), G = SampelB (BshN1), H = Sampel E (BshN1), I = DNA D2 (BshN1)


menerus yang terkait dengan proses metabolisme dan ekskresi tubuh sehingga secara akumulatifkerusakan jaringan tidak dapat dihindari. Jaringan hati memiliki kondisi yang lebih baik karena hatimemiliki kemampuan regenerasi sel hingga 80% dan mampu mendetoksifikasi toksin yang dihasilkanpatogen sehingga kerusakan sel hati dapat diminimalisir. Dari hasil metode isolasi diketahui mediaLowenstain–Jenssen memiliki tingkat kepekaan tumbuh terhadap Mycobacterium lebih tinggi dibandingmedia Shouten Agar, hal ini disebabkan Lowenstain–Jenssen merupakan media selektif yangmenggunakan penambahan suspensi telur segar yang mengandung garam tertentu, gliserol, dansubstansi organik kompleks. Malachite green yang terkandung di dalamnya bermanfaat untukmenghambat bakteri lain sehingga media ini selektif untuk Mycobacterium.

Analisis gen 16S rRNA menunjukkan bahwa isolat yang digunakan pada penelitian ini termasukdalam kelompok Mycobacterium fortuitum dengan indeks kemiripan mencapai 99% yang merupakananggota kelompok filogenik dari genus Mycobacterium.

KESIMPULAN

Kesimpulan yang dapat diambil dari penelitian ini adalah sebagai berikut:1. Diagnosa dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk deteksi penyakit mycobakteriosis pada

ikan gurame memerlukan waktu 2 hari dan 4 hari untuk sampai ke level spesies dengan analisisrestriksi.

2. Metode PCR memiliki tingkat sensitifitas mencapai 96,67% dibanding metode isolasi sebesar 68,34%dan 77,78 % dengan metode histopatologi. Analisis sekuensing gen 16S rRNA menunjukkan bahwaisolat Mycobacterium yang digunakan dalam penelitian ini definitif M. fortuitum dengan tingkatkemiripan mencapai 99%.

UCAPAN TERIMA KASIH

Pada kesempatan ini, penulis mengucapkan banyak terima kasih kepada Mikdarullah, BambangPriadi, Edy Farid, dan Ahmad Wahyudi yang telah memberikan bantuan teknis selama penelitian.Makalah ini merupakan bagian kegiatan riset pemantapan dan teknologi budidaya yang didanaioleh DIPA tahun 2009 di Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar.

DAFTAR ACUAN

Cowan, S.T. 1974. Manual for the identification of medical bacteria. Press Syndicate of University ofCambridge, Melbourne, Australia, p. 73–75.

Gurr, 1956. A Practical Manual of Medical and Biological Staining Technique, Leonard Hill Ltd. London,373 pp.

Irianto, A. 2005. Patologi Ikan teleostei. Edisi ke–1. Gadjah Mada University Press, 157 pp.Jawetz, E., Melnick, J.L., & Adelberg, E.A. 1996. Microbiologi Kedokteran. Edisi 20, EGC Press, Jakarta,

p. 302–305.Nugroho, S.W. 2008. Disertasi : Deteksi Mycobacterium avium subspesies paratuberculosis pada sapi perah,

susu pasteurisasi dan susu formula lanjutan di Bogor. Institut Pertanian Bogor.Schlegel, H.G. & Schmidt, K. 1994. Microbiologi Umum : diterjemahkan oleh Tedjo Baskoro dan Joke R.

Wattimena. Edisi ke–6. Gadjah Mada Press. Jogjakarta.Stevenson, M. 2005. An Introduction to Veterinary Epidemiology. Massey University, Palmerston North,

New Zealand, p. 50–51.Talaat, A.M., Reimschuessel, R., & Trucksis, M. 1997. Identification of mycobacteria infecting fish to

the species level using polymerase chain reaction and restriction enzyme analysis. Veterinary Mi-crobiology, 58: 229–237.

diagnosa penyakit mycobakteriosis, … · memiliki tingkat virulensi paling tinggi untuk digunakan...

Documents