cara pengawetan fungi.pdf

Cara Pengawetan dan Penyimpanan Biakan Fungi

Marlia Singgih WibowoSchool of Pharmacy

Institut Teknologi Bandung

Outline

• Prinsip Umum• Teknik Pengawetan (Preservation)• Keuntungan dan Kerugian• Pemilihan Metode

Prinsip UmumTujuan utama memelihara biakan suatu fungus adalah untuk menjaga galur fungus tersebut di dalam suatu media tanpa terjadi nya perubahan morfologi, fisiologi, atau genetik

Prinsip Umum

• Organisme dapat berasal dari berbagai sumber

• Contoh : Penicillium digitatum

Prinsip Umum

• Teknik pengawetan sangat bervariasi, dapat dengan mengurangi kecepatan metabolisme atau bahkan dapat menunda metabolisme mikroorganisme

• Pengawetan yang baik bila digunakan biakan yang sehat dan kondisi pertumbuhan yang optimum

• Microorganisme tumbuh dalam lingkungan dan kondisi yang berbeda-beda

• Beberapa diantaranya memiliki spesifisitas tertentu sebagai syarat pertumbuhannya

Prinsip Umum

• Umumnya Mikroorganisme tumbuh baik dalam media yang dibuat mendekati kondisi lingkungan tempat asalnya

• Contoh : tanah, bagian tanaman atau komponen air, dll.

Pertumbuhan Mikroorganisme• Media pertumbuhan dapat bervariasi.

Misalnya Raper & Thom (1949) menggunakan Czapek's Agar, Steep Agar and Malt Extract Agar untuk pertumbuhan Penicillia dan Aspergilli

• Pitt (1980) menganjurkan penggunaan recommends Czapek Yeast Autolysate (CYA) dan Malt Extract Agar (MEA) untuk penicillia

• Standarisasi of formula media penting dilakukan

• Media akan mempengaruhi morfologi dan warna koloni, karena kandungan media akan mempengaruhi pembentukan senyawa tertentu atau menginduksi sifat tertentu dari mikroorganisme

PertumbuhanPengaruh Media terhadap morfologi koloni

Kontaminasi pada kultur fungi• Biakan Fungi sering terkontaminasi oleh

Tyroglyphus or Tarsonemus• Di alam banyak terdapat pada tanah, dan

hampir semua bahan organik• Terbawa ke laboratorium dari bahan

tanaman, produk yang sudah kadaluarsa,pada sepatu, serangga atau biakanmikroorganisme lain.

• Cepat berkembang biak dalam keadaanlembab dan suhu ruang

• Biakan fungi menjadi rusak dan tidak dapat disimpan

Pencegahan Kontaminasi• Melakukan pekerjaan sesuai prosedur• Menjaga kebersihan dan kesehatan diri • Selalu memeriksa setiap barang yang masuk ke laboratorium • Menutup setiap biakan atau barang yang digunakan sesuai prosedur

Metode pencegahan kontaminasi

Hygiene• Bersihkan seluruh permukaan dan hindari

biakan dari udara luar dan debu• Cuci peralatan dengan desinfektan yang

sesuai.Fumigation• Digunakan selang waktu tertentu untuk ruang

laboratorium atau korikor. Pekerjaan ini harusdilakukan oleh yang berwenang

Mechanical and chemical barriers• Universal bottles, kapas lemak, tube

bersumbat

Metode pencegahan kontaminasi

• Tempat penyimpanan yang aman• Lemari pendingin 4-8°C• Lemari penyimpanan “deep freeze” (< -

20°C)• Menutup kultur dengan minyak mineral• Simpan dengan silica gel • Freeze-dry • Simpan di ultra-low temperatures case

Pengawetan dan Penyimpanan

• Continuous culturePada media padat atau cairRefrigerationDi bawah lapisan minyak mineralDi dalam air

• Pengeringan• Freeze drying• Cryopreservation

Pengawetan dan Penyimpanan

• Bagi biakan awal dan simpan 1 biakan sebagai seed stock

• Simpan satu biakan sebagai cadangan • Setelah pengawetan, viability, purity, dan

identitas harus di cek ulang dan dibandingkan dengan data aslinya atau referensi

• Morfologi, patogenitas, sifat-sifat fisik dan biokimia harus diuji

• Semua pengamatan harus dicatat dan disimpan untuk referensi di masa yad.

Metode Pengawetan mikroorganismePenumbuhan pada agar miring• Metode yang paling mudah dan murah • Disimpan di dalam lemari pendingin

dapat membantu mengurangi frekuensi sub-kultur

Metode pengawetan mikroorganisme

Kerugian metode sub-kultur pd agar• Kemungkinan terjadi variasi genetik

akibat pemindahan berulang, hilangnya sifat patogenitas atau karakteristik fisiologi dan morfologi lainnya

• Kemungkinan kontaminasi besar• Memerlukan pengawasan yang ketat

supaya biakan tidak tertukar atau terkontaminasi

Pengawetan dan PenyimpananKeuntungan metode sub-kultur pada agar :

• Koleksi biakan dapat disimpan dalam waktu cukup lama dibawah pengawasan ahlinya.

• Metodenya cukup murah dan tidak memerlukan teknisi khusus. Untuk jumlah koleksi yang sedikit, metode ini cukup menguntungkan

• Penumbuhan mudah karena tidak perlu waktu adaptasi yang lama.

• Periode pemindahan : 2 – 4 minggu atau 2 – 4 bulan

Di bawah minyak mineral

Biakan di atas agar miring di dalam 30 ml universal bottles lalu dituangkan minyak mineral di atasnya. Hal ini dapat mencegah dehidrasi dan memperlambat aktivitas metabolisme dan pertumbuhan karena kurangnya tekanan oksigen

Pengawetan dengan Minyak mineral

• Metode ini pertama kali digunakan oleh Buell &Weston (1947)

• Biakan sehat yang cukup usianya ditutup dengan 10mm minyak mineral steril (liquid paraffin or medicinalparaffin dengan specific gravity 0.830-0.890).

• Minyak disterilkan dengan autoklaf dua kali pada121°C selama 15 menit

• Penumbuhan kembali dari minyak dilakukan dengancara mengambil sejumlah koloni dengan jarumbiakan dan minyak dibuang sebanyak mungkin.

• Cara menginokulasi agar di posisi tengah-tengahkadangkala memberikan hasil yang lebih baiksehingga minyak dapat dikeluarkan dengan mudahmelalui slope

Pengawetan dalam Minyak mineral

Kerugian penyimpanan dalam minyak mineral :• Kontaminasi oleh spora mikroba dari udara• Hambatan pertumbuhan pada saat retrieval• Pertumbuhan terus terjadi di bawah kondisi

yang tidak nyaman dapat mengarah pada mutasi

Pengawetan dalam Minyak mineral

Keuntungan :• Peralatan murah dan pengerjaan mudah• Beberapa mikroorganisme hanya dapat

disimpan di dalam minyak mineral• Namun penyimpanan di bawah minyak mineral

disarankan untuk laboratorium yang memiliki keterbatasan sumbar daya dan fasilitas

Penyimpanan dalam air

Potongan agar atau suspensi spora dapat disimpan dalam air

Penyimpanan dalam airCara :1. Potongan agar ukuran 6 mm diambil dari

ujung pertumbuhan koloni jamur 2. Potongan tsb ditempatkan di dalam air steril

di dalam botol McCartney dan tutup erat , lalu disimpan pada suhu 20-25°C.

3. Peremajaan dilakukan dengan mengambil potongan agar tsb, tempatkan terbalik pada medium pertumbuhan yang sesuai

Penyimpanan dalam air

• Jangka waktu penyimpanan dapat mencapai 2-3 tahun , misalnya untuk spesies of Phytophthora dan Pythiumtanpa adanya perubahan fisik (Onions & Smith, 1984).

Penyimpanan dalam air• Pertama kali dilakukan oleh Castellani (1939,

1967) yang menyimpan fungi yang patogen thp manusia

• Figueiredo (1967) menyimpan 22 patogen tanaman tanpa kehilangan patogenitasnya.

• Figueiredo & Pimentel (1975) melaporkan penyimpanan dalam air bisa mencapai 10 years

• Boeswinkel (1976) menyimpan 650 patogen a.l. Oomycota, Ascomycota, Basidiomycotadan mitotic fungi selama 7 tahun.

• Ellis (1979) menyimpan Entomophthorales, Pyrenomycetes, Hymenomycetes, Gasteromycetes dan Hyphomycetes

Teknik pengeringan and freeze‐drying

• Penghilangan air akan mengurangi laju metabolisme sel

• Dapat dilakukan dengan pengeringan udara• Dapat pula dengan penambahan absorbant spt

tanah, silica gel, atau desiccant lain. • Cara Freeze-dry dengan vacuum dari keadaan

beku dengan cara sublimasi es

Response of cells to freezing. Slow cool: cells can maintaing osmostic equilibrium by water efflux; thus cells shrink and only extracellular ice forms. Rapid cool: cells cannot lose water rapidly enough to maintain osmotic equilibrium; thus cells shrink slightly and contain a few large ice crystals. Very rapid cool: cells contain a large number of small ice

crystals.

SLOWCOOL

RAPIDCOOL

VERYRAPIDCOOL

-2OC

-5OC

< -10OC

What happens to a cell when it freezes?

Penyimpanan dalam Silica Gel

• Sporulating fungi dpt disimpan selama 7-18 tahun • C.F. Roberts, University of Leicester menyimpan fungi

lebih dari 25 years menggunakan metode dari Perkins (1962), semua galur terbukti stabil.


Cara :

1. Sepertiga penuh botol universal 30 ml isi dengan silica gel dansterilkan dengan dry heat (180°C selama 3 jam).

2. Tempatkan botol di dalam rak dengan air dan bekukan (nominal- 20°C).

3. Siapkan suspensi spora di dalam 5% (w/v) skimmed milk yangtelah didinginkan.

4. Tambahkan kira-kira 1 ml biakan tersebut ke dalam silica geldan goyangkan agar tercampur homogen.

5. Simpan botol dengan tutup longgar selama 10-14 hari pada25°C sampai silica gel crystals mengering dan siap untukdipisahkan.

6. Kencangkan tutupnya dan simpan botol pada 4°C dalam wadahkedap udara dengan indicator silica gel untuk mengabsorbsilembab.

Penyimpanan dalam Silica gel

• Banyak fungi yang tahan lama denganmetode ini (Perkins, 1962; Ogata, 1962;Onions, 1977; Smith & Onions, 1983).

• Spora yang berdinding tipis cenderung tidakdapat bertahan.

• Keberhasilannya tergantung biakan yangsehat, dan hal ini dapat ditunjukkan dariperbedaan biakan dari setiap isolat.

• Metode ini dpt digunakan bila fasilitas freeze-drying tidak tersedia, walaupun ada bbrpfungi yang tidak dapat bertahan lama dgncara ini.


Penumbuhan kembali dgn cara menyebarkan beberapa kristal ke dalam medium pertumbuhan yang sesuai


Kekurangan cara silica gel :• Hanya terbatas pada sporulating fungi, dan tidak

sesuai untuk Pythium, Phytophthora danbeberapa Oomycota, juga beberapa fungibermiselium yang memiliki spora yangkompleks.

• Kemungkinan terjadinya kontaminasi cukupbesar setelah beberapa kali peremajaan.


Keuntungan cara silica gel :• Murah dan sederhana• Menghasilkan biakan yang stabil untuk

banyak sporulating fungi termasuk Basidiomycota.

• Kontaminasi dari bakteri dapat dihindari karena kondisi yang kering

• Peremajaan inokulum dapat dilakukan dengan mengmbil beberapa butir dari satu botol, walaupun disarankan tetap memisahkan biakan stock dari biakan kerja.

Penyimpanan dalam tanah

• Tanah harus diautoklaf dua kali (121 C for 15 min) sebelum diinokulasi dengan 1 ml suspensi spora dalam air steril

• Inkubasi pada 20-25 C selama 5-10 days tergantung pada laju pertumbuhan fungi


• Fusarium (Gordon, 1952; Booth, 1971)• Atkinson (1953) menyimpan Rhizopus, Alternaria,

Aspergillus, Circinella dan Penicillium.• Patogenitas Septoria dari sereal setelah 20 bulan

tetap tinggi (Shearer et al., 1974) dan jugaPseudocercosporella selama 1 tahun (Reinecke &Fokkema, 1979).

• Gordon's collection menunjukkan bahwa 76% isolatFusarium equiseti, 75% F. semitectum dan 50% F.acuminatum tumbuh tidak terkendali (Booth, 1971).

• Penyimpanan dalam tanah sebaiknya digunakanuntuk Fusarium dibandingkan di dalam minyakkarena adanya perubahan (variasi) terjadi dalamminyak.


Keuntungan :• Biakan dapat bertahan sampai 10

tahun.• Peremajaan berulang dapat dilakukan

dari sampel yang sama, walaupunsebaiknya stok harus ditempatkanterpisah.

• Biaya murah dan alat sederhana


Kerugian :• Kemungkinan terjadi variasi genetik• Beberapa fungi tidak dapat tahan di

desikasi • Kemungkinan kontaminasi lebih besar

Oomycota

• Paling baik disimpan di bawah nitrogen cairdengan kecepatan pendinginan 10°C min-1,walaupun beberapa galur tidak dapat disimpandengan cara ini.

• Di bawah minyak mineral dapat disimpansampai 6 bulan

• Tiga galur Phytophthora dapat tahan sampai 40tahun (laporan dari CABI-UK)

• Kultur dapat disimpan dalam air namun perlu ditransfer setiap 2 tahun

Zygomycota

• Nitrogen cair sangat disarankan untuk penyimpanan Mucor, Rhizopus dan genus lainnya

• Dapat pula dengan cara freeze-dried • Tidak semua genus tahan proses dehidrasi,

terutama dengan silica gel, misalnya Coemansia, Martensiomyces, Condiobolus, Entomophthora, Piptocephalis and Syzygites. Dari genus2 ini, hanya Piptocephalis dan Coemansia yang dapat di freeze dried.

Basidiomycota

• Umumnya tumbuh dalam bentuk miselium Fungi demikian hanya dapat disimpan dengan cara transfer regular pada agar dengan atau tanpa minyak, atau disimpan di nitrogen cair.

• Fungi tersebut menghasilkan dinding hifa yang tebal jadi mudah di freeze-dried tetapi sukar ditumbuhkan kembali

• Basidiospores yang diperoleh dari fungi yang tumbuh di alam, dapat di freeze-dried

Fungi Deuteromycota

• Fungi yang ber konidia reltif mudah di simpan

• Freeze-drying adalah teknik yang paling tepat.

• Aspergillus, Penicillium and Paecilomycesdapat disimpan mulai dari 6 bulan sampai 2 tahun pada agar miring pada -18°C.

Ragi

• Ragi (single celled vegetative yeasts)dapat disimpan dengan cara freeze-drying.

• Kebanyakan spesies dapat tahandisimpan dalam silica gel namun sukarditumbuhkan kembali

• Liquid nitrogen adalah cara yang palingbaik.

RangkumanMethod Cost Stability Longevity

Cryopreservation below –130oC

High Excellent >10 000 years

Freeze-drying High Little change reported

4-40 years

Silica gel Low Little change reported

5-20 years

Water Low Variation linked to storage time

2-7 years

Soil Low Variation common

5-20 years

Oil Low Change expected with time

1-50 years

Growth 18-22 oC Low-Medium Change expected with time

2 weeks to 6 months

Growth 4-7 oC Medium Change expected with time

6-12 months

cara pengawetan fungi.pdf

Documents