bab v optimasi potensi bakteri bacillus subtilis sebagai … · 2019. 10. 16. · bab 5 optimasi...

Bab 5 Optimasi Potensi Bakteri Bacillus subtilis sebagai sumber enzim Protease

72

BAB V OPTIMASI POTENSI BAKTERI Bacillus subtilis

SEBAGAI SUMBER ENZIM PROTEASE

Uji Proteolitik Bakteri Bacillus subtilis

Pada penelitian ini bakteri yang menjadi sampel

adalah bakteri Bacillus subtilis yang merupakan isolat

potensial yang diisolasi dari usus ikan Nila (Oreochromis

niloticus) yang dibudidayakan di Karamba Jaring Apung

(KJA) Danau Maninjau.

Hasil penelitian ini menunjukan bakteri Bacillus

subtilis mempunyai aktivitas proteolitik. Bakteri yang

mempunyai aktivitas proteolitik mempunyai

kemampuan untuk menghasilkan enzim protease yang

disekresikan ke lingkungannya. Enzim proteolitik

ekstraseluler ini selanjutnya bekerja menghidrolisis

senyawa-senyawa bersifat protein menjadi

oligopeptida, peptida rantai pendek dan asam amino.

Diameter zone hambat yang terbentuk dapat

menunjukan secara kualitatif tigginya kemampuan

proteolitik enzim protease yang dihasilkan atau juga


73

tingginya jumlah enzim yang diproduksi dan dilepas

keluar. Keberadaan enzim protease ekstraseluler ini

sangat penting bagi kehidupan bakteri karena

menyediakan kebutuhan senyawa bernitrogen yang

dapat diangkut ke dalam sel. Jenis-jenis bakteri yang

mempunyai kemampuan mensekresikan enzim protease

ini memiliki potensi yang besar untuk digunakan sebagai

agensia pembersih bahan pencemar yang bersifat

protein. Pakan ikan kaya akan protein sehingga sisa

pakan dan produk ekskreta juga mengandung protein

tinggi. Maka keberadaan enzim protease ekstraseluler

ini akan merombak senyawa-senyawa protein ini

menjadi senyawa sederhana yang langsung dapat

digunakan oleh bakteri sebagai komponen nutrisinya

untuk pertumbuhannya.

Pada penelitian ini difokuskan salah satunya pada

jenis enzim proteolitik karena komponen utama pakan

ikan adalah protein. Berdasarkan hasil penelitian

diperoleh bakteri Bacillus subtilis mempunyai


74

kemampuan menghasilkan enzim proteolitik

ekstraseluler. Kemampuan bakteri probiotik untuk

memproduksi enzim proteolitik ekstraseluler

mempunyai peranan penting dalam ikut serta mencerna

senyawa-senyawa yang bersifat protein. Adapun nilai

indeks proteolitik dari ke isolat bakteri Bacillus subtilis

terpilih dapat dilihat pada Gambar 12.

Gambar 12. Hasil Uji Aktivitas Proteolitik Isolat Bakteri Bacillus

subtilis pada Medium Skim Milk Agar (SMA) .

Protein yang terdapat pada media selektif SMA

bertindak sebagai induser bagi enzim protease. Zona


75

bening yang dihasilkan merupakan hasil hidrolisis

substrat protein yang terkandung dalam media SMA

oleh enzim protease yang dihasilkan oleh isolat

bakteri. Media SMA mengandung pepton dan susu skim

sebagai sumber karbon utama bagi kebutuhan

metabolisme bakteri.

Protease dapat dihasilkan oleh tumbuhan, hewan,

dan mikroorganisme. Penggunaan tumbuhan sebagai

sumber protease terbatas oleh tersedianya lahan tanam

dan kondisi pertumbuhan yang sesuai, serta

memerlukan waktu produksi enzim yang lama. Produksi

protease dari hewan juga dibatasi oleh ketersediaan

ternak penghasil enzim. Mikroorganisme merupakan

sumber enzim yang paling potensial dibandingkan

tanaman dan hewan. Penggunanan mikroorganisme

lebih menguntungkan karena pertumbuhannya cepat,

dapat tumbuh pada substrat yang murah, lebih mudah

ditingkatkan hasilnya melalui pengaturan kondisi

pertumbuhan dan rekayasa genetik. Beberapa genus

bakteri yang diketahui mampu menghasilkan protease


76

di antaranya Bacillus, Lactococcus, Streptomyces, dan

Pseudomonas (Rao dkk., 1998; Said dan Likadja, 2012).

Musikasang et al., (2009) menetapkan

kemampuan untuk mencerna protein sebagai salah satu

kriteria seleksi probiotik. Adanya enzim proteolitik ini

selanjutnya akan meningkatkan jumlah senyawa yang

bersifat protein yang dicerna sehingga menurunkan

jumlah limbah yang mengandung Nitrogen yang berasal

dari proses pencernaan. Hal ini menguntungkan karena

akan menekan jumlah amonia yang berasal dari proses

mineralisasi N-organik yang diharapkan dapat

memecahkan masalah kematian masal ikan yang sering

terjadi di Danau Maninjau.

Berdasarkan Gambar 12 aktivitas proteolitik isolat

bakteri Bacillus subtilis yakni dengan indeks proteolitk

26 dan dapat dijadikan sebagai kandidat probiotik.

Menurut Baehaki (2011), Bacillus sp merupakan salah

satu jenis bakteri yang memiliki kemampuan untuk

menghasilkan protease. Protease merupakan satu

diantara tiga kelompok enzim komersial yang


77

diperdagangkan sebagai katalisator hayati. Protease

dimanfaatkan dalam berbagai aplikasi industri pangan

dan non-pangan.

Penelitian tentang uji aktivitas enzim proteolitik

yang terdapat pada saluran pencernaan ikan sebagai

kandidat probiotik juga dilakukan oleh Subagyo dan

Djunaedi (2011) menemukan seluruh isolat mempunyai

kemampuan menghasilkan enzim proteolitik protease.

Hasil penelitian Mubarik et al., (2006) menunjukkan

bahwa isolat NU-2 merupakan bakteri proteolitik

dengan nilai Indeks Proteolitik (IP) sebesar 1.89 dan

berpotensi untuk dijadikan probiotik karena mampu

menghasilkan baik protease, α-amilase, dan

glukoamilase ekstraseluler.

Selanjutnya Kumaran et al., (2013) juga

melakukan penelitian isolasi bakteri proteolitik pada

kotoran ikan Neimterus japonicus di India memperoleh

30 isolat bakteri yang terdiri dari empat genus bakteri

yakni Bacillus sp, Pseudomonas sp, Alkaligenes sp. dan

Lactobacillus sp. Geethanjali dan Subash (2011)


78

menemukan bakteri Bacillus subtilis yang diisolasi dari

saluran pencernaan ikan air tawar Labeo rohita yang

berasal dari India, memiliki aktivitas proteolitik yang

tertinggi. Natarajan et al,. (2014) melakukan isolasi

bakteri dari ikan Rohu (Labeo rohita) menemukan

bakteri Bacillus cereus sebagai kandidat probiotik.

Spesies Bacillus sp. merupakan salah satu

mikrob penghasil enzim protease yang potensial.

Beberapa enzim protease komersial berhasil

dimurnikan, misalnya Alcalase (B. licheniformis),

Esperase (B. lentus), Biofeed pro (B. licheniformis) dan

Subtilisin (B. alcalophilus) (Gupta et al,. 2002). Tari et al.

(2005) melaporkan bahwa Bacillus sp. L21 dapat

menghasilkan enzim protease yang bersifat tahan basa.

Sementara itu, Suganthi et al. (2013) melaporkan

bahwa Bacillus licheniformis dapat menghasilkan enzim

protease yang bersifat halotoleran


79

Pengaruh Jenis Medium terhadap Akrivitas Enzim Protease dari bakteri Bacillus subtilis

Modifikasi formulasi medium yang sangat

diperlukan untuk mendapatkan perolehan hasil yang

maksium (Stanbury and Whitaker, 1987 dalam

Agustien, 2010). Medium yang digunakan dalam

penentuan aktivitas enzimprotease dari bakteri Bacillus

subtilis ini adalah medium A: Glukosa Yeast Skim (GYS)

yang komposisinya terdiri dari 0,3% glukosa, 1% yeast

ekstrak dan 2% susu skim., medium B: Horikoshi yang

komposisinya terdiri dari 0,1% glukosa, 0,5% yeast

ekstrak, 0,5% pepton, 0,1% KH2PO4, 0,02% MgSO4 dan

1% Na2CO3. Medium C (Son and Kim, 2002) terdiri

0,2% glukosa, 0,2% yeast ekstrak, 0,2% pepton, 1%

susu skim dan 0,4% NaCl., dan medium D: Luria Bertani

(LB) yang komposisinya terdiri dari o,5% yeast ekstrak,

1% NaCl, dan 1% pepton.

Hasil pengujian pengaruh jenis medium

produksi terhadap aktifitas spesifik enzim protease


80

menunjukkan bahwa bakteri Bacillus subtilis setelah

dilakukan inkubasi selama 48 jam pada suhu 37oC

memiliki pengaruh yang berbeda- beda tergantung

pada jenis atau komposisi medium seperti terlihat pada

Tabel 5 dan Gambar 13 .

Tabel 5. Jenis Medium Produksi Enzim Protease Bakteri Bacillus subtilis

No Jenis Medium Reaksi

1 A Keruh, banyak endapan 2 B Bening, sedikit endapan 3 C Bening, sedikit endapan 4 D Agak keruh, sedikit

endapan


81

Gambar 13. Jenis Medium Produksi Enzim Protease Bakteri Bacillus

subtilis dan Aktivitas setelah Inkubasi


82

Medium GYS yang menghasilkan aktifitas

tertinggi diantara medium lainnya. Berdasarkan Gambar

13 terlihat bahwa terdapat banyak endapan pada dasar

tabung reaksi dibandingkan medium B, C dan D. Hal ini

ditandai dengan kultur yang berwarna keruh pada

pengamatan selama 48 jam. Kultur bakteri yang semula

tidak memiliki endapan berubah warna menjadi keruh

sebagai tanda terjadinya pertumbuhan bakteri setelah

masa inkubasi yang disebabkan oleh proses

metabolisme yang dilakukan oleh bakteri tersebut.

Sesuai dengan pendapat Lay (1994), di dalam

medium cair bakteri akan tumbuh dalam waktu 24 - 48

jam. Pertumbuhan bakteri dalam suatu media cair

dapat terlihat dalam berbagai bentuk, yaitu: 1).

Kekeruhan yang biasanya terlihat pada seluruh bagian

medium, 2). Pertumbuhan pada permukaan yang dapat

berbentuk pelikel (pertumbuhan di atas bagian media

cair), cincin (pertumbuhan berbentuk cincin pada

permukaan media cair), flokulen atau membran. 3).

Sedimen atau endapan, yaitu kumpulan sel-sel yang


83

mengumpul pada dasar tabung dan akan menyebar lagi

jika tabung digerakkan atau dikocok. Medium pada

bagian atas tabung mungkin akan tetap bening jika

inkubasi dilakukan lebih lama.

Hal ini disebabkan perbandingan komposisi

didalam medium sangat mendukung bakteri untuk

hidup dan berkembang biak serta sumber karbon

yang terdapat pada media sehingga menghasilkan

nilai aktifitas tinggi (Nagar et al., 2010). Medium yang

berbeda-beda akan menghasilkan aktifitas enzim yang

berbeda- beda juga, seperti Bacillus licheniformis yang

diisolasi dari tanah Tihamet Aseer Arab Saudi jika

ditumbuhkan pada medium Casein broth selama 36

jam dapat menghasilkan protease dengan aktifitas 221

unit/ml (Al-Shehri et al., 2004).

Penentuan Waktu Optimum Produksi Protease dari bakteri Bacillus subtilis

Bakteri pada media produksi tersebut

diinkubasi pada suhu 37oC, 120 rpm selama ± 3 hari.


84

Setiap 6 jam dilakukan samping untuk pengukuran

pertumbuhan mikroba (Pengukuran OD), uji aktivitas

serta analisis kadar proteinnya. Untuk hasil pengujian

optical density (OD) dan uji aktivitas enzim berdasarkan

waktu fermentasi terlihat pada Tabel 6.

Tabel 6. Data hasil penentuan waktu produksi optimum protease dari bakteri dan optical density

(OD)

No Waktu Fermentasi (Jam) Optical Density

(OD)

1 0 0,028 2 6 0,057 3 12 0,071 4 18 0,129 5 24 0,132


85

Gambar 14. Waktu Produksi Optimum Enzim Protease dari Bakteri

Bacillus subtilis dan Optical Density (OD)

Secara teoritis kultur Bacillus subtilis

menghasilkan asam laktat dalam jumlah yang relatif

tinggi karena ditumbuhkan dalam medium GYS yang

mengandung sumber karbon yang cukup untuk

dimanfaatkan secara optimal dalam aktivitas

metabolismenya. Pada saat populasi mikroba mulai

stasioner maka produksi asam laktat juga stasioner atau

bertambah dengan peningkatan yang relatif sedikit. Hal

ini kemungkinan disebabkan karena jumlah zat gizi

dalam media pada fase ini sudah mengalami


86

penurunan. Penggunaan substrat oleh mikroba tidak

lagi untuk pertumbuhan dan produksi asam laktat,

tetapi lebih banyak untuk metabolisme sekunder .

Pengamatan fase pertumbuhan bakteri

dilakukan dengan mengamati perubahan populasi

dan nilai kerapatan optik (optical density = OD).

Faturrahman (2012) mendapatkan isolat bakteri

kandidat probiotik yaitu Abn2.1 dan Alg 3.1 dengan

fase lag terjadi antara 0 dan 2 jam. Cepat atau

lamanya fase lag memberikan konsekuensi pada fase

eksponensial dan laju dari pertumbuhan bakteri. Fase

eksponensial tercepat merupakan bakteri yang cukup

baik digunakan sebagai probiotik. Kandidat bakteri

probiotik Np 4 dan Np 5 berasal dari ikan Nila

mencapai fase eksponensial tercepat (Putra, 2010).

Hal ini berhubungan dengan waktu panen sel bakteri

dalam memproduksi suatu produk atau senyawa

metabolit, diantaranya adalah enzim, antibakterial,

vitamin dan asam organik. Menurut Faturrahman

(2012) bahwa isolat bakteri kandidat probiotik yang


87

baik adalah yang memiliki laju pertumbuhan tercepat

hal ini dikarenakan berhubungan dengan kemampuan

isolat untuk berkompetisi dengan bakteri lain

untuk menempel pada saluran pencernaan. Sebagian

besar mikroorganisme uniseluler tumbuh eksponensial

namun dengan laju yang bervariasi karena dipengaruhi

oleh berbagai kondisi lingkungan seperti, suhu,

substansi kimia dan ciri genetika dari mikroorganisme

(Madigan et al. 2009).

Pada Gambar 14 terlihat bahwa fase

pertumbuhan isolat bakteri Bacillus subtilis terdiri dari

empat fase yakni fase lag, fase eksponensial, fase

stasioner dan fase kematian. Pada fase lag biasanya

bakteri melakukan proses aklimatisasi terhadap kondisi

lingkungan seperti pH, suhu, nutrisi dan lain sebagainya.

Pada fase ini peningkatan jumlah bakteri berlangsung

lambat. Fase lag untuk isolat bakteri Bacillus subtilis

VITNJ1 berlangsung selama jam ke-1 sampai jam ke - 2.

Fase kedua adalah fase eksponensial yang merupakan

fase dimana pertumbuhan bakteri berlangsung sangat


88

cepat. Pada isolat bakteri Bacillus subtilis VITNJ1 fase

eksponensial terjadi pada jam ke - 3 sampai jam ke - 18.

Fase berikutnya adalah fase stasioner yakni

terjadi pada jam ke-19 sampai jam ke-24, dimana pada

fase ini tidak terjadi penambahan jumlah sel bakteri

karena jumlah sel yang tumbuh sama dengan jumlah sel

yang mati. Fase terakhir adalah fase kematian yang

pada isolat bakteri Bacillus subtilis mulai terjadi setelah

jam ke-24, dimana pada fase ini jumlah sel bakteri mulai

menurun karena nutrien dalam media dan cadangan

energi dalam sel mulai menipis.

Berdasarkan Gambar 14 pada fase logaritmik

(sebelum memasuki fase eksponensial) terjadi pada jam

ke-2. Secara teoritis kultur Bacillus subtilis

menghasilkan asam laktat dalam jumlah yang relatif

tinggi karena ditumbuhkan dalam medium MRS broth

yang mengandung sumber karbon yang cukup untuk

dimanfaatkan secara optimal dalam aktivitas

metabolismenya. Pada saat populasi mikroba mulai

stasioner maka produksi asam laktat juga stasioner atau


89

bertambah dengan peningkatan yang relatif sedikit. Hal

ini kemungkinan disebabkan karena jumlah nutrisi

dalam media pada fase ini sudah mengalami

penurunan. Penggunaan substrat oleh mikroba tidak

lagi untuk pertumbuhan dan produksi asam laktat,

tetapi lebih banyak untuk metabolisme sekunder yaitu

menghasilkan metabolit yang lain diantaranya adalah

bakteriosin.

Pola pertumbuhan isolat bakteri Bacillus subtilis

ini hampir sama dengan penelitian Torkar dan Matijasic

(2003) yang melakukan penelitian tentang karakterisasi

senyawa antimikroba yang dihasilkan oleh bakteri

Bacillus cereus yang berasal dari susu dan produk

olahannya menemukan bahwa produksi senyawa

antimikroba bakteriosin memasuki fase stasioner

setelah 10-16 jam inkubasi. Begitu juga dengan

penelitian Naclerio et al., (1993) tentang produksi dan

aktivitas senyawa antimikroba cerein dari Bacillus

cereus terdapat pada fase stasioner. Selanjutnya Cherif

et al., (2003), menemukan thuricin 7 yang dihasilkan


90

oleh Bacillus thuringiensis BMG1.7 pertumbuhannya

terjadi pada fase eksponensial. Senyawa antimikroba

yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat umumnya

termasuk kedalam kelas lantibiotik yang biasanya

dihasilkan pada fase eksponensial.

Pemantauan Produksi Enzim Protease Bakteri

Penelitian ini dilakukan dengan mengukur produksi

enzim protease yang disekresikan oleh bakteri

proteolitik terpilih dari waktu ke waktu, yang diukur

dari aktivitasnya. Tujuannya untuk mendapatkan

titik waktu yang optimal untuk pemanenan enzim

protease. Pengamatan dilakukan setiap 4 jam sekali

selama 5 hari (25 titik pemantauan) dari waktu

kulturnya. Pemantauan produksi enzim protease ini

disertai dengan pengamatan optical density (OD)

atau kerapatan optis dengan spektrofotometer

pada panjang gelombang 620 nm.

Pengukuran pertumbuhan bakteri merupakan hal

yang penting untuk dilakukan dalam karakterisasi bakteri.


91

Dari pengukuran pertumbuhannya maka dapat diketahui

fase-fase dalam dalam kurva pertumbuhan bakteri, yang

terdiri dari fase lag, eksponensial/logaritmik, stasioner dan

kematian. Hal tersebut berkaitan erat dengan laju

pertumbuhan bakteri. Fase eksponensial dari pertumbuhan

bakteri ditunjukkan dengan pertambahan nilai absorbansi

bakteri yang lebih besar dibandingkan dengan pertambahan

absorbansi pada saat fase lag dan stasioner. Pada fase

eksponensial, biomassa bakteri akan meningkat dan terjadi

aktivitas metabolisme, sintesis enzim, hormon antibiotik dan

senyawa metabolit sekunder lainnya. Oleh karena itu

pengukuran aktivitas enzim-enzim yang dihasilkan oleh

bakteri dilakukan pada saat pertumbuhan bakteri mencapai

fase eksponensial. Aktivitas enzim tertinggi yang dihasilkan

oleh bakteri diperkirakan dicapai pada saat fase

eksponensial, sedangkan produksi metabolit sekunder

diduga dicapai pada saat fase eksponensial akhir atau awal

stasioner.

Bakteri pada media produksi tersebut diinkubasi

pada suhu 37oC, 120 rpm selama ± 5 hari. Setiap 4 jam

dilakukan samping untuk pengukuran pertumbuhan


92

mikroba (pengukuran OD), uji aktivitas serta analisis kadar

proteinnya. Untuk hasil pengujian optical density (OD) dan

uji aktivitas enzim berdasarkan waktu fermentasi terlihat

pada Tabel 7.


93

Tabel 7 .Data hasil penentuan waktu produksi optimum

protease, optical density (OD) dan aktivitas protease dari bakteri

No. Waktu

Fermentasi (Jam)

Optical Density (OD)

Aktivitas Enzim Protease (U/ml)

1 4 0,891 8.15

2 8 1,458 8.56

3 12 1,671 8,64

4 16 1,876 8.85

5 20 2,301 9.72

6 24 2,223 8,93

7 28 2,209 8.52

8 32 2,178 8.48

9 36 2,122 8,41

10 40 2,119 8,39

11 44 2,113 8,31

12 48 2,081 8.06

13 52 2,078 8,03

14 56 2,071 8.02

15 60 2,065 7,98

16 64 2,054 7,86

17 68 2,046 7,83

18 72 2,037 7,78

19 76 2,034 7,62

20 80 2,021 7,46

21 84 2,019 7,42

22 88 2,015 7,38

23 92 2,008 7,36

24 96 2,001 7.35


94

Hasil pengamatan menunjukkan bahwa pertumbuhan

bakteri mengalami fase adaptasi pada jam ke-4 hingga

jam ke-8. Selama waktu tersebut bakteri mulai

menyesuaikan diri dengan lingkungan yang baru, sehingga

sel belum membelah. Fase eksponensial terjadi pada jam ke-

16 hingga jam ke-20. Pada fase eksponensial sel-sel bakteri

sangat aktif membelah dan metabolisme sel berlangsung

cepat. Pertumbuhan bakteri mulai melambat ketika

memasuki fase stasioner, yaitu mulai pada jam ke-28, hal

ini disebabkan nutrisi dan substrat di dalam media mulai

berkurang, sehingga kematian sel meningkat. Jumlah sel yang

mati semakin meningkat sampai terjadi suatu keadaan

dimana jumlah sel yang hidup sama dengan jumlah sel yang

mati, halini terjadi sampai jam ke 96. Fase terakhir adalah

fase kematian, hal ini terjadi karena jumlah substrat dan

nutrisi hampir habis, sehingga sel semakin lama sudah tidak

dapat tumbuh lagi. Pada bakteri, pertumbuhan optimal sel

berada pada fase eksponensial.


95

Optimasi Produksi Enzim Protease

1. Penentuan Suhu Optimum

Umumnya setiap enzim memiliki aktivitas maksimum pada

suhu tertentu. Aktivitas enzimakan semakin meningkat

dengan bertambahnya suhu hingga suhu optimum tercapai.

Setalah itu kenaikan suhu lebih lanjut akan menyebabkan

aktivitas enzim menurun. Pengaruh suhu terhadap ekstrak

kasar enzim protease dari Bacillus subtilis dapat dilihat pada

Gambar 15 di bawah ini.

Gambar 15. Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim protease dari bakteri Bacillus subtilis

Aktivitas enzim protease kasar dari bakteri Bacillus subtilis

tertinggi terdapat pada suhu 55oC dengan nilai aktivitas

enzimnya 12,35 u/ml dan yang terendah terdapat pada suhu

30oC dengan aktivitas enzim 9,02 u/ml. Hasil penelitian ini

sejalan dengan penelitian Thys dan Brandelli (2006), bahwa


96

suhu optimum enzim dari Microbacterium sp. adalah 50oC,

55oC dari bakteri Chryseobacterium sp. (Riffel et al., 2003)

dan 60oC dari bakteri Bacillus licheniformis (Suntornsuk et

al., 2004).

Untuk kebanyakan enzim suhu optimum adalah

suhu sel atau di atas sel tempat enzim-enzim berada.

Kenaikan kecepatan aktivitas enzim di bawah suhu optimum

disebabkan oleh kenaikan energi kinetik molekul-molekul

yang bereaksi. Akan tetapi bila suhu dinaikkan terus, energi

kinetik molekul-molekul enzim menjadi demikian besar

sehingga melampaui penghalang energi untuk memecahkan

ikatan-ikatan sekunder yang mempertahankan enzim dalam

keadaan aslinya atau keadaan katalitik enzim aktif.

Akibatnya struktur sekunder dan tersier hilang disertai

hilangnya aktivitas biologi (Harper, 1979).

Suhu mempengaruhi laju reaksi katalisis enzim

dengan dua cara. Pertama, kenaikan suhu akan

meningkatkan energi molekul substrat dan pada akhirnya

meningkatkan laju reaksi enzim. Peningkatan suhu juga

berpengaruh terhadap perubahan konformasi substrat

sehingga sisi reaktif substrat mengalami hambatan untuk

memasuki sisi aktif enzim dan menyebabkan turunnya


97

aktivitas enzim. Kedua, peningkatan energi termal molekul

yang membentuk struktur protein enzim itu sendiri akan

menyebabkan rusaknya interaksi-interaksi non kovalen

(ikatan hidrogen, interaksi van der Waals, interaksi

hidrofobik, dan interaksi elektrostatik) yang menjaga

struktur tiga dimensi enzim secara bersama-sama sehingga

enzim mengalami denaturasi. Denaturasi menyebabkan

struktur lipatan enzim membuka pada bagian

permukaannya, sehingga sisi aktif enzim berubah dan terjadi

penurunan aktivitas enzim (Hames & Hooper, 2000).

2. Penentuan pH Optimum

Semua reaksi enzim dipengaruhi oleh pH

medium tempat reaksi terjadi. Sebab itulah pada setiap

penelitian dengan enzim diperlukan bufer untuk

mengontrol pH reaksi. Pengaruh pH terhadap ekstrak

kasar enzim protease dari Bacillus subtilis dapat dilihat

pada Gambar 16 di bawah ini.


98

Gambar 16. Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim protease dari bakteri Bacillus subtilis

Aktivitas enzim protease kasar maksimum (pH

optimum) bakteri Bacillus subtilis terdapat pada pH 7,0

dengan nilai aktivitas enzim protease 12,73 unit/ml dan

aktivitas enzim protease terendah terdapat pada pH 4,0

yakni 10,22 unit/ml. Pada pH yang sangat asam (dalam hal

ini pH 4) aktivitasnya sangat kecil yang menunjukkan gugus

fungsionil pada sisi aktif enzim terganggu dengan adanya ion

H+ yang berlebihan, demikian juga pada pH 5 dan 6. Pada pH

7, enzim relatif bekerja lebih maksimum hingga mencapai

tingkat ionisasi yang diinginkan enzim sehingga aktivitas

enzim mencapai maksimum. Sedangkan pada pH 8 aktifitas


99

relatif enzim mengalami penurunan karena ion OH- yang

berlebihan.

Perubahan pH pada skala radiasi kecil menyebabkan

turunnya aktivitas enzim sehubungan dengan perubahan

ionisasi gugus-gugus fungsionilnya karena pada hakekatnya

enzim adalah protein yang tersusun atas asam amino yang

dapat mengadakan ionisasi (mengikat dan melepaskan)

proton ion hidrogen pada gugus asam amino, karboksil dan

gugus fungsionil lainnya. Sebaliknya, pada skala deviasi pH

yang besar perubahan pH akan mengakibatkan enzim

mengalami denaturasi sehubungan dengan adanya

gangguan terhadap berbagai interaksi nonkovalen yang

menjaga kestabilan struktur 3 dimensi enzim. Gugus ionik

berperan penting dalam menjaga konformasi sisi aktif enzim

untuk mengikat dan mengubah substrat menjadi produk

(Hames & Hooper, 2000).

Perubahan pH yang tidak begitu besar

mempengaruhi keadaan ion enzim dan sering keadaan ion

substrat juga. Bila aktivitas enzim diukur pada berbagai pH

aktivitas optimum umumnya didapat antara nilai pH 5,0 dan

9,0. Akan tetapi beberapa enzim misalnya pepsin, aktif pada

nilai pH diluar batas itu. Bentuk kurva aktivitas pH


100

ditetapkan oleh faktor denaturasi enzim pada nilai pH yang

sangat tinggi atau rendah dan pengaruh terhadap keadaan

muatan listrik subsrat atau enzim. Untuk enzim, perubahan

muatan dapat mempengaruhi aktivitas, baik dengan

perubahan struktur maupun dengan perubahan muatan

pada residu asam amino yang berfungsi mengikat substrat

atau katalis. Faktor lain yang penting adalah perubahan

konformasi enzim bila pH diubah-ubah. Suatu gugus yang

bermuatan jauh dari bagian dimana substrat terikat

mungkin perlu untuk mempertahankan struktur tersier atau

kwartener yang aktif. Bila muatan pada gugus ini diubah,

molekul protein dapat terbuka atau menjadi lebih kompak

(Harper, 1979).

bab v optimasi potensi bakteri bacillus subtilis sebagai … · 2019. 10. 16. · bab 5 optimasi...

Documents