BAB IIIMETODE PENELITIAN

1. Kerangka KonsepVariabel TerkendaliPembiakan banteri A.actinomycetemcomitans dalam media gliserin dan dibiakkan sampai konsentrasi 1x108 CFU.Tikus jantan galur wistar usia 2 bulan dengan berat badan 180-200 gram.Induksi bakteri pada gingiva bagian anterior mandibula tikus jantan wistar sebanyak 0,1 ml dengan spuit 1 cc dengan frekuensi 2 kali sehari selama 2 hari.Makrofag dari cairan peritoneal tikus jantan galur wistar usia 2 bulan dengan berat badan 180 gram.Teknik pengambilan makrofag dari cairan peritoneal tikus jantan galus wistar menggunakan jarum suntik ukuran 25 gauge dan spuit injeksi ukuran 10 ml dengan sudut pengambilan sebesar 300.Teknik kultur makrofag in vitro dalam microplate 24 well menggunakan medium RPMI. Volume suspensi makrofag sebanyak 200 l (5x105 sel) dalam tiap sumuran.Kondisi in vitro selama inkubasi kultur makrofag dalam inkubator dengan 5% CO2 dan suhu 370C.Ukuran latex beads yang digunakan, diameter 3 m.Konsentrasi latex beads sebesar 2,5x107/mlVolume latex beads dalam tiap sumuran sebanyak 200 l.Konsentrasi ekstrak buah talok (Muningia calabura L) sebesar 0,01%, 0,005%, 0,001%.

Variabel Terikataktivitas makrofag terhadap latex beads.Variabel Bebasekstrak buah talok (Muningia calabura L).

Variabel Tidak TerkendaliKondisi sistemik individual tikus.Respon imun individual tikus.

Gambar 3.1 Kerangka Konsep1. HipotesisBerdasarkan tinjuan puskata yang telah disajikan, diajukan hipotesis yaitu, terdapat peningkatan reaksi imun tikus jantan wistar yang diinduksi bakteri A.actinomycetemcomitans setelah pemberian ekstrak buah talok (Muningia calabura L) yang ditunjukkan dengan peningkatan aktivitas dan kapasitas fagosit makrofag pada latex beads (secara in vitro).1. Jenis dan Metode PenelitianPenelitian yang digunakan adalah laboratorium eksperimental dengan rancangan percobaan post test only control group design.

1. Lokasi dan Waktu PenelitianPenelitian ini dilakukan di LPPT unit I, unit II, dan unit IV Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.1. Variabel Penelitian1. Variabel BebasVariabel bebas penelitian ini adalah ekstrak buah talok (Muningia calabura L).1. Variabel TerikatVariabel terikat penelitian ini adalah aktivitas makrofag terhadap latex beads.1. Variabel terkendali1. Pembiakan banteri A.actinomycetemcomitans dalam media gliserin dan dibiakkan sampai konsentrasi 1x108 CFU.1. Tikus jantan galur wistar usia 2 bulan dengan berat badan 180-200 gram.1. Induksi bakteri pada gingiva bagian anterior mandibula tikus jantan wistar sebanyak 0,1 ml dengan spuit 1 cc dengan frekuensi 2 kali sehari selama 2 hari.1. Makrofag dari cairan peritoneal tikus jantan galur wistar usia 2 bulan dengan berat badan 180 gram.1. Teknik pengambilan makrofag dari cairan peritoneal tikus jantan galur wistar menggunakan jarum suntik ukuran 25 gauge dan spuit injeksi ukuran 10 ml dengan sudut pengambilan sebesar 300.1. Teknik kultur makrofag in vitro dalam microplate 24 well menggunakan medium RPMI. 1. Volume suspensi makrofag sebanyak 200 l (5x105 sel) dalam tiap sumuran.1. Kondisi in vitro selama inkubasi kultur makrofag dalam inkubator dengan 5% CO2 dan suhu 370C.1. Ukuran latex beads yang digunakan, diameter 3 m.1. Konsentrasi latex beads sebesar 2,5x107/ml1. Volume latex beads dalam tiap sumuran sebanyak 200 l.1. Konsentrasi ekstrak buah talok (Muningia calabura L) sebesar 0,01%, 0,005%, 0,001%. 1. Variabel Tidak Terkendali 1. Kondisi sistemik individual tikus.1. Respon imun individual tikus.1. Definisi OperasionalTabel 3.1 Definisi OperasionalNoVariabelDefinisi OperasinalCara PengukuranSkala

1.Ekstrak buah talok (Muningia calabura L)Sediaan cair buah talok (Muningia calabura L) yang dibuat dengan teknik maserasi dan pelarut akuades.Konsentrasi ekstrak 0,01%, 0,005%, 0,001%ratio

2. MakrofagSel fagosit besar berinti bulat.Pewarnaan GiemsaDesimal

3.Uji viabilitas sel makrofagSuatu uji yang dilakukan untuk mengetahui viabilitas makrofag (makrofag yang hidup)Dengan trypan blue-hemocytometerDesimal

4.MTT-assaySuatu uji kolorimetrik (pewarnaan) yang bertujuan untuk mengukur viabilitas makrofagELISA readerDesimal

5.Aktivitas fagosit makrofagAktivitas fagosit makrofag terhadap media latex beads. Terdapat dua parameter, yaiut kemapuan fagosit dan index fagositKemampuan fagosit: presentase sel yang melakukan fagosit dari 100 sel makrofag

Index fagosit: jumlah latex beads yang difagosit oleh 1 sel makrofag.Ratio

1. Populasi dan Sampela. PopulasiPopulasi penelitian ini adalah tikus jantan galur wistar berusia 2 bulan dengan berat badan 180-200 gram.b. SampelJumlah tikus yang digunakan sebagai sampel ditentutan berdasarkan rumus Federer:(t-1)(n-1) 15Keterangan:t = jumlah perlakuann = besar sampel pada masing-masing perlakuanPenelitian ini menggunakan jumlah ulangan 4, sehingga sampel per kelompok harus lebih dari 5. Penelitian ini menggunakan 6 ekor tikus per kelompok, sehingga jumlah tikus yang dibutuhkan dalam penelitian ini adalah 24 ekor tikus. Penentuan tikus pada masing-masing kelompok perlakuan dengan teknik random sampling yaitu cara pengambilan sampel yang memberikan kesempatan yang sama untuk diambil kepada setiap elemen populasi.1. Sumber DataSumber data yang diperoleh adalah sumber data primer yang diperoleh langsung melalui prosedur penelitian. 1. Alat dan Bahan1. Alat1. Alat pembuatan ekstrak buah talok (Muningia calabura L)a) Pisaub) Timbangan digitalc) Oven blowerd) Alat penyerbuke) Plastikf) Gelas ukurg) Pengaduk elektrikh) Tabung Erlenmeyeri) Toples kacaj) Kertas saringk) Pompa vacuml) Corong buchnerm) Rotary evaporatorn) Shaker evaporatoro) Blower evaporatorp) Pipet tetesq) Tabung reaksir) Plat KLTs) Bejana KLTt) Lampu UV 254 nm dan 365 nm

2. Alat kultur makrofag dan pengambilan seruma) Guntingb) Pinsetc) Hemocytometerd) Inkubator CO2e) Kapasf) Microplate 24 wellg) Sentrifugatorh) Spuit injeksi 10 mli) Jarum suntik 25 gaugej) Tabung sentrifugasik) Coverslipl) Hematokritm) Tabung litium heparin

3. Alat uji morfologi sela) Glass slideb) Deck glassc) Mikroskop fluoresen4. Alat uji aktivitas fagosita) Microplate 24 wellb) Object glassc) Mikroskop cahayad) Inkubator CO25. Alat uji MTT-assaya) Microplate 96 wellb) Microplate readerc) Inkubator CO21. Bahan1. Akuades1. Kloroform1. Anisaldehid1. Anhidrat asetat glasial1. H2SO41. Saponin standar1. Metanol1. Larutan trypan blue (Merck, Germany)1. Media Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Gibeo, Aucland, New Zealand)1. Fetal Bovine Serum (FBS) 2% (Caisson Labs, USA)1. Tikus galur Wistar (Rattus norvegicus)1. Bakteri A. actinomycetemcomitans (Lab. Mikrobio UNAIR)1. Buah talok (Muningia calabura L)1. N-hexane (Merck, Germany)1. Latex beads diameter 3 m (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA)1. Phospat Buffer Saline (PBS) (Gibeo, Auckland, New Zealand)1. Giemsa 20% (Merck, Germany)1. Ketamin hidroklorida 10% (Troy Labs. Pty. Ltd., Australia)1. Ethidium Bromide solution (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, USA)1. MTT 5mg/ml PBS (50 mg MTT dalam 10 ml PBS) (Bio-Basic Canada Inc., Canada)1. SDS 10% dalam 0,1 N HCL (Merck, Germany)1. Serum tikus galur Wistar1. Cara Kerja21. Pembuatan ekstraksi1. Determinasi terlebih dahulu buah talok (Muningia calabura L).2. Dipersiapkan buah talok (Muningia calabura L.).3. Buah talok (Muningia calabura L.) diiris dibagi menjadi dua, lalu dikeringkan menggunakan oven blower selama 2x24 jam.4. Buah talok (Muningia calabura L.) yang sudah kering ditimbang dan digiling agar menjadi serbuk.5. Serbuk buah talok (Muningia calabura L.) dimaserasi menggunakan pelarut akuades kemudian diaduk menggunakan pengaduk elektrik selama 30 menit.6. Hasil adukkan disimpan selama 24 jam.7. Hasil evaporasi disimpan di dalam toples kaca kecil kemudian ditempatkan dalam blower evaporator.8. Dievaporasi menggunakan shaker water bath selama 24 jam.21. Pembiakan bakteri A. actinomycetemcomitansIndukan bakteri di beli dari laboratorium mikrobiologi Universitas Airlangga, lalu pembiakan dilakukan oleh BLK Yogyakarta. Bakteri dibiakkan dalam media gliserin supaya tidak merusak struktur bakteri, hingga konsentrasi 1x108 CFU yang merupakan konsentrasi standar penggunaan bakteri.21. Induksi bakteri A. actinomycetemcomitansDilakukan aklimatisasi sampel selama 7 hari kemudian berat badan tikus ditimbang, lalu dilakukan induksi bakteri dengan cara mengulas A. actinomycetemcomitans sebanyak 0,1 ml dengan spuit 1 cc pada gingiva tikus bagian anterior mandibula 2 kali sehari selama 2 hari.21. Pengambilang sampelSampel diambil dari tikus yang sifat genetiknya sama, maka pengambilan sampel secara random atau tidak, bukan merupakan masalah. Sampel diambil secara acak untuk menghindari bias karena faktor umur dan berat badan dan dilakukan penimbangan setelah dan sesudah pengambilan. Tikus diadaptasikan dahulu selama 1 minggu dan diberikan perlakuan yang sama sebelum dilakukan perlakuan uji eksperimental. Tikus yang telah diadaptasikan selama 1 minggu lalu dibagi menjadi 4 kelompok secara acak, masing-masing kelompok berjumlah 6 ekor tikus, yaitu kelompok K, P1, P2, dan P3.Keterangan :K: kelompok perlakuan kontrol, tikus diinduksikan bakteri A. actinomycetemcomitans 0,1ml dan diberi akuades.P1: kelompok perlakukan satu, tikus diinduksikan bakteri A. actinomycetemcomitans 0,1ml dan diberi ekstrak buah talok dengan konsentrasi 0,01% setiap 3 kali sehari selama 3 hariP2:kelompok perlakukan dua, tikus diinduksikan bakteri A. actinomycetemcomitans 0,1ml dan diberi ekstrak buah talok dengan konsentrasi 0,005% setiap 3 kali sehari selama 3 hari.P3:kelompok perlakukan tiga, tikus diinduksikan bakteri A. actinomycetemcomitans 0,1ml dan diberi ekstrak buah talok dengan konsentrasi 0,001% setiap 3 kali sehari selama 3 hari.

1. Alur Penelitian

Tikus jantan galur Wistar 24 ekor

Adaptasi selama 7 hari

Randomisasi

Induksi bakteri A. actinomycetemcomitans

Kel. Perlakuan 3Diet standar + ekstrak buah talok 0,001%Kel. Perlakuan 2Diet standar + ekstrak buah talok 0,005%Kel. Perlakuan 1Diet standar + ekstrak buah talok 0,01%Kel. KontrolDiet standar + akuades

Kultur makrofag peritoneal

Respon imun tikus fagosit makrofag

Uji statistik

1. Metode Analisa PenelitianData dikumpulkan dan diolah dengan menggunakan program SPSS for windows. Analisis data meliputi analisis deskriptif, tes normalitas, dan uji parametrik. Analisis deskriptif berupa rerata, standar deviasi dan grafik. Variabel terpengaruh untuk aktivitas fagosistosis makrofag peritoneal didapatkan skala pengukuran ratio. Distribusi data diuji secara analisis dengan tes normalitas. Apabila data terdistribusi normal dan variasi data sama, maka analisis data dilanjutkan dengan uji secara parametrik menggunakan one-way ANOVA untuk membandingkan aktivitas fagositosis pada makrofag peritoneal tikus yang diberi ekstrak buah talok dan yang tidak diberi perlakuan. Tingkat signifikansi yang digunakan adala 95%. Jika p< 0,05pada uji one-way ANOVA, analisis data dilanjutkan dengan Post Hoc test untuk melihat perbedaan antar variabel.1. Jadwal Penelitian Berikut di bawah ini adalah rencana jadwal penelitian:Tabel 3.2 Jadwal PenelitianNoUraian KegiatanBulan ke-

123456

1Penyusunan Proposal

2Pengumpulan Data

3Analisa Data

4Penyusunan Hasil Analisa Data