55

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Fitopatologi BALITTAS yang

beralamat di Jl. Karang Ploso KM. 4 Malang. Penelitian dilakukan pada tanggal 14

Oktober 2016 – 17 Februari 2017.

3.2 Jenis dan Rancangan Penelitian

Jenis penelitian dalam kegiatan ini adalah eksperimen murni. Sukmadinata

(2011), dalam eksperimen murni pengujian variabel bebas dan terikat dilakukan

terhadap sampel kelompok eksperimen dan kelompok kontrol, dimana subjek-

subjek yang diteliti dalam kedua kelompok eksperimen murni sesungguhnya (True

Experimental Research). Rancangan yang digunakan dalam penelitian ini adalah

The Only Posttest Control Group Design. Rancangan penelitian ini

membandingkan antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol. Banyaknya

perlakuan dalam penelitian ini adalah 5 kelompok perlakuan eksperimen yaitu jenis

isolat Bacillus sp. yang terdiri dari BN 1, BN 2, BN 3, BN 4, dan BN 5. Desain

penelitian yang akan dilaksanakan adalah sebagai berikut:

56

O P1 O1

O P2 O2

O P3 O3

O P4 O4

O P5 O5

O P0 OK

Keterangan :

O : Telur Meloidogyne incognita

P1,2,3,4,5 : Jenis perlakuan (Isolat Bacillus sp. BN 1, BN 2, BN 3, BN 4, BN 5)

P0 : Tanpa adanya perlakuan

O1,2,3,4,5 : Observasi pada kelompok perlakuan

OK : Observasi pada kelompok kontrol

Rancangan penelitian yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap.

Rancangan jenis ini memiliki ciri-ciri dimana penelitian yang dilakukan di

lingkungan laboratorium dianggap homogen. Rancangan ini merupakan rancangan

yang perlakuannya diletakkan dan dilakukan secara acak pada setiap percobaan, hal

ini berarti seluruh unit percobaan memiliki peluang yang sama untuk menerima

perlakuan. Denah rancangan acak lengkap pada penelitian ini menggunakan 5

kelompok perlakuan dan perlakuan kontrol yang masing-masing diulang 4 kali.

Penempatan setiap unit eksperimen dilakukan dengan melakukan pengundian

dengan hasil berikut:

57

Tabel 3.1 Denah Rancangan Acak Lengkap

O11 O34 O22 OK4

O23 O13 O41 O51

O44 O33 O21 OK1

O43 O12 OK3 O52

O53 O32 O2 O14

O24 OK2 O31 O54

Keterangan:

X1 : Pengulangan ke 1

X2 : Pengulangan ke 2

X3 : Pengulangan ke 3

X4 : Pengulanagn ke 4

K : Kontrol Aquadest

O : Telur Meloidogyne incognita

3.3 Populasi dan Teknik Sampling

3.3.1 Populasi

Menurut Sukmadinata (2011), populasi adalah keseluruhan objek penelitian,

baik hasil mengitung maupun pengukuran (kuantitatif atau kualitatif) dari

karakteristik tertentu yang akan dikenai generalisasi. Populasi dalam penelitian ini

adalah semua telur Meloidogyne incognita yang diperoleh dari akar tanaman tomat

yang telah diinfeksi nematoda Meloidogyne incognita dari akar tembakau di

Laboratorium Fitopatologi BALITTAS.

3.3.2 Sampel

Sampel adalah bagian dari jumlah dan karakteristik yang dimiliki oleh populasi

tersebut (Sugiyono, 2010). Sampel adalah sebagai dari populasi yang diambil dari

keseluruhan obyek yang diteliti dan dianggap mewakili seluruh populasi. Sampel

dalam penelitian ini adalah 1.264 telur Meloidogyne incognita yang diperoleh dari

58

akar tanaman tomat yang telah diinfeksi nematoda Meloidogyne incognita dari akar

tembakau di Laboratorium Fitopatologi BALITTAS.

3.3.3 Teknik Sampling

Teknik pengambilan sampel yang digunakan adalah simple random sampling,

yaitu cara pengambilan sampel dari anggota populasi dengan menggunakan acak

tanpa memperhatikan strata (tingkatan) dalam anggota populasi tersebut (Sudjana,

2002). Sampel adalah bagian dari populasi yang memiliki karakteristik atau

keadaan tertentu yang akan diteliti. Sampel dalam penelitian ini adalah telur

Meloidogyne incognita yang sudah di rontokkan dengan cara dikocok selama 4

menit dengan larutan NaOCl 1%. Sampel penelitian ini adalah 50-56 telur

nematoda puru akar (Meloidogyne incognita) tiap petridish untuk 5 kelompok

perlakuan dan 1 kelompok kontrol yang masing-masing kelompok terdiri dari 4

ulangan. Menurut Kemas dalam Sudjana (2002), jumlah ulangan dianggap cukup

baik apabila memenuhi syarat berikut:

Keterangan:

r : Replikasi (jumlah ulangan)

t : Treatment (jumlah perlakuan)

(t-1) (r-1) 15

(6-1) (r-1) 15

5(r-1) 15

5r – 5 15

5r 20

r 4

(t-1) (r-1) 15

59

Dari hasil perhitungan diatas, didapatkan bahwa jumlah pengulangan yang

diperlukan adalah sebanyak lebih dari atau sama dengan 4 kali.

3.4 Jenis dan Definisi Operasional Variabel

3.4.1 Jenis Variabel

1. Variabel Bebas

Variabel bebas adalah variabel yang mempengaruhi atau yang menjadi sebab

perubahannya atau timbulnya variabel dependen (terikat) atau dimanipulasi oleh

peneliti dengan maksud untuk mengetahui pengaruhnya pada objek yang diteliti

(Sugiyono, 2013). Variabel bebas dalam penelitian ini adalah berbagai jenis isolat

Bacillus sp. yang di dapat dari Laboratorium Fitopatologi Balittas. Berbagai isolat

Bacillus sp. yang digunakan yaitu, BN 1, BN 2, BN 3, BN 4, dan BN 5.

2. Variabel Terikat

Variabel terikat adalah variabel yang dipengaruhi atau variabel yang diduga

nilainya akan berubah dan yang menjadi sebab akibat, karena adanya variabel bebas

(Sugiyono, 2013). Variabel terikat dalam penelitian ini adalah daya antagonis isolat

Bacillus sp. dalam menurunkan daya tetas telur nematoda puru akar (Meloidogyne

incognita) yang ditandai dengan tidak menetasnya telur nematoda puru akar

(Meloidogyne incognita).

3. Variabel Kontrol

Variabel kontrol adalah variabel yang dikendalikan atau dibuat konstan

sehingga hubungan variabel independen terhadap dependen tidak dipengaruhi

60

faktor luar yang tidak diteliti. Variabel kontrol dalam penelitian ini adalah suhu,

kelembapan, nematoda dengan perlakuan aquadest.

3.4.2 Definisi Operasional Variabel

Agar tidak terjadi kesalahan makna dalam setiap variabel maka perlu

didefinisikan tiap variabel yang digunakan dalam penelitian ini. Adapun

operasional variabel tersebut, yaitu:

1. Isolat bakteri merupakan hasil dari pemisahan mikroba tertentu dari populasi

campuran. Isolat yang digunakan pada penelitian ini adalah isolat Bacillus sp.

yang terdiri dari BN 1, BN 2, BN 3, BN 4, dan BN 5.

2. Telur Meloidogyne incognita dikatakan mati jika tidak menetas selama 7-14.

Telur Meloidogyne incognita yang mati memiliki ciri-ciri permukaan kulit telur

menjadi tidak rata dan mengalami deformasi, diikuti dengan hancurnya lapisan

dalam telur.

3. Telur nematoda yang digunakan pada peneltian ini sebanyak 50-56 tiap

petridish. Telur yang digunakan adalah telur yang masih hidup dengan ciri-ciri

berbentuk oval, panjang 94,37 μm (± 5,71 μm) dan lebar 41,24 μm (± 2,83 μm.

Permukaan kulit telur tampak jelas menyelimuti lapisan dalam telur.

4. Ragam waktu adalah lamanya waktu yang telah ditentukan pengamatan dalam

satuan waktu yaitu selama 7 hari.

3.5 Prosedur Penelitian

Prosedur penelitian dibagi menjadi 3 tahap, yaitu: tahap persiapan, tahap

pelaksanaan, dan tahap pengamatan.

61

3.5.1 Persiapan Penelitian

a. Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah:

1) Autoklaf 1 buah

2) Mikroskop 1 buah

3) Cawan petri 15 buah

4) Petrdish kecil 24 buah

5) Rak tabung reaksi 2 buah

6) Bunsen 1 buah

7) Erlenmeyer 250 ml 7 buah

8) Inkubator 1 buah

9) Pipet tetes 1 buah

10) Mikropipet 1 buah

11) Magnetik stirrer 1 buah

12) Shaker 1 buah

13) LAF (Laminar Air Flow) 1 buah

14) Botol scott 1 buah

15) Blender 1 buah

16) Spatula 2 buah

17) Spet/spuit 7 buah

18) Kompor 1 buah

19) Timbangan 1 buah

20) Tabung reaksi 28 buah

21) Jarum ose 1 buah

22) Saringan kasar 1 buah

23) Saringan halus 1 buah

b. Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah:

1) Kertas label 4 lembar

2) Akar tembakau 500 gram

3) Media TSA 1 liter

4) Media TSB 1 liter

7) Aquades 1 liter

8) Air steril 1 liter

9) Alkohol 70 %

10) Kapas 50 gram

11) Plastik Wrap 1 rol

12) Alumunium foil 1 rol

13) Kertas saring 4 lembar

14) NaOCl 1% 1 liter

62

3.5.2 Pelaksanaan Penelitian

a. Sterilisasi Alat

Mencuci semua alat dengan sabun hingga bersih kemudian dikeringkan.

Membungkus semua peralatan dengan alumunium foil dan mensterilkan di

dalam autoklaf pada suhu 121˚C dengan tekanan 15 atmosfer selama 15 menit.

b. Isolat Bacillus sp.

Bacillus yang digunakan pada penelitian kali ini adalah isolat Bacillus koleksi

BALITTAS, yaiut BN 1, BN2, BN 3, BN 4, dan BN 5. BN 1 merupakan isolasi

Bacillus dari tanah hutan di Naibonat, BN 2 merupakan isolasi Bacillus dari

tanah yang ditanami sorgum, BN 3 merupakan isolasi Bacillus dari tanah yang

ditanami padi, kacang hijau, dan kayu jati, BN 4 merupakan isolasi Bacillus

dari tanah Jember, dan BN 5 merupakan isolasi Bacillus yang muncul dari hasil

kontaminasi perlakuan kontrol.

c. Pembuatan Media TSA

1) Menimbang bubuk TSA 4 gram per 1 liter

2) Merebus TSA sampai mendidih kurang lebih 15 menit sambil di aduk-aduk

agar homogen.

3) Menyaring TSA kemudian memasukkan TSA kedalam 4 tabung erlemeyer

sebanyak 250 ml.

4) Mensterilkan TSA di dalam autoklaf dengan suhu 1210C dengan tekanan 1

atm selama 15 menit.

63

d. Peremajaan Bakteri Bacillus sp.

1) Menyiapkan LAF dengan memberikan alcohol pada LAF kemudian di

bersihkan.

2) Menyiapkan indukan isolat Bacillus sp., Bunsen, tisu, kertas label, cawan

petri steril, media TSA, dan plastic wreb.

3) Plating media TSA di cawan petri, tunggu sampai memadat.

4) Mensterilkan tangan dengan alcohol 70% sebelum masuk LAF, kemudian

mensterilkan jarum ose dengan alkohol dan di bakar di bunsen hingga

memerah.

5) Mengambil bakteri dari indukan Bacillus sp. kemudian di tanamkan pada

media TSA pada cawan petri.

6) Mensterilkan bibir cawan petri dengan bunsen dan menutup cawan petri

plastik wreb, dan memberi label.

e. Infestasi Telur Nematoda.

1) Mencari akar tomat yang telah diinfeksikan dengan Meloidogyne incognita

dari tanaman tembakau (Nicotiana tabacum).

2) Mencuci bersih akar dengan air mengalir

3) Memotong akar menjadi bagian yang kecil-kecil

4) Menghaluskan akar dengan di blender selama 4 detik, kemudian menyaring

hasil blenderan dengan saringan kasar dan saringan halus.

5) Memasukkan hasil blenderan akar kedalam botol scott dan menambahkan

larutan NaOCl 1% secukupnya.

6) Mengocok akar yang telah diberi larutan NaCl 1% selama 4 menit.

64

7) Menyaring hasil kocokan dengan saringan kasar dan saringan halus.

8) Mengendapkan hasil ekstraksi akar selama 2-4 jam.

9) Mengambil 2 ml dari hasil endapan dan melakukan pengamatan jumlah telur

nematoda yang diperlukan (50-56 telur) dibawah mikroskop.

10) Meletakkan hasil pengamatan telur pada petridish kecil dan diberi label.

f. Pembuatan Media TSB

1) Menimbang bubuk TSB 30 gram per 1 liter

2) Merebus TSB sampai mendidih kurang lebih 15 menit sambil di aduk-aduk

agar homogen.

3) Menyaring TSB kemudian memasukkan TSB kedalam 10 tabung erlemeyer

sebanyak 100 ml.

4) Mensterilkan TSB di dalam autoklaf dengan suhu 1210C dengan tekanan 1

atm selama 15 menit.

g. Kultur Bakteri Bacillus sp.

1) Menumbuhkan Bakteri Bacillus sp. pada media TSA selama 48 jam atau

lebih.

2) Memindahkan koloni tunggal ke dalam 100 ml media TSB

3) Men-shaker bakteri selama 48 jam dengan kecepatan 150 rpm dengan suhu

300C.

4) Mengambil 24 ml untuk setiap kultur bakteri hasil sentrifugasi dengan

mikropipet dan meletakkan dalam tube sentrifugasi, tiap-tiap tube diisi 12

ml kultur bakteri.

5) Mensentrifugasi kultur bakteri Bacillus sp dengan kecepatan 5400 rpm

65

selama 15 menit.

6) Menyaring hasil sentrifugasi dengan syringe filter 0,22 µm.

h. Perlakuan Bakteri Bacillus sp pada Telur Nematoda Puru Akar

(Meloidogyne incognita)

1) Menyiapkan kultur bakteri yang telah disentrifuge dan disaring.

2) Menyiapkan telur nematoda sejumlah 50-56 telur dan meletakkannya pada

petridish kecil.

3) Menyiapkan spuit, rak tabung reaksi (rak tube sentrifuge) dan kertas label.

4) Mengambil sebanyak 5 ml kultur bakteri yang sudah di sentrifugasi ke

dalam petridish kecil berisi telur nematoda (50-56 telur).

5) Menyimpan petridish di dalam incubator dengan suhu 250C.

6) Melakukan pengamatan setiap 24 jam sekali selama 7 hari.

i. Membuat Media Kitin

1) Menyiapkan bahan-bahan yang digunakan untuk media kitin

2) Menimbang koloidal kitin sebanyak 0,5 gram

3) Menimbang MgSO4 sebanyak 1,2 gram

4) Menimbang K2HPO4 sebanyak 0,5 gram

5) Menimbang KCl sebanyak 1 gram

6) Menimbang FeSO4. 7H2O sebanyak 0,01 gram

7) Menimbang ZnSO4 sebanyak 0,001 gram

8) Menimbang MnCl2 sebanyak 0,001 gram

9) Menimbang agar sebanyak 12-15 gram

10) Menyiapkan aquadest sebanyak 1 liter

66

11) Menuangkan semua bahan kedalam panci berisi aquadest dan

mengaduknya sampai mendidih

12) Menyaring media dengan kain saring dan meletakkannya ke dalam wadah.

13) Menuangkan media kitin kedalam botol schot, masing-masing 30 ml dan

kedalam erlenmeyer masing-masing 20 ml.

14) Menutup botol dan erlenmeyer dengan aluminium foil.

15) Mensterilisasi media kitin degan autoclave selama 15 menit dengan suhu

1210C.

j. Uji Kitinase pada Bacillus sp

1) Menyiapkan media kitin yang telah disterilkan

2) Memanaskan dan mencairkan media kitin pada microwave

3) Sterilisasi LAF

4) Mendinginkan media kitin dengan cara putar-putar membentuk angka 8

pada LAF.

5) Menambahkan safranin secukupnya pada media kitin hingga media kitin

berwarna merah.

6) Menuangkan media kitin pada cawan petri secukupnya dan menunggunya

hingga dingin.

7) Menanamkan bakteri Bacillus sp pada media kitin

8) Menutupnya dengan plastic wrap

9) Mendiamkan media kitin yang telah ditanam bakteri untuk melihat hasil

kitinase selama 2 minggu.

67

3.6 Metode Pengumpulan Data Penelitian

Metode pengumpulan data yang digunakan dalam penelitian ini dilakukan

yaitu melalui observasi eksperimen yaitu dengan teknik pengambilan data secara

langsung dengan cara mengamati dan mencatat aktivitas yang sedang berlangsung.

Observasi di laboratorium ini difokuskan pada obyek perlakuan yaitu variabel

terikat yang diberi perlakuan, kemudian data yang diperoleh diaplikasikan ke dalam

bentuk tabel. Tabel tersebut akan mencangkup data jumlah telur Meloidogyne

incognita yang tidak menetas dan jumlah larva yang hidup dan mati. Observasi

perhitungan daya hambat penetasan telur Meloidogyne incognita ditunjukkan pada

tabel berikut:

Tabel 3.2 Tabel Data Daya Hambat Bacillus sp. Terhadap Penetasan Telur

Meloidogyne incognita

Perlakuan Pengulangan Telur /

Larva

Hari Rata-

Rata 1 2 3 4 5 6 7

1 Telur

Larva

2 Telur

Larva

3 Telur

Larva

4 Telur

Larva

3.7 Penyusunan Sumber Belajar Booklet

Pengembangan sumber belajar cetak berupa booklet. Secara sistematis

pengembangan sumber belajar cetak booklet dilakukan sebagaimana diuraikan

sebagai berikut:

68

a) Menganlisis kurikulum untuk menentukan pokok bahasan

b) Menentukan KI/KD yang sesuai dengan materi yang akan dibuat sebagai

sumber belajar. Materi yang akan disusun sebagai sumber belajar adalah

materi ciri-ciri dan peranan Eubacteria.

c) Menentukan judul booklet yang disesuaikan dengan kompetensi dasar serta

materi pokok yang akan dicapai oleh peserta didik.

d) Penyajian kalimat singkat dan jelas.

3.8 Teknik Analisis Data

Data hasil pengamatan dianalisis dengan menggunakan analisis ragam

(ANOVA) satu jalur berdasarkan model RAL dengan bantuan analisis komputer

SPSS. Apabila hasil analisis tersebut menunjukkan beda nyata, maka perlu

dilakukan uji lanjutan dengan menggunakan uji Duncan untuk mengetahui

perlakuan yang paling efektif. Semua uji menggunakan tingkat kemaknaan 95% (∞

= 0,05).

Metode pengembangan sumber belajar pada penelitian ini adalah booklet

dengan sasaran siswa SMA kelas X. Booklet ini berupa ringkasan materi tentang

ciri-ciri dan peranan Eubacteria, khusunya perana Bacillus sp. sebagai pengendali

hayati penyakit puru akar yang disebabkan oleh nematoda Meloidogyne incognita.