27

III. METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Ilmu dan Teknologi Pangan,

Fakultas Pertanian-Peternakan Universitas Muhammadiyah Malang. Waktu

pelaksanaan dimulai pada bulan maret 2017 sampai bulan september 2017.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah timbangan analitik, pompa

vakum, pengering (sinar matahari), thermometer, kertas whatman No. 42, ayakan

100 mesh, beaker gelas 100 ml, 600 ml, 2000 ml, cawan porselen, mortal martil,

oven, hotplate stirer, magnetic stirer, spatula kaca, pompa vakum, sendok.

Sedangkan alat yang digunakan untuk analisis adalah labu kjeldahl, lemari asam,

erlenmayer, pipet, krus porselen, desikator, spektroakopi UV, petridish, tabung

reaksi, rak tabung, spirtus, korek api dan alat-alat gelas.

3.2.2 Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah cangkang rajungan

(portunus pelagicus) yang diperoleh dari Mini Plan Grand Pelangi Tongas

Probolinggo, bahan kimia yang digunakan untuk penelitian adalah, H2SO4,

indikator metil merah, asam asetat 0,5%; 1%; 1,5% dan 2%, asam borat, HCl 1 N,

HCL 0,2 N, aquades, NaOH 20%; 30%; 3,5%; 40% dan 50%, NA, pH universal

dan fillet ikan Nila.

28

3.3 Metode Penelitian

Metode penelitian terdiri dari dua tahapan yaitu penelitian 1 yaitu pembuatan

kitosan dan penelitian 2 yaitu aplikasi kitosan terhadap umur simpan fillet ikan

Nila. Penelitian tahap 1 ini menggunakan Rancangan Acak Kelompok (RAK) yang

disusun secara faktorial. Faktor perlakuan yang dicobakan terdiri dari 2 macam dan

masing-masing perlakuan diulang 3 kali. Faktor yang dicobakan adalah faktor 1

konsentrasi NaOH (4 level), dan faktor 2 waktu (2 level). Pengaplikasian

konsentrasi NaOH pada saat proses deasetilisasi dan waktu pengadukan pada saat

proses deasitilisasi.

Faktor I : konsentrasi NaOH

K0 : Konsentrasi NaOH 20%

K1 : Konsentrasi NaOH 30%

K2 : Konsentrasi NaOH 40%

K3 : Konsentrasi NaOH 50%

Faktor II : waktu ekstraksi deasetilasi

A1 : Waktu 30 menit

A2 : Waktu 45 menit

Tabel 3. Perlakuan perbedaan konsentrasi NaOH dan waktu ekstraksi deastilasi

pada pembuatan kitosan

K

A

K0 K1 K2 K3

A1 K0A1 K1A1 K2A1 K3A1

A2 K0A2 K1A2 K2A2 K3A2

Keterangan :

K0A1 = konsentrasi NaOH 20%, waktu ekstraksi 30 menit

K1A1 = konsentrasi NaOH 30%, waktu ekstraksi 30 menit

29

K2A1 = konsentrasi NaOH 40%, waktu ekstraksi 30 menit

K3A1 = konsentrasi NaOH 50%, waktu ekstraksi 30 menit

K0A2 = konsentrasi NaOH 20%, waktu ekstraksi 45 menit

K1A2 = konsentrasi NaOH 30%, waktu ekstraksi 45 menit

K2A2 = konsentrasi NaOH 40%, waktu ekstraksi 45 menit

K3A2 = konsentrasi NaOH 50%, waktu ekstraksi 45 menit

Analisa data pada penelitian ini menggunakan Analisis Ragam (ANOVA)

dan apabila terjadi perbedaan nyata atau ada interaksi pada masing-masing

perlakuan maka data yang diperoleh akan dilanjutkan dengan uji pembeda dengan

menggunakan Uji DMRT (Duncan’s Multiple Rnage Text). Selanjutnya kitosan dari

perlakuan terbaik akan diaplikasikan pada fillet ikan Nila untuk mengetahui

pengaruhnya terhadap umur simpan fillet ikan Nila.

Penelitian tahap 2 ini menggunakan Rancagan Acak kelompok (RAK)

sederhana dengan 1 faktor , dimana faktor 1 adalah perbedaan konsentrasi

penambahan kitosan yang dilarutkan dalam 100 ml asam asetat 1% serta periode

waktu penyimpanan 0 hari, 1 hari dan 2 hari. Kemudian diulang sebanyak 5 kali

ulangan, dengan perlakuan sebagai berikut:

N1 = Penambahan kitosan dengan konsentrasi 0% (kontrol)

N2 = Penambahan kitosan dengan konsentrasi 1%

N3 = Penambahan Kitosan dengan konsentrasi 1,5%

N4 = Penambahan Kitosan dengan konsentrasi 2%

Untuk menentukan hubungan antara konsentrasi kitosan dengan umur

simpan fillet ikan Nila dilakukan dengan cara Analisis Ragam (ANOVA) dan

apabila terjadi perbedaan nyata atau ada interaksi pada masing-masing perlakuan

30

maka data yang diperoleh akan dilanjutkan dengan uji pembeda dengan

menggunakan Uji BNT (Beda Nyata Terkecil).

3.4 Pelaksanaan Penelitian

3.4.1 Pembuatan Kitosan

3.4.1.1 Tahap Persiapan (Tanasae, et al., 2006)

Limbah cangkang rajungan dicuci menggunakan air sampai bersih, lalu

dikeringkan dengan sinar matahari selama hingga kering, selanjutnya di tumbuk

dan diayak dengan ukuran 100 mesh.

3.4.1.2 Tahap Deproteinasi (Tanasae et al., 2006)

1. Ditimbang sebanyak 50 gram serbuk cangkang rajungan dimasukkan kedalam

gelas beaker 600 ml dan ditambahkan larutan NaOH 3,5% perbandingan 1:10

(gr serbuk/ml NaOH)

2. Campuran dipanaskan pada suhu 65 0C selama 2 jam sambil diaduk dengan

kecepatan pengadukan 50 rpm kemudian dikeringkan dan didinginkan

3. Padatan dicuci menggunakan aquades dan disaring menggunakan kertas saring

hingga pH netral

4. Endapan dikeringkan dalam oven pada suhu 100 0C selama 15 jam.

3.4.1.3 Tahap Demineralinasi (Tanasae et al., 2006)

1. Endapan kering hasil proses deprotenasi dimasukkan dalam gelas beker 600 ml

dan ditambahkan HCl 1 N dengan perbandingan 1:15 (w/v)

2. Kemudian dilakukan pemanasan dengan pengadukan menggunakan magnetic

stirer selama 1 jam pada suhu 750C

3. Padatan dicuci menggunakan aquades dan disaring menggunakan kertas saring

untuk menghilangkan sisa-sisa HCl hingga berpH netral.

31

4. Setelah kondisi netral tercapai, residu yang diperoleh kemudian dikeringkan

pada suhu 100 0C 15 jam.

3.4.1.4 Tahap Deasetilasi (Tanasae et al., 2006)

1. Kitin yang telah terbentuk pada proses demineralisasi, ditambahkan

konsentrasi larutan NaOH yang berbeda-beda yaitu 20%, 30%, 40% dan 50

% sesuai dengan perlakuan dengan perbandingan 1:10

2. Dipanaskan dan diaduk pada suhu 100 0C dengan menggunakan waktu yang

berbeda-beda yaitu selama 30 menit dan 45 menit dengan kecepatan

pengadukan 50 rpm.

3. Larutan didinginkan kemudian dicuci menggunakan aquades dan disarig

menggunakan kertas saring dengan dibantu pompa vakum untuk

mempercepat proses penyaringan dilakukan hingga pH netral.

4. Kemudian dikeringkan menggunakan oven dengan suhu 100 0C selama 15

jam, selanjutnya terbentuk bubuk kasar kitosan dan dilakukan penggerusan

sehingga didapat kitosan.

3.4.2 Pembuatan Larutan Kitosan

Prosedur pembuatan larutan edible coating dari kitosan pada penelitian ini

menggunakan metode dari Butler et al (1996). Konsentrasi kitosan yang digunakan

adalah 0; 0,5; 1; 1,5 dan 2%. Edible coating dengan konsentrasi 0,5% dibuat dengan

melarutkan masing-masing sampel menimbang 1 gram kitosan ke dalam 0,5 mL

asam asetat, kemudian ditambah 99,5 mL aquades. Pelarut kitosan dalam asam

asetat 0,5% dilakukan agar kitosan dengan larutan dapat homogen. Larutan

dihomogenkan dengan pengaduk magnetic stirer pada suhu 500C selama 60 menit

sampai larutan coating terlarut dengan sempurna.

32

3.4.3 Pem fillettan Ikan

Tahap pertama proses pemfilletan yaitu membersikan sisik ikan sampai

bersih dan membersihkan isi perut kotoran dalam ikan. Memotong bagian daging

ikan sampai terpisah dari tulangnya menjadi lembaran lalu memotong daging ikan

berbentuk persegi, kemudian mencuci daging ikan dengan air.

3.4.4 Aplikasi Larutan Kitosan pada Fillet Ikan Nila

Setelah pembersihan ikan dan pemotongan ikan kemudian melakukan proses

pelapisan dengan memasukkan fillet ikan Nila ke dalam larutan coating selama 30

detik, lalu ditiriskan sampai larutan edible coating yang menempel pada fillet ikan

Nila agak mengering. Tiriskan ikan yang telah direndam dalam larutan edible

coating, kemudian letakkan dalam wadah dan simpan pada suhu ruang.

3.5 Prosedur Analisis Penelitian

3.5.1 Analisis Kitosan

1.5.1.1 Perhitungan Rendemen (Kyoon No et al., 2000)

Rendemen kitin dihitung berdasarkan perbandingan antara berat kitosan

dengan berat limbah cangkang rajungan menggunakan rumus:

Rendemen = (Berat kitosan/Berat Limbah Cangkang Rajungan) x 100 %

1.5.1.2 Analisis Derajat Deasetilasi Kitosan (Liu et al., 2006)

1. Ditimbang kitosaan sebanyak 6,1 mg

2. Dilarutkan dalam 5 ml HCl 0,1 M

3. Disiapkan spektrofotometer UV dan masukan blanko yaitu HCl 0,1 M dalam

kuvetdengan rentang bilangan gelombang 201 nm

4. Dimasukan ke dalam kuvet larutan kitosan yang sudah dilarutkan dalam HCl

0,1 M

33

5. Dicatat nilai absorbansinya

6. Dihitung derajat deasetilasi dengan rumus:

DA : (161,1 x A x V)-(0,0128 x m)

(3,3615 x m)-(42,1 x A x V)

DD : 1 – (DA) x 100%

Keterangan :

DA = Derajat Asetilasi

DD = Derajat Deasetilasi

A = Absorban

V = Volume Larutan Kitosan (L)

M = Berat Kitosan (mg)

3.5.1.3 Pengujian Kadar Abu (Sudarmadji dan Suhardi, 1994)

1. Menimbang sampel sebanyak l-2 g dalam krus porselin yang kering dan telah

diketahui massanya.

2. Memasukkan dalam tanur pada suhu 6000C selama ± 24 jam sampai diperoleh

abu berwarna keputih-putihan.

3. Kemudian krus dan abu didinginkan dalam desikator selama 30 menit.

4. Setelah dingin abu ditimbang.

Perhitungan kadar abu dapat dilakukan dengan rumus sebagai berikut:

% kadar abu = a – b x 100%

c

Keterangan:

a : massa cawan dan sampel awal (g)

b : massa cawan dan sampel setelah menjadi abu (g)

c : massa sampel awal (g)

34

3.5.1.4 Pengujian Kadar Protein (Sudarmadji, 1989)

1. Menimbang 0,1 g bahan, masukkan ke dalam labu kjeldahl. Menambahkan

katalisator sepucuk dan H2SO4 pekat 2 ml.

2. Mencampur pada labu kjeldahl dipanaskan dalam almari asam sampai

berhenti berasap, dipanaskan sampai cairan menjadi jernih dan kemudian

dinginkan.

3. Menyiapkan asam borat 15 ml didalam erlenmeyer pada setiap sampel.

Memanaskan alat destilasi, erlenmeyer destilat yang sudah berisi aquades

dipanaskan menggunakan hotplate.

4. Sampel yang sudah dingin ditambahkan dengan aquades 15ml. Kemudian

dimasukkan kedalam alat destilasi menggunakan corong kaca lalu

menambahkan 10 ml NaOH 50% dan aquades 10ml

5. Setelah dimasukkan ditutup dan erlenmeyer yang berisi asam borat

diletakkan dipenampung bawah hingga berubah menjadi hijau mudah.

6. Hasil destilat tersebut kemudian dititrasi menggunakan HCl 0,2 N hingga

berubah warna menjadi merah mudah.

Perhitungan kadar protein dapat dilakukan dengan rumus sebagai berikut :

Kadar Nitrogen = m HCl x N HCl x 14,008 x 100%

berat bahan (g) x 100

Kadar Protein = Fk x Kadar Nitrogen

3.5.1.4 Kelarutan (Kyoon No et al., 2000)

Berat kitosan 0,1% (b/v) dilarutkan dalam asam asetat 2% (v/v),

lalu difiltrasi. Persentase kelarutan kitin ditunjukkan dengan kitosan yang tersisa

dibandingkan dengan kitosan awal.

35

3.5.1.6 Viskositas (Hwang et al., 1997)

Masukkan 1 gram sampel dalam 100 ml asam asetat 1% dan diaduk hingga

homogen. Kemudian diukur menggunakan alat viskositas, catat waktu putar (1 kali

putaran) menggunakan stopwatch.

3.5.1.7 Pengujian Kadar Air (Sudarmadji dkk., 1994)

1. Timbang sampel sebanyak 1-2 gr dala cawan porselin yang telah diketahui

beratnya

2. Masukkan dalam oven pada suhu 100-1050C selama 1-2 jam tergantung

bahannya. Kemudian didinginkan dalam desikator selama kurang lebih 30

menit dan ditimbang

3. Panaskan lagi dalam oven, didinginkan dalam desikator dan diulangi hingga

konstan

Perhitugan kadar air dapat dilakukan dengan rumus sebagai berikut :

% kadar air = a – b x 100%.

c

Keterangan :

Sampel : kitin dan kitosan

a : Berat cawan dan sampel awal (g)

b : Berat cawan dan sampel setelah kering (g)

c : Berat sampel awal (g)

3.5.2 Analisis Kitosan sebagai Pengawet Alami Fillet Ikan Nila

3.5.2.1 Uji Organoleptik (SNI 01-2346-2006)

Metode yang digunakan untuk uji organoleptik yaitu dengan menggunakan

score sheet. Pengujian dilakukan oleh 15 panelis yang ada di Laboatorium Ilmu

danTeknologi Pangan. Pengujian bersifat subjektif dengan menggunakan indera

36

yang ditujukan pada kenampakan, aroma dan tekstur. Skor yang diperoleh pada

pengujian organoleptik berdasarkan SNI 01-2729.1-2006 dapat dilihat pada tabel 4.

Tabel 4. Kategori skor uji organoleptik

Uji Organoleptik Score sheet

Tekstur 1 = lunak, daging mudah sobek

2 = tidak elastis, jaringan daging longgar

3 = kurang elastis, jaringan daging agak

longgar

4 = kurang padat, jaringan daging masih

melekat kuat

5 = kompak, padat, elastis

Aroma 1 = aroma busuk

2 = aroma mengarah ke busuk

3 = tidak beraroma

4 = sedikit segar

5 = aroma segar

Kenampakan 1 = perubahan warna seluruh permukaan

2 = warna daging kecoklatan, kusam

3 = warna daging krem kecoklatan, agak

kusam

4 = warna cerah dan kurang mengkilap

5 = warna daging cerah dan mengkilap

3.5.2.2 Pengujian Uji Total Plate Count (TPC) (SNI 01-2332-3-2006)

1. Semua peralatan dan bahan seperti aquades dan NA yang digunakan

disterilkan terlebih dahulu menggunakan autoclaf

2. Ambil sampel sebanyak 1g kemudian dihaluskan.

3. Menyiapkan NA (Natrium Agar) dan NA dimasukkan kedalam setiap

cawan petridish

4. Sampel yang telah halus dimasukkan kedalam tabung reaksi pertama yang

berisi aquades steril dan disentrifuse kemudian dilakukan pengenceran

hingga 10-5

37

5. Selanjutnya sampel yang telah diencerkan diambil sebanyak 1 ml dan

dituangkan kedalam cawan petri steril kemudian dituangkan media NA

(Nutrient Agar).

6. Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C setelah itu dilakukan pengamatan

koloni dan dihitung jumlah koloni.

3.5.3 Analisis Data

Data hasil pengamatan penelitian tahap pertama kemudian dilakukan analisa

secara deskriptif dan kedua dilakukan analisa dengan menggunakan uji analisis

statistik (analisis ragam /ANOVA). Hasil analisa statistik jika memberikan

pengaruh akan dilakukan uji jarak ganda Duncan 𝛼 5%.

38

Gambar 6. Diagram alir pembuatan tepung rajungan (Tanasae et al., 2006)

Cangkang rajungan

matang

Pencucian

Penjemuran sinar matahari

3hari

Penghalusan

Tepung rajungan

Pengayakan 100 mesh

Air Air kotor

39

Gambar 7. Diagram Alir Proses Deproteinasi dan Demineralisasi (Tanasae et al.,

2006, telah dimodifikasi)

Ekstraksi deproteinasi

Tepung rajungan

Larutan NaOH 3,5%

, T =650C, t = 2jam

Pendinginan suhu ruang

Penyaringan dengan kertas saring

Pencucian sampai pH 7

Pengeringan (T = 1000C, t = 15 jam)

Hasil deproteinasi

Aquades

Filtrat

Ekstraksi demineralisasi

Pendinginan suhu ruang

Penyaringan dengan kertas saring

Filtrat

Larutan HCl 1 N T=

750C, t= 1jam

Pencucian sampai pH 7

Pengeringan (T= 1000C, t= 15 jam)

Kitin

Aquades

40

Pengujian

1. Rendemen

2. Derajat

deasetilasi

3. Kelarutan

4. Viskositas

5. Kadar

protein

6. Kadar air

7. Kadar abu

8. Struktur

mikroskopi

Keterangan : * = konsentrasi larutan NaOH (20%, 30%, 40% dan 50%)

** = waktu ekstraksi (30 menit dan 45 menit)

Gambar 8. Diagram Alir Proses Pembuatan Kitosan (Tanasae et al., 2006, telah

dimodifikasi)

Kitin

Ekstraksi deasetilasi

Penyaringan dengan kertas

saring

Pendinginan suhu ruang

Pencucian sampai pH 7

Larutan NaOH*

dan waktu **

Kitosan

Aquades

Pengeringan (T=1000C, t=15

jam)

Kitosan

41

Gambar 9. Diagram Alir Aplikasi Kitosan pada fillet ikan Nila

Kitosan 0,5 gram

Mencampurkan bahan

Pengadukan dengan

magnetic stirer (t = 500C, T

= 60 menit )

Asam asetat

0,5%

Larutan Kitosan

Pengenceran dengan

aquades hingga mencapai

100 ml

Coating 3 menit Larutan

Kitosan

Penyimpanan suhu ruang

42

Gambar 10. Diagram Alir Uji Total Plate Count (TPC)

Ikan nila (1 g)

Dihaluskan

Dimasukan dalam 1 tabung reaksi

Divortex sampel dalam tabung

reaksi

Diambil sampel (1 ml)

Dilakukan pengenceran

(10-1 – 10-5)

Diambil ke dalam cawan petri

steril

Dituangkan media NA (Nutriet

Agar)

Diinkubasi

(24 jam dan suhu 370C)

Total koloni