BAHAN DAN METODE

Tempat dan Waktu

Penelitian dilaksanakan mulai bulan Januari 2010 sampai November 2010

di Laboratorium Kimia Analitik Departemen Kimia IPB dan Laboratorium Pusat

Penelitian Kimia LIPI-Serpong, karakterisasi senyawa aktif dengan

spektrofotometer UV-VIS dan FT-IR dilakukan di Laboratorium Pusat Studi

Biofarmaka Bogor, analisis dengan GC-MS dilakukan di Laboratorium Forensik

Mabes-POLRI dan uji antibakteri di Laboratorium Mikrobiologi Pusat Antar

Universitas (PAU) Institut Pertanian Bogor.

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan pada proses ekstraksi dan fraksinasi adalah

peralatan ekstraksi maserasi, rotari evaporator, plat KLT, kolom kromatografi,

peralatan untuk uji antibakteri dan peralatan untuk karakterisasi senyawa aktif

digunakan spektrofotometer UV-VIS Shimadzu Pharmaspec 1700 Double Beam,

spektrofotometer FT-IR Bruker jenis Tensor 37, spektroskopi massa (MS) Agilent

7890A dan Gas kromatografi (GC) Agilent 5975C dengan jenis kolom HP-5MS

(panjang 30 m dan diameter 0,25 mm).

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah herba bandotan

dengan tinggi ± 40-50 cm yang kemudian diambil daunnya. Herba bandotan

diperoleh di sekitar Desa Ciherang, Kecamatan Dramaga, Kabupaten Bogor.

Pelarut-pelarut organik antara lain heksana, etil asetat (EtOAc), metanol (MeOH),

dan kloroform (CHCl3

), pereaksi-pereaksi untuk uji fitokimia, bakteri S. aureus

ATCC 25923 dan E. coli ATCC 35022.

Persiapan Sampel dan Penentuan Kadar Air (AOAC 1970)

Tanaman bandotan segar dikeringkan dan dipisahkan daunnya dari bagian

lainnya. Daun bandotan yang telah kering kemudian digiling/dihaluskan hingga

diperoleh serbuk daun bandotan dengan ukuran 100 mesh. Sebelum ekstraksi,

terlebih dahulu dilakukan penentuan kadar air sampel dengan cara 2-3 g sampel

kering dimasukkan ke dalam cawan porselin yang telah diketahui bobot

kosongnya. Cawan kemudian dipanaskan di dalam oven pada suhu 105 oC selama

17

30 menit. Setelah itu, didinginkan di dalam desikator dan ditimbang untuk

mengetahui bobot keringnya. Pemanasan sampel diulangan sampai diperoleh

bobot yang konstan.

Ekstraksi Sampel

Metode ekstraksi yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode

umum menurut Harborne (1996), yaitu ekstraksi dan fraksinasi suatu senyawa

dari jaringan tumbuhan berdasarkan tingkat kepolaran dengan menggunakan

maserasi.

Sebanyak 2 kg sampel kering dimaserasi dengan heksana (3 x 24 jam)

untuk menghilangkan kandungan lemak dan minyak yang terdapat dalam sampel.

Setelah dilakukan penyaringan dan pengeringan, residu yang dihasilkan

dimaserasi kembali dengan etil asetat (3 x 24 jam), lalu filtratnya dipekatkan

dengan menggunakan vakum penguap putar pada suhu 40oC - 50o

Sebanyak 0,3 g sampel dilarutkan dalam 10 ml kloroform-amonia lalu

disaring. Filtrat hasil penyaringan ditambahkan beberapa tetes H

C sehingga

diperoleh ekstrak kasar etil asetat. Ekstrak kasar etil asetat yang dihasilkan di atas

dan sampel sebelum diekstraksi, diuji kandungan fitokimianya. Ekstrak kasar etil

asetat hasil ekstraksi kemudian difraksinasi dengan kromatografi kolom dengan

eluen yang menunjukkan pemisahan yang paling baik sehingga diperoleh

beberapa fraksi. Masing-masing fraksi dilakukan uji antimikroba untuk

mendapatkan fraksi yang memiliki aktivitas antimikroba paling tinggi. Fraksi

yang memiliki aktivitas antimikroba paling tinggi kemudian dipisahkan dan

dilakukan pengujian antibakteri kembali. Setelah dilakukan beberapa kali

fraksinasi dan diketahui fraksi terakhir yang masih memiliki aktivitas sebagai

antibakteri, kemudian dilanjutkan dengan elusidasi struktur senyawanya

menggunakan spektrofotometer UV-Vis, IR, dan GC-MS.

Uji Fitokimia (Harborne 1987)

Alkaloid

2SO4 2M,

kemudian dikocok sehingga terbentuk 2 lapisan. Lapisan asam (tidak berwarna)

dipipet ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan pereaksi Mayer, Dragendorff,

18

dan Wagner. Hasil endapan putih dengan pereaksi Mayer, endapan merah jingga

dengan pereaksi Dragendroff, dan endapan coklat dengan pereaksi Wagner, maka

sampel tersebut positif mengandung alkaloid.

Flavonoid dan Senyawa Fenolik

Sebanyak 0,5 g sampel ditambah metanol 30% sampai terendam kemudian

dipanaskan. Filtratnya ditambahkan NaOH 10% dan H2SO4. Warna merah yang

terbentuk karena penambahan NaOH 10% menunjukkan terdapatnya senyawa

fenolik hidrokuinon, sedangkan warna merah yang terbentuk akibat penambahan

H2SO4 pekat menunjukkan terdapatnya senyawa flavonoid (Harborne 1988).

Saponin

Sebanyak 0,5 g sampel di dalam gelas piala ditambahkan 50 ml air panas

dan dididihkan selama 5 menit, kemudian disaring. Sebanyak 10 ml filtratnya

yang dihasilkan dimasukkan ke dalam tabung reaksi tertutup selama 10 menit,

terbentuknya busa yang stabil menandakan adanya saponin.

Tanin

Sebanyak 0,5 g sampel di dalam gelas piala ditambahkan 50 ml air panas dan

dididihkan selama 5 menit, kemudian disaring. Sebanyak 10 ml filtrat yang

dihasilkan pada item 3, ditambahkan FeCl3 1%. Identifikasi tanin yang positif

ditandai dengan adanya warna biru tua atau hijau kehitaman.

Triterpenoid-Steroid

Sebanyak 0,5 g sampel ditambahkan 5 ml etanol lalu dipanaskan dan

disaring. Filtratnya diuapkan kemudian ditambahkan eter dan dikocok. Lapisan

eter dipisahkan dan ditambahkan pereaksi Liebermenn-burchad (3 tetes asam

asetat anhidrida dan 1 tetes H2SO4

KLT digunakan dalam menentukan eluen terbaik untuk fraksinasi dan

penggabungan fraksi hasil fraksinasi. Plat KLT yang digunakan adalah plat

alumunium silika gel F

pekat). Adanya warna merah atau ungu

menunjukkan adanya triterpenoid dan warna hijau menunjukkan adanya steroid.

Fraksinasi dan Identifikasi Senyawa Aktif

Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

254. Sampel ditotolkan dengan menggunakan pipa kapiler

19

pada plat KLT yang telah ditandai garis awal dan garis akhirnya. Pelarut

dimasukkan dalam bejana tertutup dan dibiarkan hingga uapnya jenuh, kemudian

plat KLT dimasukkan dalam bejana dan ditutup kembali. Setelah pelarut naik dan

sampai garis akhir, maka plat KLT segera dikeluarkan dan dikeringkan. Plat KLT

yang telah kering kemudian diamati di bawah sinar ultraviolet pada panjang

gelombang 254 nm.

Penentuan eluen terbaik dilakukan dengan membandingkan jumlah spot

dan pola pemisahan yang dihasilkan dari beberapa sistem pelarut yang digunakan.

Eluen yang menghasilkan jumlah spot terbanyak dan pola pemisahan terbaik

selanjutnya digunakan pada proses fraksinasi. Sedangkan penggabungan fraksi

hasil fraksinasi dilakukan dengan melihat kemiripan pola spot yang terbentuk

pada masing-masing fraksi tersebut.

Kromatografi Kolom

Sampel sebanyak 2 gram dilarutkan dalam pelarut etil asetat kemudian

dimasukkan ke dalam kolom kromatografi. Eluen terbaik yang telah ditentukan

dituangkan sedikit demi sedikit ke dalam kolom kromatografi. Fraksi yang keluar

dari kolom kromatografi ditampung pada tabung reaksi masing-masing sebanyak

5 ml. Setelah proses fraksinasi selesai, kemudian dilanjutkan pada tahap

penggabungan fraksi dengan menggunakan KLT. Fraksi-fraksi dengan pola spot

yang sama digabung menjadi satu fraksi. Dengan demikian diperoleh jumlah

fraksi total yang terdapat pada sampel.

Uji Aktivitas Antibakteri (Haswirna 2006)

Pembuatan Media Trypton Soy Agar (TSA) dan Persiapan Suspensi Bakteri

Sebanyak 40 g TSA (tryptone soy agar) dilarutkan dalam 1 liter aquades

lalu dipanaskan dan diaduk dengan menggunakan pengaduk magnetik sampai

homogen. Setelah homogen larutan tersebut dimasukkan ke dalam tabung reaksi

sebanyak 20 ml, kemudian ditutup dengan kapas. Media disterilkan dengan

otoklaf pada tekanan 1,5 atm dengan suhu 121 0C selama 15 menit. Tabung-

tabung tersebut dimiringkan sebelum mengeras dan dibiarkan selama 24 jam.

Media ini digunakan untuk pertumbuhan bakteri.

20

Bakteri diperoleh dari laboratorium mikrobiologi PAU-IPB, yaitu bakteri

S. aureus ATCC 25923 dan E. coli ATCC 35022. Bakteri S. aureus dan E. coli

dibiakkan pada media yang telah disiapkan. Sebanyak 1 ose bakteri uji

dimasukkan ke dalam media yang telah disiapkan kemudian diinkubasi selama 24

jam pada suhu 37 0C.

Pengujian Aktivitas Antibakteri

Biakan bakteri yang diperoleh kemudian diencerkan menggunakan metode

Mc. Farland 0,5 hingga diperoleh bakteri uji dengan konsentrasi 1 x 107.

Sebanyak 100 µl bakteri yang telah diencerkan, kemudian dituangkan dalam

cawan petri yang telah berisi media TSA dan disebar dengan batang kaca

penyebar kemudian dibiarkan memadat. Setelah padat, media agar dilubangi

dengan pipet berdiameter ± 5,5 mm. Sampel yang telah diencerkan dengan pelarut

etil asetat kemudian diteteskan pada sumuran sebanyak 20 µl dengan konsentrasi

300 mg/ml untuk diuji aktivitas antibakterinya.

Media uji selanjutnya diinkubasi selama 24 jam pada temperatur 37 0

Nilai MIC adalah konsentrasi terendah yang mematikan bakteri yang

diinokulasikan ke dalam media. MIC ditentukan dengan menggunakan metode

broth dillution menggunakan kaldu TSB (Tryptone Soy Broth). Penentuan nilai

MIC dilakukan setelah diketahui bahwa fraksi etil asetat daun tanaman bandotan

memiliki aktivitas antibakteri. Biakan bakteri uji sebanyak 1 ose dimasukkan ke

dalam 10 ml media cair TSB lalu diinkubasi dalam inkubator bergoyang selama

24 jam pada suhu 37

C

kemudian diamati aktivitas antibakterinya. Ekstrak dinyatakan positif sebagai

antibakteri apabila mampu menghambat pertumbuhan bakteri dengan

terbentuknya zona hambatan berupa areal bening di sekitar sumuran. Besarnya

hambatan dapat diukur dengan diameter area bening dikurangi dengan diameter

sumuran dan dibandingkan dengan kloramfenikol dengan konsentrasi 0,4 mg/mL

(sebagai antibiotik standar). Semakin besar diameter zona bening yang terbentuk,

semakin aktif zat uji tersebut sebagai antibakteri. Hal ini menunjukkan bahwa

semakin banyak bakteri yang dihambat pertumbuhannya oleh zat uji tersebut.

Penentuan Nilai MIC (Minimum Inhibition Consentration) (Haswirna 2006)

0C. Sebanyak 50 µl biakan bakteri kemudian dicampurkan ke

21

dalam 20 ml media TSA bersuhu ± 45 0C lalu dibiarkan sampai memadat. Media

agar yang telah memadat dilubangi dengan pangkal pipet tetes (diameter ± 5,5

mm). Variasi konsentrasi yang digunakan untuk menentukan MIC adalah 500,

250, 100, 75, 50, 25, 10, dan 5 mg/ml. Sebanyak 50 µl sampel dimasukkan pada

lubang media TSB yang telah diinkubasi dengan bakteri uji, kemudian diinkubasi

kembali selama 24 jam pada suhu 37 0C. Setelah inkubasi selesai, dilakukan

pengamatan terhadap adanya pertumbuhan bakteri. Konsentrasi fraksi etil asetat

tanaman bandotan yang menyebabkan bakteri tidak tumbuh pada subkultur

merupakan konsentrasi yang dipilih sebagai nilai MIC.