BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Kromatografi

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan

kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Istilah kromatografi

berasal dari gabungan kata chroma (warna) dan graphein (menuliskan). Prinsip

pemisahan kromatografi yaitu adanya distribusi komponen-komponen dalam fase

diam dan fase gerak berdasarkan perbedaan sifat fisik komponen yang akan

dipisahkan. Kromatografi dapat digunakan untuk analisa kualitatif dan kuantitatif.

Pada dasarnya semua cara kromatografi menggunakan dua fase yaitu fase diam

(stationer) dan fase bergerak (mobile). Persyaratan utama kromatografi adalah:

1. Ada fase diam dan fase gerak. Fase diam tidak boleh bereaksi dengan fase

gerak.

2. Komponen sampel (contoh) harus larut dalam fase gerak dan berinteraksi

dengan fase tetap (diam).

3. Fase gerak harus bisa mengalir melewati fase diam, sedangkan fase diam

harus terikat kuat di posisinya.

Komponen utama kromatografi adalah fase diam dan fase gerak. Kromatografi

dibagi menjadi beberapa jenis bergantung pada jenis fase gerak, fase diam, dan

pemisahannya. Beberapa contoh kromatografi yang sering digunakan untuk analisa

di laboratorium adalah kromatografi partisi, kromatografi kertas, kromatografi gas,

dan HPLC (Ardianingsih, 2009).

2.2 Jenis-jenis Kromatografi

2.2.1 Kromatografi Padatan Cair (LSC)

Teknik ini tergantung pada teradsorpsinya zat padat pada adsorben yang polar

seperti silika gel atau alumina. Kromatografi lapisan tipis (TLC) adalah salah satu

bentuk dari LSC. Dalam KCKT kolom dipadati atau dipak dengan partikel-partikel

micro or macro particulate or pellicular (berkulit tipis 37 -44 µ).Sebagian besar dari

KCKT sekarang ini dibuat untuk mencapai partikel-partikel micro particulate lebih

kecil dari 20µ. Teknik ini biasanya digunakan untuk zat padat yang mudah larut

dalam pelarut organik dan tidak terionisasi. Teknik ini terutama sangat kuat untuk

pemisahan isomer-isomer.

2.2.2 Kromatografi Partisi

Teknik ini tergantung pada partisi zat padat diantara dua pelarut yang tidak

dapat bercampur salah satu diantaranya bertindak sebagai rasa diam dan yang lainnya

sebagai fasa gerak. Pada keadaan awal dari kromatografi cair (LSC), rasa diamnya

dibuat dengan cara yang sama seperti pendukung pada kromatografi gas (GC). Fasa

diam (polar atau nonpolar) dilapisi pada suatu pendukung inert dan dipak kedalam

sebuah kolom. Kemudian rasa gerak dilewatkan melalui kolom. Bentuk kromatografi

partisi ini disebut kromatografi cair cair (LLC) Untuk memenuhi kebutuhan akan

kolom-kolom yang dapat lebih tahan lama, telah dikembangkan pengepakan fase

diam yang berikatan secara kimia dengan pendukung inert. Bentuk kromatografi

partisi ini disebut kromatografi fase terikat (BPC = Bonded Phase Chromatography).

BPC dengan cepat menjadi salah satu bentuk yang paling populer dari KCKT.

Kromatografi partisi (LLC dan BPC), disebut "fase normal" bila fase diam lebih

polar dari fase gerak dan "fase terbalik" bila fase gerak lebih polar dari pada fase

diam.

2.2.3 Kromatografi Penukar Ion (IEC)

Teknik ini tergantung pada penukaran (adsorpsi) ion-ion di antara fase gerak

dan tempat-tempat berion dari pengepak. Kebanyakan mesin-mesin berasal dari

kopolimer divinil benzen stiren dimana gugus-gugus fungsinya telah ditambah.

Asam sulfonat dan amin kuarterner merupakan jenis resin pilihan paling baik untuk

digunakan Keduanya, fase terikat dan resin telah digunakan. Teknik ini digunakan

secara luas dalam life sciences dan dikenal untuk pemisahan asam-asam amino.

Teknik ini dapat dipakai untuk keduanya kation dan anion.

2.2.4 Kromatografi Eksklusi

Teknik ini unik karena dalam pemisahan didasarkan pada ukuran molekul dari

zat padat. Pengepak adalah suatu gel dengan permukaan berlubang-lubang sangat

kecil (porous) yang inert. Molekul-rnolekul kecil dapat masuk dalarn jaringan dan

ditahan dalam fase gerak yang menggenang (stagnat mobile phase). Molekul-

molekul yang lebih besar, tidak dapat masuk kedalam jaringan dan lewat melalui

kolom tanpa ditahan. Kromatografi eksklusi rnernpunyai banyak nama, yang paling

umum disebut permeasi gel (GPC) dan filtrasi gel. Apapun namanya, mekanismenya

tetap sama. Dalam bidang biologi, sephadex, suatu cross-linked dextran gel, telah

digunakan secara luas, hanya pengepak keras dan semi keras (polistiren, silika, glass)

yang digunakan dalam KCKT. Dextran gel lunak tidak dapat menahan kinerja diatas

1 atau 2 atmosfer. Tenik ini dikembangkan untuk analisis polimer-polimer dan

bahan-bahan biologi, terutama digunakan untuk rnolekul-molekul kecil.

2.2.5 Kromatografi Pasangan Ion (IPC)

Kromatogtafi pasangan ion sebagai penyesuaian terhadap KCKT termasuk

baru, pemakaian pertama sekali pada pertengahan tahun 1970. Diterimanya IPC

sebagai metode baru KCKT merupakan hasil kerja Schill dan kawan-kawan dan dari

beberapa keuntungan yang unik. Kadang-kadang IPC disebut juga kromatografi

ekstraksi, kromatografi dengan suatu cairan penukar ion dan paired ion

chromatography (PIC). Setiap teknik-teknik ini mempunyai dasar yang sama.

Popularitas IPC muncul terutama sekali dari keterbatasan IEC dan dari sukanya

menangani sampel-sampel tertentu dengan metode-metode LC lainnya (seperti

senyawa yang sangat polar, senyawa yang terionisasi secara kompleks dan senyawa

basa kuat). IPC dapat dilaksanakan dalam dua tipe yaitu fase normal dan fase balik.

Fase diam dari rase balik IPC dapat terdiri dari suatu pengepak silika yang

disilanisasi (misalnya C8 atau C18 Bonded Phase) atau dari suatu pengepak yang

diperoleh secara mekanik, fase organik yang tidak dapat bercampur dengan air

seperti 1 pentanol. Fase diam yang dipakai adalah Cs atau CIS BPC Packing. Fase

gerak terdiri dari suatu larutan bufer (ditambah suatu kosolven organik seperti

metanol atau asetonitril untuk pemisahan fase terikat) dan suatu penambahan ion

tanding,yang muatannya berlawanan dengan molekul sampel (Putra, 2004).

2.3 Prinsip Kromatografi Kertas

Larutan cuplikan atau campuran zat yang akan dipisahkan ditotolkan pada

kertas saring di daerah yang sudah diberi tanda dimana cuplikan tersebut akan

meluas membentuk sebuah noda yang bulat. Setelah menotolkan cuplikan maka

tunggu totolan cuplikan tersebut kering. Diameter totolan yang membentuk noda

tidak lebih dari 0,4 cm. Hal ini dikarenakan agar noda cuplikan (totolan cuplikan)

pada saat dilakukan elusi, setelah pengeringan tidak menyatu antara noda satu

dengan noda yang lain, sehingga dapat memisah.

Setelah noda (totolan cuplikan) kering masukkan atau gantung kertas dalam

bejana tertutup (lemari kromatografi) yang tercelup dalam pelarut atau eluen yang

dipilih sebagai fase gerak. Jangan sampai noda tercelup dalam eluen (pelarut) karena

dapat mengakibatkan senyawa yang dipisahkan akan terlarut dari kertas. Pelarut

bergerak melalui serat-serat dari kertas oleh gaya kapiler dan menggerakkan

komponen (pitakromatogram) dalam laju yang berbeda. Bila permukaan pelarut telah

bergerak dengan cukup jauh dan dengan waktu yang ditentukan, maka kertas diambil

dari bejana dan batas permukaan pelarut diberi kita lalu kertas dikeringkan

(pengeringan bisa dilakukan dengan hairdryer).

Jika senyawa-senyawa berwarna maka akan terbentuk dan terlihat noda-noda

yang terpisah. Bila senyawa tak berwarna maka harus dideteksi dengan cara fisika

dan kimia. Cara yang biasa digunakan adalah dengan suatu pereaksi yang

memberikan sebuah warna dari senyawa-senyawa tersebut. Untuk mendeteksi bisa

juga dengan sinar ultra ungu atau teknik radio kimia (Diani, 2010).

2.4 Faktor – faktor yang Mempengaruhi Harga Rf

Kromatografi kertas termasuk dalam kromatografi planar. Kromatografi kertas

adalah salah satu metode kromatografi yang sederhana namun penggunaannya sangat

luas. Pada kromatografi planar, sejumlah tertentu larutan contoh ditempatkan dengan

cara menotolkannya di dekat salah satu sisi dari kertas kromatografi. Teknik

kromatografi kertas bermacam-macam, salah satunya adalah dengan menempatkan

kertas di dalam suatu bejana tertutup yang telah dijenuhkan dengan uap pelarutyang

akan digunakan sebagai eluen. Ketika fasa gerak mencapai titik sampel, komponen

dalam tiap titik akan terdistribusi baik ke dalam fasa gerak maupun fasa diam,

sehingga dapat terjadi pemisahan.

Pada tipe kromatografi kertas teknik ascending, keberadaan gaya kapiler akan

mengakibatkan pelarut akan bergerak ke atas sepanjang kertas dengan membawa

serta komponen-komponen terlarut dari sampel. Jika terdapat perbedaan interaksi

dari masing-masing komponen yang akan dipisahkan dengan pelarut, maka

komponen-komponen tersebut akan bermigrasi dengan kecepatan yang berbeda-beda

pula. Perbandingan jarak migrasi tiap komponen dengan jarak migrasi eluen

didefinisikan sebagai faktor retensi (Rf).Nilai Rf (Retordation Factor) adalah rasio

jarak yang dipindahkan oleh suatu zat terlarut terhadap jarak yang dipindahkan oleh

garis depan pelarut selama waktu yang sama (Puspita, 2013).

Rf =

Jarak perambatan bercak dari titik pentotolanJarak perambatan pelarut dari titik pentotolan

Jarak yang ditempuh oleh tiap bercak dari titik pentotolan diukur dari pusat

bercak dan harga Rf berada antara 0,00–1,00. Harga Rf sangat beguna untuk

mengidentifikasi suatu senyawa. Faktor-faktor yang mempengaruhi harga Rf adalah

sebagai berikut:

1. Struktur kimia senyawa yang dipisahkan

2. Sifat penyerap

3. Tebal dan kerataan lapisan penyerap

4. Pelarut dan drajat kemurniannya

5. Derajat kejenuhan uap pengembang dalam bejana

6. Teknik percobaan

7. Jumlah cuplikan yang digunakan

(Steffi, 2010)

2.5 Aplikasi Kromatografi Kertas “Identifikasi Zat Pewarna Makanan Pada

Jelly Secara Kromatografi Kertas”

Pewarna makanan banyak digunakan untuk berbagai jenis makanan, terutama

berbagai produk jajan pasar serta berbagai makanan olahan yang dibuat oleh industri

kecil ataupun industri rumah tangga meskipun pewarna buatan juga ditemukan pada

berbagai jenis makanan yang dibuat oleh industri besar. Jajanan pasar yang sering

(Steffi, 2010)

ditambahkan pewarna makanan adalah jelly. Jelly merupakan makanan setengah

padat yang terbuat dari buah-buahan dan gula dengan kandungan total padatan

minimal 65 persen. Komposisi bahan mentahnya ialah 45 bagian buah dan 55 bagian

gula. Oleh sebab begitu banyak produk jelly yang ada di pasaran yang sangat

mungkin mengandung pewarna makanan. Pengujian perwarna jelly ini dilakukan

dengan menggunakan metode kromatografi kertas karena metode ini sederhana

dengan hasil yang bagus untuk analisa kualitatif.

Dari hasil identifikasi zat pewarna makanan pada jelly secara kromatografi

kertas diketahui bahwa zat pewarna yang digunakan pada jelly tersebut memenuhi

persyaratan Permenkes 722, yakni Tartrazin CI 19140, Carmoisin CI 14720, Sunset

Yellow CI 15985. Hasil ini diperoleh dengan cara membandingkan harga Rf dari

pembanding dengan harga Rf sampel yang ditotolkan. Oleh sebab itu, harga Rf

antara pembanding dengan harga Rf sampel identik sama maka dapat dikatakan

bahwa sampel tersebut mangandung zat pewarna yang sama dengan pembanding

(Bakri, 2011).

Adapun flowchart percobaan dari identifikasi zat pewarna makanan pada jelly

adalah sebagai berikut:

Gambar 2.1 Flowchart Identifikasi Zat Pewarna Makanan Pada Jelly

Secara Kromatografi Kertas

(Bakri, 2011)

Mulai

Dibiarkan beberapa saat hingga mengering

Kertas Whatmann No. 1 yang telah mengandung cuplikan dimasukkan kedalam chamber yang terlebih dahulu telah dijenuhkan dengan fasa gerak

berupa isobutanol, etanol, dan aquadest (3:2:2)

Dibiarkan fasa gerak naik sampai jarak rambat yang telah ditetapkan, yakni 12 cm

Diamati noda yang diperoleh secara visual, kemudian dihitung harga Rf-nya

Kertas Whatman diangkat dan dibiarkan kering pada suhu kamar

Selesai

Bandingkan harga Rf bercak larutan uji dengan Rf bercak zat warna pembanding

Eritrosin, Sunset Yellow, Cokelat HT, Ponceau 4R, Carmoisin, Tartrazin, Merah Allura, dan Brilian Blue ditotolkan pada plat dengan menggunakan

pipa kapiler