ANALISA KUALITATIF DAN KUANTITATIF KARBOHIDRAT

Analisis Kualitatif

Karbohidrat dengan zat tertentu akan menghasilkan warna tertentu yg dapat dgunakan

untuk analisis kualitatif. Beberapa reaksi yg lebih spesifik dpt membedakan golongan

karbohidrat. Banyak cara untuk mengetahui atau mengidentifikasi  karbohidrat dalam suatu

bahan alam, diantaranya adalah sebagai berikut:

1.      Uji Molisch

Prinsip reaksi ini adalah dehidrasi senyawa karbohidrat oleh asam sulfat pekat. Dehidrasi

heksosa menghasilkan senyawa hidroksi metil furfural, sedangkan dehidrasi pentose

menghasilkan senyawa fulfural. Uji positif jika timbul cincin merah ungu yang merupakan

kondensasi antara furfural atau hidroksimetil furfural dengan a-naftol dalam pereaksi molish.Uji

molisch adalah uji kimia kualitatif untuk mengetahui adanya karbohidrat. Uji ini untuk semua

jenis karbohidrat. Mono-, di-, dan polisakarida akan memberikan hasil positif. Sampel yang diuji

dicampur dengan reagent Molisch, yaitu α-naphthol yang terlarut dalam etanol 95%. Setelah

pencampuran atau homogenisasi, H2SO4 pekat perlahan-lahan dituangkan melalui dinding tabung

reaksi agar tidak sampai bercampur dengan larutan atau hanya membentuk lapisan. H2SO4 pekat

(dapat digantikan asam kuat lainnya) berfungsi untuk menghidrolisis ikatan pada sakarida untuk

menghasilkan furfural. Furfural ini kemudian bereaksi dengan reagent Molisch, α -naphthol

membentuk cincin yang berwarna ungu.

Reaksi :

.

KH (pentose) + H2SO4 pekat → furfural → + α-naftol → warna ungu

KH (heksosa) + H2SO4 pekat → HM-furfural → + α-naftol → warna ungu

Kedua macam reaksi diatas berlaku umum, baik untuk aldosa (-CHO) maupun karbohidrat

kelompok ketosa (C=O).

Prosedur kerja :

1. Masukkan 15 tetes larutan uji karbohidrat kedalam tabung rekasi yang masih kering

danbersih

2. Tambahkan 3 tetes pereaksi Molisch. Campurkan dengan baik.

3. Miringkan tabung rekasi, lalu alirkan dengan hati-hati 1 mL H2SO4 pekat melalui dinding

tabung supaya tidak bercampur.

4. Perhatikan terbentuknya cincin berwarna ungu pada batas antara kedua lapisan

yangmenandakan reaksi positif karbohidrat.

5. Catat hasil dan buatlah kesimpulannya.

6. Lakukan tes terhadap larutan glukosa, galaktosa, laktosa, sukrosa, maltosa,

arabinosa,larutan 1% amilum dan selulosa (kapas) yang disuspensikan dalam air.

2.      Uji Benedict

Uji Benedict adalah uji kimia untuk mengetahui kandungan gula (karbohidrat) pereduksi

(yang memiliki gugus aldehid atau keton bebas) . Gula pereduksi meliputi semua jenis

monosakarida dan beberapa disakarida seperti laktosa, glukosa dan maltosa. Uji benedict

berdasarkan reduksi Cu2+ menjadi Cu+ oleh gugus aldehid atau keton bebas dalam suasana

alkalis, biasanya ditambahkan zat pengompleks seperti sitrat atau tatrat untuk mencegah

terjadinya pengendapan CuCO3.

Uji positif ditandai dengan terbentuknya endapan merah bata, kadang disertai dengan

larutan yang berwarna hijau, merah, atau orange. Pada uji Benedict, pereaksi ini akan bereaksi

dengan gugus aldehid, kecuali aldehid dalam gugus aromatik, dan alpha hidroksi keton. Oleh

karena itu, meskipun fruktosa bukanlah gula pereduksi, namun karena memiliki gugus alpha

hidroksi keton, maka fruktosa akan berubah menjadi glukosa dan mannosa dalam suasana basa

dan memberikan hasil positif dengan pereaksi benedict. Untuk mengetahui adanya monosakarida

dan disakarida pereduksi dalam makanan, sample makanan dilarutkan dalam air, dan

ditambahkan sedikit pereaksi benedict. Dipanaskan dalam waterbath selama 4 - 10 menit. Selama

proses ini larutan akan berubah warna menjadi biru (tanpa adanya glukosa), hijau, kuning,

orange, merah dan merah bata atau coklat (kandungan glukosa tinggi). Sukrosa (gula pasir) tidak

terdeteksi oleh pereaksi Benedict. Sukrosa mengandung dua monosakrida (fruktosa dan glukosa)

yang terikat melalui ikatan glikosidik sedemikian rupa sehingga tidak mengandung gugus

aldehid bebas dan alpha hidroksi keton. Sukrosa juga tidak bersifat pereduksi.

Pengamatan yang dilakukan dalam uji Benedict ini dapat dilakukan dengan mengamati

perubahan warna dan terjadinya endapan. Warna larutan dapat terlihat bermacam-macam

tergantung dari konsentrasi karbohidrat yangg dipakai, larutan dapat berwarna hijau, hijau

kebiruan dan kuning. Pada uji Benedict terhadap glukosa dan fruktosa larutan berwarna hijau

kebiruan dan terdapat endapan merah bata di dalamnya yang menandakan pengujian positif,

sedangkan pada maltosa dan laktosa larutan memiliki warna hijau kebiruan tanpa endapan merah

batahal ini menunjukan bahwa pengujian positif terdapat gula di dalamnya, tetapi pada pengujian

terhadap sukrosa dan pati warna yang terlihat adalah biru menandakan bahwa hasil uji negatif

mengindikasikan bahwa sukrosa dan pati tidak memiliki gula pereduksi yang dapat mereduksi

reagen benedict. Uji Benedict dapat dilakukan pada urine untuk mengetahui kandungan glukosa.

Urine yang mengandung glukosa dapat menjadi tanda adanya penyakit diabetes. Sekali urine

diketahui mengandung gula pereduksi, test lebih jauh mesti dilakukan untuk memastikan jenis

gula pereduksi apa yang terdapat dalam urine. Hanya glukosa yang mengindikasikan penyakit

diabetes. Berikut reaksi yang berlangsung:

Reaksi:

R-COH + CuO → Cu2O (s) + R-COOH

Atau

KH + camp CuSO4, Na-Sitrat, Na2CO3 → Cu2O (endapan merah bata)

Pereaksi Benedict : Satu liter pereaksi Benedict dapat dibuat dengan menimbang sebanyak 100

gram natrium karbonat anhydrous (Na2CO3), 173 gram natrium sitrat, dan 17,3 gram tembaga

(II) sulfat pentahydrate, kemudian dilarutkan dengan akuadest sebanyak 1 liter.

Prosedur kerja :

1. Masukkan 3 tetes larutan uji karbohidrat kedalam tabung rekasi yang masih kering dan

bersih

2. Tambahkan 2 mL pereaksi Benedict, kemudian dikocok.

3. Masukan kedalam penangas air selama 5 menit. Amati perubahan warna endapannya.

4. Pembentukan warna endapan hijau, kuning, atau merah menunjukan reaksi

positif karbohidrat.

5. Catat hasil dan buatlah kesimpulannya.

6. Lakukan percobaan ini dengan menggunakan larutan glukosa, galaktosa,

maltosa,fruktosa, laktosa, sukrosa dan larutan amilum.

3.      Uji Barfoed

Uji ini untuk membedakan monosakarida dan disakarida dengan jalan mengontrol

kondisi-kondisi percobaan, seperti pH dan waktu pemanasan. Pada analisa ini, karbohidrat

direduksi pada suasana asam. Disakarida juga akan memberikan hasil positif bila didihkan cukup

lama hingga terjadi hidrolisis. Uji Barfoed menggunakan reagen Barfoed yang terdiri dari

tembaga asetat dan asam asetat glacial sebagai pereaksi. Diketahui bahwa disakarida merupakan

agen pereduksi yang lemah, mereka tidak membentuk ion kupri pada reagen Barfoed yang ada

dalam keadaan asam, sedangkan monosakarida merupakan agen pereduksi yang kuat dan mampu

membentuk ion kupri dalam reagen Barfoed dalam keadaan asam karena itu uji Barfoed ini

digunakan untuk membedakan disakarida pereduksi dengan monosakarida pereduksi dalam suatu

sampel. Pada proses pengujian, larutan dipanaskan, pemanasan terhadap sampel membantu

asamasetat glacial menghidrolisis disakarida menjadi monosakarida yang kemudian

akanmereduksi reagen, karena itu perbedaan waktu yang ada menjadi indikasi perbedaan

terhadap monosakarida pereduksi dan disakarida pereduksi. Monosakarida pereduksi ditandai

dengan terjadinya endapan merah bata kupro oksida (Cu2O) pada saat di panaskan dalam kurun

waktu dua sampai tiga menit sedangkan disakarida pereduksi di tandai dengan pembentukan

endapan merah bata kupro oksida (Cu2O) dalam kurun waktu sepuluh sampai dua belas menit.

KH + camp CuSO4 dan CH3COOH → Cu2O endapan merah bata

Prosedur kerja :

1. Masukkan 1 mL larutan uji karbohidrat kedalam tabung rekasi yang masih kering dan

bersih.

2. Tambahkan 1 mL pereaksi Barfoed, kemudian dikocok.

3. Masukan kedalam penangas air selama 3 menit.

4. Kemudian didinginkan dalam air mengalir.

5. Bila tidak terjadi reduksi selama 5 menit, lakukan pemanasan selama 15 menit sampai

terlihat adanya reduksi.

6. Catat hasil dan buatlah kesimpulannya

7. Lakukan percobaan ini dengan larutan glukosa, galaktosa, laktosa, sukrosa dan maltosa.

4.      Uji Seliwanoff

Uji Seliwanoff bertujuan untuk mengeahui adanya ketosa (karbohidrat yang mengandung

gugus keton). Pada pereaksi seliwanoff, terjadi perubahan oleh HCl panas menjadi asam

levulinat dan 4-hidroksilmetilfurfural. Jika dipanaskan karbohidrat yang mengandung gugus

keton akan menghasikan warna merah pada larutannya. Disakarida sukrosa yang mudah

dihidrolisa menjadi glukosa dan fruktosa memberi reaksi positif dengan uji Seliwanoff. Glukosa

dan karbohidrat lain dalam jumlah banyak dapat juga memberi warna yang sama. Pada pengujian

dilakukan pemanasan pada larutan, pemanasan akan membantu proses hidrolisis disakarida yang

akan menghasilkan monosakarida ketosa, dan kemudian member warna. Keberadaan HCl dalam

reagen pada saat fruktosa yang berada dalam golongan ketosa bereaksi dengannya akan

menghasilkan warna merah cherry dengan struktur kimia yang kompleks. Sebaliknya golongan

disakarida seperti maltosa dan laktosa tidak bereaksi (negatif) pada saat mereka dihidrolisis

menjadi monosakarida aldosa, dengan kata lain aldosa tidak bereaksi dalam uji Seliwanoff ini.

Pada dasarnya uji ini memiliki dua tahapan penting yang harus dilewati pada pendidihan,yaitu

proses dehidrasi yang dialami fruktosa oleh reagen Seliwanoff yang menghasilkan pembentukan

hidroksi metil furfural dan kondensasi hidroksi metil furfural dengan resorcinol sehingga

membentuk senyawa kompleks berwarna merah cherry. Hasil yang didapat pada uji ini dapat

diidentifikasi dari warna larutan yang berubah pada saat bereaksi. Jika sampel berubah menjadi

warna merah cherry, itu menunjukan bahwa di dalam sampel terdapat ketosa, tetapi jika sampel

berwarna biru kehijauan atau peach menunjukan bahwa sampel memiliki aldosa.

KH (ketosa) + H2SO4 → furfural → + resorsinol → warna merah.

KH (aldosa) + H2SO4 → furfural → + resorsinol → negatif

Prosedur kerja :

1. Masukkan beberapa tetes larutan uji karbohidrat kedalam tabung rekasi yang telah diisi 2

mL pereaksi Seliwanoff.

2. Masukan kedalam penangas air selama 1 menit. Perhatikan perubahan warna yangterjadi.

3. Catat hasil dan buatlah kesimpulannya

4. Lakukan percobaan ini dengan larutan fruktosa, glukosa, dan sukrosa.

5. Terjadinya perubahan warna merah dan endapan menunjukan reaksi positif untuk ketosa,

bila endapan dilarutkan dalam alcohol terjadi larutan berwarna merah.

5. Uji Fehling

Prinsip reaksi ini yaitu menggunakan gugus aldehid pada gula untuk mereduksi senyawa

Cu2SO4 menjadi Cu2O (enpadan berwarna merah bata) setelah dipanaskan pada suasana

basa (Benedict dan Fehling) atau asam (Barfoed) dengan ditambahkan agen pengikat

(chelating agent) seperti Na-sitrat dan K-Na-tatrat.

Reaksi :

6. Uji Tollens

Uji ini untuk positif terhadap karbohidrat pentosa yang membedakannya dengan heksosa.

Aldehidadapat mereduksi pereaksi Tollens sehingga membebaskan unsur perak (Ag).

Pereaksi tollens, pengoksidasi ringan yang digunakan dalam uji ini, adalah larutan basa dari

perak nitrat. Larutannya jernih dan tidak berwarna. Untuk mencegah pengendapan ion perak

sebagai oksida pada suhu tinggi, maka ditambahkan beberapa tetes larutan amonia. Amonia

membentuk kompleks larut air dengan ion perak. Pereaksi Tollens mengandung ion diammin

perak(I), [Ag(NH3)2]+. Ion ini dibuat dari larutan perak (I) nitrat. Caranya dengan memasukkan

setetes larutan natrium hidroksida ke dalam larutan perak (I) nitrat yang menghasilkan sebuah

endapan perak (I) oksida, dan selanjutnya tambahkan larutan amonia encer secukupnya untuk

melarutkan ulang endapan tersebut.

 

Pereaksi Tollens sering disebut sebagai perak amoniakal. Endapan perak pada uji ini akan

menempel pada tabung reaksi yang akn menjadi cermin perak. Oleh karena itu Pereaksi Tollens

sering juga disebut pereaksi cermin perak.

Prosedur kerja :

1. Masukkan beberapa tetes larutan uji karbohidrat kedalam tabung rekasi yang telah diisi2

mL pereaksi Tollens.

2. Masukan kedalam penangas air selama 1 menit. Perhatikan perubahan warna yangterjadi.

3. Catat hasil dan buatlah kesimpulannya

4. Lakukan percobaan ini dengan larutan arabinosa, glukosa dan gummi arabikum.

7. Uji Osazon

Pada uji Osazon, yang mendasarinya adalah pemanasan karbohidrat yang memiliki gugus

aldehida atau keton bersama fenilhidrazin berlebihan akan membentuk hidrazon atau osazon.

Osazon yang terbentuk mempunyai bentuk kristal dan titik lebur yang spesifik. Osazon dari

disakarida larut dalam air mendidih dan terbentuk kembali bila didinginkan, namun sukrosa tidak

membentuk osazon karena gugus aldehida dan keton yang terikat pada monomernya sudah tidak

bebas, sebaliknya osazon monosakarida tidak larut dalam air mendidih. Beberapa larutan uji

menunjukkan reaksi positif dengan membentuk kristal berwarna kuning yang disebut dengan

osazon yaitu larutan fruktosa dan galaktosa dan larutan lainnya tidak membentuk kristal osazon.

Setelah diamati di bawah mikroskop, bentuk kristal dari fruktosa adalah pentagonal sedangkan

pada galaktosa segi empat runcing.

Prosedur kerja :

1. Masukkan 5 mL larutan uji karbohidrat kedalam tabung rekasi.

2. Masukkan campuran fenil hidrazon Na-asetat kering.

3. Kocok dan panaskan dalam penangas air selama 30 menit.

4. Dinginkan, kemudian diperiksa endapan yang terbentuk di bawah mikroskop.

5. Catat hasil dan buatlah kesimpulannya.

6. Lakukan percobaan ini dengan larutan arabinosa, sukrosa, glukosa, fruktosa, maltosa,dan

galaktosa

8. Uji Iodium

Karbohidrat dengan golongan polisakarida akan memberikan reaksi dengan larutan

iodium dan memberikan warna yang spesifik bergantung pada jenis karbohidratnya. Analisa

dengan iodin akn berwarna biru, amilopektin dengan iodin akan berwarna merah violet, glikogen

dengan iodin akan berwarna merah cokelat, begitu juga dengan dekstrin.

Uji Iodium Dilakukan untuk menentukan polisakarida. Larutan uji dicampurkan dengan larutan

iodium. Hasil positif ditandai dengan amilum dengan iodium berwarna biru, dan dekstrin dengan

iodium berwarna merah anggur.

KH (poilisakarida) + Iod (I2) →  warna spesifik (biru kehitaman)

Prosedur kerja :

1. 2 ml larutan uji dimasukkan ke dalam tabung reaksi atau porselin tetes.

2. Kemudian ditambahkan dua tetes larutan iodium.

3. Kemudian warna spesifik yang tebentuk diamati.

9. Uji Fermentasi

Dalam ragi terdapat enzim-enzim yang dapat mencerna amilum sampai menjadi CO2 dan H2O,

juga terdapat enzim sukrosa (invertase) maupun fruktokinase. Oleh karena amilum, glukosa,

fruktosa, maltosa, dan sukrosa dapat diragikan. Dalam ragi tidak terdapat laktosa, maka laktosa

tidak dapat dipecahkan. Hal ini dapat digunakan untuk membedakan apakah gula dalam urin

glukosa atau fruktosa. Enzim ragi pada umumnya baik bekerja pada temperatur 37o C – 40o C.

Analisis Kuantitatif

Kadar karbohidrat dalam berbagai bahan makanan dapat ditentukan dengan berbagai cara,

diantaranya cara kimiawi, cara fisik, cara enzimatik atau biokimia dan cara kromatografi.

Penentuan karbohidrat yang termasuk polisakarida maupun oligosakarida memerlukan

pendahuluan yaitu hidrolisis lebih dahulu sehingga diperoleh monosakarida. Untuk keperluan ini,

maka bahan dihidrolisa dengan asam atau enzim pada suatu keadaan tertentu. Salah satu metode

yang dapat digunakan adalah Luff Schoorl.

Penentuan kadar karbohidrat pada percobaan dengan metode Luff Schoorl dibagi atas tiga

tahapan, yaitu:

1.    Tahap sebelum inversi

2.    Tahap setelah inversi lemah

3.    Tahap setelah inversi kuat

Pada penentuan karbohidrat dengan metode Luff Schoorl, yang ditentukan bukan Cu2O

yang mengendap tapi dengan menggunakan CuO dalam larutan yang belum direaksikan dengan

gula reduksi (titrasi blanko) dan sesudah direaksikan dengan gula reduksi (titrasi sampel).

Penentuannya dengan menggunakan titrasi volumetri. Setelah diketahui selisih banyaknya titrasi

blanko dan titrasi sampel kemudian dikonsultasikan dengan tabel yang telah tersedia yang

menggambarkan hubungan antara banyaknya Na2S2O3 dengan banyaknya gula pereduksi. Pada

metode Luff Schoorl terdapat dua cara pengukuran yaitu        :

1.    Penentuan Cu tereduksi dengan I2

2.    Menggunakan prosedur Lae-Eynon

Metode Luff Schoorl mempunyai kelemahan yang terutama disebabkan oleh komposisi

yang konstan. Hal ini diketahui dari penelitian A.M Maiden yang menjelaskan bahwa hasil

pengukuran yang diperoleh dibedakan oleh pebuatan reagen yang berbeda.

Monosakarida akan mereduksikan CuO dalam larutan Luff  menjadi Cu2O. Kelebihan CuO

akan direduksikan dengan KI berlebih, sehingga dilepaskan I2. I2 yang dibebaskan tersebut

dititrasi dengan larutan Na2S2O3. Pada dasarnya prinsip metode analisa yang digunakan adalah

Iodometri karena kita akan menganalisa I2 yang bebas untuk dijadikan dasar penetapan kadar.

Dimana proses iodometri adalah proses titrasi terhadap iodium (I2) bebas dalam larutan. Apabila

terdapat zat oksidator kuat (misal H2SO4) dalam larutannya yang bersifat netral atau sedikit asam

penambahan ion iodida berlebih akan membuat zat oksidator tersebut tereduksi dan

membebaskan I2 yang setara jumlahnya dengan dengan banyaknya oksidator. I2 bebas ini

selanjutnya akan dititrasi dengan larutan standar Na2S2O3 sehinga I2 akan membentuk kompleks

iod-amilum yang tidak larut dalam air. Oleh karena itu, jika dalam suatu titrasi membutuhkan

indikator amilum, maka penambahan amilum sebelum titik ekivalen.

Metode Luff Schoorl ini baik digunakan untuk menentukan kadar karbohidrat yang

berukuran sedang. Dalam penelitian M.Verhaart dinyatakan bahwa metode Luff Schoorl

merupakan metode tebaik untuk mengukur kadar karbohidrat dengan tingkat kesalahan sebesar

10%.

Persamaan reaksinya:                                                                                                                    

R-COH + 2 CuO → Cu2O (s) + R-COOH (aq)

H2SO4 (aq) + CuO → CuSO4 (aq) + H2O (l)

CuSO4 (aq) + 2 KI (aq) → CuI2 (aq) + K2SO4 (aq)

2 CuI2 ↔ Cu2I2 + I2

I2 + Na2S2O3 → Na2S4O6 + NaI

I2 + amilum → Biru

Penetapan sebelum inversi dilakukan untuk mengetahui jumlah gula pereduksi yang

terdapat dalam sampel. Penetapan inversi lemah dilakukan untuk mengetahui jumlah disakarida

yang tidak bersifat reduksi seperti sukrosa. Penetapan sesudah inversi kuat biasanya dilakukan

untuk menentukan kadar karbohidrat pada poliskarida.