biokimia 7(mekanisme kerja enzim)

1

Kuliah ke tujuh :

BIOKIMIABIOKIMIA FAKULTAS KESEHATAN MASYARAKAT

2

~

Katalisator anorganik/organik( lebih sederhana )

Spesifisitas Substrat(sangat tinggi)

Efisiensi Katalitik(luar biasa)

Katalitis Reaksi Individual(cepat dan selektif)

3

Enzim

Melibatkan serangkaian Intermediate yang terikatEnzim

(bukan satu intermediet substrat – enzim tunggal)

4

Tujuan mekanisme ini untuk memahamipada tingkat molekuler

Enzim merupakan katalisator yang Efisien dan Spesifik

5

• Identifikasi langkah dalam menentukan kecepatan reaksi,• Karakterisasi intermediet yang terikat enzim,• Identifikasi ion logam (gugus fungsional residu asam amino),• Koenzim,• Gugus prostetik yang terikat dalam pengikatan substrat,• Produk• Intermediet pada tapak aktif.

6

7

Pemeriksaan Kristalografi sinar x+

Informasi Mekanistik

Memudahkan Rancangan ObatContoh: inhibisi enzim HMG-KoA-reduktase

Enzim pemicu Biosintesis Kolesterol

8

Memanfaatkan teknologiDNA rekombinan

Mutagenesis

Diarahkan pada tapak aktif enzim

Untuk memodifikasi spesifisitas enzim dan efisiensi katalisnya.

9

Kimotripsin sifat umum katalis enzim(enzim kimotripsin kerjanya mengkatalisis hidrolisis ikatan peptida)

• Gugus karbolik diberikan oleh asam amino aromatik, (Phe, Tyr, atau Trp), atau oleh asam amino dengan gugus R non polar yang besar (Met).

• Seperti enzim protease yang lain, kimotripsin juga mengkatalisis senyawa ester tertentu.

10

Substrat sintetik p-nitrofenil asetat (PNPA)untuk analisis kolorimetrik terhadap aktivitasEnzim Kimotripsin, karena pada hidrolisis PNPA p-nitrofenol.

N

O

O

O

O

p- nitrofenil asetat (PNPA)

p-nitrofenol alkalis Anion p-nitrofenilat(Berwarna kuning)

11

Kinetika laju hidrolisis kimotripsin terhadap PNPA

Dapat diteliti dengan alat STOP – FLOW.

Alat STOP – FLOWTerdiri dari dua lubang

Lubang pertama Lubang kedua (Kimotripsin) (PNPA)

Kedua lubang secara serentak mengeluarkan isinyamasuk ke tabung yang sempit melewati alat Spektrofotometer yang dihubungkan dengan komputer

12

Pelepasan anion p-nitrofenilat berlangsung dalam 2 fase (bifasik)

Fase ledakan (burst phase)

Fase keadaan mantap(steady state phase)

Waktu (mili detik)

Fe

nol y

ang

dib

eba

ska

n

1. Fase ledakan, ditandai dengan pembebasan cepat PNP2. Pelepasan PNP tambahan lebih lambat

CT + PNPA CT-PNPA CT-Ac CTCepat Cepat Lambat

fenolH2O Ac-

13

Mutagenesis Tapak aktif enzim(wawasan mekanistik)

Teknik Biologi Molekuler Penyelidikan Mekanisme Kerja Enzim

Rangkaian basa nukleotida pada gen

Mengekspresikan protein dalam hospesAtau bakteri Escherichia coli.

14

Kombinasi Larutan Kristalografi sinar x

Struktur Kinetik Teknik 3 dimensi Klasik Molekuler

Wawasan Baru dalam mekanisme kerja enzim

15

Data Fisik dan Kinetik

Asam amino turut berperan dalam Katalisis yang spesifik (sebagai basaumum atau sebagai pemindah gugus)

Pendekatan yang lebih umum adalah“MUTAGENESIS BERORIENTASI TAPAK”

( dengan mengubah rangkaian basa sebuah kodon spesifik, dapat mengganti asam amino tertentu dengan asam amino protein lain ).

16

“ METALOENZIM “

Mengandung ion logam fungsionil dalam jumlah yang pasti

(ion logam dapat menfasilitasi ikatan substrat dengan katalis)

Ion logam diteliti dengan :

1. Kristalografi sinar x2. MRI (Magnetic Resonance Imaging)3. ESR (Electron Spin Resonance)

17

Enzim yang diaktifkan oleh logam

Ikatan yang lemah dengan logam

(sehingga memerlukan logam tambahan)

Perbedaan metaloenzim dengan enzim yangdiaktifkan oleh logam terletak pada Afinitas Enzim terhadap ion logamnya.

18

Kompleks terner (kompleks dengan 3 komponen),yaitu : tapak katalitik enzim (Enz), sebuah ion logam (M), dan substrat (S)

Yang memperlihatkan susunanStokiometri 1 : 1 : 1, dalam 4 skema

Enz - S - M

kompleks jembatan substrat

M - Enz - S

kompleks jembatan enzim

Ens - M - Skompleks jembatan logam

sederhana

Ens

M

S

kompleks jembatan logamsiklik

19

Metaloenzim tidak dapat membentuk kompleksterner karena metaloenzim mempertahankan Logam selama proses pemurnian, yaitu Enz-M

Tiga aturan umum :1. Sebagian besar, tetapi tidak semua enzim kinase (ATP:

fosfotransferase) membentuk kompleks jembatan substrat: Enz–nukleotida–M

2. Enzim fosfotransferase yang menggunakan piruvat atau fosfoenolpiruvat sebagai substrat, enzim yang mengkatalisis reaksi fosfoenolpiruvat lain, dan enzim karboksilase, membentuk kompleks jembatan logam

3. Suatu enzim tertentu dapat membentuk satu tipe kompleks jembatan dengan satu substrat, membentuk tipe kompleks yang berbeda dengan substrat lyang lain.

20

A. Kompleks Jembatan Enzim ( M-Ens-S)

Logam dalam kompleks jembatan enzim

Peranan Struktural(mempertahankan konformasi aktif

misal, glutamin sintase).

Atau membentuk jembatan logam dengan sebuah substrat (misal, piruvat kinase)

Disampaing peran strutural, ion logam dalam Piruvat kinase mengikat satu substrat (ATP).

Piruvat kinase

M

ATP

Kreatinin

21

B. Kompleks Jembatan Substrat (Enz-S-M)

Contoh jembatan substrat terner padaNukleotida trifosfat.

ATP4 - + M(H2O)62+ ATP M(H2O)3

2 - + 3 H2O

ATP M(H2O)32 - + Enz ATP M(H2O)3

2 -Enz

Dalam reaksi fosfotransferase, ion logam diduga mengaktifkan ion fosfor, dan membentuk kompleks Polifosfat adenin (kompleks kuartener yang aktif)

22

C. Kompleks Jembatan Logam

Ens - M - Skompleks jembatan logam

sederhana

Ens

M

S

kompleks jembatan logamsiklik

Kristalografi dan penentuan rangkaian

His turut terlibat dalam pengikatanlogam pada tapak aktif protein(karboksi peptidase A, alkalifosfatase, fosfolipase c, subredoksi, protein yang mengandung heme seperti mioglobin dan hemoglobin).

23

Enz – M (kompleks biner)Pelepasan molekul H2ODari lingkup koordinasi Ion logam.

Contoh : Enzim peptidase

Pengaktifan oleh ion logam merupakan proses yang lambat (reaksi lambat ini merupakan penyususnan konformasi kompleks Enz-M binermenjadi konformasi yang aktif).

Enz + M(H2O)6 Enz M(H2O)6.n + n H2Ocepat

Enz M(H2O)6.n Enz* M(H2O)6.n

Penyusunan kembali konformasi aktif (Enz*)

Pengikatan logam

lambat

24

Kompleks jembatan logam ternerdapat dibuat dari METALOENZIM(Enz – M) melalui penggabungan dengan substrat (S)

Enz M + S Enz M S atau Ens

M

S

tepat

dapat

siapa