bab 7

Bab 7 – Prinsip-prinsip Biologi Molekular dan Genetika Kardiovaskular

Elizabeth G. Nabel

Biologi molekular dan genetika saat ini membentuk dasar yang solid untuk ilmu

kardiovaskular dan kedokteran. Dalam dua dekade terakhir, konsep biologi

molekular dan genetika merembet semua aspek kedokteran. Prinsip-prinsip disiplin

ini merupakan ujung tombak dari kurikulum sekolah kedokteran. Lab-lab ilmuwan-

dokter secara rutin menggunakan pendekatan-pendekatan genetika molekular untuk

menguji hipotesis tentang penyakit kardiovaskular. Dokter punya akses ke susunan

pernagkat genetik dan molekular untuk memandu diganosis dan treatment pasien.

Produksi banyak agen terapeutik saat ini menggunakan teknologi asam

deoksiribonukelik rekombinan (DNA).

Terobosan-terobosan dalam pemahaman kami tentang dasar genetika penyakit

kardiovaskular telah sangat menakjubkan. Apresiasi kami terhadap mekanisme di

mana gen-gen tunggal menyebabkan penyakit, bahkan ketika penyakit ini tidak

lazim mendorong padapemahaman patogenesis penyakit-penyakit kardiovaskular

yang lebihumum. Dengan selesainya perangkaian genom manusia, penemuan-

penemuan genomik pada penyakit kardiovaskular saat ini terjadi dengan cepat.

Bagaimana penemuan-penemuan ini akan diterjemahkan ke perawatan pasien

penyakit kardiovaskular saat ini masih sulit diprediksikan.

Bab ini menjelaskan prinsip-prinsip dasar biologi molekular dan genetika. Ini

dirancang sebagai tinjauan singkat dan sumber referensi, yang dimaksudkan untuk

mempersiapkan pembaca bagi diskusi-diskusi aplikasi kardiovaskular spesifik

dalam bab-bab lain dalam teks ini dan dalam literatur kontemporer. Referensi

1

diberikan untuk ulasan umum tentang sebuah topik dan juga sebagai ulasan

mendalam terhadap setiap subyek.

Prinsip-prinsip biologi sel dan siklus biologi

Semua organisme hidup terdiri atas sel dan semua sel berasal dari sel-sel yang ada

sebelumnya. Sel-sel disusun dalam beberapa kompartemen. Prokariot seperti

bakteri mengandung sebuah kompartemen sel tunggal yang dibatasi oleh sebuah

membran atau beberapa membran. Eukariot seperti mamalia ditentukan oleh

pembelahans etiap sel ke dalam sebuah nukleus yang berisi bahan genetik, yang

dikelilingi oleh sitoplasma, dibatasi oleh membran plasma yang menandai tepi sel.

Sitoplasma juga berisi kompartemen-kompartemen khusus, juga dibatasi oleh

membran. Untuk menentukan pelaksanaan isntruki-instruksi genetikdalam sebuah

sel kita harus mempertimbangkan sifat dari bebragai kompartemendan bagaimana

ini berfungsi menciptakan daerah-daerah dengan ciri-ciri yang berbeda.

Sel mamalia merupakan struktur yang sangat terkompartementalisasi (gb 7.1).

membran luar yang disebut membran plasma adalah dua lapis lemak yang

dimaksudkan untuk mengeluarkan lingkungan akueous seperti fluida ekstraselular

membran plasma diisi dengan protein transmembran yang disebut reseptor. Sebuah

reseptor memiliki tempat pengikatan yang mengenali suatu ligan pada sisi eksterior

membran. Pengikatan ligan biasanya memicu perubahan pada protein yang

ditransmisikan dalam muka sitoplasmik oleh perubahan konformasional dalam

protein reseptor atau sebagai pergerakan seluruh protein ke dalam interior.

Perubahan ini memicu perubahan-perubahan lain dalam sel dan memberi jalan

untuk merespon lingkungan. Tipe hubungan ini disebut transduksi sinyal.

2

Sitoplasma berisi jejaring membran. Lembaran-lembaran membran menyusun

retikulum endoplasmik (ER) dan aparatus golgi. ER terdiri ats lembaran kontinyu

membran-membran yang sangat berlipat yang meluas dari membran inti terluar. ER

bisa dibagi menjadi dua tipe, yang merupakan bagian dari lembaran membran yang

sama. ER kasar memiliki ribosom, partikl-partikel kecil yang berhubungandengan

sintesis protein pada permukaannya sementara ER halus tidak. Aparatus golgi

terdiri atas tumpukan-tumpukan sisterna terpisah. Protein yang telah dimodifikasi

dalam ER memasuki aparatus golgi, mengalami modifikasi selanjutnya dan

kemudian keluar. Fungsi utama ER dan aparatus golgi adalah menyortir protein

menurut tujuan, menggunakan sinyal-sinyal inheren dalam rangkaian protein.

Proses mengarahkan protein ke tujuan akhirnya ini disebut protein sorting atau

trafficking. Mitokodria merupakn organel-organel khusus dalam sitoplasma yang

menghasilkan energi yang disimpan dalam bentuk adenosin triphosphate dari

oksidasi senyawa-senyawa yang mengandung karbon seperti gula atau lemak.

Lisosom merupakan badan-badan berlapis membran yang berisi enzim-enzim

hidrolitik yang kemudian memproses protein dan makromolekul lain di dalam sel.

Bentuk sel ditentukan oleh sitoskeleton yang berisi jaringan serat-serat protein yang

meluas melintasi dan di sekitar sel. Tiga kelas serat adalah filamen aktin,

mikrotubula, dan filamen-filamen perantara.

Fitur terpenting dari nukleus adalah materi genetik. Nukleus memiliki penampilan

granular karena kromatin yang mudah dikenalidengan stain-stain tertentu. Antara

pembelahan sel, kromatin membentuk masa tunggal dan padat. Ketika sebuah

selmembelah, kromatinnya bisa terlihat terdiri atas sejumlah struktur seperti benang

khusus yang disebut kromosom. Ciri utama sel kecuali yang mencapai kondisi

3

perkembangan final dan khusus (diferensiasi terminal) adalah kemampuan untuk

membelah. Banyak perubahan struktural terjadi di dalam sebuah sel selama

pembelahan. Membran dan sitoskleton mengalami reorganisasi ekstensif. Sel diatur

oleh sebuah struktur baru yang disebut spindel yang berfungsi memungkinkan

distirbusi kromosom ke sel-sel kembar perubahan-perubahan ini menghentikan

banyak aktivitas sel sebelumnya – ekspresi gen, sintesis dan sekresi protein dan

motilitas sel.

Siklus sel, periode antara pelepasan sel yang baru dibentuk sebagai progeni

pembelahan dan pembelahan selanjutnya menjadi dua sel kembar, terdiri atas dua

bagian. Interfase, sebuah periode yang relatif panjang, mereprsentasikan waktu di

mana sel terlibat dalam aktivitas sintetisnya dan mereproduksi komponen-

komponen subselularnya. Selama interfase, sel memiliki kompartemen inti khusus,

mengandung sebuah masa kromatin padat. Selama mitosis, periode waktu yang

relatif singkat, pembelahan aktual menjadi dua sel kembar terjadi. Dalam sel-sel

dalam mitosis, spindel mengantikan organisasi internal sel dan kromosom individu

muncul. produk-produk seri pembelahan mitotik yang menghasilkan organisme

disebut sel-sel somatik. Selama perkembangan embrionik, banyak atau sebagian

besar sel somatik berlangsung melalui siklus sel. Dalam organisme dewasa banyak

sel berdiferensiasi akhir dan tidak lagi membelah. Sel-sel ini tetap pada fase

stasioner di mana tidak terdapat sintesis DNA, sama dengan interfase perpetual.

Mitosis merekapitulasi konstitusi kromosm sel. Setiap sel kembar memulai

kehidupannya dengan dua kopi dari setiap kromosom. Kopi-kopi ini disebut

homolog. Jumlah total kromoso disebut set diploid dan memiliki 2n anggota.

Selama interfase, sel yang tumbuh menduplikasi materi kromosomalnya. Pada awal

4

mitosis, setiap kromosom nampak mebelah secara longitudinal untuk menghasilkan

dua kopi disebut sister kromatid. Sel ini sekarng berisi 4n kromosom, diatur sebagai

2n pasang sister kromatid. Proses mitosis terdiria tas empat fase: profase, metafase,

anafase dan telofase, berakhir dalam sitokinesis di mana sel membelah dan setiap

sel kembar memiliki set kromosom komlit yang sama, satu anggota dari setiap

pasang berasal dari setiap induk (gb 7-2). Setiap fase terdiri atas gerakan-gerakan

sentromer berbeda, daerah sentral dan konstriksidari kromosom. Gerakan-gerakan

ini penting bagi pemisahan pasangan-pasangan kromosom menajdi setiap sel

kembar dan perampungan pembelahan sel.

Sebelum mitosis, kromosom helai ganda pecah atau kerusakan DNA lain diperbaiki

oleh seri checkpoin siklus sel. Di bawah kondisi normal, DNA selular diperbaiki

dan sel menyelesaikan mitosis. Sel-sel yang DNAnya tidak diperbaiki akan

mengalami apoptoisis atau kematian sel terprogram. Mekanisme ini memungkinkan

percepatan pembelahan sel di mana DNA kromosal tetap utuh. Karsinogenesis bisa

timbul jika pembelahan sel lepas dari kontrol checkpoin dan sel dengan DNA helai

ganda pecah atau bentuk-bentuk DNA rusak lainnya membelah secara tak

terkontrol.

Protein-protein esensial dalam kontrol checkpoin siklus sel adalah cyclin dan

cyclin-dependent kinase (CDK) (Gb 7.3). CDK merupakan kompleks-kompleks

holoenzim yang berisi berisi subunit regulatoris siklin dan sub unit katalitik

CDK. Empat fase khusus dari siklus sel diatur oleh kompleks siklin-CDK: fase

Gap 1 atau G1. Replikasi DNA atau fase S, fase Gap 2 atau G2, dan mitosis atau

fase M. Kontrol poin pembatasan dalam fase G1 dimediasi oleh dua CDK, cyclin

5

D- dan cyclin-E-dependent kinase. Siklin tipe-D (D1, D2, dan D3) berinteraksi

secara kombinas idengan dua partner katlitik, CDK4 dan CDK5, awal pada G1

menghasilkan setidaknya enam holoenzim yang diekspresikan dalapola spesifik

jaringan. Cyclin E memasuki sebuah kompleks dengan partner katalitiknya

CDK2 dan berkolaborasi dengan cyclin D-dependent kianse untuk

menyelesaikan fosforilasi rtinoblastoma tumor-supressor protein (rb) akhir pada

G1 yang menghasilkan transit melalui checkpoin G1-S ke dalam fase S.

Inhibitor endogen dari cyclin-CDK, yang disebut inhibitor kinase bergantung-

cyclin atau CKI, diekspresikan di seluruh G1 untuk menghambat fosforilasi dan

aktivasi kompleks cyclin-CDK, yang menyebabkan penahanan GI. CKI

berfungsi mencegah transisi melalui checkpoin G1 dan menghambat mitosis,

menyebabkan penahanan pertumbuhan sel. CKI digolongkan menjadi dua

keluarga berdasarkan pada struktur-struktur mereka dan target-target CDK.

Protein-protein CIP/KIP merupakan inhibitor yang bekerja luas yang mengubah

aktivitas-aktivitas cyclin-D, cyclin-E dan cyclin A-dependent kianse. Keluarga

ini meliputi p21 (Cip1), p27 (Kip1), dan p57 (Kip2). Ketiganya berisi motif-

motif karakteristik dalam daerah amino-terminal yang mengikat siklind an

substrat CDK p21 (Cip1) berfungsi sebagai sebagai efektor downstream dari

faktor transkripsi dan gen supresor tumor, p53, menyebabkan reparasi kerusakan

DNA dan/atau mendukung apoptosis. P27 (Kip1) adalah inhibitor kuat dari

proliferasi sel dalam jaringan normal dan sakit dan normal dan merupakan

mediator kritis dalam cidera jaringan, inflamasi dan perbaikan luka. Keluarga

INK4 (inhibitor CDK4) dari protein terdiri atas INK4A, INK4B (p15),

6

INK4C(p18) dan INK4D (p19). CKI ini mengandung pengulangan ankyrin

ganda, mengikat hanya ke CDK4 dan CDK6 dan bukan CDK yang lain dan

secara khusus menghamabt sub unit katalitik CDK4 dan CDK6. Protein-protein

INK merupakn regulator penting pertumbuhan tumor dan dalam biologi

perkembangan, tapi berperan lebih kecil dalam penyakit-penyakit

kardiovaskular.

Cidera pada pembuluh darah atau jantung menyebabkan proses remodeling yang

bersifat adaptif di bawah kondisi normal atau maladaptif dalam kondisi

patofisiologi penyakit (lihat bab 22 dan 38). Sebagai respon terhadap stimuli

fisiologis, sel-sel otot halus vaskular (VSMC) di dalam media berproliferasi dan

bermigarsi ke intima membentuk luka vaskular multi lapis atau neointima. Secara

normal ini merupakan proses yang membatasi diri yang menyebabkan lual vaskular

yang sembuh dengan baik dan pemeliharaan aliran darah luminal. Dalam penyakit-

penyakit vaskular tertentu proliferasi VSMC menjadi berlebihan menyebabkan lesi

patologis dalam pembuluh darah yang pada akhirnya menyebabkan gejala-gejala

klinis. Penyakit-penyakit ini sering ditandai oleh inflamasi sistemik atau lokal yang

memperburuk repson prliferatif VSMC. CIP/KIP CKIs merupakan regulator

penting dari remodeling jaringan dalam vasklatur. p27 (Kip1) secara secara

konstitutif diekspresikan dalam VSMC dan sel-sel endotel arteri dan

didownregulasi setelah cidera vaskular atau pemaparan VSMC dan sel-sel endotel

ke mitogen. Setelah ledakan proliferatif, VSMC mensintesa dan mensekresi

molekul matriks ekstraselular yang menandai VSMC dan sel-sel endotel

7

menyebabkan induksi p27 (Kip1) dan p21 (Cip1) dan supresi siklin E-CDK2.

Ekspresi CIP/KIP CKI menyebabkan penahanan siklus sel dan inhibisi pembelahan

sel. P27 (Kip1) juga meruapakn regualtor penting inflamasi jaringan melalui efek-

efeknya terhadap proliferasi T-limposit dalam vaskulatur, p27 (Kip1) memedaisi

reparasi vaskular melalui regulasinya terhadap proliferasi, inflamasi dan sel-sel

progenitor sungsum tulang. Delesi genetik p27 (Kip1) pada tikus menyebabkan

hiperplasia jinak pada sel epitelial dan mesodermal dalam organ-organ ganda yang

meliputi jantung dan vaskulatur. P21 (Cip1) diperlukan untuk pertumbuhan dan

diferensiasi pada jantung, tulang, kulit dan ginjal dan mencakup kerentanan

terhadap apoptosis. CKI ini berfungsi dengan cara yang bergantung dan tidak

bergantung p53. Pada jantung P21 (Cip1) diekspresikans ecara independen dari p53

pada miosit kardiak; overekspresi p21 (Cip1) di dalam miosit menyebabkan

hipertropi.

Sebagian besar sel kanker manusia mempertahankan mutasi yang mengubah fungsi

p53 atau Rb dengan mtuasi langsung rangkaian-rangkaian gen atau dengan

menargetkan sel-sel yang bekerja secara epistatik untuk mencegah fungsi normal

normalnya. Rb membatasi proliferasi sel dengan mencegah entri ke fase S.

mekanisme ini adalah penghambatan faktor-faktor transkripsi E2F dari

mengaktifkan gen-gen yang diperlukan untuk replikasi DNA dan metabolise

nukleotida. P53 dimutasi dalam lebih dari 50 persen kanker manusia. Protein

berakumulasi sebagai respon terhadap stres selular dari kerusakan DNA, hipoksia,

dan aktivasi onkogen. p53 memulai sebuah program transkripsional yang memicu

penahanan siklkus sel atau apoptopsis. Ketika diaktivasi oleh p53, p21 (CipI)

mengindukasi apoptosis dalam sel-sel tumor dan sel-sel lain.

8

Siklus sel berfungsi sebagai regulator utama pembelahan sel. Replikasi DNA dan

sitokinresis bergantung pada fungsi normal siklus sel. Cyclin, CDK dan CKI

merupakan mediator karsinogenesis penting, inflamasi jaringan dan perbaikan luka.

Kode Genetik; DNA, RNA dan PROtein

DNA

DNA adalah blok pembentuk kehidupan manusia (gb 7-4). Struktur heliks

gandanya cukup sederhana, namun aturan-aturan yang dikodekan di dalam struktur

ini menentukan bentuk dan fungsi dari semua sel di dalam sebuah organisme. DNA

terdiri atas dua helai polideoksiribonukleotida yang memelintir satu sama lain

searah jarum jam membentuk helik sganda yang tak retak. Kelompok-kelompok

deoksiribose-fosfat yang bergantian mebentuk tulang punggung heliks, dengan

kelompok fosfat menyusun ikatan 5’-3’fosfodiester di antarakarbon kelima dari

satu cincin pentosa dan karbon ketiga dari cincin pentosa berikutnya (gb 7-5). Basa

asam nukleik yang menempel ke kelompok gula dari setiap helai saling berhadapan

di dalam helisk, perpendikular terhadap sumbu helai. Urutan asam nukleik

menetapkanr angkaian produk protein gen ini. Hanya ada empat basa: purin adenin

dan giuanin (A dan G) dan pyrimidine cytosine danthymine (C dan T). selama

perakitan doubel heliks, purin hanya bisa berpasangan dengan pirimidin dan

pirimidin dengan purin.s etiap pasang basa (bp) membentuk salah satu dari cincin

dalam tangga terpelintir dari molekul DNA, yang ditahan bersama-sama oleh ikatan

hidrogen di antara pasangan-pasangan basa komplementer, memiliki polaritas-

polaritas kimia yang berlawanan. Satu helai diarahkan pada arah 5’ hingga 3’,

9

sementara yang lain diarahkan pada 3’ ke 5’. Enzim yang mengenali rangkaian

DNA spesifik juga mengakui polaritas helai. Enzim “membaca” rangkaian

nukleotida pada dua helai dalam arah yang berlawanan. Karenaa struktur tulang

punggung heliks bersifat invarian, enzim yang bertanggungjawab untuk

pengkopian, pembelahan dan perbaikan DNA , pecahan-pecahan helai bisa bekerja

di manapun di sepanjang helai helai DNA.

Dampak penting dari pemasangan A-T dan G-C adalah rangkaian nuklotida pada

stau helai doubel heliks menentukan rangkaian pada helai komplementer. Aturan

pemasangan basa ini penting bagi penyimpanan, pemerolehan dan transfer materi

genetik, apakah untuk duplikasi DNA ke dalam sebuah sel kembar, perbaikan helai

DNA yang rusak atau membaca sbagai template bagi transkripsi RNA>

Kromosom merupakan helai heliks ganda panjang dari DNA yang dipasangkan ke

dalam panjang padang, khusus oleh protein-protein inti. Setiap kromosom

panjangnya berbeda-beda dan komposisi pasangan basanya juga berbeda-beda.

Pada sel-sel manusia nukleus berisi 23 pasang kromosom yang berbeda, masing-

masing dengan rangkaian pasang basa dan panjang spesifik. Rangkaian DNA

gabungan (sekitar 3 x 109) pada semua kromosom di dalam sebuah sel menyusung

enom. Ifnormasi yang dibawa di dalam genom identik pada semua sel organisme

dan sedikit berbeda di antara anggota spesies. Genom manusia, Homo Sapiens kira-

kira 99 persen identik di antara individu.

Selama pembelahan sel, enzim-enzim yang disebut polimerase mengurai heliks

DNA dalam setiap kromosom dan mengkopi masing-masing dari dua helai secara

terpisah diseluruh panjangya. Setiap sel kembar mewarisi molekul DNA berhelai

ganda yang berisi satu helai baru dan helai baru. Masing-masing helai bisa

10

menghasilkan helai baru yang mereproduksi template asli. Kecermatan replikasi

DNA ini penting bagi transfer akurat informasi genetik. Eror-eror pada proses ini

merupakan sumber umum mutasi gen yang diwarisi dalam putaran pembelahan sel

suksesif.

Sebuah gen merupakan bagian dari rangkaian basa yang digunakan sebagai

template untuk proses pengkopian transkripsi dan oleh karena itu merupakan fraksi

kecil dari semua DNA yang dibawa pada sebuah kromosom. Hanya 1 hingga 2

persen dari basanya mengkodekan protein, dan komplemen penuh rangkaian

protein-koding tetap perlu ditegakkan. Genom manusia berisi sekitar 30.000 gen

khusus. Informasi koding protein yang terkandung di dalam sebuah gen tunggal

bukan kontinyu tapi dikodekan dalam paket-paket diskontinyu ganda yang disebut

ekson. Antara ekson-ekson tersebut terhadap regangan-regangan DNA yang disebut

intron. Fungsi dari intron-intron tersebut tidak diketahui. Intron ini mungkin berisi

banyak informasi regulatoris yang mengontrol ekspresi sekitar 30.000 gen yang

mengkodekan protein, dan banyak lagi elemen-elemen fungsional seperti gen-gen

koding non protein dan detemrinan rangkaian dinamika kromosom. Bahkan lebih

sedikit yang dikethaui tentang fungsi sekitar setengah genom yang terdiri atas

rangkaian-rangkaian repetitif tinggi atau DNA non koding dan non repetitif sisanya.

RNA

Langkah pertama dalam eskspresi informasi genetik adalah transkripsi, yang

berfungsi membawa informasi genetik adalah transkripsi yang berfungsi membawa

informasi genetik dari nukleus ke sitoplasma dimana tejradi sintesis protein. Dalam

proses ini transkripsi DNA ke RNA memerlukan ekspresi template gen yang

11

disebut RNA messenger (mRNA) dalam nukleus (gb 7.6). enzim khusus, RNA

polimerase, mengkopi satu dari du ahelai DNA (helai antisense) menciptakan

regangan kompelmenter yang merupakan salinan tepat dari helai sense. Struktur

RNA sedikti berbeda dari DNA. Salah satu basa RNA, urasil, mengganti timin basa

DNA, dan ribosa komponen fosfat gula RNA menggantikan deoksiribosa DNA.

Ribosa membuat molekul RNA lebih rentan terhadap degradasi daripada

deoksiribosa yang lebih stabil. Ini memungkinkan RNA merespon lebih cepat ke

pergeseran-pergeseran dalam signaling selular dan bergerak cepat ke sitoplasma

untuk produksi protein.

Dari gen-gen ke protein

Proses yang mengonversi sebuah gen ke sebuah protein melibatkan dua langkah

utama; transkripsi DNA oleh RNA dalam nukleus dan translasi RNA ke dalam

protein dalam sitoplasma. Ini merupakan proses yang sangat kompleks dan

teregulasi. Transkripsi bermula dalam nukleus dengan mengkopi rangkaian DNA

gen ke dalam mRNA (lihat Gb 7-6). RNA helai tunggal dimodifikasi pada kedua

ujungnya. Pada ujung 5’, struktur nukleotida yang disebut cap ditambahkan untuk

meningkatkan efisiensi translasi dengan memungkinkan ribosom mengikat ke

RNA. Pada ujung 3’, nukleotida mengenali rangkaian kaya A/T pada daerah non

koding dan merampingkan downstream tarnskrip pada sekitar 20bp. Sebuah enzim

yang menambahkan regangan adenosit untuk membentuk ekor polyA, yang

menyetabilkan transkrip, memodifikasi ujung 3’ yang baru membelah. Transkrip

kemudian menjalani pembelahan untuk menghilangkan rangkaian-rangkaian

intronik. Ini merupakan proses yang sangat teregulasi karena transkrip yang tidak

12

dipecah sangat tidak stabil dan dibersihkan dengan cepat dari sel. Splicing

merupakan titik kontrol penting dalam ekspresi gen. ini harus benar-benar presisi

karena delesi atau penambahan nukleotida tunggal pada jungsi splice akan

melempar frame dari translasi kodon tiga-basa RNA selanjutnya. Signifikansi RNA

splicing penuh tidak sepenuhnya diphamai tapi harus merepresetnasikantitik kritis

dalma regulasi ekspresi gen karena ekspansi besar rangkaian-rangkaian itnrondan

ketidakmampuan transkrip meninggalkan nukleus hingga intron-intronnya dilepas.

Sekali dalam sitoplasma, mRNA membrikan template untuk translasi atau sintesis

protein. Translasi terjadi pada kompleks makromolekular, seperti lini assembly,

terdiri atas ribosom. Ribosom membca dan mentranslasikan rangkaian nukleoitida

dalam mRNA ke dalam rangkaian asam amino; yaitu empat kode mRNA basa

ditranslasi ke dalam 20 alfabet asam amino protein. Kode genetik ini sangat

sederhana dan telah dikonversi di sebagian besar organisme. Setiap tiga nukleotida

RNA mengokdoekan satu asam amino; oleh karena itu kodon merupakan sebuah

triplet basa (gb 7.7). permutasi empat nuklotida RNA menghasilkan 64 triplet

berbeda (4x4x4) berbeda sehingga setiap 20 asam amino bisa ditetapkan oleh lebih

dari satu kodon. Salah satu triplet, AUG, menetapkan metionine yang merupakan

asma amino yang memulai setiap protein. Tiga triplet lain, UAA, UGA, dan UAG

memprogram ribosom pada translasi akhir dan oleh karena itu disebut stop codon.

Konversi sebuah kodon ke dalam sebuah asam amino memerlukan molekul adapter,

disebut transfer RNA (tRNA) untuk mendekodekan mRNA. Setiap tRNA

menggunakan rangkaian tiga-basa unik atau antikodon untuk menyesuaikan dengan

kodon komplementer dalam mRNA (lihat gb 7- 6). Enzim-enzim ribosomal

berhubungan menggabungkan asam amino, yang membebaskannya dari tRNA

13

adapter dan menambahkannya ke rantai asam amino yang tumbuh. Urutan asam

amino ditetapkan oleh urutan kodon pada template mRNA yang berhubungan.

Translasi kemudian menyelesaikan transfer informasi dari DNA dalam nukleus ke

struktur protein unik.

Karena kode genetik dipertahankan di antara spesies, rangkaian genetik manusia

bisa ditransfer ke dalam bakteri, ragi, atau sel-sel insektisida di mana rangkaian

akan direplikasi dan didekodekan ke dalam RNA dan protein. Prinsip ini

merupakan dasar teknologi DNA rekombinan yang digunakan untuk menghasilkan

protein-protein rekombinan untuk tujuant erapeutik dan riset (misalnya aktivator

plasminogen jaringan).

Proses ekspresi gen memerlukan regulasi presisi dan terkontrol pada beberapa

langkah. Hanya seidkit gen diekspresikan di dalam sebauh sel pada waktu tertentu.

Satu set gen diekspresikan secar akonstitutif pada sebagian besar sel yang disebut

sebagai “gen-gen housekeeping.” Gen-gen ini diperlukan untuk replikasi sel,

pembentukan energi dan fungsi-fungsi survival. Set gen kedua diekspresikan

dengan cara spesifik silsilah (yaitu di dalam sel-sel tertentu). Gen-gen ini

diperlukan untuk fungsi-fungsi spesifiks el seperti kontraktulitas. Regulasi presisi

gen-gen spesifik silsilah menentukan identitas dan fungsi unik dari sebuah sel

tertentu. Set gen lainnya diinduksi sebagai respon terhadap stimuli lingkungan set-

set kontrol ini diperlukan untuk menghasilkan pola ekspresi gen kompleks dan

dinamik yang memungkinkan organisme merespon sinyal-sinyal eksternal dan

internal.

Prinsip-prinsip dan teknik-teknik biologi molekular

14

Teknologi DNA rekombinan berkembang pada 1970an sebagai respon terhadap

kebutuhan akan kuantitas DNA yang mencukupi untuk analisis biokimia. Metode

ini mengacu pada clipping sebuah segmen di luar DNA sekeliling menggunakan

endonuklease spesifik rangkaian yang dikenal sebagai enzim restriksi. Segmen bisa

dimasukkan sekehendaknya ke dalam vektor yang memungkinkan mengkopi dalam

jutaan kali (lihat kemudian). Sukses teknik-teknik DNA rekombinan mendorong

sebagian besar kemajuan dalam biologi molekular selama lebih dari 30 tahun.

Banyakdari teknik tersebut sekarang umum dalam lab riset. Pendekatan-pendekatan

ini digunakan secara rutin untuk analisis ekspresi gen; dan penemuan gen-gen dan

terapeutik baru. Kemajuan ini mengubah wajah riset medis. Teknik genetika

dimana sebuah organisme dimodifikasi meliputi gen-gen baru yang dirancang

dengan karakteristik yang diinginkan menjadi praktek rutin dalam banyak lab riset.

Teknologi DNA rekombinan berfungsi untuk memproduksi masa protein terapeutik

seperti aktivator plasminogen jaringan rekombinan. Kemampuan manipulasi genom

manusia membuka kemungkinan baru untuk pengembangan uji diagnostik dan

terapi-terapi baru. Teknik-teknik biologi molekular, seperti struktur DNA itu

sendiri sangat sederhana. Pendekatan-pendekatan dasar dijelaskan di sini; pembaca

dipandu utnuk meninjau secara mendalam untuk primer tentang bagaimana

menjalankan teknik-teknik tersebut.

Kloning DNA

Kloning molekular memberi cara untuk menghaslkan jutaan kopi rangkaian atau

gen DNA di dalam sel-sel bakterial. Fragmen DNA pertama kali dimasukkan ke

dalam vektor kloning. Vektor yang paling sering dipakai adalah molekul DNA kecil

15

dan sirkular yang disebut plasmid atau virus-virus bakteri yang disebut phage.

Vektor-vektor tersebut mengandung informasi genetik yang memungkinkan sel

bakterial untuk mereplikasi rangkiaan DNA. Setelah insersi rangkaian DNA vektor

plasmid atauphage dimasukkan ke dalam sel bakterial. Tumbuhnya kultur bakterial

mereplikasi vektor yang mengandung rangkaian DNA dalam ribuan kopi pe sel,

menghasilkan banyak klone identik dari rangkaian DNA awal. Vektor-vektor

kemudian dpanen untuk kultur bakterial dengan menggunakan enzim pembatasan

yang sama yang digunakan untuk memasukkan rangkaian DNA ke dalam vektor.

Ahli biologi molekular menggunakan endonuklease pembatasan yang diperoleh

dari bakteri sebagia gunting molekular yang memotong motif-motif DNA pada

rangkaian-rangkaian yang bisa diprediksikan. Setiap enzim pembatasan mengenali

rangkaian nukleotida spesifik. Tempat-tempat pengenalan tersebut terdapat secara

random di sepanjang DNA dari organisme dan terdiri atas motif rangkaian simetrik

pendek yang disebut palindrome yang diulangi dalam orientasi berlawanan pada

helai-helai DNA heliks ganda. Misalnya, enzim EcoRI dari bakteri Escherichia coli

mengenali dan memotong rangkaian GAATTC palindromic rangkaian asimetrik,

meninggalkan overhang helai ganda pada setiapujung potongan. Ujung-ujung

“sticky” tersbeut memiliki rangkaian unik dan kmplementer yang bisa digunakan

untuk menghubungkan fragmen DNA manusia dengan ujung-ujung DNA

komplementer dari sumber lain. Reaksi enzimatik berhubungan dengan DNA helai

ganda kontinyu yang membentuk splice halus. Prinsip-prinsip tersebut digunakan

untuk menyusun penyusunan kembakli DNA untuk tujuanganda seperti kloning

gen, menghasilkan tikus knockout, atau menyusun terapi-terapi DNA rekombinan.

16

Teknik-teknik Blotting

Blotting merupakan alat yang memugkinkan identifikasi DNA, RNA atau protein

oleh ukuran molekularnya. Analisis DNA disebut sebagai Southern blot;

identifikasi RNA adalah Northern blot; dan isolasi protein adalah western blot.

Prinsip-prinsip teknik blotting cukup jelas. Campuran molekul yang dianalisa

ditujukan pada elektroforesis gel, agarose gel digunakan di mana molekul-molekul

dimasukkan ke dalam well pada satu ujung. Gel dicelupkan ke dalam buffer dan

ditujukan pada arus listrik. Molekul-molekul tersebut bermograsi di antara medan

listrik. Karena DNA dan RNA asam yang memabwa muatan negatif, mereka

bermigrasi ke arah kutup positif gel. Matriks agarose menghambat migrasi

molekul-molekul yang lebih besar sheingga molekul-molekul juga berpisah

menurut ukruannya. Ketika elektroforesis rampung, gel diangkat dari bufer dan

filter nilon dan bahan absorben kering ditaruh di bagian atas. Buffer dari gel

diblotting ke dalam bahan absorben dengan membawa molekul-molekul terpisah

yang tetap pada filter nilon. Filter ini ditangani untuk menaruh molekul-molekul

pada permukaannya, mencitpakan bayangan cermin dari gel asli. Filter ini

kemduian dibilas dengan molekul tagged (uji) yang mengenali (berhibridasi ke)

molekul yang dimaksud dan dibilas untuk menghilangkan uji yang tidak dibatasi.

Untuk southern (DNA) dan northern (RNA) blot, uji merupakan fragmen kecila

sam nukleik yang membawa rangkaian komplementari pada molekul yang

diinvestigasi. Asam nukleik ditag dengan elemen radioaktif yang bisa dideteksi

oleh pemaparan ke film sinar x atau teknik-teknik lain.

Posisi uji hibridasi yang nampak sebagai sebuah pita, memberi estimasi ukuran

segmen DNA atau RNA. Dengan menjalankan lane-lane paralel dari amrker

17

moleklar dengan ukuran yang diketahui, ukuran preissi elemen DNA atau RNA

ditentukan. Untuk indentifikasi protein (Western blot), uji ini terdiri atas antibodi

tagged yang mengenaliprotein target. Marker-marker ukuran juga dijalankan dalam

gel untuk mengidentifikasi ukuranprotein.

Teknik-teknik blotting juga digunakan untuk tujuan-tujuan lain meliputi pemetaan

posisi tempat-tempat pemabtasan dalam gen khusus setelah pencernaan enzim

pembatasan dan dalam analisis sitogenik untuk membandingkan tempat-temppat

pembatasan pada DNA genomik dari sampel ujidan referensi.

Polymerase Chain Reaction (PCR)

PCR adalah prosedur amplifikasi yang berlangsung dalam tabung uji (gb 7-9).

Segmen DNA atau RNA yang diamplifikasi digabungkan dalam sebuah tabung uji

dengan dua primer oligonukleotida pendek (fragmen-fragmen DNA berhelai

tunggal yang disintesa secara kimia). Primer-primer ini memulai amplifikasi, yang

kemudian berlangsung dalam seri siklus dimana DNA awal, yang disebut template,

dipisahkan menjadi helai-helai tunggal. Pemisahan helai-helai memungkinkan

primer mengikat atua menempel ke rangkaian-rangkaian kompelmenter masing-

masing disetiap ujung helai tunggal. Enzim polimerase DNA stabil panas

menambah basa nukleotida pada ujung setiap primer, membaca di antara helai

DNA tunggal, menghasilkan kopi komplementer dari helai tunggal. Pada saat

polimerase mencapai ujung helai tunggal, rangkaian berhelai ganda baru telah

dihasilkan. Siklus ini mulai lagi, memanskand an memisahkan helai ganda, dikuti

oleh pembentukan helai baru oleh primer dan polimerase. Setiap putaran

amplifikasi PCR menggandakan jumlah template DNA. Menciptakan jutaan kopi

18

sebuahs egmen DNA dimungkinkan dalam beberapa jam oleh PCR, bahkan ketika

materi pemulanya merupakan kopi DNA tunggal. Seluruh amplifikasi dilakukand

alam tabung uji bersegel atau dalam sebuah mesin yang dirancang khusus yang bisa

diprogram utn memanaskan dan mendinginkan sampel secara otoamtis. PCR

sekarng menjadi alat umum untuk menghasilkan jumlah materi genetik identik yang

cukup untuk analisis.

Prinsip-prinsip Genetik Molekular

Genotip dan Identifikasi Gen-gen penyebab penyakit

Penemuan struktur dan fungsi DNA pada 1953 memberi dasar bagi genetika

molekular. Penyelesaian perangkaian genom manusia menambah banyak pada

dasar ini. Para dokter sekarang memiliki perangkat genetika molekular di mana

mereka bisa melakukan diagnosis dan treatment. Dalamhal ini tiga konsep terbukti

berguna dalam enetika kardiovaskular: genotip, genomik dan proteomik. Genotip

merupakan campuran rangkaian DNA dalam set gen individu atau rangkaian

komplit DNA individu pada 23 pasang kromosom. Genomik ini merupakan

ekspresi rangkaian-rangkaian gen sebagai RNA. Fokus genomik adalah gen mana

yang diekspresikan? Proteomik adalh studi protein yang diekspresikan di dalam

sebuahsel atau organisme yang mencoba memahami jaringan interaksi protein-

protein.

Secara historis, bidang genetik berfokus pada gangguan-gangguanmonogenik yaitu

penyakit yang disebabkan oleh delesi gen tunggal atau mutasi. Dengan perangkat

genomik dan proteomik yang lebih baru, perhatian ditujukan pada evaluasi

19

kerentanan genetik terhadap ciri-ciri penyakit kompleks seperti penyakit arteri

koroner dan diabetes. Memahamidasar genetik dari penyakit kompleks memerlukan

pengetahuan tentang rangkaian-rangkaian gen, protein-protein yang dikodekan oleh

gen dan fungsi protein. Meski demikian semakin jelas bahwa problem

kardiovaskular kompleks tidak bisa dipeahkan hanya dengan mendapakan

rangkaian nukleotida genom manusia atau dari mengungkap 30.000 loci yang

mengkodekan protein-protein masing-masing atau meregulasi gen-gen lain.

Diperlukan karya yang besar untuk menentukan dengan tepat mekanisme molekular

di mana perubahan-perubahan pada gen individu atau set gen menetapkan atau

menyampaikan resiko untuk penyakit spesifik.

Gangguan-gangguan monogenik

Genetika medis berfokus pada penyakit monogenik atau gen tunggal, di mana

penyebab penyakit dilacak pada gen yang hilang atau bermutasi. Sekitar 1000 gen

penyebab penyakit telah diidentiifkasi. Gangguan-gangguan monogenik langka dan

biasanya diwariskan dengan cara mendelian atau autosomal. Yang menarik,

pemahaman kami tentang mekanisme di managemen tunggal menyebabkan

penyakit, meski mekanisme tersebut tidak lazim telah mendorong pada pemahaman

patogenesis penyakit kardiovaskular yang lebih umum.

Pemahaman terbaru faktor-faktor genetik dalam penyakit kardiovaskular diulas

secara lebih detail di tempat lain. Secara singkat, setiap gen ada dalam dua kopi,

dikenal sebagai alele. Individu homozigous pada suatu lokus jika dua alele identik,

atau heterozigous jika alelenya berbeda. Alele khusus yang muncul pada loci

tertentu merepresetnasikan genotip untuk gen-gen tersebut. dipandang lebih luas,

20

genotip merupakan campuran dari faktor-faktor genetik yang bertanggungjawba

menciptakan sebuah fenotip. Sebuah fenotip merupakan sifat yang nampak atau

bisa diukur yang berasal dari sebauh genotip seperti penyakit arteri kroner atau

obesitas. Fenotip bisa juga diartikan sebagai efek aksi gen, apakah karena gen

tunggal atau seluruh genotip.

Perbedaan-perbedaan pada rangkaian nukleotida, baik di antara dua individu atau di

antara semau individu dalam sebuah populasi merupakan variasi genetik.

Perbedaan-perbedaan yang muncul dalam rangkaian nukleotida dan menyebabkan

perubahan struktural pada protein yang dikodekan disebut mutasi. Mutasi diartikan

terjadi pada kurang dari 1 persen populasi tertentu. Sekitar 16.000 mutasi dalam

gangguan gen tunggal telah diidentifikasi. Contoh-contoh mutasi meliputi

msissense, non sense, pergeseran frame, delsi dan insersi (gb 7-10). Mutasi-mutasi

misssense berasal dari substitusi satu atau beberap anukleotide dengan cara yang

mengubah rangkaian primer protein yang dikodekan. Mutasi-mutasi missense

tersebut mengubah fungsi protein dengan mengubah struktur primernya. Mutasi

nonsense memperkenalkan kodon hentian prematur ke dalam gen menyebabkan

produk gen truncated yang bisa menunjukkan perubahan-perubahan dalam fungsi

dan bisa tidak stabil. Insersi atau delesi nukleotida menambah atau mensubstrak

asam amino dari protein-protein yangdihasilkan jika peurbahan-perubahan

nukleotida menyebabkan penambahan atau delesi triplet. Mutasi-mutasi frame-shift

terjadi ketika kodon sebuah gen dibaca dalam rangka pembacaan yang keliru.

Mutasi-mutasi ini basanya menyebabkan struktur proteina bnormal karena

pengenalan kodon termiansi out-of frame yang menyebabakn penghentian protein

prematur. Mutasi dalam introndan ekson menyebabkan splicing eror yang juga bisa

21

menyebabkan perubahan struktur protein atau penghentian prematur. Yang terakhir

mutasi dalam promoter atua enhancer gen bisa menyebabkan perubahan pada level

ekspresi sebuah protein, atau pola temporal atau spasial ekspresi gen sebuah

protein.

Beragam mutasi telah ditemukan dalam penyakit kardivoaskular monogenik.

Misalnya meski cacat primer dalam hiperkolesteromia familial merupakand eifist

LDLR, lebih dari 600 mutasi dalam gen LDLR telah diidentifikasi pada pasien

dengan gangguan ini. Demikian juga kardiomiopati hipertropik (sebuah penyakit

odminan autosomal) disebabkan oleh mutasi dalam en-gen yang mengkodekan

protein aparatus kontraktil-myocardial. Mtuasi-mutasi kausatif ganda pada

setidaknya 10 protein sarkomerik berbeda telah teridentifikasi antara lain rantai

beart beta-myosin kardiak, protein pengikatan miosin kardiak, cardiac troponin T,

cardiac triponin I, alfa-tropomyosin, rangai ringan regualtoris dan esnesia dan aktin

kardiak. Gangguan akrdiovaskular monogenik lainnyameliputi sindrom Q-T

panjang familial, venous trombosis karena faktor V leiden dan bentuk-bentuk

hipertensi turunan.

Analisis ciri kompleks

Polimorfisme merupakan variasi-variasi umum yang diartikan muncul dalam lebih

dari 1 persen populasi. SNP merupakan substitusi nukleotida yang tidak mengubah

struktur protein (gb 7-11). SNP merupakan penanda yang bergunauntuk memetakan

gen-gen ke dalam loci kromosomal. SNP bisa berupa marker kerentanan penyakit

(yaitu ini bisa berhubungan dengan penyakit karena efek langsungSNP terhadap

penyakit atau hubungandengan lokus kerentanan di sekitarnya). seklitar 1.4 juta

SNP ada dalam genom manusia. SNP putatif dan konfirmatoris bisa diakses

22

melalui beberapa database publik seperti dbSNP, database yang disimpan oleh

National Center for Biotechnology Information.

Sebuah haplotipe adalah serangkaian SNP yang dikelompokkan dalma daerah

genetik kontiguous dan diwariskan en bloc di dalam sebuah populasi. Haplotipe

bisa memiliki hubungan yang jelas dengan penyakit atau hanya muncul dikaitkan

dengan faktor-faktor pengacau. Jika SNP dikaitkand engan sebuah penyakit

kemungkiann SNP diwariskan sebagai bagian dari ahplotipe di mana SNP lain juga

dikaitkan secara statistik dengan penyakit ini. Asosaisi non random alele ini disebut

linkage disequilibrium. Linkage disequilibrium ada ketika alele di dua loaksi

berbeda dalam genom diwariskan bersama secara lebih sering daripada yang

diperkirakan. Karena SNP bisa menjadi marker bukannya penyebab rpedisposisi

penyakit, bukti kausalitasmemerlukan penunjukan fugsi gen yang berubah.

Upaya internasional mengidnetifikasi semua SNP pada 22 kromosom somatik pada

300 individud ari latar belakang beragam di Asia, Afrika, Eroap dan Amerika.

Proyek ini disebut Haplotype Map atau HapMap yang dimulai pada 2002 untuk

menyusun peta kluster SNP genom luas berdasarkan sampel-sampel DNA dari

poulasi manusia yang berbeda dan HapMap komplit diterbitkan pada 2005.

HapMap memberi peta jalan SNP untuk melakukan analisis silsilah, studi-studi

asosiasi dan evaluasi partner SNP untuk kontribusi pada sebuah penyakit. SNP

memberi wawasan tentang dasar genetika untuk penyakit karena beberapa alasan:

agena-gen penyebab langsung dari fungsi gen yang berubah; marker penyakit,

tanpa memperhatikan kausalitas; marker genom luas untuk studi-studi genetik

karena kehadirannya pada kerapatan tinggi di seluruh genom.

23

Analisis Silsilah dan studi-studi Asosiasi

Dua tipe studi genetik menguji pewarisan: analisis silsilah dan studi-studi asosiasi.

Studi-studi silsilah dilakukan dalam keluarga-keluarga untuk mempelajari

pewarisan bersama dua ciri yang diturunkand ari orang tua ke anak. Analisis SNP

digunakan karena marker ini bisa menunjukkan ko-pewarisan dari dua sifat atau

alele yang berada berdekatan satu sama lain pada lokus kromosomal. Gen-gen yang

mengkodekan dua sifat berada berdekatan satu sama lain dan alele dihubungkan.

Silsilahditentukan oleh skor LOD, atau logaritma odds bahwa marker dihubungkan

pada jarak tertentu, dibagi oleh odd yang dihubungkan pada 50 persen ko-

pewarisan (tidak dihubungkansama sekali). Analisis silsilah umumnya digunakan

untuk mengidentifikasi dan mempelajari sifat-sifat Mendleian. Metode pembagian

Allele juga digunakan untuk membandingkan kemiripan alele-alele dalam ndividu

yang terpengaruhseperti pasangan saudara kandung yang terkena.

Studi-studi asosiasi berbasis populasi berguna untuk investigasi ganguan-gangguan

umum tanpa pewarisan Mendelian yang jelas. Studi-studi asosiasi sering

menggunakan pendekatan kontrol kasus di mana grup eksperimental dan refernesi

dibandingkan. Pertimbangan cermat terhadap populasi kotnrol yang paling tepat

diperlukan untuk mengambil kesimpulan valid dan menduga fungsi gen dari studi-

studi tersebut. Studi-studi kontrol kasus harus diperkuat dengan ukuran sampel

yang cukup besar untuk mencapai signifikansi statistik. Dalam pendekatanini, SNP

yang dikenal dalam gen-gen calon disleidiki mewnggunakana lele-alele sebuah

SNP sebagai variabel yang kemudian dikaitkand engan kehadiran atau ketiadaan

penyakit atau hasil tertentu. Jika SNP dalam gen target tidak diketahui, maka gen

ini secara langsung dirangkaikan dalam subset studi dan dalam populasi kontrol

24

untuk menentukan SNP mana yang direpresentasikans ecara difernesial dalam dua

populasi. Konfirmasi SNP kemudiand ialkuaknda lam isa populasi menggunakan

teknik-teknik berbasis PCR. Validasi memerluakn pengujian asosaisi dalam kohort

indepdenden. Keterbatasan pendekatan asosiasi merupakan bias yang inheren

dalam seleksi gen-gen calon. Hanya gen-gen yang dikenal atau yang menarik yang

sering dipilih untuk investigasi. Sebaliknya, identifikasigen-gen dengan cloning

posisional sering mendorong pada penemuan tak terduga.

Scan luas Genom

Genome wide scan SNP merupakan teknik yang lebih baru yang dilakukan pada

platform high-troughput dan uji untuk beberapa ratus ribu SNP secara bersamaan.

Dengan mengambil keuntungan dari distribusi fisik SNP melalui genom, daerah

kromosmal dia ntara SNP bisa dihubungkan dengan penyakit menggunakan

metode-metode statisitk. Ini merupakan teknik yang kuat untuk membantu

penemuan SNP baru didalam atau di dekat gen-gen yang menyebabkan atau

dikaitkan dengan penyakit ini, seringkali penyakit-penyakit kardiovaskular

kompleks. Genom-wide scan juga merupakan perapatan berguna untuk riset yang

didorong oleh hipotesis. Pendekatan ini kemungkinan akan menerima perhatian

yang cukup besar dalam 5 hingga 10 tahun berikutnya ketika para peneliti

mempelajari kerentanan genetik terhadap penyakit kardiovaskuar kompleks,

modifier genetik penyakit dan interaksi-interaksi gen-lingkungan.

Genomik

25

Genomik adalah studi fungsi gen melalui pengukuran-pengukuran paralel genom,

sebagian besar menggunakan teknik-teknik microarray an analisi serial ekspresi gen

(SAGE). Pemakaian microarray dalam penemuan obat meluas, dan apliaksinya

meliputi rsiet dasar dan penemuan target, determinasi biomarker, farmakologi,

toksikgenomik, selektivitas target, perkembangan uji prognostik, dan determiansi

penyakit-subklas.

Teknik-teknik dasar melibatkan ekstraksi RNA dari sampel-sampel biologis dalam

kondisi uji atau normal (gb 7-12). RNA dikopi, semetnara mamsukkan flurescent

nukleotida atau tag yang kemudian di stain dengan fluerescence. RNA berlabel

kemduian dihibridsasi ke microarray, kelebihannya dibilas, dan microarray discan

di bawah sinar laser. Hasil akhir adalah 4000 hingga 5000 pengukuran ekspresi gen

per sampel biologis. Krena eksperimen komplit bisa melibatkan jumlah hinga

ratusan microarray, set data ekspresi RNA resultan bisa sangat beragam ukurannya.

cDNA Microarrays

cDNA (complementary DNA) microarrays dibentuk dari pustaka cDNA uji (500

hingga 5000 basa) dengan menentukan titik cDNA yang berhubungan dengan gen

individu atau uji di loaksi presisi pada slide mikroskop. Setiap microarray

mengukur dua sampel dan memberikan level pengukruan erealtif untuk setiap

molekul RNA. RNA target yang diberi label flurescencet dye dihibrdisasi ke

permukaan microarray cDNA, bersama dengan sampel kontrol. Dua sampel RNA

dirampungkan untuk mengikat setiap uji. RNA yang cocok dengan rangkaian

cDNA berhibidira ke titik cDNA pada slide mirkoskop. Label-label flurescenet

diaktivasi laser dan sinyal menguat dari uji fluerencence yang mengikat titik-titik

26

cDNA dibandingkan. Perbandingan ini merefleksikan rasio keberlimpahan RNA

untuk setiap gen yang diekspresikan. Strategi-strategi normalisasi yang

memungkinkan standardisasi perbandingan inter-array diterapkan, diikuti oleh

metode analisis, sebagaimana dijelaskan sebelumnya.

Oligonucleotide Arrays

Oligonucleotide arrays diciptakan oleh penempelan uji nukleotida sintetis (12-80-

mer oligonukleotida) yang mereprestnasikan bagian gen unik ke permukaan

susunan, cDNA disintesa dari sampel mRNA eksperimental, diikuti oleh langkah

transkripsi in vitro untuk menciptakan cRNA biotin-labeled, yang berhibrida ke

target microarray. Micrroarray ditangai dengan flurescencet dye yang ditag ke

avidin (protein yang mengikat secara kuat ke biotin) dan ditujukan ke aktivasi laser.

Dengan susunan oligonukleotida, setiap microarray mengukur sampel tunggal dan

memberi level pengukuran absolut dari setiap molekul RNA. Intensitas sinyal

diukur sebagi refleksi level ekspresi untuk setiap gen.

SAGE

SAGE adalah teknik untuk karakterisasi ekspresi gen berdasarkan pada perangkaian

langsung transkrip. Kekuatan utamanya adalah penentuan dan analisis transkrip

ketika rangkaian tidak diketahui. SAGE memerlukan sekitar 10 kali lebih besar

kuantitas mRNA untuk analisis dan lebih melelahkan daripada beberapa platform

susunan bahkan dengan sequencer otoamtis, karena perbandingan dua sampel

paling sederhana memerlukan perangkaian sekitar 1.5 x 10 basa. Faktor ini saja

mengalami kesulitan ketika keberlimpahan RNA rendah, sementara keuntungan

27

utamanya adalah senitivtayang lebih tinggi untuk perubahan-perubahan pada level

ekspresi.

Setelah akuisisi data dengan pemrosesan gambar, data dianalisa dalam tiga langkah:

normalisasi, filtering dan komputasi. Normalisasi mencakup faktor-faktor teknik

seperti aray manufacturing, perbedaan-perbedaan pada penggunan dye, dan

ketidakteraturan dalam distribusi uji selama hibiridasasi dan dilakukan utn

memungkinkan perbandingan bermakna di antara susunan-susunan individu.

Penyaringan data mengacu padaseleksi data yang kemungkinan mepreresentasikan

temuan-temuan signifikan. Kriteria khusus untuk penyaringan meliputi pengukuran

kualitas sinyal dan perubahan lipatan pada level ekspresi gen. ekspresi gen

diferensial dalam analisis microarray seringkali diartikan sebagia perbedaan 1.5

hingga 2 kali lipat dalam level ekspresi gen relatif.

Penentuan kemiripan dan ketidakmiripan merupakan komponen penting dari

analisis data. Dua pendekatan umum digunakan: diawasi dan tidak diawasi.

Metode-metode yang diawasi digunakan untuk menemukan gen-gen dengan level

ekspresi yang secara signifikan berbeda di antara grup-grup sampel dan

menemukangen-gen yang dengan akurat memprediksikan karakteristik sampel. Dua

teknik diawasi yang seringdigunakan antara lain ‘tetangga terdekat” dan “mesin

vektor pendukung.” Pengguna metode yang tak terawasai mencoba menemukan

struktur internal atau hubungan dalam set data bukannya mencoba menentukan cara

terbaik memprediksikan jawaban yang benar. Emapt teknik tak terawasi yang

sering dipakai antara lain pengelompokan hirakis, peta pengaturan-diri, jaringan

relevansi dan analisis komponen-prinsip. Metod-emetode analitis tersebut

dijelaskan secara detail di bagian lain. Pendekatan-pendekatan komputasional

28

tersebut kemudian diikuti oleh analisis statistik. Sebelum data microarray diambil

pada nilai permukaan, temuan-temuan signifikan harus divalidasi dengan uji

independen level ekspresi RNA menggunakan PCR transkripsi terbalik kuantitatif

atau teknik-teknik blotting Northern konvensional .

Proteomics

Proteomic adalah studi protein yang diekspresikan oleh genom. Genomik dan

proteomik harus dipandang sebagai komponen komplementer dari spektrum

genetik, dimulai dengan DNA dan berakhir dengan protein-protein yang

dimodifikasi (gb 7-13). Protein adalah produk akhir dari genom manusia dan pada

akhirnya menentukan biologi manusia. Protein bertanggungjawab untuk bentuk dan

fungsi bioplogis. Para ilmuwan memperkirakan ada enam hingga tujuh kali protein

banyaknya gen (200.000) pada manusia karena splicing, pertukaran kaset-kaset

struktural di antara gen selama transkripsi dan modifikasi posttranslasional. Bidang

protemik mencoba memahami interaksi-interaksi kompleks dari semua protein yang

diekpsresikan dalam jaringan atau organisme di bawha kondisi normal atau

perturbansi. Sebenarnya proteomik manusia masih dalam tahap dini.

Metode-metode untuk analisis proteome masih dikembangkan dan divalidasi.

Meski demikian ada lima elemen dasr bagi analisis protemik: pemerolehan sampel,

ekstraksi protein, pemisahan protein, penentuan rangkaian protein dan

perbandingan rangkaian dengan database referensi untuk identifikasi protein.

Pemerolahn sampel cukup jelas, melibatkan pemerolehan sebuah biopsi jaringan

atau sampel plasma dari seseorang (dibawah izin tertulis). Ekstraksi protein

umumnya dilakukan dengan metode-metode kimia, umumnya dengan metanol

29

untuk mengeluarkan semua DNA, RNA, karbohidrat dan lipid. Protein-protein yang

diekstraksi harus dipisahkan untuk identifikasi dan langkah ini secara tradisional

dilakukan elektroferesis gel dua dimensional. Dalam dimensi pertama protein-

protein dipisahkan oleh massa dan dalam dimensi keduamereka dipisahkan oleh

poin isoelektrik atau muatan jaring. Karena sebagian besar titik pada gel dua-

dimensional mengandung beberapa konstituen protein, metode-metode alternatif

untuk memisahkandan mengidentifikasi protein, termasuk kromatografi cair, telah

berkembang. Kromatografi cair mengunakan media berfase padat dan berfase cair

untuk memisahkan protein menurut sifat-sifat biokimia yang meliputi massa

molekular, titik isoelektrik atau hidrofobisitas. Pemsiahan-pemisahan kromatografi

cair ini bisa dilakukandalam serial untuk memperbaiki resoluisi. Tipe-tipe kolom

kromatografi lain bisa digunakan untuk meningkatkan sensitivitas dan kekhususan

seperti kromatografi afinitas di mana sebuah kolom berisi antibodi-antibodi yang

spesifik untuk fungsi-fungsi tertentu untuk mencapai hasil yang diinginkan.s telah

pmeisahan protein diidentifiaski umumnya menggunakan suatu bentuk spektrometri

massa (gb 7-14). Spektrometri massa mengonversi protein atau peptida ke spesies-

spesies bermuatan yang bisa dipisahkan berdasarkan rasio massa terhadap muatan.

Beberapa tipe metode ionisasi spektrometri massa digunakan antara lain ionisasi

elektrospary dan MALDI. Rangkaian-rangkaian peptida yang diidentifkasi engan

metode-metode ini selanjutnya harus dianalisa dengan dibandignkan dengan

rangkaian database yang dikenal untuk menentukan identitas protein unequivokal.

Sekali protein dalam proteme tertentu diidentifikasi, level keberlimpahan relatif

ditentukan untuk membandingkan keberlimpahan relatif protein dalma kondisi

normal atau sakit. Yang terakhir, analisis menyeluruh terhadap sebuah proteome

30

harus meliputi suatu ukuran fungsi apakah ini berada dalam sel-sel yang

dikulturkan atau dalam model-model binatang. Pendekatan ini mirip dengan

analisis genomik fungsinal di mana penting untuk mengukur pentingnya gen atau

mutasi melalui penentuan fungsi gen.

Analisis proteomik saat ini dibatasi oleh sensitivitas, kekhususan, dan throughput.

Meski demikian bidang ini dan metodologinya berkembang dengan cepat. Aplikasi

protemik terhadap penyakit kardiovaskular cukup menjanjikan untuk memahami

fungsi sistem kardiovaskular dalam semua kompleksitasnya.

Modifikasi Genetik Tikus untuk mempelajari penyakit kardiovaskular

manusia

Teknik-teknik untuk menghasilkan tikus yang dimodifikasisecara genetik memiliki

dampak yang besar terhadap riset kardiovaskular. Tikusadalah binatang kecil

dengan periode kehamilan pendek (21 hari). Ada konservasi yang besar dari jalur

khusus molekular yang mengontrol perkembangan dan fungsi kardiovaskular di

antara tikus dan manusia. Gen-gen yang sama dan jalru khusus signaling

meregulasi perkembangan jantung dan vaskulatur pada kedua spesies. Dengan

selesainya perangkaian genom manusia dan tikus, genetika komparatif sekarang

dimungkinkan. Karena alasan-alasan tersebut, tikus yang dimodifikasi secara

genetik menjadi model binatang penting untuk mempelajari genetika

kardiovaskular, biologi perkembangan dan fisiologi. Keterbatasan-keterbatasan

model-model tikus untuk mempelajari penyakit kardiovaskular manusia juga

dibuktikan, tapi karena kesederhanaan manipasi genetik pada tikus, ini menjadi

31

temapt awal standar untuk uji hipotesis sebelum evaluasi pada binatang yang lebih

besar. bagian ini secara signkat menjelaskan prinsip-prinsip dari empat pendekatan

ke modifikasi dalam tikus: transgenik, delesi gen atau knockout, conditional

knockout dan mempelajari fisiologi tikus.

Tikus Transgenik

Penciptaan tikus transgenik melibatkan empat langkah: kloning gen yang

dimaksud; fusi gen ke rangkaian regulatoris transkripsional yang memprogram

ekspresinya dalam semua jaringan tikus atau dalam jaringan-jaringan khusu: injeksi

transgen yang dimurnikan ke dalam pronukleus jantan dari embrio tikus satu sel y

agn dibuahi; dan reimplantasi embrio yang disuntikkan ke ibu foster. Transgen

yang disuntikkan secara random berintegrasi ke dalam sebuah kromosom embrio

yang dibuahi menghasilkan seekor tikus founder yang mengekspresikan transgen

yang disuntikkan dan yang melewatkan transgen ke 50 persne dari progeninya.

Studi-studi komapratif bisa dilakukandi antara tikus littermate non transgenik dan

tikus transgenik sebagia kontrol produksi tikus transgenik founder sekarangs ecara

rutin dilakuakn dalam banyak lab dan dicapai scara umum dalam waktu kruang dari

satu bulan. Teknik-teknik yang sama telah digunakan utn menciptakan kelinci, tikus

dan babi transgenik.

Penyaringan teknik-teknik ini telah membantu model-model transgenik yang lebih

canggih. Promoter spesifik sel memprogram ekspresi transgen secara khussu dalam

akrdiomiosit, sel-sel endotel, dan sel-sel otot halus vaskular, menciptakan tikus

transgenik engan ekspresi terbatas pada sistem akrdiovaskular. Meski overekspresi

sebuah transgen menghasilkan pertambahan fungsi, ini juga dimungkinkan

32

menghilangkanf ugnsi gen tungal dengan mengovberekspresi mutan negaitf

dominand ari gen tersebut, protein yang dikodekan yang mengganggu fungsi

protein tipe liar. Ekspresi transgene bisa juga dimatikan atau dihidupan dengan

menggunakan obat sederhana seperti tetracycline mengugnakan sistem tet operon

tikus ini memungkinakn eksrpesi transgene tepat waktu dan juga perbandingan

dengan bintang yang sama dari fenotip transgetn pad kondisi on dan off.

Inaktivasi gen atau pendekatan-pendekatan knockout

Delesi gen merupakan pendkeatn tambahan bagi transgenesis untuk mempelajari

peran gen khusus dalam perkemabgnandan fisiologi tikus (gb 7-15). Dalam studi-

studi delesi gen, ekspresi satu atau beberapa gen di knockout untuk menghasilkan

tikus mutan yang kehialngan fungsi. Pendekatan knockout melibatakn langkah-

langkah beriktu: penyusunan vektor penarget yang berisi gen yang dimaksud

dengan delesi atau mutasi nonsnse; transfeksi sel batang embrionik tikus pluripotein

dengan vektor penarget; rekombinasi homolog di antar konstruk penarget dan satu

kopi gen endogen, menghasilkan sebuah sel batang embrionik dengan delesi

homozigous gen yang dimaksud; injeksi sel batang embrionik mutan ke blastokista

tikus yang dibuahi; dan implantasi blastokista ke dalam ibu foster. Anak tikus yang

dihasilkan adalah chimera di mana semua jaringan yang meliputi gonad diperoleh

sbeaigiand ari sel-sel batang embrionik mutan dan sebagian dari sel-sel tipe liar dari

blastokista yang disuntikkan. Binatang chimerik ini diternak ke sebuah biantang

tipe liar dan fertiliasasi telur tipe liar dengan sperma mutan dari chmera

menghasilkan tikus knockout heterozygous di mana satu kopi gen yang dimaksud

di semau sel merupakan mtuandan kopi lain merupakan tipe liar. Biantang

33

heterozigous kemudian diternak satu sama lain utn menghasilkan fenotip khsuus

yang menunjukkan fungsi langsung gen dalam perkembangan dan fisilogi nromal

dan yang terganggu. Penciptaan tikus knockout secara teknis lebih menantang

daripada transggenesis dan sering butuh 9 hingga 12 bulan untuk rampung.

Tikus knockout kondisional

Inaktivasi gen-gen penting umumnya menghasilkan fenotip mematikan embrionik

dini yang sulit dianalisa dan dimengerti. Akibatnya metode-metode telah

dikemabngkan untuk menghapus gen-gen dengan cara spesifik jaringan dan/atau

menonaktifkan gen-gen pada waktu-waktu yang berbeda dalam perkembangan

selain itu seringkali menarik untuk menghasilkan mutasi gen khusus dairpada

mengeliminasi ekspresi mereka secara utuh. Rekombinasi homolog juga digunakan

untuk memperkenalkan mtuasi-mutasi spesifik ke gen-gen tipe liar; perbedaan

dalam tekniknya adalah knock ins terebut menggunakan targeting construct yang

berisi gen mutan daripada delesi gen. pendekatan-pendekatn rekombinasi hoolog

lainnya memungkinkan pengenalan gen khusu atau tak berhubugnan ke dalam

sebuah lokus genetik asing untuk mengatur gen baru di bawah kontrol promoter

lokus yang ditargetkan.

Pendekatan lain pada delesi gen spesifik jaringan adalah penggunaan sistem

rekombinasi phage bakterial yang disebut Cre-lox. P1 bacteriophage mengkodekan

sebuah enzim yang disebut Cre yang mengkatalisis rekombinasi DNA di antara dua

rangkaian spesifik (disebut tempat-tempat loxP) yang menandai rekombinasi.

Sistem ini telah diterapkan pada tikus dengan menghasilkan targeting construct di

mana gen yang dimaksud diflanked dengan tempat-tempat loxP (sebauh floxed

34

allele). Tikus homozigous untuk floxed allele diternakkan dengan tikus transgenik

yang mengekspresikan Cre recombiase dengan cara spesifik jaringan (misalnya sel-

sel endotel, sel-sel oto halus vaskular, kardiomiosit). Tikus yang dihasilkan

memiliki delesi gen yang menarik hanya pada jaringan yang mengekspresikan Cre

rekombinase. Dengan menempatkan Cre transgene di bawah kontrol promotor

responsif tetracycline, delesi gen diprogram hanya dengan mengikuti tetracycline

feeding.

Studi-studi Fisiologi Tikus

Menyadari keuntugnan potensi genetika tikus memerlukan teknologi yang bisa

mengolongkan fenotip tikus mutan. Tikus ini secara teknis menantang karena

pembuluh jantung dan hati berikuran kecil dan denyut jantung tikus yang

beristirahat lebih dari 500 denyut/menit. Teknik mikro bedah dan instrumentasi

miniatur membantu memecahkan problem ini. Dengan teknik-teknik tersebut,

dimungkinkan untuk mengambil ukuran-ukuran fisiologis pada tikus yang

dianastesi dan diintubasi termasuk tekanan darah aortik, tracing tekanan ventrikular

kiri dan hemodinamika kardiak sebelum dan setelah infusi zat-zat farmakologis,

seperti dobutamine atau isoproterenol. Pencitraan non invasif jantung dan

vaskulatur membaik scara substnsial dan ekokardiogram dua dimensi sekarang ini

rutin dilakukan pada tikus dewasa dan fetal. MRI memberi gambar yang jelas pada

struktur dan fungsi kardiak. Teknik-teknik non invasif ini digunakan untuk

mengkur dimensi ventrikular kiri sistolik akhir dan diastolik akhir, ketebalan dan

massa dinding ventrikular kiri dan fraksi pemendekan. Infraksi miokard yang

dihasilkan oleh ligasi arteri koroner, cidera bawat pada pembuluh yang

35

mensimulasi angioplasti dan aortic banding untuk menginduksi hipertropi

ventrikular kiri umumnya dilakukan pada tikus yang dimodifikasi gen. uji latihan,

25 jam pencatatan elektrokardiogram pada tikus sadar dengan menggunakan

implanted transducer dan studi-studi elektrofisiologis untuk mendeteksi cardiac

arrhytmia juga menjadi teknik standar. Dengan keterediaan teknik untuk

mempelajari fisilogi kardiovaskular, tikus yang dimodifikasi scara genetik sekarang

memberi cara yang akurat dan nyaman untuk mengevaluasi fungsi gen-gen khusus

dalam penyakit kardiovaskular.

Transfer Gen

Transfer gen adalah pengenalan atau ekspresi gen-gen rekombinan pad sel-sel

mamalia. Transfer gen bertujuan memperkenalkan gen-gen rekombinan ke sel-sel

target untuk mempelajari mekanisme dan konskenwesi ekspresi gen. gen-gen

ditranfeksi ke dalam sel-sel menggunakan vektor. Gen rekombinan mengalami

transkripsi ke dalam RNA dan translasi ke dalam protein oleh enzim inang, yang

emmuncak dalam ekspresi protein rekombinan. Protein rekombinan tetap

intraselular atau disekesi ke ruang ekstraselular atau sirkulasi. Ekspresi gen transien

atau stabil, bergantung pada apakah integrasi ke dalam kromosom terjadi. Efiisensi

uptake DNA dan ekspresi gen sering disebut sebagai efisiensi transfeksi bergantung

pada banyak faktor antara lain pengiriman DNA ke dalam sel, uptake DNA ke

dalam sitoplasma, degradsi DNA dalam endosom, pelepasan DNA dari endoosm ke

sitoplasma, transpor ke nukleus dan persistensi dalam nukleus.

Transfer gen in vivo dilakukan oleh metode transfer gen langsung atau dimediasi

sel. Transfer gen ex vivo atau yang dimediasi sel melibatkan pelepasan sel-sel

36

autolog dari inangd an mentransfeksi sel-sel dengan vektor in vitro. Sel-sel yang

dimodifikasi secara genetik diperkenalkan kembali ke inang oleh infusi atau injeksi.

Transfer gen ex vivo memungkinkan pengenalan materi genetik rekombinan ke

dalam sel spesifik – misalnya sel-sel otot endotelial atau halus – dan analisis

eksprei gen rekombinan di dalam tipe sel tersebut

Transfer gen in vivo menggunaan gen-gen rekombinan langsung ke dalam sel-sel

dan jaringan-jaringan target. Transfer gen yang ditargetkan dalam vaskulatur

dilakukan oleh promotor spesifik sel untuk mencapai ekspresi gen did alam sel

endotel atau sel-sel otot halus. Baik pendekatan transfer gen ex vivo dan in vivo

telah digunakan dalam pengembangan model binatang penyakit vaskular dan dalam

percobaan klinis transfer gen ke sistem kardiovaskular.

Vektor

Transfeksi sel-sel target yang cocok merupakan langkah pertama yang penting

dalam transfer gen. akibatnya pengembangan metode transfer gen

merepresentasikan bidang penelitian yang cukup signifikan. Baik vektor viral dan

non viral telah digunakan dalam studi-studi transfer gen vaskular. Ciri-ciri umum

dari metode tersebut adalah pengiriman gen secara efisien ke dalam sel. Vektor

berbeda dalam pemrosesan DNA asing dan frekuensi integrasi ke dalam DNA

kromosomal. Dalam kasus vktor retroviral dan lentiviral, rangkaian-rangkaian yang

ditransfer diintegrasikanke dalam DNA kromosomal sel target. Vektor-vektor ini

paling sering digunakan dalam terapi gen ex vivo. Metode-metode lain dari hasil

transfer gen menghasilkan pengenalan dna asing ke nuklei sel target dalam bentuk

yang tidak terintegasi. Metode-metode ini menghasilkan ekspresi gen tinggi tapi

37

transien. Vektor-vektor yang meliputi adenovirus, virus terkait adeno dan liposome

kationik telahdigunakan terutama untuk studi-studi transfer gen in vivo.

Retrovirus

Retrovirus merupakan vektor-vektor pertama yang digunakan dalam studi transfer

gen sejak 1980an. Minat awal terhadap retrovirus sebagai vektor muncul dari

observasi bahwa vektor-vektor tersebut dengan stabil mentransduksi hampir sekitar

100 persen sel-sel target yang berproliferasi dalam kultur. Vektor-vektor retrovirus

digunakan pada awalnya dalam studi-studi tranfer gen vaskular, terutama studi-

studi ex vivo, tapi penggunaannya terbatas oleh efisiensi transfeksi. Vektor-vektor

retroviral telah digunakan baru-baru ini dalam studi-studi terapi gen klinis untuk

pengobatan SCID. Sayangnya dalam satu percobaan, dua anak mengalami

komplikasi insersi retroviral ke dalam tempat onkogenik kromosom X yang

menyebabkan leukemia.

Adenovirus

Adenovirus tipe 2 dan 5 adalah dua serotip yang digunakan untuk vektor-vektor

dalam transfer gen kardiovaskular. Genom adenovirus linear, DNA berhelai ganda,

sekitar 36kb panjangnya yang dibagi menjadi 100 unit peta masing-masing 360

pasangan basa panjangnya. DNA mengandung ITR pendek pada ujung genom yang

diperlukan untuk replikasi DNA viral. Produk-produk gen ini diatur ke daerah awal

(E1-E4) dan akhir (L1-L5) berdasarkan eksprei sebelum atau sesudah permulaan

replikasi DNA. Adenovirus emiliki siklus hidup litik yang ditandai oleh

penempelan ke reseptor glikoprotein adenoviral pada sel-sel mamali adan masuk k

38

sel-sel dengan endositosis yang dimediasi reseptor. Protein capsid adenoviral

melindungi adenovirus dari degradasi lisosomal, dan DNA viral bertranslokasi ke

nukleus. Ekspresi gen-gen viral berganung pada faktor-faktor transkripsi selular dan

ekpsreis daerah E1 adenoviral, yang mengkodekan transaktivator ekspresi gen viral.

Selama infeksi litik, genom viral mereplikasi ke beberapa ribu kopi per sel. Genom

viral berhubungan dengan protein inti dan dikemas ke dalam kapsid dengan

menyusun protein kapsid utama.

Genom adenovirus merupakan replikasi yang defisien untuk menciptakan sebuah

vektor. Vektor-vektor disusun oleh rekombinan homolog dalam lini sel yang

dikenal sebagi 293 sel oleh kontrasfeksi 1) plasmid bakteri yangmengandung

cDNA yang dimaksud dan daerah kecil genom adenoviral yang didelesi dari daerah

E1A dan E1B (daerah-daerah ini meregulasi transkripsi adenoviral dan diperlukan

untuk replikasi viral) dan 2) genom adenoviral tak sempurna. Rekombinasi

homolog di antara dua DNA menghasilkan genom rekombinan di mana gen asing

menggantikand aerah E1. Stok viral dipropagasi pada 293 sel ke titer tinggi yang

umumnya merupakan unit pembentuk plak (pfu) per mililiter.

Vektor-vektor adenoviral memiliki beberapa keuntungan tambahan yang meliputi

infeksi efisien sel-sel mamalia dan ekspresi dalam sel-sel non membelah dan in

vitro dan in vivo. Vektor-vektor ini relatif stabil dan bisa ditumbuhkan dan

dikonsenrasikan pada titer tinggi. Replikasi ekstrakromosomal dari vektor sangat

mengurangi peluang mutasi oleh integrasi random dan disregulasi gen-gen selular

inang. Meski demikian jumlah kekurangan membatsi penggunaannya sebagai

vektor transfer gen. ekpsresi gen dalam sel-sel vaskular dan miokardial setealh

infeksi adenoviral berumur pendek, terdiri hanya selama beberapa minggu. Respon

39

imun kekebalan terhadap protein adenoviral menunjukkan kelemahan utama pada

pemakaian in vivonya. Meski tingkat antibodi penetral yang rendah tidak nampak

menimbulkan efek klinis buruk, mash tetap ditentukan apakah respon kekebalan

inang terhadap adenovirus akan menghilangkan pemakaian adenoviral dari serotipe

adenovirus yang sama. vektor-fvektor adenoviral rekomin an genrasi pertama

(delesi gen E1A dan E1B dan delesi partial gen-gen E3) telah digunakan

secaraklinis dalam studi-studi terapi gen, meski dalam model-model binatang

vektor-vektyor tersebut sering dikaitkan dengan inflamasi jaringan, khususnya pada

liver dan paru-paru. Pemaparan langsung liver yang sakit terhadap vektor

adenoviral titer tinggi sangat beracun dan dalam satu kasus mematikan. Inaktivasi

dari gen E2A memperpanjang ekspresi gen dan menghasilkan lebih sedikit

inflamasi pada paru-paru dan liver. Dalam studi-studi transfer gen artetrial yang

menggunakan avektor adenoviral, infiltrat sel inflamatoris mononuklear telah

diamati dalam adventitia arteri pulmonary dan periferal tapi tidak ditemukan

adanya nekrosis atau vaskulitlis. Infeksi arteri pulmonary dengan adenovirus

dikaitkand engan tingkat inflamasi perivaskuarl reingan; meski demikaina rteri

pulmonary yang diberi saline atu lposome juga menunjukkan akumulasi ringan sel-

sel mononuklear perivaskular. Meskid engan kelemahan respon imun terhadap

protein kapsid adenoviral, vektor-vektor adenoviral merupakan alat yang menarik

untuk transfer gen in vivo pada model-model binatang karena efisiensi tarnsfeksi.

Apakah vektor adenoviral akan digunakan secara klinis masih perlu dilihat.

Virus-virus terkait-Adeno

40

Adeno-associated virus (AAV) adalah parvovirus manusia defektif yang memiliki

ciri-ciri menarik sebagai vektor transfer gen. vektor viral ini dipersiapkan pada titer

tinggai dan normalnya tidak patogenik pada manusia dan meginfeksi banyak tipe

sel in vitro. Genom AAV adalah molekul berhelai tunggal, linear berukuran DNA

5kB. AAV tipe liar berinterasi menurut tempat dalam daerah 7 kb tunggal pada

kromosom 19 manusia. Genom AAV diflanking oleh 145 pengulangan terminal

terbalik-pasangan basa yang berisi rangkaian yang diperlukan untuk pengemasan,

replikasi DNA dan integrasi. Daerah koding mengandung dua frame badcaan

terbuka yang didelesi dan diganti dengan satu atau beberapa cDNA plus unit-unit

regulatoris transkripsional selama konstruksi vektor. Vektor-vektor AAV menerima

kaset transgene hanya 4 hingga 5 kb; ini membatsi tipe-tipe transgene yang bisa

digunakan. Propatgagasi vektor-vektor AAV memerluakn pekemasan kompleks

yang meliputi protein AAV Rep dan Cap dan lima protein adenoviral (E1A, E1B,

E2A, E4 dn VA). Syarat-syarat pengemasan kompleks ini menghilangakn

konstruksi lini sel helper untuk AAV. Aat ini vektor disusun oleh kontrasfeksi sel-

sel dengan vektor AV dan plasmid non packeable yang berisi protein Rep dan Cap

AAV. Ini diikuti oleh infeksi sel-sel yang ditransfeksi dengan adenovirus helper

mutan atau tiep liar. AAV dipisahkan dari adenovirus pengontaminasi oleh

treatment panas dan sentrifugasi gradsi kerapatan ekulibrium.

Vektor-vektor AAV menginfeksi beberapa tipe sel in vitro tapi kegunaannya secara

in vivo masih tidak pasti. Transduksi sel-sel otot halus dan endotelial vaskular tetap

tidak diketahui. Kelemahan selanjutnya meliputi tidak adanya lin9-nili sel kemasan

dan kebutuan untuk koninfeksi dengan adenovirus sehinga memeprsulit

mempersiapkan vektor AAV murni dalam jumlah besar. delesi gen-gen viral

41

selaam konstruksi vektor membatasi kemampuan vektor-vektor tersebut berinterasi

dengan cara spesifik tempat tapi memberi kemungkinan mutagenesis interlesional.

Vektor-vektor AAV memiliki daya tarik teoritis tapi diperlukan karya yang lebih

besar sebelum bisa digunakan secara klinis.

CATIONIC LIPOSOMES

Cationic lipids merupakan preparasi lipid bermuatan positif yang secara spontan

berkompleks dengan DNA bermautan negatif membentuk konjugat lipid-DNA>

komponen lipid membantu pengiriman DNA ke sel-sel dengan fusi dengan

membran plasmid atau dengan membran endosomal setealh endositosis. Setelah

pelepasan dari endosom, DNA plasmid dipertahnakand alam bentuk

ekstrakromosomal. Liposom kationik telah digunakan dalam studi-studi transfer

gen arterial dalam banyak model binatang termasuk tikus, kelinci, anjing dan babi.

Keuntungan liposom kationik melipuiti profil keamanan yang bagus, tidak adanya

rangkaian koding viral dan tidak ada batasan-batasan ukuran cDNA. Mereka

menghasilkan toksisitas biokimia, hemodinamika atau akrdiak minimal pada

biantang atau manusia. Vektor-vektor ini cukup jelas untuk dipersiapkan bagi

pemakaian klinis dan eksperimental. Kelemahan-kelemahan meliputi efisiensi

transfeksi rendah dan ekspresi gen jangka pendek.

POLYMERS

Asam nukleik dan obat telah digunakan pada gel-gel polimer yang dilapiskan

pada sten atu balon dan secara langsung diterapkan pada arteri. Banyak polimer

sebelumnya dikaitkand engan reaksi-reaksi ifnlamatoris kuat. Formualsi-

42

formualsi yang lebih baru telah berhasil dignakan dalam pengembagnan drug-

eluting stent.

Model-model binatang

Transfer gen adalah pendekatan yang berguna untuk memasukkan asam nukleik ke

sel-sel somatik pada binatang untuk menentukan fungsi gen, mendieseksi

patofisiolgoi penyakit atau mencapai efek terapeutik. Selama dekade yang lalu

transfer gen telah diguanaknda lam banyak model binatang penyakit

kardiovaskular. Pendekatan berbasis gen dan berbasis sel telah digunakan meliputi

minat terbaru dalam menggabungkan trasnfer gen dengan terapi-terapi berbasis sel

batng. Transfer gen sebagai perangkat untuk menginduksi pertumbuhan vaskular

merupakan contoh ilustratif.

Pertumbuhan vaskular berlangsung melalui beberapa tahap angiogenesis,

arteriogenesis dan limpoangiogenesis. Angiogenesis merpakan sprotuing pembuluh

darah baru dari pembuluh-pembuluh yang ada sebelumnya. Arteriogenesis adalah

pembesaran pembuluh darah kolateral muskular dari anastomosis arteriola yang ada

dan sering disebut sebagai kolateralisasi. Limpangiogenesis adalah pembentukan

pembuluh limpatik baru dari yang sudah ada. Ini dipakai scara luas dalam studi

klinis dan pra klinis. Dua varian splice dari VEGFA, VEGF dan VEGF memiliki

sifat-sifat angiogenik pada model binatang dan dievaluasi dalam percobaan-

percobaan klinis. PIGF juga memiliki aktivitas angiogenik pada binatang. PIGF

43

mengikat ke VEGFR-1 dan berkontribusi pada angiogenesis di bawah kondisi

patologis. Yang menarik PIGF juga mendukung angiogenesis dan arteriogenesis

melalui mobilisasi sel-sel batang hematopoietik dan sel-sel progenitor endotel dari

sungsum tulang. Relevansi klinis VEGF, PIGF, dan sel-sel progenitor endotlial

dalam treatment klinis iskemia masih belum ditetapkan meski ada upaya

mentrandsuksi sel-sel batang dengan VEGF untuk meningkatkan angiogenesis.

Faktor-faktor pertumbuhan lain telah dievaluasi untuk sifat-sifat angiogenik dalam

model transfer gen. hypoxia-inducible transcription factor-1-alha mengaktifkan

faktor-faktor pertumbuhana ngiovengik antara lain VEGF-A, vEGR-2 faktor

pertumbuhan seperti insulin 2, dan eritropoiten. Faktor transkripsi lueicne zippr

yang mengaktivasi transkirpsi VEGF juga telah dijelaskan baru-baru ini.

Hipotesis bahwa overekspresi faktor-faktor pertumbuhan akan menyebabkan

pertumbuhan vaskular terapeutikt elah diuji pada beberapa model biantang iskemia

periferal dan myokarial termasuk transduksi ex vivo sel-sel batang dan sel-sel

progenitor endotel. VEGF yang dimedaisi adenoviral dan pengiriman dan

pertumbuhanv askular telah ditunjukkan dalam miokardium dan otot skeletal oleh

prolfeirasi dan pembesaran kapiler, meski penghentian terapi (atau pemusnahan

transgen) menyebabkan regresi sebagian besar pembuluh. Ekspresi VEGF selama

lebih dari 4 minggu menyebabkanr emodeling vaskular yang memadsi bahwa

pertumbuhan pembuluh baru berlangsung selama beberapa bulan setelah treatment

VEGF dihentikan. Pada model-model binatang, faktor hemodinamika dan

persistensi aliran darah penting bagi stabilitassi pembuluh yang baru dibentuk.

Selanjutnya nilai prediktif model binatang praklinis berhubungan terbalik dengan

ukuran binatang. Banyak aplikasi dan vektor bekerja dengan baik pada binatng

44

kecil seperti tiksu dan mencit tapi meningkat pada binatang besar seperti babi,

anjing dan bibri-biri terbukti sulit. Demo kemanjuran pad binatang normal dam

muda mungkint idak memprediksikanr espon pada pasien manusia tua dengan

penaykit kronis. Sebenarnya, binatang diabetik dan lansia mengalami gangguan

pertumbuhan vaskular. Banyak efek biologis menguntungkan yang dilaporkan pada

binatang tidak diterjemahkan pada manusia dengan keterbatasan vektor saat ini

Percobaan-percobaan klinis

Percobaan-percobaan terapig en kardiovaskular memiliki proses yang bisa

diperiksa. Banyak percobaan fase 1 etlah dirampungkan tapi sedikit yang berlanjut

ke studi fase II. Perhatian muncul tentang penggunan vektor-vektor adenoviral

bahkan utnuk aplikasi kardiak atau vaskular, dan juga efisiensi transfeksi rendah in

vivo. Sebagian besar studi berfokus pada stimulasi angiogenesis dan arteriogenesis

untuk memperbaiki perfusi otot skelatal atau myokardial. Tiga fase percobaan

angiogenesis terapeutik telah dilakukans aat ini. Percobaan fase 1 awal

menggunakan DNA plasmid dan adenovirus untuk menginduksi angiogenesis ke

iskemia miokardial atau periferal. Percobaan ini mengevaluasi keamanan fvektor

dan kateter atau pengiriman injekasi langsung pada sejumlahkecil pasien. Temuan-

temuan yang konsisten juga dibuktikan: tidak ditemukan peristiwa buruk serius

akibat vektor gen tersebut atau alat pengirim. Dengan menunjukkan keamanan,

percobaan fase I/II mengevaluasi jumlah pasien yang lebih besar dengan titik-titik

akhir keampuhan l;unak. Tidak ada perisitwa buruk utama yang dilaporkan dan

meski temuan-temuan kampuhan positif dilaporkan, banyak dari percobaan tersbeut

yang tidak dikontrol. Secara kolektif didapatkan pemahaman klinis berikut. Efek-

45

efek plasebo umum pada pasien yang diobati mungkinkarena perubahan

hemodinamika atau membaiknya perawatan klinis. Titik-titik akhir klinis tidak

slealu ditetapkan sebelumnyad an menimbulkan keraguan tentangdata kemanjuran.

Tidak adanya studi random dan terkontrol juga tidak memabntu bidang ini

melangkah lebih maju. Fase ketiga percobaan klinis telah dimulai dengan studi

terkontrol palcebo yang meliputi jumlah apsien yang lebih besar dan titik-titik akhir

klinis yang lebih jelas. Data dari studi fase III tersebut dan follow up jangka

panajgn penting untuk menentukana pakah sebuah produk terapi gen akan disetujui

oleh FDA dan digunakans cara klinis untuk mengobati iskemia perifral dan/atau

myokardial. Membaiknya pemahaman tentang farmakokinetika juga penting. Para

peneliti harus berlanjut dengan percobaan yang dievaluasi dan dilakukan dengan

hati-hati.

Petunjuk-petunjuk di masa mendatang

Biologi molekular dan selular sekarang bergabung dengan riset kardiovaskular

mainstream. Pendekatan-pendekatan ini mengedepankan pemahaan kami tentang

aptogenesis penyakit kardiovaskular yang mendorong pada pengembangan model

binatang yangs angat berguna dan memberi prinsip-prinsip dasar untuk terapi-terapi

molekular. Riset kardiovaskular sekarangberalih ke genetika molekular sebagai

areana ilmiah berikutnya di mana kemajuan utama akan terjadi. Saat ini, kami

mulai memahami mekanisme di mana gen-gen tunggal menyebabkan penyakit

akrdiovasular. Mekanisme ini memberikan wawasan yang luar biasa tentang

patofisiologi gangguan kardiovaskular umum kompleks. Tantangan utama

berikutnya dalam bidang genetika adalah memahami dengan lebih jelas kerentanan

46

genetik terhadap penyakit-penyakit kardivoaskular umum. Genotyping, genomik

dan proteomik merupakan pendekatan-pendekatan yang menjanjikan dan masih

pada tahap aplikasi dini. Informasi yang didapatkan dari teknik ini hanya akan

sebagus karakterisasi fenotip klinis oleh dokter yang cermat dan pintar yang

mendeteksi pola-pola penyakit yang tak lazim pada para pasien mereka. Meski

banyak invetigator tetap bisa diharapkan, kami tidak tahu peran yang dimainkan

oleh terapi berbasis sel atau genetik dalam praktek kardiologi klinis. Upaya-upaya

dari banyak dokter-ilmuwan dan para peneliti klinis diperlukan untuk melakukan

studi yang cermat dan penuh pertimbangan. Hanya kemudian janji genetika

molekular bisa diwujudkan dan diterapkan untuk mengobati pasien kardiovaskular.

47