III. METODE PENELITIAN

A. Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian akan dilaksanakan di Laboratorium Zoologi Fakultas Matematika

dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung pada bulan Juni 2011

sampai November 2011. Pembedahan dan pembuatan preparat histologi akan

dilakukan di Laboratorium Patologi BPPV (Balai Penyidikan dan Pengujian

Veteriner) Regional III Bandar Lampung.

B. Desain Penelitian

Penelitian yang dilakukan merupakan uji eksperimental dengan menggunakan

desain penelitian Rancangan Acak Lengkap.

C. Populasi dan Sampel

1. Populasi

Penelitian ini menggunakan mencit jantan (Mus musculus L.) yang

diperoleh dari Fakultas Peternakan IPB (Institut Pertanian Bogor).

40

2. Sampel

a. Kriteria Sampel

Penelitian ini menggunakan mencit jantan (Mus musculus L.) yang

memenuhi kriteria inklusi berikut:

1) Mencit jantan sehat

2) Berusia 3-4 bulan

3) Memiliki berat 30-40 gram

b. Besar Sampel

1) Penentuan Sampel

Penelitian ini terdiri atas 4 kelompok perlakuan. Jumlah mencit

ditentukan dengan menggunakan rumus Frederer, yaitu (t-1) (n-1)

≥ 15 (Sastrosupadi, 2000), dengan nilai t merupakan jumlah

perlakuan dan nilai n merupakan jumlah ulangan dan besar sampel.

2) Perhitungan Besar Sampel

(t -1) (n-1) ≥ 15

(4-1) (n-1) ≥ 15

3 (n-1) ≥ 15

(n-1) ≥ 5

n ≥ 6

Sehingga jumlah sampel mencit yang dipakai ialah 24 ekor

mencit dengan 6 ekor mencit tiap kelompok perlakuan.

41

D. Alat dan Bahan Penelitian

1. Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: Kandang hewan

uji (mencit) yang digunakan sebagai tempat perlakuan mencit, lempeng

logam elektroda yang digunakan untuk mengalirkan arus medan listrik,

electric power supply yang digunakan untuk mengatur arus medan listrik,

botol spesimen yang digunakan untuk menyimpan spesimen, alat bedah

yang digunakan dalam proses pemotongan jaringan, mikrotom geser yang

digunakan untuk memotong jaringan, pan, lampu gas, oven, kuas, stik

berujung runcing, mikrotom geser, balok kayu (3 x 2 cm), embedding

casette, staining jar, refrigator, stopwatch, water bath, cover glass, object

glass dan mikroskop.

2. Bahan Penelitian

Bahan-bahan yang dipergunakan dalam penelitian ini adalah organ tubuh

mencit jantan. Aluminium foil, kertas saring, kapas, tissue. Buffer

formalin, aquades, alkohol 80 %, alkohol 95%, alkohol 96%, alkohol

absolut, xylol, parafin, pewama harris, hematoxilen eosin, dan acid alcohol

dan pelet ayam sebagai makanan mencit.

42

E. Prosedur Penelitian

1. Pemeliharaan Hewan Uji

Sebelum diberi perlakuan, mencit akan diaklimatisasikan selama satu

minggu di Laboratorium Zoologi FMIPA Unila tempat akan

dilaksanakannya penelitian.

Setiap mencit dipelihara dalam kandang yang berbeda. Untuk satu

kandang berisi satu ekor mencit. Minuman yang diberikan pada mencit

diletakkan dalam botol plastik yang disumbat pipa aluminium.

2. Pemberian Perlakuan

Mencit percobaan ditempatkan ke dalam kandang dilapisi bahan tembaga

dengan ukuran 20 x 75 cm sebanyak 6 kandang. Masing-masing kandang

disekat-sekat menjadi 6 bagian. Kedua lempengan tersebut dipasang

vertikal pada sebuah papan. Lempeng tembaga dihubungkan dengan

transformator pengubah arus AC ke DC.

Menurut WHO tahun 2007, batasan pajanan kuat medan listrik yang

diduga dapat menimbulkan efek biologis untuk umum adalah 5 kV/m.

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan sebelumnya oleh Busman

tahun 2007, pemajanan medan listrik tegangan tinggi (6 kV dan 7 kV)

mempengaruhi motilitas, viabilitas, dan morfologi normal spermatozoa

mencit jantan. Penelitian tersebut menggunakan waktu pemajanan sesuai

43

dengan siklus spermatogenesis mencit yaitu selama 35 hari, masing-

masing pemajanan 8 jam/hari. Berdasarkan penelitian tersebut diduga telah

terjadi perubahan anatomi, maupun histologi pada organ lain namun belum

sempat dilakukan penelitian. Penelitian lain oleh Amalia tahun 2010

menunjukkan perubahan histopatologi ginjal pada mencit jantan akibat

paparan medan listrik pada 5kV, 6 kV, dan 7 kV selama 8 jam/hari (37

hari).

Berdasarkan penelitian-penelitian diatas, perlakuan dilakukan terhadap

masing-masing kelompok selama 8 jam per hari selama 37 hari dengan

rincian perlakuan sebagai berikut:

a. Kelompok kontrol (K), yaitu kelompok M. musculus yang tidak

diberikan paparan medan listrik.

b. Kelompok perlakuan 1 (P1), yaitu kelompok M. musculus yang akan

diberi paparan medan listrik 5 kV/m

c. Kelompok perlakuan 2 (P2), yaitu kelompok M. musculus yang akan

diberi paparan medan listrik 6 kV/m

d. Kelompok perlakuan 3 (P3), yaitu kelompok M. musculus yang akan

diberi paparan medan listrik 7 kV/m

3. Proses Pembedahan

Setelah mencit diberi perlakuan selama 37 hari, pada hari ke-38 mencit

tersebut segera dibawa ke Laboratorium Patologi Balai Penyidikan dan

Pengujian Veteriner (BPPV) Regional III Bandar Lampung untuk

44

dilakukan pembedahan dan diambil organ jantungnya. Sebelum dilakukan

pembedahan mencit terlebih dahulu dibius dengan kloroform, kemudian

setelah mencit tidak bergerak lagi mulailah dilakukan pembedahan pada

bagian ventral tubuh mencit secara vertikal. Spesimen dibuka perutnya dan

diambil jantungnya. Jantung yang telah diambil segera difiksasi dengan

larutan formalin 10% atau 10% formolsaline (1 bagian formalin dalam 9

bagian NaCl – fisiologis) di dalam botol. Perbandingan volume specimen

dengan larutan formalin 1:10, guna mendapatkan hasil fiksasi yang

sempuma.

4. Pembuatan Preparat Histologi

Adapun prosedur pembuatan preparat histologi yang dilakukan terhadap

organ jantung meliputi fiksasi, trimming, dehidrasi, clearing, impregnasi,

embedding, cutting, staining dan mounting. Berikut adalah uraian tahapan

pembatan preparat adalah sebagai berikut (Akoso et.al., 1999).

a. Fiksasi

Spesimen hasil nekropsi berupa organ jantung baik dari kelompok

kontrol dan hewan yang terpajan medan listrik segera dimasukkan ke

dalam larutan fiksasif (pengawet) buffer formalin 10%. Perbandingan

antara volume spesimen dengan larutan yaitu 1:10 untuk mendapatkan

hasil yang baik. Tujuan dilakukannya fiksasi yaitu untuk manghindari

kemungkinan rusaknya organ sebelum dilakukan tahapan lainnya.

45

b. Trimming

Trimming yaitu suatu proses pemotongan organ secara tipis (± 4 mm)

dengan orientasi sesuai organ yang akan dipotong dengan

menggunakan pisau skapel. Trimming dilakukan setelah proses fiksasi.

Potongan organ tersebut dimasukkan ke dalam embedding casette, tiap

embedding casette berisi 1-5 buah potongan jaringan organ yang

disesuaikan dengan besar kecilnya potongan. Kemudian dicuci di

bawah air mengalir selama 30 menit.

c. Dehidrasi

Dehidrasi dilakukan dengan tujuan untuk menghilangkan kandungan

air di dalam jaringan. Organ diletakkan di atas tisu untuk

mengeringkan air. Proses ini dilakukan dengan menggunakan alat

embedding cassette. Kemudian diberi perlakuan sebagai berikut secara

berurutan:

Tabel 5. Tahapan proses dehidrasi

Tahap Waktu Zat KimiaDehidration 2 jam Alkohol 80%

2 jam Alkohol 95%Clearing 1 jam Alkohol 95%

1 jam AJkohol absolut I1 jam Alkohol absolut III1 jam Xylol I1 jam Xylol II1 jam Xylol III

Impregnansi 2 jam Paraffin I2 jam Paraffin II2 jam Paraffin III

46

d. Embedding (Pembenaman)

Setelah proses dehidrasi, siapkan paraplast cair dengan cara paraplast

dimasukkan ke dalam cangkir logam dan dimasukkan dalam oven

dengan suhu di atas 58°C. Tuangkan paraplast cair ke dalam pans.

Potongan organ satu persatu dipindahkan dari embedding cassette ke

dasar pans dengan mengatur jarak satu dengan yang lainnya. Pans

dimasukkan atau diapungkan di dalam air. Paraplast yang berisi

jaringan dilepaskan dari pans, paraplast dipotong-potong sesuai

dengan letak jaringan dengan menggunakan skalpet atau pisau hangat.

Kemudian letakkan pada balok kayu yang berfungsi untuk dipegang

saat dipotong dengan mikrotom, pinggirnya diratakan dan pada bagian

ujungnya dibuat sedikit meruncing. Blok paraplast siap dipotong

dengan menggunakan mikrotom.

e. Cutting (Pemotongan)

Cutting adalah proses pemotongan jaringan dengan menggunakan

mikrotom yang terlebih dahulu didehidrasi. Proses ini dilakukan di

dalam ruangan dingin. Sebelum dipotong, blok terlebih dahulu

didinginkan, pemotongan dilakukan secara kasar dan halus,

selanjutaya blok dipotong dengan ketebalan 4 -5 µm. Setelah blok

dipotong, pilih lembaran yang baik, apungkan pada air dan kerutannya

dihilangkan dengan cara salah satu sisi lembaran jaringan tersebut

ditekan dengan ujung jarum, di sisi lain ditarik dengan kuas runcing.

Lembaran jaringan tersebut ke dalam waterbath selama beberapa detik

47

sampai mengembang sempurna. Dengan gerakan disedot, jaringan

tersebut diambil dengan slide bersih dan ditempelkan di tengah atau

sepertiga atas/bawah. Dicegah agar jangan sampai ada gelembung

udara di bawah jaringan. Kemudian slide jaringan ditempelkan pada

inkubator (37oC) selama 24 jam sampai jaringan melekat sempurna.

f. Staining (Pewarnaan)

Setelah pembuatan slide preparat selesai, dilakukan pengamatan di

bawah mikroskop untuk melihat preparat yang terbaik sebelum

dilakukan pewarnaan. Proses selanjutnya adalah pewarnaan dengan

menggunakan pewama HE (Hematoxilin-Eosin), secara berurutan slide

dimasukkan ke dalam zat kimia di bawah ini dengan waktu sebagai

berikut:

Tabel 6. Tahapan proses staining (pewarnaan)

Zat Kimia WaktuXylol I 5 menitXylol II 5 menitXylol III 5 menitAlkohol absolut I 5 menitAlkohol absolut II 5 menitAquades 1 menitHarris Hematoxylin 20 menitAquades 1 menitAcid alcohol 2-3 celupanAquades 1 menitAquades 15 menitEosin 2 menitAlkohol 96% I 2 menitAlkohol 96% II 3 menitAlkohol Absolut III 3 menitAlkohol Absolut IV 3 menitXylol IV 5 menitXylol V 5 menit

48

g. Mounting (Penutupan)

Setelah pewarnaan selesai, slide ditempatkan di atas kertas tisue pada

tempat datar, kemudian ditetesi dengan kanada balsam dan ditutup

dengan cover glass.

h. Pembacaan Slide

Slide yang telah jadi diperiksa di bawah mikroskop cahaya dengan

pembesaran 40x, 100x, 200x atau 400x. Pada hasil slide yang baik,

akan terlihat inti sel berwarna biru dan sitoplasma berwarna merah

jambu.

F. Identifikasi Variabel dan Definisi Operasional Variabel

1. Identifikasi Variabel

a. Variabel Independen

Pemberian perlakuan 3 paparan bertingkat medan listrik tegangan

tinggi

b. Variabel Dependen

Ketebalan miokardium pada atrium kanan, atrium kiri, ventrikel kanan

dan ventrikel kiri

49

2. Definisi Operasional Variabel

a. Paparan bertingkat medan listrik tegangan tinggi

Paparan medan listrik tegangan tinggi yaitu 5 kV, 6 kV dan 7kV

b. Ketebalan miokardium

Ketebalan miokardium adalah ketebalan miokardium pada atrium

kanan, atrium kiri dan ventrikel kanan serta ventrikel kiri. Pada

masing-masing perlakuan dihitung dalam satuan mikrometer dengan

skala pengukuran variabel numerik.

3. Parameter yang diamati

Parameter yang diamati pada penelitian ini berupa perubahan ukuran

ketebalan miokardium pada keempat ruangan jantung, yaitu pada atrium

kanan, atrium kiri, ventrikel kanan dan ventrikel kiri. Hasil yang diperoleh

akan dilihat melalui uji statistik.

G. Pengumpulan dan Analisis Data

Data yang diperoleh dalam penelitian ini merupakan data primer, yaitu data

yang diperoleh langsung dari sumber. Data yang diperoleh akan diolah secara

statistik dengan menggunakan program SPSS versi 16.0 for Windows. Untuk

mengetahui ada tidaknya perbedaan efek yang ditimbulkan antar perlakuan,

maka akan diolah secara statistik dengan menggunakan Analisi varians

(Analysis of Variance, ANOVA). Apabila terdapat perbedaan nyata maka

Dibagi menjadi 4 kelompok masing-masing terdiri dari 6 ekor

50

dilanjutkan dengan uji beda nyata terkecil (BNT) pada taraf 5% (Soekidjo,

2002).

24 mencit jantan diaklimatisasi selama 7 hari

K

Mencit jantan tidak terpapar medan listrik

P1

Mencit jantan terpapar medan listrik (5 kV/m)

Gambar 10. Bagan alir penelitian

Pembuatan dan pengamatan preparat histologi

Selesai

- Interpretasi Data- Penyusunan Laporan

Pelaksanaan Penelitian

P2

Mencit jantan terpapar medan listrik (6 kV/m)

P3

Mencit jantan terpapar medan listrik (7 kV/m)

HASIL

Dialiri listrik 8 jam/hari selama 37 hari

Persiapan penelitian