35

BAB IIIMETODE PENELITIANA. Bahan dan Subyek PenelitianBahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi PGV-0 murni secara KLT (kromatografi lapis tipis) yang diperoleh dari hasil sintesis CRC (Curcumin Research Center) Fakultas Farmasi UGM, kitosan viskositas rendah (KVR, Sigma Aldrich), natrium alginat (Shadong Bio-Technologi, Shanghai), kalium diklofenak (Cataflam, Novartis, Jakarta), karagenin kappa (Sigma Chemical Co.), natrium karboksi metil selulosa, HCl p.a., NaCl p.a., MgCl2 p.a., KCl p.a., CaCl2 p.a. dan NaHCO3 p.a., CH3COONa p.a., asam asetat glasial, etil asetat p.a., etanol 96% teknis (CV General Labora, Yogyakarta), akuades teknis (CV General Labora, Yogyakarta), NaCl 0,9% (PT Otsuka, Jakarta), dan tikus (Rattus norvegisus) galur Wistar (Laboratorium Farmakologi dan Toksikologi, Fakultas Farmasi UGM).Subyek dalam penelitian in vivo untuk uji anti inflamasi adalah tikus (Rattus norvegicus) jantan galur Wistar dengan berat badan antara 120-180 gram, dan umur 3-4 bulan. Keterangan kelaikan etik tertera pada Lampiran 8.

B. PeralatanAlat gelas (Pyrex), mikropipet (pipetPAL), neraca analitik (Sartorius BP 310 P), pH meter (Hanna), vortex mixer (Thermolyne Type 16700 Mixer), hotplate and magnetic stirrer (Stuart CB162), Stuart Overhead Stirrer Model SS30, rotary evaporator (Stuart RE300), water bath (Stuart RE300DB), vacuum pump (Diaphragm Vacuum Pump GM-0.33II), waterbath shaker (Orbit), ultrasonic bath (Transsonic 570), Spektrofotometer (Genesys 10 UV Scanning), centrifuge (eppendorf Centrifuge 5804 R), transmission electron microscopy (JEOL JEM 1400), DelsaTM Nano Submicron Particle Size and Zeta Potential Analyzer (Beckman Coulter), dan pletismometer (UGO Basile 7140).

C. Jalannya Penelitian1. Formulasi nanopartikel PGV-0 dengan kitosan viskositas rendah alginatFormulasi nanopartikel pada penelitian ini dipengaruhi oleh 3 faktor, yaitu PGV-0, kitosan viskositas rendah (KVR), dan natrium alginat dengan berbagai seri konsentrasi. Formulasi dimulai dalam skala kecil menggunakan tabung mikro yaitu dengan volume akhir sebanyak 1 mL. Sebanyak 0,5 mL larutan KVR dalam dapar asetat pH 4,0 dicampurkan dengan 0,5 mL larutan PGV-0 dalam etanol teknis 96%, kemudian dilakukan pencampuran menggunakan vortex. Setelah pencampuran berlangsung selama 20 detik, larutan natrium alginat dalam akuades sebanyak 0,5 mL dimasukkan ke dalam campuran tersebut. Campuran tersebut di-vortex kembali selama 20 detik. Pada tahap akhir tutup tabung dibuka agar pelarut organik PGV-0 menguap hingga volume akhir menjadi 1 mL. Sistem dispersi yang stabil merupakan formula yang terpilih dan dilakukan scaling up pada volume 10 mL.Formulasi nanopartikel pada skala akhir 10 mL menggunakan cara yang sama dengan formulasi skala 1 mL. Perbandingan volume larutan PGV-0 KVR alginat tetap 1 : 1 : 1 (masing-masing 2,5 mL). Namun ada perbedaan pada alat pencampur yang digunakan, yaitu Stuart Overhead Stirrer Model SS30, dengan kecepatan putar sebesar 2000 rpm dan lama pencampuran 10 menit. Penguapan dilakukan dengan menuangkan campuran pada cawan petri, agar penguapan berjalan lebih cepat (kontak dengan udara luar lebih besar). Kemudian sambil diuapkan, campuran diaduk dengan magnetic stirrer pada suhu ruang selama 15 menit (volume akhir menjadi 7,5 mL).

2. Uji stabilitas fisikFormula yang digunakan untuk uji stabilitas fisik adalah hasil scaling up pada volume 10 mL pada beberapa formula terpilih. Dispersi yang terbentuk dimasukkan ke dalam tabung yang telah diberi skala ukuran panjang menggunakan kertas millimeter blok, dan didiamkan pada rak dengan posisi tegak. Pengamatan kecepatan pengendapan dilakukan pada hari ke-0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, dan 14.

3. Scale up nanopartikel PGV-0 KVR alginat formula terpilihFormula yang di-scale up menjadi volume akhir 100 mL adalah 5 formula terpilih yang memiliki stabilitas fisik yang paling baik dan dengan pertimbangan efektivitas dan efisiensi produksi. Pembuatan formula dengan skala 100 mL ini serupa dengan cara pembuatan formula nanopartikel skala 10 mL. Perbandingan volume larutan PGV-0 KVR alginat tetap 1 : 1 : 1 (masing-masing 50 mL), kecepatan putar tetap 2000 rpm. Akan tetapi lama pengadukan lebih lama yaitu 20 menit. Penguapan dilakukan menggunakan rotary evaporator (Stuart RE300) pada pemanasan penangas air (Stuart RE300DB) suhu 50oC dengan skala putar 7 (kecepatan putar alat antara 20 190, hingga pelarut organik PGV-0 menguap semua, dengan kata lain volume akhir menjadi 100 mL.

4. Karakterisasi nanopartikela) Penentuan ukuran dan potensial zeta nanopartikelPengukuran dilakukan menggunakan alat Particle Size Analyzer (PSA) di Balai Inkubator Teknologi Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BIP-BPPT) Serpong-Tangerang pada suhu 25oC dengan refraksi indeks 1,3328 dan viskositas 0,8878 cP. Sampel nanopartikel sejumlah 2 tetes dimasukkan ke dalam kuvet dan ditambahkan 5 mL akuabides, kemudian sampel tersebut ditentukan ukuran partikelnya menggunakan alat DelsaTM Nano Submicron Particle Size and Zeta Potential Analyzer (Beckman Coulter).b) Pengamatan morfologi nanopartikelPengamatan morfologi nanopartikel PGV-0 KVR alginat menggunakan mikroskop elektron transmisi (TEM). Copper grid ditetesi dengan sampel nanopartikel kemudian dilapisi karbon dengan alat Auto Carbon Coated (JOEL JEC-560, Japan) selama 5 detik kemudian dikeringkan pada suhu ruang selama 24 jam. Setelah sampel nanopartikel kering dilapisi lagi dengan carbon kemudian copper grid dimasukkan ke dalam holder dan sampel siap dianalisis dengan percepatan voltage 120 kV dan magnifikasi 40.000.c) Entrapment efficiency (%)Efisiensi penjerapan PGV-0 dalam kompleks KVR alginat dilakukan menggunakan metode ekstraksi. Sebanyak 3 x 1,5 mL formula nanopartikel diendapkan dengan sentrifugasi 10000 rpm 10oC selama 10 menit. PGV-0 bebas (tak terjerap dalam kompleks KVR alginat) dalam supernatan diekstraksi menggunakan 2,5 mL etil asetat dengan cara di-vortex. Fase etil asetat diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 400 nm untuk mengetahui kandungan PGV-0 bebasnya.d) Entrapment stability testGuna mengetahui stabilitas penjerapan PGV-0 dalam kompleks KVR alginat pada pH cairan lambung dan usus. Formula nanopartikel PGV-0 KVR alginat diinkubasi dalam Artificial Gastric Fluid (AGF) (0,2% NaCl; 0,26% HCl; pH akhir 1,2) dan Artifisial Intestinal Fluid (AIF) (20 mM bikarbonat; 139 mM klorida; 5 mM kalium; 140 mM sodium; 4 mM kalsium; dan 3 mM magnesium; pH akhir 7,0). Sebanyak 7 mL volume formula nanopartikel dimasukkan ke dalam 93 mL AGF / AIF, kemudian digoyangkan dengan alat shaker waterbath pada suhu 37oC dan kecepatan pengadukan 100 rpm. Sampel diambil tiap jam selama 4 jam untuk pengujian dalam cairan lambung buatan dan 5 jam untuk pengujian dalam cairan usus buatan.Untuk mengetahui kandungan PGV-0 bebas, tiap kali pengambilan sampel adalah 3 x 1,5 mL. Cuplikan diendapkan dengan sentrifugasi 10000 rpm 10oC selama 10 menit. PGV-0 bebas (tak terjerap dalam kompleks KVR alginat) dalam supernatan diekstraksi menggunakan 2,5 mL etil asetat dengan cara di-vortex. Fase etil asetat diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 400 nm.5. Uji aktivitas antiinflamasi metode radang buatanUji daya antiinflamasi formula nanopartikel PGV-0 KVR alginat dilakukan dengan mengukur penghambatan pembentukan udem kaki tikus (Rattus norvegicus) putih jantan galur Wistar. Hewan uji yang telah dipuasakan selama 1 hari, dibagi menjadi 10 kelompok (masing-masing kelompok 3 ekor) dan diberi larutan uji secara per oral sesuai yang tertera pada Tabel 1. Kaki kanan tiap tikus diberi tanda batas di atas tumit dan diukur volumenya menggunakan pletismometer sebagai volume telapak kaki mula-mula. Selanjutnya kaki tersebut diinjeksi secara intraplantar dengan karagenin 1%, dan langsung diukur kembali volumenya sebagai volume udem menit ke-0. Pengukuran volume udem kaki hewan uji dilakukan tiap 30 menit selama 6 jam dan dilanjutkan kembali pada jam ke-24.

Tabel 1. Pembagian kelompok hewan uji dalam uji antiinflamasi penghambatan volume udem kaki tikus terinduksi karageninKelompokPerlakuan

1Blangko Na-CMC 0,5%

2Kontrol positif kalium diklofenak dosis 2,25 mg/KgBB

3Blangko matriks KVR-alginat (konsentrasi tertinggi pada nanopartikel terpilih)

4Kontrol pembanding PGV-0 dosis 5 mg/KgBB

5Kontrol pembanding PGV-0 dosis 20 mg/KgBB

6Kontrol pembanding PGV-0 dosis 40 mg/KgBB

7Perlakuan nanopartikel PGV-0 dosis 3 mg/KgBB (Nano A)

8Perlakuan nanopartikel PGV-0 dosis 5 mg/KgBB (Nano B)

9Perlakuan nanopartikel PGV-0 dosis 3 mg/KgBB (Nano C)

10Perlakuan nanopartikel PGV-0 dosis 5 mg/KgBB (Nano D)

11Perlakuan nanopartikel PGV-0 dosis 5 mg/KgBB (Nano E)

D. Analisis1. Pengukuran uji stabilitas fisik formula dilakukan terhadap tinggi lapisan paling atas endapan relatif yaitu dihitung menggunakan persamaan 1.Tinggi endpaan relatif (HR) = .......................(1)2. Ukuran dan distribusi partikel nanopartikel dapat diamati dengan Particle Size Analyzer (PSA) dan morfologinya dengan alat transmission electron microscopy (TEM).3. Entrapment efficiency (EE (%)) PGV-0 dalam nanopartikel kitosan-alginat ditetapkan dengan mengukur post-polimerization free drug. Kadar PGV-0 yang tidak terjerap ditetapkan menggunakan spektrofotometer, dan nilai efisiensinya ditentukan dengan rumus :....(2)

4. Stabilitas nanopartikel ditetapkan dengan menghitung kadar PGV-0 yang terlepas setiap satuan waktu selama inkubasi. Kadar PGV-0 ditetapkan menggunakan spektrofotometer. Persentase nanopartikel PGV-0 yang masih stabil dihitung dengan rumus :..(3)5. Uji aktivitas antiinflamasi metode radang buatan ditetapkan dengan memperhitungkan luas daerah di bawah kurva dari data volume udem. Nilai AUC (Area Under Curve) kelompok perlakuan dibandingkan dengan AUC kelompok kontrol dari 0 sampai 24 jam untuk memperoleh daya antiinflamasi.a. Perhitungan nilai volume udem (), diperoleh dengan rumus : ..(4)Keterangan:Vut= volume udem pada waktu tVt = volume kaki tikus pada waktu tVp = volume kaki tikus sebelum injeksi karageninb. Nilai AUC antar waktu pengamatan dihitung dengan rumus :AUC = .(5)Keterangan:Vtn-1= volume udem pada waktu pengamatan sebelumnyaVtn= volume udem pada waktu tnt= selisih waktu pengukuran

c. Nilai daya antiinflamasi (DAI) dihitung menggunakan rumus : ..(6)Keterangan:A = AUC0-24jam kelompok kontrolB= AUC0-24jam kelompok perlakuand. Daya hambat inflamasi diuji statistik menggunakan pirantik lunak Statistical Product and Service Solutions (SPSS).

E. Bagan Alur Penelitian

Gambar 10. Bagan alur penelitian

26