PEMERIKSAAN

“Vibrio cholerae”

Disusun untuk memenuhi tugas Mata Kuliah Laboratorium Epidemiologi

Dosen pengampu : drg. Yunita Dyah Puspita Santik

Disusun Oleh :

KELOMPOK 8

1. Luluk Listiarini Riza (6411411198)

2. Ellya Ma’unah (6411411199)

3. Charisna Neilal Muna (6411411201)

4. Sundari Sukoco (6411411210)

5. Hamid Rifki Baharun (6411411257)

Rombel 01

JURUSAN ILMU KESEHATAN MASYARAKAT

FAKULTAS ILMU KEOLAHRAGAAN

UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG

2014

Pemeriksaan Vibrio cholerae

Gambar Bakteri Vibrio Cholerae

Vibrio cholerae merupakan salah satu spesies dari genus Vibrio yang

merupakan famili Vibrionaceae. Genus Vibrio terdiri lebih dari 30 spesiesyang

biasanya ditemukan pada lingkungan perairan. Vibrio yang pathogen terhadap

manusia adalah Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus dan Vibrio vulnificus.

Vibrio cholerae merupakan penyebab penyakit Cholera yaitu infeksi saluran usus

yang bersifat akut dan disebabkan oleh bakteri Vibrio cholerae. Bakteri ini masuk

kedalam tubuh host secara per oral umumnya melalui makanan atau minuman

yang tercemar. Cholera dapat menular sebagai penyakit yang bersifat epidemik.

1. Tujuan

Prosedur ini digunakan untuk melakukan Pengujian Vibrio cholerae pada

produk perikanan dan produk makanan yang berkaitan dengan hasil – hasil

perikanan.

2. Acuan

Standar Nasional Indonesia (SNI) 01-2332.4-2006

3. Media dan Reagensia :

a. Alkaline Peptone water (APW)

b. Alkaline Peptone salt (APS)

c. Decarboxylase basal medium dengan penambahan suplemen arginine,

lysine dan ornithine secara individual

d. Kliger Iron Agar ( KIA)

e. Motility Test Medium (MTM), semisolid

f. MRV-VP Broth

g. Purple Broth Base (PBB) dengan penambahan suplemen sucrose, lactose,

cellobiose, arabinose, D-mannitol, D-mannose secara individual

h. Of medium semisolid dengan penambahan suplemen glucose, sucrose,

lactose, cellobiose, arabinose, D-mannitol, D-mannose secara individual

i. Triple Sugar Iron (TSI) agar

j. Thiosulfate-citrat-Bile-Salt-Sucrose (TCBS) agar

k. Trypticase (tryptic) Soy Broth (TSB)

l. Trypticase (tryptic) Soy Agar (TSA)

m. Tryptone Broth and Tryptone salt Broths (T1N0, T1N1, T1N3, T1N6,

T1N8, T1N10)

n. Urea Broth

o. Pereaksi Kovacs

p. Mineral atau parafin oil steril

q. O/129 (2,4-diamino-6,7-diisopropyl pteridine) disk, 10 µg dan 150 µg

r. ONPG disk

s. Pereaksi oksidase

t. HCL 1 N

u. Physiological saline 0,85%

v. Phospate-buffered Saline (PBS)

w. NaCl 2 % dan 3 %

x. Larutan NaOH 1 N

y. Pereaksi VP

z. Pereaksi pewarnaan gram

aa.Baku pembanding Vibrio cholerae

bb. Anti serum Poly hikojima inaba – ogawa

4. Peralatan

a. Blender beserta jar yang dapat disterilisasi atau stomacher beserta plastik

steril.

b. Cawan petri ukuran 15 mm x 100 mm

c. Tabung reaksi ukuran 16 mm x 125 mm dan 13 mm x 100 mm

d. Tabung bertutup ukuran 16 mm x 150 mm

e. Timbangan analitik dengan ketelitian 0,01 g dan 0,0001 g

f. Inkubator 36 °C ± 1 °C

g. Waterbath 42 °C ± 0,2 °C

h. Autoclave 121 °C.

i. Jarum inokulasi dan jarum ose

j. Bunsen

k. pH meter

l. Peralatan sterilisasi filter

m. Oven

n. Pipet atau pippetor 1 ml, 5 ml dan 10 ml.

o. Mikroskop

p. Hot plate dilengkapi dengan magnetic stirer.

q. Alat pengocok (Voltex mixer )

No Nama Alat Gambar

1. Tabung reaksi

2.Rak tabung reaksi

3. Kaca preparat

4.Pipet

5. Inkubator

6. Jarum ose

7. Mikroskop

5. Kondisi Pengujian

Selama melakukan pengujian, terapkan teknis aseptis dan lakukan pengujian

diruang atau laminar air flow yang terkontrol. Media TCBS agar yang

digunakan harus dalam keadaan kering.

6. Pengambilan contoh

a. Ikan Jaringan daging, saluran pencernaan dan insang.

b. Crustacea Jika memungkinkan seluruh tubuh atau hanya bagian tengah

termasuk insang dan saluran pencernaan.

c. Kekerangan Daging kerang termasuk cairan dalam cangkang.

7. Prosedur

7.1 Persiapan contoh

a. Produk perikanan selain kekerangan.

Timbang secara aseptis 25 g sesuai butir 7.2.2.1 dan 7.2.2.2.,

kemudian tambahkan 225 ml larutan Alkaline Pepton Water,

Homogenasi selama 2 menit – 3 menit. Homogenat ini merupakan

larutan dengan pengenceran 1 : 10.

b. Produk kekerangan

Timbang secara aseptis 50 g sesuai butir 7.2.2.3., kemudian

tambahkan 450 ml larutan Alkaline Pepton Water, Homogenasi

selama 2 menit – 3 menit. Homogenat ini merupakan larutan dengan

pengenceran 1 : 10.

7.2 Isolasi Vibrio cholerae

a. Tanpa mengocok tabung

Ambil 1 ose dari setiap tabung yang positif (keruh) pada setiap

pengenceran sedalam 1 cm dari permukaan cairan dan goreskan

kedalam TCBS agar. Inkubasikan TCBS agar pada suhu 36 oC ± 1 oC

selama 18 jam – 24 jam.

b. Amati keberadaan Vibrio cholerae pada TCBS agar.

Koloni Vibrio cholerae besar, permukaan halus. Agak datar, bagian

tengah uram dan bagian pinggir terang, berwarna kuning (sukrosa

positif).

Gambar Koloni Vibrio cholerae pada media TCBS

7.3 Pemurnian

Secara hati – hati ambil 3 koloni terduga atau lebih dari setiap TCBS agar,

goreskan kedalam T1N1 agar atau TSA + 1,5 % NaCl (Total Mengandung

NaCl 2 %). Inkubasikan selama 18 jam – 24 jam pada suhu 36 oC ± 1 oC.

Gambar Media TSA slant

7.4 Uji biokimia pendahuluan

a. Uji Oksidase

Goreskan 1 ose dari T1N1 agar atau TSA + NaCl 1,5 % atau medium

lain yang tidak memfermentasikan karbohidrat kedalam cawan petri

yang berisi TSA agar. Inkubasikan pada suhu 36 oC ± 1 oC selama 18

jam – 24 jam. Teteskan 2 – 3 tetes pereaksi oksidase pada koloni

bakteri dan amati reaksinya. Reaksi positif ditunjukkan dengan

terbentuknya warna biru tua pada koloni. Uji oksidase dapat dilakukan

dengan menggunakan kertas oksidase dengan cara menggoreskan

koloni dari T1N1 agar atau TSA + NaCl 1,5 % keatas permukaan 

kertas oksidase menggunakan tusuk gigi (jangan menggunakan ose

yang terbuat dari nikel atau krom). Reaksi positif ditunjukkan dengan

terbentuknya warna biru tua secara cepat.

b. Uji sensitifitas terhadap 0/129 vibriostat

Goreskan 1 ose dengan cepat dari T1N1 agar atau TSA + NaCl 1,5 %

kedalam cawan Petri yang berisi TSA dengan rapat. Letakkan disk

0/129 10 µg dan 150 µg pada goresan yang paling rapat dan

inkubasikan pada suhu 36 oC ± 1 oC selama 18 jam – 24 jam. Amati

pertumbuhan disekitar disk . Reaksi sensitif ditunjukkan dengan

terbentuknya zona disekitar disk (S), sedangkan reaksi resisten

ditandai dengan adanya pertumbuhan disekeliling disk (R). Vibrio

cholerae sensitive terhadap  0/129 µg dan 150 µg.

Gambar Uji sensitifitas

c. Triple Sugar Iron (TSI) Agar dan Kligger Iron Agar (KIA)

Inokulasikan koloni dari T1N1 agar atau TSA + NaCl 1,5 % dengan

cara menggoreskan agar miring dan menusuk agar tegak media TSI

agar dan KIA. Inkubasikan pada suhu 36 oC ± 1 oC selama 18 jam –

24 jam. Vibrio cholerae menghasilkan asam (warna kuning) pada agar

miring, asam (warna kuning) pada agar tegak dan tidak mengasilkan

gas serta H2S. Reaksi Vibrio spp dalam beberapa media agar miring

yang berbeda dapat dilihat pada tabel 1.

Reaksi Vibrio cholera: TSI (Asam/Asam=A/A) dan KIA

(Alkaline/Asam=K/A)

(Asam=kuning & Alkaline=merah)

Tabel 1. Reaksi Vibrio spp dalam beberapa media agar yang

berbeda

Bakteri KIA TSI

Agar

Miring

Agar

TegakAgar Miring Agar Tegak

v. cholerae K A A (K jarang) A

v. mimicus K A K (A jarang) A

v. parahaemolyticus K A K A

v. alginolytus K A A A

v. vulnificus K atau A A K (A jarang) A

a.hidrophilla K atau A A K atau A A

p.shigoleides K atau A A K atau A A

d. Uji ONPG

Untuk uji ONPG gunakan kultur dari TSI atau media lain yang

mengandung lactose. Inokulasikan 1 ose kultur dari TSI kedalam

tabung yang berisi 0,5 ml larutan psysiological saline. Masukkan disk

ONPG lalu inkubasikan pada suhu  36 oC ± 1 oC selama 20 menit 

sampai dengan 1 jam. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya

warna kuning pada media dalam tabung.

Reaksi ONPG negatif (kiri) dan Positif (kanan)

e. Uji Oksidatif – fermentatif ( OF )

Inokulasikan 2 tabung kedalam media OF yang telah ditambahkan

glukosa 1 % dengan kultur dari T1N1 agar atau TSA + NaCl 1,5 %

tambahkan mineral oil steril setinggi 1 cm – 2 cm kedalam salah satu

tabung. Inkubasikan pada suhu 36 oC ± 1 oC selama 1 hari – 2 hari.

Reaksi oksidatif ditunjukkan dengan terbentuknya warna kunimg

(reaksi asam) pada tabung yang tidak ditambahkan dengan mineral

oil, sedangkan reaksi fermentative ditunjukkan dengan terbentuknya

warna kuning pada tabung yang ditambahkan mineral oil. Asam

mengubah media dari warna hijau menjadi kuning.

Uji OF: 2 tabung kiri positif (kuning) dan 2 tabung kanan negatif (hijau)

f. Pewarnaan gram

Lanjutan pengujian apabila pada uji biokimia pendahuluan diatas

ditemukan reaksi Vibrio cholerae . Kultur diambil  agar miring atau

TSA miring + NaCl 1,5 % yang telah diinkubasi selama 24 jam.

Bakteri Vibrio cholerae termasuk gram – negatif, berbentuk batang

pendek atau koma.

7.5 Uji Biokimia Lanjutan

Lanjutkan pengujian apabila pada uji biokimia pendahuluan diatas

ditemukan reaksi  Vibrio cholerae yang khas. Goreskan kembali kultur

dari T1N1 agar atau TSA + NaCl 1,5 % ke TSA dan TSB. Inkubasikan

pada suhu 36 oC ± 1 oC selama 18 jam – 24 jam.

a. Uji Hidrolisis Urea.

Inokulasikan 1 ose dari TSA + NaCl 1,5 % kedalam media urea.

Inkubasikan pada suhu 36 oC ± 1 oC selama 18 jam. Reaksi positif

ditunjukkan dengan perubahan warna media dari orange menjadi

merah muda. Vibrio cholerae tidak mempunyai kemampuan dalam

menghidrolisis urea (reaksi negatif).

Urea broth (negatif)

b. Uji Arginin dihydrolase, Lysin dekarboksilase dan ornithin

dekarboksilase.

Inokulasikan kultur dari TSA + NaCl 1,5 % kedalam tabung media

dasar dekarboksilase yang masing – masing mengandung arginin,

Lysine, ornithin serta kedalam 1 tabung kontrol media dasar

dekarboksilase yang tidak mengandung asam amino. Tambahkan

masing – masing tabung dengan mineral oil steril setinggi 1 cm – 2

cm. Inkubasikan pada suhu 36 oC ± 1 oC selama 4 hari. Lakukan

pengamatan setiap hari. Reaksi dekarboksilase terhadap asam amino

menghasilkan pH alkaline dan mengubah media menjadi ungu cerah

(reaksi positif). Sedangkan reaksi fermentasi glucose menghasilkan

asam dan mengubah media menjadi warna kuning (reaksi negatif).

Tabung control yang tidak mengandung asam amino berubah menjadi

kuning Vibrio cholerae menghasilkan reaksi arginin dihydrolase

negative, Lysine dan ornithin positif dan orithin decarboxylase positif.

Dari Kiri ke Kanan: Arginine(-), Lysine(+), Ornithin(+), Sucrose(+),

Lactose(-), Arabinose(-), Mannose(-) , Mannitol(+)

c. Uji Toleransi terhadap garam

Inokulasikan kultur dari TSB kedalam 3 tabung yang masing – masing

mengandung tryptone broth 1 % yang ditambahkan NaCl 0 % ; 1 %

dan 3 % (T1N0,T1N3). Inkubasikan pada suhu 36 oC ± 1 oC selama

18 jam – 24 jam. Reaksi positif ditandai dengan terjadinya keruhan

yang menunjukkan pertumbuhan. Vibrio cholerae dalam media T1N0

dan T1N3 (table 2).

d. Uji pertumbuhan pada suhu 42 oC

Inokulasikan 1 ose dari TSB yang telah diinkubasikan selama 24 jam

kedalam TSB yang telah dihangatkan dalam waterbath 42 oC.

Inkubasikan pada suhu 42 oC dalam waterbath selama 24 jam. Reaksi

positif ditandai dengan terjadinya kekeruhan yang menunjukkan

adanya pertumbuhan. Vibrio cholerae mengasilkan reaksi variable.

e. Uji voges-proskauer

Inokulasikan 1 ose dari TSA+ NaCl 1,5 % kedalam MRV – VP broth

inkubasikan pada suhu 36 oC ± 1 oC selama 2 hari. Pindahkan 1 ml

dari setiap MRV – VP broth yang menunjukkan pertumbuhan

kedalam tabung reaksi ukuran 13 mm x 100 mm steril. Tambahkan

0,6 ml larutan alphanaphtol dan 0,2 ml KOH 40 % lalu kocok.

Tambahkan sedikit kristal keratin untuk mempercepat reaksi. Kocok

kembali dan diamkan selama 2 jam. Reaksi positif ditandai dengan

terbentuknya warna merah muda sampai warna merah mirah delima

(ruby) pada media Vibrio cholerae menghasilkan reaksi variable.

f. Uji Fermentasi karbohidarat

Inokulasikan 1 ose dari TSA+ NaCl 1,5 % kedalam masing – masing

satu tabung purple broth base yang mengandung sucrose, lactose, D-

mannitol, mannose, arabinosa atau cellobiose. Tambahkan masing –

masing tabung dengan mineral oil steril setinggi 1 cm – 2 cm.

inkubasikan pada suhu 36 oC ± 1 oC selama 4 hari – 5 hari  dan

lakukan pengamatan setia hari. Reaksi positif fermentasi karbohidrat

menghasilkan asam dan mengubah media menjadi kuning ( table 2).

7.6 Uji Serologi

Ambil 1 ose kultur dari T1N1 agar atau TSA+ NaCl 1,5 % yang telah

diinkubasikan selama 16 jam – 24 jam dan letakkan diatas gelas preparat.

Tetesi dengan larutan saline 0,85 % dan emulsikan. Letakkan 1 tetes

antiserum poly hikojima inaba – ogawa disamping suspensi koloni.

Campurkan antiserum sedikit demi sedikit dengan suspensi koloni sampai

tercampur sempurna. Lakukan kontrol dengan menggunakan larutan

saline dan antiserum.

Goyangkan  campuran tersebut  kekiri dan kekanan dan amati reaksi

penggumpalan pada latar belakang yang gelap sebagai berikut :

Positif apabila terjadi penggumpalan pada larutan kultur dan tidak terjadi

penggumpalan pada larutan control.

Negatif apabila tidak terjadi penggumpulan baik pada larutan kultur

maupun larutan control.

8. Interpretasi Hasil

No Jenis Uji Interpretasi Hasil

1 Morfologi Gram – negatif, bentuk batang atau koma

2 TSIAgar miring: asam (kuning) Agar tegak: asam (kuning)

3Oksidatif / fermentatif (media OF)

Oksidatif positif dan fermentatif positif

4 Oksidase Positif

5 Arginin Dehidrolase Negatif

6 Lysine Decarboxylase Positif

7 VP Variabel

8Pertumbuhan pada suhu 42oC

Positif

9 Halophilik T1N0; positif; T1N3; positif, T1N6; negatif

10 Fermentasi Sucrose Positif

11 Fermentasi Arabinose Negatif

12 ONPG Positif

13 Sensitifitas terhadap 0/129 Sensitif (S) terhadap 10 µg dan 150 µg

9. Pelaporan Hasil

Laporkan ada atau tidak Vibrio cholerae berdasarkan uji biokimia dan

serologi.

DAFTAR PUSTAKA

Brooks GF dkk. 1996. Mikrobiologi Kedokteran. Edisi 20. EGC

Chin J.2006. Manual Pemberantasan Penyakit Menular. Edisi 17. Infomedika

Shulman ST dkk. 1994. Dasar Biologis & Klinis Penyakit Infeksi. Edisi 4. Gadjah Mada University Press

Staff pengajar FK UI. 1993. Mikrobiologi Kedokteran. Binarupa Aksara

http://elib.fk.uwks.ac.id/asset/archieve/jurnal/Vol%20Edisi%20Khusus%20Desember%202010/CHOLERA.pdf

http://www.cdc.gov/cholera/pdf/laboratory-methods-for-the-diagnosis-of-vibrio-cholerae-chapter-6.pdf

http://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/3576/1/05010682.pdf