i

VIABILITAS EMBRIO MENCIT (Mus musculus albinus) VITRIFIKASI

SETELAH KULTUR IN VITRO DALAM INKUBATOR CO2 PORTABLE

RIKI PRIMA SANTOSA

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2016

iii

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN

SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Viabilitas Embrio

Mencit (Mus musculus albinus) Vitrifikasi setelah Kultur In Vitro dalam

Inkubator CO2 Portable adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi

pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi

mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan

maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan

dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.

Bogor, Agustus 2016

Riki Prima Santosa

NIM B04120029

v

ABSTRAK

RIKI PRIMA SANTOSA. Viabilitas Embrio Mencit (Mus musculus

albinus) Vitrifikasi setelah Kultur In Vitro dalam Inkubator CO2 Portable.

Dibimbing oleh ARIEF BOEDIONO dan KUSDIANTORO MOHAMAD.

Inkubator CO2 portable dapat digunakan untuk kultur embrio selama

proses transportasi. Vitrifikasi merupakan salah satu metode kriopreservasi untuk

penyimpanan embrio dalam waktu yang lama. Penelitian bertujuan untuk

mengevaluasi tingkat perkembangan dan viabilitas embrio vitrifikasi setelah

kultur in vitro dalam inkubator CO2 portable. Embrio dikoleksi dari mencit pada

hari ke-3 pasca fertilisasi yang telah disuperovulasi menggunakan PMSG dan

hCG. Embrio dibagi ke dalam kelompok vitrifikasi dan tanpa vitrifikasi (sebagai

kontrol). Vitrifikasi dilakukan menggunakan krioprotektan etilen glikol 15% +

DMSO 15%, dihangatkan (warming) secara bertahap dalam sukrosa 0.5, 0.25 dan

0.1 M, serta dikultur in vitro selama 48 jam. Evaluasi berupa tingkat

perkembangan embrio dan viabilitas dengan pewarnaan vital Hoechst–propidium

iodide. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa embrio pasca vitrifikasi tidak

memperlihatkan penurunan kualitas secara morfologi. Tingkat perkembangan

embrio tidak menunjukkan perbedaan antara embrio vitrifikasi dan kontrol

(P>0.05). Embrio yang divitrifikasi mampu mencapai tahap hatching dan hatched.

Total sel dan persentase sel hidup pada embrio vitrifikasi tidak berbeda dengan

embrio kontrol, yaitu berturut-turut 112.6±27.7 dan 95.8±3.3% untuk embrio

vitrifikasi serta 100.8±17.2 dan 97.3±3.2% untuk kontrol (P>0.05). Dapat

disimpulkan bahwa embrio mencit setelah vitrifikasi memiliki tingkat

perkembangan dan viabilitas yang baik setelah dikultur in vitro dalam inkubator

CO2 portable.

Kata kunci: embrio mencit, inkubator CO2 portable, viabilitas, vitrifikasi

ABSTRACT

RIKI PRIMA SANTOSA. Viability of Vitrified Mouse (Mus musculus

albinus) Embryos after In Vitro Culture in Portable CO2 Incubator. Supervised by

ARIEF BOEDIONO and KUSDIANTORO MOHAMAD.

Portable CO2 incubator can be used for embryo culture during transportation.

Vitrification is one of cryopreservation methods for long term embryo storage.

The aim of study was to examine the development and viability of vitrified

embryos after in vitro culture in portable CO2 incubator. Embryos were collected

on day 3 post fertilization from mice that superovulated with PMSG and hCG.

The embryos were divided into vitrified and not vitrified (as control) groups.

Vitrification were done using 15% ethylene glycol + 15% DMSO and warmed

using step wise method in 0.5, 0.25, 0.1 M sucrose then cultured for 48 hours in

vitro. Evaluation were the development rate of embryos and their viability with

Hoechst–propidium iodide stainning. There were no morphologically abnormality

in post warming on vitrified embryos. The development rate were no difference

(P>0.05) between vitrified and control groups, and embryos had developed to

hatching and hatched development stage. The total number of cells and percentage

of life cells were no difference between vitrified and control groups, i.e.

112.6±27.7, 95.8±3.3% and 100.8±17.2, 97.3±3.2% for vitrified and control

groups, respectively. It was concluded that vitrified mouse embryo have a good

development and viability after in vitro culture in portable CO2 incubator.

Keywords: mouse embryos, portable CO2 incubator, viability, vitrification

vii

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Kedokteran Hewan

pada

Fakultas Kedokteran Hewan

VIABILITAS EMBRIO MENCIT (Mus musculus albinus) VITRIFIKASI

SETELAH KULTUR IN VITRO DALAM INKUBATOR CO2 PORTABLE

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2016

RIKI PRIMA SANTOSA

ix

Judul Skripsi : Viabilitas Embrio Mencit (Mus musculus albinus) Vitrifikasi

setelah Kultur In Vitro dalam Inkubator CO2 Portable.

Nama : Riki Prima Santosa

NIM : B04120029

Disetujui oleh

Prof Drh Arief Boediono, PhD, PAVet (K) Drh Kusdiantoro Mohamad, MSi, PAVet

Pembimbing I Pembimbing II

Diketahui oleh

Prof Drh Agus Setiyono, MS, PhD, APVet

Wakil Dekan Bidang Akademik dan Kemahasiswaan FKH

Tanggal Lulus:

xi

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala yang

telah memberikan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi

yang berjudul “Viabilitas Embrio Mencit (Mus musculus albinus) Vitrifikasi

setelah Kultur In Vitro dalam Inkubator CO2 Portable”. Skripsi ini diharapkan

dapat memberikan manfaat bagi banyak pihak dan merupakan salah satu syarat

untuk memperoleh gelar Sarjana Kedokteran Hewan pada Fakultas Kedokteran

Hewan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini berlangsung dari bulan Februari

sampai Mei 2016 di Laboratorium Embriologi, Departemen Anatomi, Fisiologi

dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.

Penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof Drh Arief Boediono, PhD,

PAVet (K) selaku pembimbing pertama dan Drh Kusdiantoro Mohamad, MSi,

PAVet selaku pembimbing kedua, atas bimbingan dan arahan yang diberikan

selama proses penyelesaian tugas akhir. Penulis juga mengucapkan terima kasih

kepada Bapak Wahyu yang telah membantu penulis selama pelaksanaan

penelitian di Laboratorium Embriologi. Penulis juga mengucapkan terimakasih

kepada Yusa, Septi, Alissa, Senna, Herman, Syam, dan Reza sebagai rekan

penelitian dan keluarga besar Astrocyte 49. Penulis mengucapkan terima kasih

yang tak berhingga kepada orang tua tercinta ayah Slamet Widyatmo dan ibu

Julaeha, juga kakak dan adik tercinta Bara, Raka dan Gugun yang senantiasa

memberikan motivasi dan doa. Karya ilmiah ini diharapkan dapat memberi

manfaat dan menambah wawasan bagi banyak pihak. Adanya kritik dan saran

diharapkan dapat membantu penyempurnaan karya tulis ini.

Bogor, Agustus 2016

Riki Prima Santosa

xiii

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL xiii

DAFTAR GAMBAR xiii

ABSTRAK iv

PENDAHULUAN 1

Latar Belakang 1

Perumusan Masalah 1

Tujuan Penelitian 1

Manfaat Penelitian 2

TINJAUAN PUSTAKA 2

Fertilisasi In Vivo dan Produksi Embrio In Vitro 2

Kriopreservasi Embrio dengan Metode Vitrifikasi 2

Inkubator Portable 3

METODE 3

Waktu dan Tempat Penelitian 3

Metode Penelitian 4

Rancangan Percobaan 6

HASIL DAN PEMBAHASAN 6

Morfologi Embrio 6

Tingkat Perkembangan Embrio 7

Daya Hidup Embrio 9

SIMPULAN DAN SARAN 11

Simpulan 11

Saran 11

DAFTAR PUSTAKA 11

RIWAYAT HIDUP 15

DAFTAR TABEL

1 Tingkat perkembangan embrio vitrifikasi dan kontrol yang dikultur

dalam inkubator CO2 portable 7 2 Rerata sel hidup, sel mati dan total sel embrio vitrifikasi dan kontrol yang

dikultur dalam inkubator CO2 portable 10

DAFTAR GAMBAR

1 Morfologi embrio sebelum, sesaat dan satu jam setelah vitrifikasi 6 2 Persentase viabilitas embrio vitrifikasi dan kontrol yang dikultur dalam

inkubator CO2 portable 8 3 Tahapan perkembangan embrio vitrifikasi dan kontrol pada kulur in vitro 9 4 Pewarnaan embrio menggunakan Hoecsht-propidium iodide setelah 48

jam kultur in vitro dalam inkubator CO2 portable 11

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Teknologi fertilisasi in vitro (IVF) sudah ada sejak 1890 saat Walter

Heape pertama kali berhasil melakukan transfer embrio pada kelinci (Mapletoft

dan Hasler 2005). Keberhasilan tersebut disusul dengan kelahiran manusia

pertama melalui IVF yaitu Louis Brown pada 1978 (Kovacs et al. 2003).

Teknologi IVF memungkinkan untuk memproduksi embrio baik secara in vivo

maupun in vitro yang siap untuk ditransfer sehingga memunculkan harapan baru

sebagai solusi berbagai persoalan reproduksi seperti infertilitas dan konservasi

satwa terancam punah. Hewan bibit unggul jika hanya melahirkan sekali dalam

satu periode dapat dimaksimalkan produksi embrionya dengan cara ditransfer

kepada resipien sehingga anak yang dihasilkan dari induk kualitas unggul menjadi

lebih banyak.

Inkubator CO2 yang digunakan untuk kultur embrio merupakan inkubator

yang sudah dilengkapi dengan pengaturan otomatis terhadap suhu dan konsentrasi

CO2. Inkubator tersebut pada umumnya memiliki ukuran yang besar dan tidak

untuk dipindah-pindahkan. Saat ini telah banyak dikembangkan inkubator dengan

ukuran yang lebih kecil dan dapat dibawa dengan mudah. Salah satunya adalah

desain inkubator portable yang telah dikembangkan oleh Suzuki et al. (1999).

Teknologi kriopreservasi (pembekuan) embrio sudah berkembang sejak

lama. Salah satu metode kriopreservasi yaitu vitrifikasi menjadi teknik

penyimpanan yang ideal. Kriopreservasi sudah berkembang sejak tahun 1971

ketika Whittingham berhasil membekukan dan mencairkan embrio mencit

(Whittingham 1971). Sementara itu vitrifikasi merupakan metode pembekuan

dengan menghindari terjadinya pembentukan kristal es telah dikembangkan sejak

1985 (Rall dan Fahy 1985). Penyimpanan sel hidup terutama embrio

menggunakan metode vitrifikasi telah menunjukkan kemajuan yang pesat. Kultur

embrio segar pada inkubator CO2 portable telah dilakukan oleh Suzuki et al.

(1999) dan Kandil et al. (1999). Meskipun demikian kultur embrio vitrifikasi

dalam inkubator CO2 portable belum pernah dilakukan sehingga perlu dilakukan

penelitian mengenai kultur embrio pasca vitrifikasi dalam inkubator CO2

portable.

Perumusan Masalah

Permasalahan yang diangkat adalah bagaimana mengetahui daya hidup

embrio mencit yang telah dibekukan dengan metode vitrifikasi dan dikultur in

vitro di dalam inkubator CO2 portable.

Tujuan

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi tingkat

perkembangan dan viabilitas embrio mencit yang dikriopreservasi dengan metode

vitrifikasi dan dikultur in vitro dalam inkubator CO2 portable.

2

Manfaat

Manfaat yang didapat dari penelitian ini adalah informasi mengenai daya

hidup embrio mencit yang telah dibekukan dengan metode vitrifikasi dan dikultur

in vitro dalam inkubator CO2 portable yang ekonomis serta ramah lingkungan.

Inkubator ini selanjutnya dapat digunakan untuk membantu laboratorium yang

membutuhkan, serta dapat digunakan untuk tujuan konservasi pada kawasan-

kawasan terpencil dan mudah dibawa.

TINJAUAN PUSTAKA

Fertilisasi In Vivo dan Produksi Embrio In Vitro

Produksi embrio secara in vivo sudah banyak dilaporkan, akan tetapi

aplikasi teknoligi ini masih sangat terbatas karena harga hormon cukup mahal

serta respon setiap individu donor yang berbeda terhadap hormon. Menurut

Jodiansyah et al. (2013) stimulasi superovulasi melalui sinkronisasi dapat

meningkatkan respon pasien, respon perolehan embrio dan efektifitas manajemen

yang lebih baik dibandingkan dengan superovulasi biasa.

Embrio dapat tumbuh dalam media kultur dengan pH antara 7.2-7.4

dengan kisaran optimal 7.1-7.2 (Edwards et al. 1998). Untuk mencapai pH media

pada kisaran 7.2-7.4 diperlukan konsentrasi CO2 sebesar 5% (Swain 2012).

Menurut Geshi et al. (1999), konsentrasi CO2 5% di udara dalam inkubator

merupakan kondisi in vitro yang ideal agar natrium bikarbonat dapat bekerja

sebagai buffer dalam media kultur. Dalam inkubator CO2 portable dengan luas

600 mL, suhu 37-38 °C, tekanan 1 psi dapat diperoleh konsentrasi CO2 antara 5-6

% dengan menggunakan serbuk effervescent yang berisi 0.2 mg natrium

bikarbonat dan 0.46 mg asam sitrat dalam 5 mL aquades (Mirsageri 2013).

Kriopreservasi Embrio dengan Metode Vitrifikasi

Teknik kriopreservasi adalah suatu teknik penyimpanan sel hewan,

tumbuhan maupun bahan biologis yang lain dalam keadaan beku melalui reduksi

aktivitas metabolisme tanpa memengaruhi organel-organel di dalam sel sehingga

fungsi biologis, dan morfologis tetap ada. Teknik kriopreservasi merupakan

teknik penyimpanan yang dilakukan pada suhu yang sangat rendah (-196 °C)

dalam nitrogen cair (Boediono 2003). Teknologi kriopreservasi memungkinkan

spermatozoa (semen), oosit, serta embrio dapat ditransportasikan pada jarak yang

jauh. Kriopreservasi dapat menyimpan embrio dalam waktu yang lama sehingga

dapat digunakan sewaktu-waktu. Metode kriopreservasi terdapat dua macam,

yaitu metode konvensional dengan pembekuan lambat dan vitrifikasi. Terdapat

beberapa kelebihan dan kekurangan pada masing-masing metode. Saat ini metode

vitrifikasi lebih banyak diaplikasikan untuk oosit dan embrio (Wahjuningsih et al.

2010). Vitrifikasi lebih banyak digunakan sebab memiliki viabilitas yang lebih

tinggi. Selain itu vitrifikasi lebih mudah diaplikasikan. Pembekuan secara lambat

3

dapat memperlama paparan terhadap suhu dingin. Beberapa mamalia memiliki

oosit dan embrio yang lebih sensitif terhadap suhu dingin (Seki et al. 2014).

Etilen glikol banyak digunakan sebagai krioprotektan pada beberapa

spesies mamalia karena memiliki toksisitas yang rendah. Beberapa krioprotektan

lain telah digunakan dalam kriopreservasi embrio dan berhasil menghasilkan anak

(Han et al. 2003). Dimetil sulfoksida (DMSO) sering digunakan pada metode

pembekuan lambat (Balaban et al. 2008) maupun vitrifikasi (Liebermann dan

Tucker 2002). Krioprotektan yang lain adalah gliserol (Rall et al. 2000), propilen

glikol (Dochi et al. 1998), propanediol, formamide dan eritritol (Sztein et al.

2001). Mekanisme utama kerusakan sel pada embrio yang divitrifikasi antara lain

sebagai akibat dari toksisitas krioprotektan, pembentukan es intraselular, dan stres

osmotik selama penghilangan cairan krioprotektan (Han et al. 2003). Proses

vitrifikasi dan penghangatan menyebabkan mulai dari kerusakan organel hingga

kematian sel. Proses dehidrasi dan rehidrasi secara cepat akan menyebabkan

keseimbangan cairan terganggu. Krioprotektan pada konsentrasi tertentu akan

bersifat toksik bagi sel sehingga dapat menurunkan daya hidupnya. Proses

kriopreservasi memiliki viabilitas yang lebih tinggi dibandingkan proses

pembekuan lambat (Han et al. 2003). Perlu diteliti lebih jauh mengenai jumlah sel

yang hidup dan sel yang mati selama dan sesudah proses vitrifikasi.

Inkubator Portable

Desain inkubator CO2 portable yang digunakan dalam penelitian ini

mengambil contoh dari Suzuki et al. (1999) dengan beberapa modifikasi untuk

mengultur embrio sapi. Modifikasinya antara lain berupa inkubator portable yang

menggunakan listrik sebagai pemanas. Inkubasi embrio dilakukan dalam kotak

plastik berukuran 0.6 L (15 x 10 x 4 cm). CO2 yang diperlukan diperoleh dari

penambahan granul berisi 420 mg asam tartarat, 460 mg natrium bikarbonat, dan

10 mg fiber silikon per granul. Desain tersebut juga digunakan oleh Kandil et al.

(1999) untuk kultur embrio kerbau, Dong et al. (2001), Khan et al. (1993) untuk

kultur embrio sapi, dan Iwayama et al. (2005) untuk pematangan oosit paus biru.

Sebuah penelitian dari Mirsageri (2013) menggunakan inkubator termodifikasi

untuk kultur embrio mencit dengan berbagai konsentrasi bahan pembentuk CO2.

Penggunaan inkubator portable untuk mentransportasikan embrio yang telah

divitrifikasi pada jarak yang jauh sudah banyak dilakukan dengan tingkat

keberhasilan yang bervariasi (Inoe et al. 2014).

METODE

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini berlangsung pada bulan Februari sampai dengan Mei 2016.

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Embriologi, Departemen Anatomi

Fisiologi dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.

4

Metode Penelitian

Superovulasi mencit

Mencit (Mus musculus albinus) betina sebanyak dan jantan (strain DDY)

berumur 8-10 minggu yang berasal dari koloni bebas penyakit digunakan dalam

penelitian ini. Superovulasi dilakukan dengan penyuntikan hormon pregnant

mare’s serum gonadotropine (PMSG) (Folligon®, Intervet, Belanda) 5 IU per ekor

secara intraperitoneum pada pukul 16.00 WIB. Setelah 48 jam penyuntikan

PMSG, dilanjutkan dengan penyuntikan hormon human chorionic gonadotropine

(hCG) (Chorulon®, Intervet, Belanda) 5 IU per ekor secara intraperitoneal untuk

menggertak ovulasi. Setelah penyuntikan hCG, setiap mencit betina tersebut

dikawinkan dengan mencit jantan dengan perbandingan 1 : 1 (single mating).

Pemeriksaan sumbat vagina (vaginal/copulation plug) dilakukan pada pagi hari

berikutnya untuk memastikan mencit tersebut telah kawin. Hari di mana sumbat

vagina terlihat dihitung sebagai hari pertama (H-1) kebuntingan.

Koleksi Embrio

Mencit betina yang memperlihatkan sumbat vagina dipisahkan dari mencit

jantan ke dalam kandang individu. Koleksi embrio dilakukan hari ketiga atau 65-

67 jam setelah penyuntikan hormon hCG. Mencit betina bunting dikorbankan

dengan cara dislocatio cervicalis. Bagian oviduk atau tuba Falopii diisolasi dan

ditempatkan pada medium koleksi (G-MOPS™, Vitrolife Sweden AB, Swedia)

yang telah ditambahkan fetal bovine serum (FBS) 5%. Embrio dikoleksi dengan

cara membilas (flushing) bagian oviduk menggunakan jarum berukuran 30G dan

diamati di bawah mikroskop stereo. Selanjutnya, embrio hasil koleksi dievaluasi

dan dihitung jumlahnya. Hari ketiga diperoleh embrio tahap 4 atau 8 sel,

dikumpulkan dan dibilas 2-3 kali di dalam medium kultur (BlastAsstTM, ORIGIO

Malov, Denmark).

Kriopreservasi Embrio dengan Metode Vitrifikasi Embrio

Metode vitrifikasi dalam penelitian ini mengacu pada Mohamad et al.

(2005) dengan beberapa modifikasi. Embrio yang dikoleksi pada hari ketiga

selanjutnya dibekukan dengan metode vitrifikasi. Embrio terlebih dahulu

diekuilibrasi dalam larutan PBS + etilen glikol 10% selama maksimal 10 menit

pada suhu kamar. Kemudian embrio dipaparkan ke dalam medium vitrifikasi yang

berisi etilen glikol 15 % + DMSO 15 % + sukrosa 0.5 M + PBS selama kurang

dari 1 menit pada suhu kamar, embrio ditempatkan pada ujung straw (0.25 mL).

Embrio selanjutnya langsung dimasukkan ke dalam nitrogen cair dengan suhu -

196 °C.

Penghangatan (warming) embrio dilakukan dengan metode bertahap (step

wise), embrio dikeluarkan dari nitrogen cair kemudian langsung direndam ke

dalam larutan PBS + sukrosa 0.5 M (maksimal 1.5 menit). Embrio selanjutnya

dipaparkan secara berturut-turut dalam larutan PBS + sukrosa 0.25 M (2.5menit),

PBS + sukrosa 0.1 M (2.5 menit). Selanjutnya embrio dicuci dalam medium

kultur dan dikultur in vitro.

5

Kultur dalam Inkubator CO2 Portable

Pada eksperimen ini, digunakan inkubator portable yang dilengkapi

dengan thermostat dan termometer secara digital yang bekerja secara otomatis

menjaga kondisi ruangan inkubator tersebut berada pada suhu 37.0 °C. Kultur in

vitro embrio dilakukan dalam bentuk kotak plastik (15 cm x 10 cm x 4 cm = 0.6 L

volume). Selanjutnya kotak plastik tersebut dimasukkan ke dalam inkubator

portable kotak pemanas yang telah diatur suhunya pada 37 °C. Gas CO2

diproduksi melalui serbuk effervescent (natrium bikarbonat 0.2 mg dan asam sitrat

0.46 mg yang dikemas ke dalam kapsul) yang kemudian ditambahkan aquades 5

mL. Sehingga dicapai konsentrasi CO2 di dalam inkubator berkisar antara 5-6 %.

Serbuk effervescent selalu diganti pada setiap dilakukan pengamatan embrio.

Tingkat Perkembangan Embrio pada Kondisi Inkubator CO2 Portable

Kondisi inkubator CO2 portable dievaluasi dengan mengamati tingkat

perkembangan embrio mencit pada kultur in vitro. Embrio yang dikoleksi pada

hari ketiga dikultur secara in vitro dalam medium kultur BlastAsstTM (ORIGIO

Malov, Denmark) dalam inkubator CO2 portable sampai tahap perkembangan

blastosis. Sebanyak 10 embrio ditempatkan pada polysterene dish 35 mm

(Nunclon™, Roskilde, Denmark) yang berisi medium kultur sebanyak 10 μl dan

ditutupi dengan mineral oil (Sigma, St Louis, USA) untuk mencegah penguapan

medium dan kontaminasi selama kultur. Embrio dikultur dalam inkubator CO2

portable dengan konsentrasi CO2 5-6 %. Pada kondisi kultur in vitro, embrio akan

berkembang mencapai tahap morula setelah 24 jam inkubasi dan mencapai tahap

blastosis setelah diinkubasi selama 48 jam.

Pengamatan setiap tahap perkembangan embrio dilakukan melalui

identifikasi morfologi. Tahap morula kompak diidentifikasi dengan tidak

terlihatnya batas antar sel blastomer. Perkembangan tahap blastosis ditandai

dengan terbentuknya rongga blastosul dan ukuran embrio masih normal. Blastosis

ekspan memperlihatkan adanya ruang blastosul yang semakin besar sehingga

ukuran embrio juga lebih besar dari normal. Blastosis hatching yaitu lanjutan dari

blastosis ekspan di mana sebagian embrio telah keluar dari zona pelusida

(menetas), sedangkan blastosis hatched tercapai apabila semua bagian embrio

telah keluar dari zona pelusida (Hyttel et al. 2010).

Viabilitas Embrio

Embrio mencit yang sudah dikultur selama 48 jam dalam inkubator CO2

portable diwarnai dengan pewarna diferensial Hoechst–propidium iodide. Embrio

tahap blastosis dipindahkan ke dalam drop 20 µL berisi 10 µg/mL pewarna

Hoechst dan 10 µg/mL pewarna propidium iodide, dan diinkubasi dalam

inkubator selama 20 menit. Embrio kemudian dipindahkan ke dalam larutan G-

MOP + serum 10 %, dipindahkan ke atas glass obyek dengan diberi sedikit

larutan G-MOP + serum 10 %, dan ditutup cover glass agar embrio sedikit

tertekan. Preparat langsung diamati dan dipotret dengan mikroskop flourescence

(Nikon Eclipse E 6000) dalam kondisi gelap. Penghitungan sel yang hidup dan

yang mati dilakukan dengan menggunakan aplikasi ImageJ. Sel yang hidup

ditandai dengan inti akan berwarna biru sedangkan sel yang mati berwarna merah.

6

Rancangan Percobaan

Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah

rancangan teracak lengkap (complete random design). Penelitian terdiri atas dua

perlakuan yaitu embrio yang telah divitrifikasi dan embrio tidak divitrifikasi

(kontrol). Respon yang diamati adalah perkembangan embrio pada tiap kelompok

hingga mencapai tahap blastosis hatched. Pengamatan dilakukan 24 jam (H-4) dan

48 jam (H-5) setelah dilakukan kultur. Setelah hari ke 2 kultur embrio diwarnai

dengan pewarnaan diferensial untuk menghitung jumlah total sel, sel hidup dan

sel mati.

Analisis Data

Data disajikan dalam bentuk persentase (rata-rata) ± standar deviasi dan

dianalisis dengan menggunakan uji t test. Semua perhitungan statistik dilakukan

menggunakan perangkat lunak SPSS.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Morfologi Embrio

Morfologi embrio setelah penghangatan (warming) menunjukkan tidak

ada kerusakan yang signifikan. Seluruh embrio setelah warming menunjukkan

angka kelangsungan hidup (survival rate) 100%. Penilaian kelangsungan hidup

didasarkan pada keadaan morfologis embrio setelah satu jam penghangatan dan

kultur in vitro (Gambar 1). Angka kelangsungan hidup embrio secara umum

dinilai berdasarkan keutuhan morfologi dan kemampuan reekspansi rongga

blastosul (Khoirinaya 2011). Keutuhan morfologi embrio yang diamati antara lain

keutuhan membran sel dan zona pelusida, warna sitoplasma yang homogen, serta

tidak terjadi degenerasi dan fragmentasi blastomer. Seluruh embrio pasca

vitrifikasi mampu reekspansi kembali ke bentuk dan ukuran semula.

Gambar 1 Morfologi embrio mencit hasil vitrifikasi. (A) Embrio sebelum

vitrifikasi, (B) Embrio vitrifikasi sesaat setelah warming, dan (C)

Embrio vitrifikasi satu jam setelah kultur in vitro. Bar = 10 µm

7

Tingkat Perkembangan Embrio

Data perkembangan embrio disajikan dalam Tabel 1. Hasil pengamatan

awal pada saat koleksi embrio (hari ke-3 pascafertilisasi) menunjukkan proporsi

embrio tahap morula dan di bawah 8 sel yang tidak berbeda nyata (P>0.05) antara

embrio yang digunakan pada perlakuan vitrifikasi dan kontrol. Pengamatan hari

ke-4 (24 jam setelah kultur in vitro) sebagian besar embrio mencapai tahap morula

kompak dan blastosis (Gambar 3). Jumlah embrio yang mencapai tahap blastosis

pada hari ke-5 (48 jam setelah kultur in vitro) pada perlakuan vitrifikasi dan

kontrol tidak berbeda nyata (P>0.05) (Tabel 1). Jumlah embrio yang divitrifikasi

yang mencapai tahap blastosis hatching adalah sebesar 12 (27.3 %) dan blastosis

hatched sebesar 5 (11.4 %). Hasil tersebut menunjukkan perlakuan vitrifikasi

tidak memengaruhi kemampuan embrio untuk mencapai tahap hatched. Hasil

pengamatan perkembangan embrio menunjukkan tidak terdapat perbedaan secara

nyata antara embrio kontrol dengan embrio vitrifikasi yang dikultur dalam

inkubator CO2 portable. Secara persentase embrio vitrifikasi memiliki tingkat

pertumbuhan yang baik. Hal ini menunjukkan embrio mencit yang telah

dikriopreservasi dengan metode vitrifikasi dapat berkembang dengan baik dalam

inkubator CO2 portable. Hal ini sesuai dengan penelitian Khoirinaya (2011) yang

menyatakan embrio mencit yang telah dibekukan dengan metode vitrifikasi dapat

berkembang dengan baik dalam kultur in vitro. Menurut Swain (2010) embrio

mencit dapat dikultur dalam inkubator konvensional hingga tahap blastosis

menggunakan CO2 yang diperoleh dari reaksi kimia sederhana.

Tabel 1 Tingkat perkembangan embrio vitrifikasi dan kontrol yang dikultur dalam

inkubator CO2 portable

Tahap Perkembangan

Embrio

Jumlah embrio (%)

Vitrifikasi Kontrol

N 44 49

0 jam

Kultur

< 8 sel 10 (22.7)a 13 (26.5)a

Morula 34 (77.3)a 36 (73.5)a

24 jam

kultur

Morula kompak 21 (47.7)a 32 (63.2)b

Blastosis 18 (41.0)a 9 (18.4)b

Degenerasi (mati) 5 (11.3)a 9 (18.4)b

48 jam

kultur

Blastosis 34 (77.3)a 39 (79.6)a

Degenerasi (mati) 10 (22.7)a 10 (20.4)a

Superskrip yang berbeda pada baris yang sama menandakan berbeda secara nyata (P<0.05)

Kualitas oosit yang digunakan untuk kultur berpengaruh terhadap

perkembangan embrio hingga mencapai tahap blastosis (Adifa et al. 2010).

Perkembangan embrio secara in vitro sangat dipengaruhi oleh kualitas embrio,

respon individu embrio, komposisi medium kultur yang digunakan dan

lingkungan inkubasi sistem kultur. Kualitas oosit berpengaruh terhadap

perkembangan embrio selanjutnya. Kualitas oosit diantaranya dipengaruhi oleh

genetik, karakteristik fisiologis, kesehatan organ reproduksi, dan nutrisi induk

(Silva et al. 2009).

8

Gambar 2 Persentase viabilitas embrio vitrifikasi dan kontrol yang dikultur dalam

inkubator CO2 portable

Mekanisme utama kerusakan sel saat vitrifikasi antara lain toksisitas

krioprotektan, pembentukan kristal es intraselular, dan stres osmotik selama

penghilangan krioprotektan (Swain 2010). Menurut Wahjuningsih et al. (2010),

etilen glikol yang digunakan sebagai krioprotektan dalam penelitian ini memiliki

sifat toksik terhadap embrio. Menurut Han et al. (2003), pengeluaran

krioprotektan yang tidak sempurna pada vitrifikasi satu tahap dapat menyebabkan

terbentuknya kristal es tetapi pengaruhnya tidak terlalu terlihat pada morfologi

embrio karena sebagian besar bentuk embrio tampak normal. Morfologi embrio

tahap empat sel vitrifikasi dalam penelitian Han et al. (2003) tidak

memperlihatkan perbedaan dengan embrio kontrol, sedangkan embrio tahap

delapan sel menunjukkan perbedaan.

Kualitas kultur oosit tidak dipengaruhi oleh tipe inkubator atau kontainer

(Fuji et al. 2009), namun dipengaruhi oleh konsentrasi CO2. Penggunaan

inkubator modifikasi tersebut membutuhkan suplai CO2 dengan konsentrasi yang

konstan. Penggunaan serbuk effervescent dalam kotak inkubator membuat

konsentrasi CO2 tidak dapat diubah hingga pengamatan selanjutnya. Hal ini

menyebabkan konsentrasi yang dapat diukur hanya pada saat pengamatan (24

jam). Konsentrasi CO2 selama 24 jam tersebut tidak dapat diukur fluktuasinya.

Menurut Swain (2012), karbon dari CO2 digunakan dalam berbagai proses

metabolik embrio. Pengaruh karbon dari CO2 dalam proses metabolik mungkin

menjelaskan mengapa ada beberapa variasi dalam literatur yang menyebutkan

jumlah CO2 yang tepat untuk pH optimal. Perubahan pH intraseluler sedikit saja

dapat menurunkan tingkat perkembangan embrio. Swain (2010) menyebutkan,

peningkatan pH sebesar 0.1-0.15 secara signifikan meningkatkan glikolisis embrio

dan menurunkan metabolisme oksidatif yang juga mempengaruhi kualitas

perkembangan.

100

88,6

77,3

100

81,6 79,6

0

20

40

60

80

100

120

0 jam 24 jam 48 jam

Vitrifikasi

Kontrol

9

Gambar 3 Tahapan perkembangan embrio vitrifikasi dan kontrol pada kulur in

vitro. (A) embrio vitrifikasi saat 0 jam kultur; (B) Embrio vitrifikasi

24 jam kultur; (C) embrio vitrifikasi 48 jam kultur; (D) embrio segar

isolasi 0 jam kultur; (E) embrio kontrol 24 jam kultur; (F) embrio

kontrol 48 jam kultur. Bar = 20 µm

Tingkat penurunan viabilitas embrio vitrifikasi cenderung tidak ada

perbedaan dengan embrio kontrol secara keseluruhan. Selain pada tahap morula

kompak ke blastosis awal, embrio kontrol memiliki nilai penurunan viabilitas

yang lebih tinggi pada semua tahap perkembangan. Jumlah embrio yang tidak

berkembang ke tahap selanjutnya dan yang mati mengalami peningkatan. Tahap

yang paling tinggi tingkat penurunan viabilitas adalah pada tahap blastosis

mencapai hatching dan blastosis hatching mencapai hatched. Angka penurunan

viabilitas yang tinggi pada tahap blastosis hatching hingga hatched disebabkan

salah satunya oleh elastisitas dan ketebalan zona pelusida yang akan berpengaruh

terhadap proses hatching (Balaban et al. 2006), serta trofektoderm dari embrio

tidak mampu mensekresi faktor-faktor untuk hatching. Kultur in vitro dan stres

akibat proses pembekuan-pencairan dapat menyebabkan pengerasan zona pelusida

sehingga memengaruhi proses hatching. Proses hatching dan hatched sangat

diperlukan untuk proses implantasi.

Daya Hidup Embrio

Rerata sel hidup, sel mati dan total sel disajikan pada Tabel 2. Hasil

pengamatan menunjukkan tidak terdapat perbedaan yang nyata (P<0.05) pada

rerata total sel dan persentase sel hidup dan mati pada perlakuan vitrifikasi dan

kontrol. Embrio yang telah divitrifikasi memiliki rerata total sel tidak berbeda

10

nyata dibandingkan embrio kontrol. Hasil ini menunjukkan embrio yang telah

mengalami proses vitrifikasi mampu berkembang dengan baik dalam inkubator

CO2 portable (Gambar 4). Persentase sel hidup pada embrio yang telah

divitrifikasi dan embrio kontrol tidak berbeda nyata. Persentase sel hidup yang

tinggi tersebut menunjukkan tingkat proliferasi sel embrio pasca vitrifikasi baik.

Tabel 2 Rerata sel hidup, sel mati dan total sel embrio vitrifikasi dan kontrol yang

dikultur dalam inkubator CO2 portable

Perlakuan N Rerata sel hidup (%) Rerata sel mati (%) Rerata total sel

Vitrifikasi 14 95.8±3.3 4.2±3.3 112.6±27.7

Kontrol 15 97.3±3.2 2.7±3.3 100.8±17.2

Gambar 4 Pewarnaan embrio menggunakan Hoecsht-propidium iodide setelah 48

jam kultur in vitro dalam inkubator CO2 portable. (A, B) embrio

vitrifikasi dan (C, D) kontrol. Warna biru menunjukkan sel yang hidup

(A, C), sedangkan warna merah menunjukkan sel mati (B, D). Bar = 50

µm

Waktu yang diperlukan bagi sel embrio untuk membelah mulai dari tahap

4 sel dan tahap-tahap selanjutnya memiliki interval 12 jam (Wolpert et al. 2015).

Standar deviasi yang besar rerata total sel diakibatkan oleh banyaknya variasi

tingkat perkembangan embrio, mulai dari tahap blastosis hingga blastosis hatched.

Jumlah sel embrio mencit yang telah dilaporkan berbeda-beda, yaitu tahap

blastosis sebanyak 74.3±2.6 sel (Sudiman et al. 2014) dan tahap blastosis ekspan

sebanyak 73.7±7.1 sel (Lin et al. 2003). Sementara itu, hasil penelitian

menunjukkan jumlah sel yang jauh lebih tinggi dibandingkan penelitian yang

11

dilaporkan oleh peneliti sebelumnya. Hal ini karena pada penelitian ini evaluasi

dilakukan sampai tahap blastosis yang sudah hatched dengan jumlah sel yang

lebih banyak dibanding jumlah sel blastosis atau blastosis ekspan.

Faktor-faktor yang memengaruhi perkembangan embrio dalam sebuah

inkubator antara lain konsentrasi CO2 dan suhu. Konsentrasi CO2 dalam inkubator

portable pada penelitian ini disesuaikan seperti yang telah dilaporkan oleh

Mirsageri (2013), yaitu dengan menambahkan serbuk everffescent sehingga terjadi

reaksi kimia yang menghasilkan konsentrasi CO2 sebesar 5-6 %. Sementara itu

suhu dalam penelitian ini diatur dengan menggunakan pemanas yang

mempertahankan suhu pada 37.5 °C. Dengan demikian, tingkat perkembangan

dan viabilitas embrio pasca vitrifikasi sangat baik selama proses kultur in vitro

dalam inkubator CO2 portable.

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Tingkat perkembangan dan viabilitas embrio vitrifikasi sangat baik dan

tidak berbeda dengan kontrol. Inkubator CO2 portable dapat digunakan untuk in

vitro kultur embrio yang telah mengalami proses kriopreservasi dengan metode

vitrifikasi.

Saran

Inkubator CO2 portable dapat digunakan untuk kultur in vitro embrio pada

mamalia lain pada berbagai spesies hewan yang lebih tinggi.

DAFTAR PUSTAKA

Adifa NS, Astuti P, Widayati DT. 2010. Pengaruh penambahan chorionic

gonadotrophin pada medium maturasi terhadap kemampuan maturasi,

fertilisasi, dan perkembangan embrio secara in vitro kambing peranakan

ettawa. Bul Peter. 34(1):8-15

Balaban B, Urman B, Yakin K, Isiklar A. 2006. Laser-assisted hatching increases

pregnancy and implantation rates in cryopreserved embryos that were allowed

to cleave in vitro after thawing: a prospective randomized study. Hum Reprod.

21(8):2136–2140.

Balaban B, Urman B, Ata B, Isiklar A, Larman MG, Hamilton R, Gardner DK.

2008. A randomized controlled study of human day 3 embryo cryopreservation

by slow freezing or vitrification: vitrification is associated with higher survival,

metabolism and blastocyst formation. Hum Reprod. 23(6):1976-1982.

Boediono A. 2003. Vitrifikasi vs pembekuan lambat pada pembekuan embrio. Di

dalam. Symposium Perkumpulan Teknologi Reproduksi Indonesia I (PATRI).

Oktober 2003. Denpasar, Indonesia. Denpasar (ID).

12

Dochi O, Yamamoto Y, Saga H, Yoshiba N, Kano N, Maeda J, Miyata K,

Yamauchi A, Tominaga K, Oda Y, Nakashima T, Inohae S. 1998. Direct

transfer of bovine embryos frozen-thawed in the presence of propylene glycol

or ethylene glycol under on-farm conditions in an integrated embryo transfer

program. Theriogenology. 49:1051-1058.

Dong YJ, Varisanga MD, Mtango NR, Aono M, Otoi T, Suzuki T. 2001.

Improvement of the culture conditions for in vitro Production of cattle embryos

in a portable CO2 incubator. Reprod Dom Anim. 36:313–318.

Edwards LJ, Williams DA, Gardner DK. 1998. Intracellular pH of the

preimplantation mouse embryo: effects of extracellular pH and weak acids.

Mol Reprod Dev. 50:434–442.

Fuji A, Kaedei Y, Tanihara F, Ito A, Hanatate K, Kikuchi K, Nagai T, Otoi T.

2009. In vitro maturation and development of porcine oocytes cultured in a

straw or dish using a portable incubator with a CO2 chamber. Reprod Dom

Anim. 45:619–624

Geshi M, Yonai M, Sakaguchi M, Nagai T. 1999. Improvement of in vitro co-

culture systems for bovine embryos using a low concentration of carbon

dioxide and medium supplemented with 13-mercaptoethanol. Theriogenology.

51:551-558.

Han MS, Niwa K, Kasai M. 2003. Vitrification of rat embryos at various

developmental stages. Theriogenology. 59:1851-1863.

Hyttel P, Sinowatz F, Vejlsted M. 2010. Essentials of Domestic Animal

Embryology. Oxford (GB) : Saunders Elsevier.

Inoue T, Ono Y, Yonezawa Y, Fujiwara T, Nohara A, Mimura O, Kishi J, Emi N.

2014. Successful pregnancy following transfer of frozen-thawed day 7

blastocysts derived from transported oocytes. J Mamm Ova Res. 31(1):52–56

Iwayama H, Ishikawa H, Ohsumi S, Fukui Y. 2005. Attempt at in vitro maturation

of minke whale (Balaenoptera bonaerensis) oocytes using a portable CO2

incubator. J Reprod Dev. 51(1):69-75.

Jodiansyah A, Imron A, Sumantri C. 2013. Tingkat respon superovulasi dan

produksi embrio in vivo dengan sinkronisasi CIDR (controlled internal drug

releasing) pada sapi donor simmental. JIPTHP. 1(3):184-190.

Kandil OM, Abdoon ASS, Murakami M, Otoi T, Suzuki T. New technique, using

a portable CO2 incubator, for the production of in vitro fertilized egyptian

buffalo embryos. J Reprod Dev. 45(5):315-320.

Khan NH, Kikkawa Y, Sumantri C, Saba S, Murakami MS, Boediono A, Suzuki

T. 1993. Effect of gas atmosphere on the development of bovine embryos using

a simple portable incubator. J Jpn Embryo Transfer Soc. 2:113-122.

Khoirinaya C. 2011. Viabilitas embrio mencit (Mus musculus albinus) setelah

kriopreservasi dengan vitrifikasi ganda pada tahap perkembangan zigot dan

dilanjutkan pada tahap blastosis. [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian

Bogor.

Kovacs GT, Morgan G, Wood EC, Forbes C, Howlett D. 2003. Community

attitudes to assisted reproductive technology: a 20-year trend. Med J Aus.

179:536-538.

Liebermann J, Tucker MJ. 2002. Effect of carrier system on the yield of human

oocytes and embryos as assessed by survival and developmental potential after

vitrification. Reproduction. 124:483-489.

13

Lin TC, Yen JM, Gong KB, Hsu TT, Chen LR. 2003. IGF-1/IGFBP-1 increases

blastocyst formation and total blastocyst cell number in mouse embryo culture

and facilitates the establishment of a stem-cell line. BMC Cell Biol. 4(14).

Mapletoft RJ, Hasler JF. 2005. Assisted reproductive technologies in cattle: a

review. Rev Sci Tech Off Int Epiz. 24(1):393-403.

Mirsageri M. 2013. Perkembangan embrio mencit (Mus musculus albinus) pada

inkubator CO2 termodifikasi. [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Mohamad K, Djuwita I, Boediono A, Supriatna I. 2005. Vitrifikasi ovarium

mencit menggunakan etilen glikol dan DMSO sebagai krioprotektan dan

viabilitasnya pasca autotransplantasi di subkapsula ginjal. Med Ked Hewan.

20(1):23-27.

Rall WF, Schmidt PM, Lin X, Brown SS, Ward AC, Hansen CT. 2000. Factors

affecting efficiency of embryo cryopreservation and rederivation of rat and

mouse models. ILAR J. 41(4):221-227.

Rall WF, Fahy GM. 1985. Ice free cryopreservation at -196 °C by vitrification.

Nature. 313:573-575.

Seki S, Jin B, Mazur P. 2014. Extreme rapid warming yields high functional

survivals of vitrified 8-cell mouse embryos even when suspended in a half-

strength vitrification solution and cooled at moderate rates to 196 °C.

Cryobiology. 68:71-78.

Silva JCC, Alvarez RH, Zanenga RA, Pereira GT. 2009. Factors affecting embryo

production in superovulated Nelore cattle. Anim Reprod. 6(3):440-445.

Sudiman J, Ritter LJ, Feil DK, Wang X, Chan K, Mottershead DG, Robertson

DM, Thompson JG, Gilchrist RB. 2014. Effects of differing oocyte-secreted

factors during mouse in vitro maturation on subsequent embryo and fetal

development. J Assist Reprod Genet. 31(3):295-306.

Suzuki T, Sumantri C, Khan NHA, Murakami M, Saha S. 1999. Development of a

simple, portable carbon dioxide incubator for in vitro production of bovine

embryos. Anim Reprod Sci. 54:149–157.

Swain JE. 2010. Optimizing the culture environment in the IVF laboratory:

impact of pH and buffer capacity on gamete and embryo quality. Reprod

BioMed Online. 21:6–16.

Swain JE. 2012. Is there an optional Ph for culture media used in clinical IVF?.

Hum Reprod Update. 18(3):333-339.

Sztein JM, Noble K, Farley JS, Mobraaten LE. 2001. Comparison of permeating

and nonpermeating cryoprotectants for mouse sperm cryopreservation.

Cryobiology. 41:28-39.

Wahjuningsih S, Hardjopranjoto S, Sumitro SB. 2010. Pengaruh konsentrasi

etilen glikol dan lama paparan terhadap tingkat fertilitas in vitro oosit sapi. J

Ked Hewan. 4(2):61-64.

Whittingham DG. 1971. Survival of mouse embryos after freezing and thawing.

Nature. 233:125-126.

Wolpert L, Tickle C, Arias AM. 2015. Principles of Development. Oxford (UK):

Oxford University Press.

14

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Pandeglang pada tanggal 01 Januari 1995. Riwayat

pendidikan antara lain menyelesaikan sekolah dasar sekolah dasar di SD Negeri

03 Cadasari, Pandeglang dari tahun 2000 hingga 2006, Kemudian penulis

melanjutkan ke sekolah menengah di SMP Negeri 1 Karang Tanjung, Pandeglang

dari tahun 2006 hingga 2009. Penulis melanjutkan pendidikan sekolah menengah

atas di SMA Negeri 2 Pandeglang dari tahun 2009 hingga 2012. Penulis diterima

sebagai mahasiswa Institut Pertanian Bogor di Fakultas Kedokteran Hewan

pada bulan Juni 2012 melalui jalur SNMPTN Undangan. Alamat tempat tinggal

saat ini yaitu di Wisma Baristar, Bara 6, Desa Babakan, Kecamatan Dramaga,

Kabupaten Bogor. Alamat asal penulis dari Desa Cadasari, Kecamatan Cadasari,

Kabupaten Pandeglang, Banten.

Selama kegiatan perkuliahan penulis aktif di beberapa organisasi, yaitu

Himpunan Minat Profesi Hewan Kecil dan Satwa Akuatik Eksotik (HKSA)

sekaligus anggota divisi Eksternal tahun 2013/2015, DPM FKH IPB tahun

2013/2014 sebagai ketua Komisi Satu.