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  • UNIVERSIDAD DE OVIEDO

    MASTER UNIVERSITARIO EN BIOTECNOLOGA

    ALIMENTARIA

    UTILIZACIN DE LA DGGE PARA LA

    CARACTERIZACIN DE LA

    MICROBIOTA ASOCIADA A LA

    MANZANA DE SIDRA

    TRABAJO FIN DE MASTER

    POR

    SERGIO ALONSO FERNNDEZ

    JULIO DE 2013

  • Utilizacin de la DGGE para la caracterizacin de la microbiota asociada a la manzana de sidra

    ii

    AGRADECIMIENTOS

    A mis tutores Baltasar Mayo y Mario Daz por su apoyo y paciencia; a Ana Beln

    Flrez, Luca Guadamuro y los trabajadores del IPLA por su amabilidad y por hacer

    ms agradable mi estancia en los laboratorios de Villaviciosa; a Amanda Laca por tener

    ms paciencia que el santo Job; a Daniel Serna, Jos Luis Martnez y el personal de los

    Servicios Cientfico Tcnicos del Severo Ochoa por su ayuda siempre que lo necesit; a

    Sal y el personal de los laboratorios de la Facultad de Qumicas por su amabilidad y

    sus buenos consejos; a mis compaeros de Mster por compartir buenos momentos

    entre clase y clase y en los laboratorios; a Luca Basco, Ana M Moreno y Marce

    Sanabria el tro de las Azores por el apoyo moral; a Patricia Cofio por su amistad

    durante mi estancia en Central Lechera Asturiana; a Rubn Lpez, Cristina Gutirrez,

    David Martnez y las hermanas Dez, por comprender mi azoramiento estos meses; a

    Jana, Vipo, Boy y Homer, la estirpe canina de la familia, por su leal compaa; a Olaya

    por sacar lo mejor de m a pesar de sus rabietas y berrenchines; a mis padres, familiares

    y amigos; y en definitiva, a todos cuantos me ayudaron, directa o indirectamente, a

    hacer posible este trabajo fin de mster. Gracies.

  • Utilizacin de la DGGE para la caracterizacin de la microbiota asociada a la manzana de sidra

    iii

    RESUMEN

    La fabricacin tradicional de sidra en el Principado de Asturias se realiza mediante una

    fermentacin espontnea del mosto de manzana recin prensado. Segn este proceso, la

    doble fermentacin que experimenta el mosto se lleva a cabo por la accin de la

    microbiota indgena: levaduras del gnero Saccharomyces en el caso de la fermentacin

    alcohlica y bacterias lcticas, principalmente de la Oenococcus oeni, en el caso de la

    fermentacin malolctica. La presencia de estos microorganismos en el mosto puede

    vincularse con la microbiota de la manzana y/o con los equipos y materiales de trabajo

    utilizados durante los procesos de molienda, prensado y macerado.

    En este trabajo se estudi la microbiota presente en la superficie de cinco variedades de

    manzana para analizar la diversidad microbiana de la fruta y su posible vnculo con la

    microbiota que participa en los procesos fermentativos de la sidra. Para ello, se extrajo

    el ADN microbiano total de la superficie de las manzanas estudiadas y se amplificaron

    por PCR especfico y de manera independiente las regiones V3 del gen que codifica el

    ARNr 16S de las bacterias y el dominio D1 del gen que codifica el ARNr 26S de los

    eucariotas. Los amplicones obtenidos se analizaron mediante DGGE, y con la finalidad

    de identificar las poblaciones que conforman los perfiles electroforticos, varias bandas

    de los geles se aislaron, se reamplificaron y se secuenciaron para comparar las

    secuencias resultantes con las bases de datos pblicas.

    Los perfiles de DGGE revelaron una elevada diversidad microbiana en la fruta (15-20

    bandas correspondientes a bacterias y 5-7 correspondientes a mohos y levaduras), con

    escasa variacin entre las cinco variedades estudiadas. La identificacin de las bandas

    revel la dominancia de enterobacterias de los gneros Escherichia y Shigella en el

    perfil procariota, y la presencia de hongos del gnero Exobasidium entre los eucariotas.

    Estas poblaciones mayoritarias detectadas por DGGE no parecen estar relacionadas con

    los procesos de fermentacin espontnea del mosto de manzana.

  • Utilizacin de la DGGE para la caracterizacin de la microbiota asociada a la manzana de sidra

    iv

    ABSTRACT

    Traditionally, the manufacturing of cider in Asturias is made by spontaneous

    fermentation of the freshly pressed apple juice. According to this process, the double

    fermentation of the apple juice is accomplished by the native microbiota:

    Saccharomyces yeasts, with takes over the alcoholic fermentation, and lactic acid

    bacteria species, mainly strains of Oenococcus oeni, which are responsible for the

    malolactic fermentation. The presence of these microorganisms in the apple juice can be

    linked to the apple ecology and/or to the equipment, tools and the production

    environment during the processes of crushing, pressing and mashing.

    In the present work, we studied the microbiota present to the surface of five apple

    varieties in order to analyze the microbial diversity of the fruit and its potential link to

    the microorganisms involved in the cider fermentation process. For this, total microbial

    DNA of the apple surface was extracted by repeated washing and used as a template in

    specific and independent PCR experiments to amplify the V3 region of the bacterial 16S

    rRNA gene and the D1 domain of the eukaryotic 26S rRNA gene. The amplicons

    obtained were analyzed with the DGGE technique, and some of the bands observed in

    the profiles were then isolated, reamplified, sequenced and the sequences compared

    with those in databases in order to identify the microbial populations giving raise to the

    electrophoretic profiles.

    The DGGE profiles showed a high microbial diversity in the original fruit, with 15-20

    bands and 5-7 bands corresponding to bacteria and yeasts and moulds, respectively.

    Little variation of the profiles was found among the five batches of apples studied.

    Identification of the bands showed the dominance of Enterobacteriaceae belonging to

    the genera Shigella and Escherichia, as well as the presence of fungi species of the

    genus Exobasidium. Among the dominant populations detected by DGGE, usual species

    associated with apple juices spontaneous fermentation were not identified.

  • Utilizacin de la DGGE para la caracterizacin de la microbiota asociada a la manzana de sidra

    v

    NDICE

    ABREVIATURAS.................................................................................................. vi

    LISTA DE FIGURAS.... vii

    LISTA DE TABLAS.. viii

    1. INTRODUCCIN..... 1

    1.1. Antecedentes........ 2

    1.2. Objetivo........ 4

    2. CONSIDERACIONES TERICAS.... 5

    2.1. La sidra en el mundo.... 6

    2.2. Elaboracin de la sidra natural. 8

    2.3. Microbiologa de la sidra. 11

    2.3.1. Levaduras. 12

    2.3.2. Bacterias lcticas.. 16

    2.3.3. Bacterias acticas. 18

    2.3.4. Otros gneros... 19

    2.4. Tcnicas de laboratorio 20

    2.4.1. Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)... 20

    2.4.2. Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE).. 22

    2.4.3. Secuenciacin de ADN.... 23

    3. METODOLOGA.......... 26

    3.1. Lixiviado de manzanas 27

    3.2. Extraccin de ADN.. 27

    3.3. PCR.. 28

    3.4. Electroforesis en gel de agarosa... 30

    3.5. DGGE.. 31

    3.6. Reamplificacin y purificacin de bandas... 33

    3.7. Secuenciacin.. 36

    4. RESULTADOS Y DISCUSIN... 37

    4.1. Perfiles de DGGE.... 38

    4.2. Resultados de la secuenciacin........ 40

    5. CONCLUSIONES. 44

    6. BIBLIOGRAFA 46

  • Utilizacin de la DGGE para la caracterizacin de la microbiota asociada a la manzana de sidra

    vi

    ABREVIATURAS

    A Adenina

    ADN cido desoxirribonucleico

    ADNc cido desoxirribonucleico complementario

    ARNr 16S cido ribonucleico ribosomal 16S

    APS Persulfato amnico

    BAL Bacterias del cido lctico o cido lcticas

    BrEt Bromuro de etidio

    C Citosina

    dNTP Desoxirribonucletido trifosfato

    DOP Denominacin de origen protegida

    EDTA cido etilendiaminotetraactico

    G Guanina

    g Gramo

    mL Mililitro

    mM Milimolar

    nM Nanomolar

    PCR Reaccin en cadena de la polimerasa

    pb Par de bases

    PME Pectn metilesterasa

    RFLP Polimorfismo de longitud de fragmento de restriccin

    T Timina

    TAE Tris-acetato EDTA

    TBE Tris-borato EDTA

    TEMED Tetrametil etilen-diamina

    ufc Unidad formadora de colonia

    V Voltio

    g Microgramo

    M Micromolar

    L Microlitro

  • Utilizacin de la DGGE para la caracterizacin de la microbiota asociada a la manzana de sidra

    vii

    LISTA DE FIGURAS

    Figura 1: Porcentaje de volumen de produccin de sidra en la UE..... 6

    Figura 1: Diagrama de flujo del proceso de elaboracin de sidra natural.... 8

    Figura 2: Perfil habitual de la evolucin de la microbiota dominante en el proceso

    de fabricacin de sidra natural en Asturias y en el Pas Vasco.... 13

    Figura 3: Esquema de las tres etapas cclicas de una PCR.. 21

    Figura 4: Diagrama de la secuenciacin de ADN por el mtodo de Sanger.... 25

    Figura 6: Estructura de los operones ribosomales en bacterias y levaduras 28

    Figura 7: Marcador GRS Universal Ladder. 30

    Figura 8: Visin parcial de un equipo DCode Universal Mutation Detection

    System.. 31

    Figura 9: Marcador Low DNA Mass Ladder .. 34

    Figura 10: Perfil DGGE de amplicones de la regin V3 del gen ARNr 16S en

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