universitas indonesia - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-s680-kombinasi...

59
UNIVERSITAS INDONESIA Kombinasi Metode Sonikasi, Pemanasan dan Fraksinasi Ammonium Sulfat untuk Ekstraksi Enzim Fosfolipase-A 2 dari Acanthaster planci SKRIPSI RESPATIPHALA ARDHA SATWIKA 0806368143 FAKULTAS TEKNIK UNIVERSITAS INDONESIA PROGRAM EKSTENSI DEPARTEMEN TEKNIK KIMIA DEPOK, NOVEMBER 2010 Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Upload: ngokhue

Post on 11-Jul-2018

233 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

UNIVERSITAS INDONESIA

Kombinasi Metode Sonikasi, Pemanasan dan Fraksinasi Ammonium

Sulfat untuk Ekstraksi Enzim Fosfolipase-A2 dari Acanthaster planci

SKRIPSI

RESPATIPHALA ARDHA SATWIKA

0806368143

FAKULTAS TEKNIK UNIVERSITAS INDONESIA

PROGRAM EKSTENSI

DEPARTEMEN TEKNIK KIMIA

DEPOK, NOVEMBER 2010

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 2: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

UNIVERSITAS INDONESIA

Kombinasi Metode Sonikasi, Pemanasan dan Fraksinasi Ammonium

Sulfat untuk Ekstraksi Enzim Fosfolipase-A2 dari Acanthaster planci

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana

RESPATIPHALA ARDHA SATWIKA

0806368143

FAKULTAS TEKNIK UNIVERSITAS INDONESIA

PROGRAM EKSTENSI

DEPARTEMEN TEKNIK KIMIA

DEPOK, NOVEMBER 2010

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 3: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

i

Universitas Indonesia

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

Skripsi ini adalah hasil karya sendiri,

dan semua sumber baik yang dikutip maupun dirujuk

telah saya nyatakan dengan benar

Nama : Respatiphala Ardha Satwika

NPM : 0806368143

Tanda Tangan :

Tanggal : 30 Desember 2010

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 4: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

ii

Universitas Indonesia

HALAMAN PENGESAHAN

Skripsi ini diajukan oleh :

Nama : Respatiphala Ardha Satwika

NPM : 0806368143

Program Studi : S1 Ekstensi

Judul Skripsi : Kombinasi Metode Sonikasi, Pemanasan dan Fraksinasi

Ammonium Sulfat untuk Ekstraksi Enzim Fosfolipase-A2

dari Acanthaster planci

Telah berhasil dipertahankan di hadapan Dewan Penguji dan diterima

sebagai bagian persyaratan yang diperlukan untuk memperoleh gelar

Sarjana Teknik pada Program Studi Ekstensi

Fakultas Teknik Kimia, Universitas Indonesia.

DEWAN PENGUJI

Pembimbing : Prof. Dr. Ir. Anondho Wijanarko, M.Eng. ( )

Pembimbing : Dr. Eng. Muhamad Sahlan, S.Si., M.Eng. ( )

Penguji : Dr. Ing. Ir. Misri Gozan, M.Tech ( )

Penguji : Ir. Dianursanti, MT ( )

Penguji : Dr. Eny Kusrini ( )

Ditetapkan di : Departemen Teknik Kimia

Tanggal : 6 Januari 2011

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 5: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

iii

Universitas Indonesia

KATA PENGANTAR

Puji syukur saya panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa, karen atas

berkat dan rahmat-Nya, saya dapat menyelesaikan skripsi ini. Penulisan skripsi ini

dilakukan dalam rangka memenuhi salah satu syarat untuk mencapai Gelar

Sarjana Teknik Kimia Jurusan Teknik Kimia pada Fakultas Teknik Universitas

Indonesia. Saya menyadari bahwa, tanpa bantuan dan bimbingan dari berbagai

pihak, dari masa perkuliahan sampai pada penyusunan skripsi ini, sangatlah sulit

bagi saya untuk menyelesaikan skripsi ini. Oleh karena itu, saya mengucapkan

terima kasih kepada :

1. Bapak Dr. Ir. Widodo Wahyu Purwanto, DEA, selaku ketua Departemen

Teknik Kimia FTUI.

2. Prof. Anondho Wijanarko, Dr. Muhamad Sahlan, dan Ibu Imelda atas

bimbingan yang telah diberikan.

3. Ibu Nunuk Widhyastuti, bu Kesi, Suri, Ninu, Neng, dan Mas Ugi yang telah

memberikan kesempatan untuk belajar lebih banyak di LIPI

4. Ayah dan Ibu yang sangat ingin penulis bahagiakan. Terima kasih atas

dukungan, kasih sayang, dan doa yang diberikan.

5. Dipank, Toni, dan Skripsi. Terimakasih untuk berbagi ilmu dan

kebersamaannya.

6. Teman-teman Ekstensi angkatan 2008 atas kebersamaan dan pertemanannya

selama ini.

7. Tim Riset Mikroalga, Biofilter, yang telah banyak mengajarkan mengenai

penelitian.

8. Pihak-pihak lain yang mendukung dan membantu yang tidak dapat disebutkan

satu persatu.

Akhir kata, saya berharap Tuhan Yang Maha Esa berkenan membalas segala

kebaikan semua pihak yang telah membantu. Semoga skripsi ini membawa

manfaat bagi pengembangan ilmu.

Depok, 30 Desember 2010

Penulis

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 6: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

iv

Universitas Indonesia

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI

TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademik Universitas Indonesia, saya yang bertanda tangan di

bawah ini :

Nama : Respatiphala Ardha Satwika

NPM : 0806368143

Program Studi : Ekstensi

Departemen : Teknik Kimia

Fakultas : Teknik

Jenis Karya : Skripsi

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, menyetujui untuk memberikan kepada

Universitas Indonesia Hak Bebas Royalti Nonekslusif (Non-exclusive Royalty

Free Right) atas karya ilmiah saya yang berjudul :

Kombinasi Metode Sonikasi, Pemanasan dan Fraksinasi Ammonium Sulfat

untuk Ekstraksi Enzim Fosfolipase-A2 dari Acanthaster planci

Beserta perangkat yang ada (jika diperlukan). Dengan Hak Bebas Royalti

Nonekslusif ini Universitas Indonesia berhak menyimpan, mengalihmedia/format-

kan, mengelola dalam bentuk pengkalan data (database), merawat, dan

memublikasikan tugas akhir saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai

penulis/pencipta dan sebagai pemilik Hak Cipta.

Demikian pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di : Depok

Pada Tanggal : 30 Desember 2010

Yang menyatakan

(Respatiphala Ardha Satwika)

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 7: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

v

Universitas Indonesia

ABSTRAK

Nama : Respatiphala Ardha Satwika

Program Studi : Ekstensi

Judul : Kombinasi Metode Sonikasi, Pemanasan dan Fraksinasi

Ammonium Sulfat untuk Ekstraksi Enzim Fosfolipase-A2 dari Acanthaster

planci

Sengatan duri bintang laut Acanthaster planci terbukti mempunyai

aktivitas biologi fosfolipase-A2 (PLA2), DNAse II (plancitoxin), dan peptida

antikoagulan (plancinin) yang mengakibatkan banyak aktivitas biologi merugikan

pada manusia seperti hemolitik, pembengkakan, myonocretic, pembentukan

edema dan aktivitas antikoagulan. Penelitian ini berhasil memurnikan enzim

fosfolipase-A2 pada spesimen duri A. planci sebanyak 50 gr dengan

menggunakan metode sonikasi, pemanasan dan fraksinasi ammonium sulfat.

Aktivitas PLA2 tertinggi terdapat pada fraksi pengendapan ammonium sulfat 20%

sebanyak 108,48 unit/mg dengan tingkat kemurnian 20 kali lebih besar dari crude

venom, telah dibuktikan bahwa metode ini memberikan tingkat pemurnian yang

sama dan lebih efisien jika dibandingkan dengan metode-metode yang digunakan

untuk memurnikan enzim pada umumnya.

Kata Kunci : Acanthaster planci, sonikasi, fosfolipase-A2, fraksinasi ammonium

sulfat

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 8: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

vi

Universitas Indonesia

ABSTRACT

Name : Respatiphala Ardha Satwika

Study Program : Extensions

Title : The Combination of Sonication, Heating and

Ammonium Sulfate Fractionation for Enzyme Phospholipase-A2 Extraction

from Acanthaster planci

The sting of Acanthaster planci thorns starfish shown to have biological

activity of phospholipase-A2 (PLA2), DNAse II (plancitoxin), and anticoagulant

peptide (plancinin) which resulted in many adverse biological activity in humans,

such as hemolytic, swelling, myonocretic, edema formation and anticoagulant

activity. This study succeeded in purifying the enzyme phospholipase-A2 in thorns

of A. planci specimens 50 gr by using a simple heating method and the

precipitation of ammonium sulphate fractionation. The highest PLA2 activity

present in ammonium sulphate precipitation fraction of 20% of 108.48 units/mg

with a purity level of 20.75 times greater than the crude venom, it’s proven that

this method provides the same level of purification and more efficient than the

methods used to purify the enzyme in general.

Keyword : Acanthaster planci, sonication, phospholipase-A2, ammonium sulphate

fractination.

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 9: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

vii

Universitas Indonesia

DAFTAR ISI

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ................................................... i

HALAMAN PENGESAHAN .............................................................................. ii

KATA PENGANTAR ........................................................................................ iii

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS AKHIR

UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS ............................................................ iv

ABSTRAK .......................................................................................................... v

ABSTRACT ....................................................................................................... vi

DAFTAR ISI ..................................................................................................... vii

DAFTAR TABEL .............................................................................................. ix

BAB I PENDAHULUAN .................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang Penelitian ...................................................................... 1

1.2 Perumusan Masalah ............................................................................... 2

1.3 Tujuan Penelitian ................................................................................... 2

1.4 Batasan Masalah .................................................................................... 2

1.5 Sistematika Penulisan ............................................................................ 3

BAB II TINJAUAN PUSTAKA .......................................................................... 4

2.1 State Of The Arts ................................................................................... 6

2.2 Prinsip Dasar Isolasi Protein ................................................................ 10

2.3 Teknik-Teknik Isolasi Protein .............................................................. 10

2.4 Sodium Dodesil Sulfat-Gel Poliakrilamid (SDS-PAGE)....................... 16

2.5 Fosfolipase-A2 ..................................................................................... 18

2.6 Uji Aktivitas Fosfolipase-A2 ................................................................ 18

2.7 Uji Aktivitas Kaseinolitik .................................................................... 19

2.8 Uji Kadar Protein Lowry ...................................................................... 19

BAB III METODE PENELITIAN ..................................................................... 21

3.1 Preparasi Sampel Protein Enzim .......................................................... 21

3.2 Fraksinasi Ammonium Sulfat ............................................................... 23

3.3 Uji Aktivitas Kaseinolitik .................................................................... 23

3.4 Uji Aktivitas Fosfolipase-A2 ................................................................ 24

3.5 Penentuan Kadar Protein Metode Lowry .............................................. 24

3.6 Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrilamide Gel Electrophoresis (SDS-

PAGE) ........................................................................................................... 25

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 10: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

viii

Universitas Indonesia

3.7 Bahan dan Alat .................................................................................... 26

BAB IV PEMBAHASAN .................................................................................. 29

4.1 Hasil Preparasi Enzim dan Pemanasan ................................................. 29

4.2 Hasil Uji Aktivitas Antikoagulan ......................................................... 30

4.3 Hasil Fraksinasi Ammonium Sulfat...................................................... 31

4.4 Hasil Uji Aktivitas Kaseinolitik ........................................................... 32

4.5 Hasil Uji Aktivitas Fosfolipase-A2 (PLA2) ........................................... 33

4.6 Hasil Uji SDS-PAGE ........................................................................... 36

BAB V KESIMPULAN ..................................................................................... 39

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 41

LAMPIRAN A .................................................................................................. 44

Penentuan Kadar Protein Metode Lowry ............................................................ 44

Tabel Kurva Standar ...................................................................................... 44

Gambar Kurva Standar Protein BSA .............................................................. 44

Penentuan Kadar Protein Sampel ................................................................... 44

Tabel Kadar Protein Enzim ............................................................................ 45

LAMPIRAN B ................................................................................................... 46

Penentuan Aktivitas Spesifik PLA2 .................................................................... 46

Unit (abs/menit) ............................................................................................. 46

Aktivitas Enzim (unit/ml) ............................................................................... 46

Unit Total (unit) ............................................................................................. 46

Jumlah Protein Total (mg) .............................................................................. 46

Aktivitas Spesifik (unit/mg) ........................................................................... 46

Tingkat Kemurnian Enzim ............................................................................. 47

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 11: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

ix

Universitas Indonesia

DAFTAR TABEL

Tabel 2. STATE OF THE ARTS 6

Tabel 4.1 Aktivitas Spesifik PLA2 32

Tabel 4.2 Hasil Pemurnian PLA2 Penelitian Kazuo Shiomi 34

Tabel 4.3 Hasil Pemurnian PLA2 Racun Bintang Laut Plazaster borealis 35

Tabel 4.4 Hasil pemurnian PLA2 Racun Echis ocellatus 35

Tabel 4.5 Hasil pemurnian PLA2 Racun Echis ocellatus 36

Tabel 4.6 Hasil Pemurnian PLA2 Racun Kobra India Timur (Naja naja) 36

Tabel Kurva Standar 44

Tabel Kadar Protein Enzim 45

TABEL HASIL PEMURNIAN ENZIM 48

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 12: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

1

Universitas Indonesia

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Penelitian

Bintang laut Acanthaster planci (crown-of-thorns) berhabitat di perairan

tropis dan subtropis memangsa polip karang, sehingga merusak terumbu karang.

Bintang laut ini juga diketahui mempunyai sejumlah duri beracun di atas

permukaan tubuhnya. Ketika disengat oleh duri, variasi gejala patologikal seperti

perih, memar, bengkak dan muntah dapat terjadi. Racun kasar yang diekstrak dari

duri memperlihatkan aktivitas biologis yang beragam: kematian pada tikus,

aktivitas hemolitik, aktivitas myonecrotic, aktivitas hemorrhagic, peningkatan

aktivitas permeabilitas kapiler, aktivitas pembentukan edema, aktivitas

fosfolipase-A2 (PLA2) (Shiomi et al., 1985), aktivitas pelepasan histamin dari sel

(Shiomi et al., 1989), dan aktivitas antikoagulan (Karasudani et al., 1996).

Dengan aktivitas biologi sebanyak itu dapat memberikan kontribusi besar

terhadap dunia kedokteran. Aktivitas fosfolipase-A2 dan antikoagulan menjadi ciri

khas racun A. planci, jika dikaitkan dalam dunia kedokteran berhubungan dengan

penyakit jantung koroner, atrosklerosis, zamtomatosis, dan pankreatitis

dikarenakan peningkatan metabolisme lipid, peningkatan kadar lipid atau

hiperlipidemia. Kolesterol, ester kolesterol, trigliserida dan fosfolipid merupakan

lipid utama yang terdapat dalam darah dan khususnya fosfolipid sebagai bahan

penyusun membran sel. Dari hasil penelitian secara kualitatif telah ditunjukan

bahwa jenis fosfolipid membran eritrosit penderita hiperlipidemia tidak berbeda

dari fosfolipid membran eritrosit normal, sedangkan dari hasil analisis kuantitatif

dengan pengolahan data statistik diperoleh peningkatan kadar fosfatidilkolin dan

fosfatidiletanolamin.

Maka dari itu tujuan penelitian ini adalah mengekstrak protein enzim

fosfolipase-A2 dari duri A. planci menggunakan metode sederhana dengan cara

sonikasi, pemanasan dan fraksinasi ammonium sulfat. Pemurnian (pemekatan)

protein menggunakan ammonium sulfat adalah metode yang sering digunakan

karena memiliki daya larut tinggi di dalam air, relatif murah, dan kestabilan

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 13: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

2

Universitas Indonesia

protein di dalam larutan ammonium sulfat (2 M – 3 M) tahan bertahun-tahun.

Pemilihan ammonium sulfat didasarkan pada kelarutan protein yang berinteraksi

polar dengan molekul air, interaksi ionik protein dengan garam dan daya tolak

menolak protein yang bermuatan sama. Kelarutan protein (pada pH dan

temperatur tertentu) meningkat pada kenaikan konsentrasi garam (salting in).

Kenaikan kelarutan protein akan meningkatkan kekuatan ion larutan. Pada

penambahan garam dengan konsentrasi tertentu kelarutan protein menurun

(salting out). Molekul air yang berikatan dengan ion-ion garam semakin banyak

yang menyebabkan penarikan selubung air yang mengelilingi permukaan protein

sehingga mengakibatkan protein saling berinteraksi, beragregasi, dan kemudian

mengendap.

Sampel protein yang telah hilang kelarutannya kemudian diendapkan dari

suspensinya dengan cara sentrifugasi refrigerasi. Fraksinasi dilakukan pada 20%,

40%, 60%, 80% dan 100%. Lalu setiap fraksi diuji aktivitasnya untuk diketahui

aktivitas dari fosfolipase-A2 yang tertinggi. Identifikasi enzim menggunakan

SDS-PAGE. Kontrol positif metode ini menggunakan enzim papain yang diambil

dari lateks pepaya dan diuji aktivitas kaseinolitiknya.

1.2 Perumusan Masalah

Fokus pada penelitian ini adalah apakah dengan metode sonikasi,

pemanasan dan fraksinasi ammonium sulfat bisa didapatkan enzim fosfolipase-A2.

1.3 Tujuan Penelitian

Tujuan utama penelitian ini untuk mengetahui jumlah PLA2 yang bisa

didapatkan dengan fraksinasi ammonium sulfat.

1.4 Batasan Masalah

Batasan masalah yang dibahas pada penelitian ini mencakup sebagai

berikut.

1. Specimen bintang laut yang dipakai adalah Acantaster planci.

2. Target enzim protein yang diinginkan adalah fosfolipase-A2.

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 14: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

3

Universitas Indonesia

3. Metode pemisahan protein yang dipakai adalah metode sonikasi, pemanasan

dan ammonium sulfat.

4. Pemisahan enzim protease dari papain dengan metode yang sama digunakan

sebagai kontrol positif dalam penelitian ini.

5. Identifikasi enzim protein menggunakan SDS-PAGE.

6. Uji aktivitas untuk enzim protease menggunakan metode kaseinolitik (metode

Anson).

7. Uji aktivitas untuk enzim fosfolipase menggunakan metode Marinetti (1965).

8. Penentuan kadar protein menggunakan metode Lowry.

1.5 Sistematika Penulisan

Sistematika penulisan yang digunakan dalam penulisan penelitian ini

adalah sebagai berikut :

BAB I. PENDAHULUAN

Bab ini terdiri dari latar belakang masalah, rumusan masalah, tujuan

penelitian, batasan masalah, dan sistematika penulisan.

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA

Tinjauan Pustaka berisi ulasan tentang Acanthaster planci, fosfolipase-A2,

pemisahan protein dan uji aktivitas protein.

BAB III. METODE PENELITIAN

Metode penelitian berisi diagram alir penelitian, prosedur penelitian, alat

dan bahan yang dipakai.

BAB IV. PEMBAHASAN

Menyajikan data hasil pengamatan dan pembahasannya.

BAB V. KESIMPULAN

Berisi kesimpulan dari penelitian yang telah dilakukan berdasarkan data

yang selama ini diperoleh.

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 15: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

4

Universitas Indonesia

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Bintang laut Acanthaser planci (Crown of Thorns) adalah corallivore

(pemangsa terumbu karang) dimana kehadirannya dalam jumlah besar dapat

menghancurkan ekosistem terumbu karang. Seperti bintang laut pada umumnya,

A. planci mampu mengeluarkan perutnya yang berlipat untuk mencerna

mangsanya diluar. Metode pencernaan ini bisa membuat bintang laut ini mencerna

karang dengan area luas dalam waktu relatif singkat. Torehan luka berwarna

putih-lah yang tersisa ketika karang telah dimangsa oleh A. planci. Luka bekas

mangsa ini tak pernah kembali dan pada kebanyakan kasus ditumbuhi oleh alga.

Fenomena ini mampu memanipulasi ekosistem dengan mengurangi spesies dan

kekayaan spesies karang dan menyediakan ruang bagi alga untuk berkembang

(Porter et al, 1972). Di lain pihak mengurangi habitat untuk kebanyakan spesies

terumbu karang dan dampak negatif sistem terumbu karang.

Makanan utama A. planci adalah scleractinian atau karang pembentuk

terumbu, sering juga selain makanan utamanya tersebut dia juga memangsa

spesies yang bertumbuh cepat seperti Acropora spp. dan Montipora (De’ath dan

Moran, 1997). Ketika A. planci telah diketahui salah satunya memangsa

Pocillopora spp., spesies karang ini bukan mangsa yang umum seperti karang

yang lain dengan ukuran dan rugositas yang sama. Ini dikarenakan sebagian besar

adanya simbiosis dengan invertebrata yang akan melindungi karang dari A. planci

(Pratchett, 2001). Studi tahun 2001 yang dilakukan oleh Morgan Pratchett

menemukan kepiting Trapezia dan spesies Tetralia cukup efektif melindungi

karang, sehingga A. planci berpindah ke karang yang lain, keseringan karang yang

kurang disukainya untuk mencegah dirinya dari bahaya. Ketika simbiosis dengan

karang berakhir, A. planci akan memangsa karang tersebut tanpa ragu (Pratchett,

2001).

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 16: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

5

Universitas Indonesia

Gambar 2.1 Acanthaster planci

A. planci adalah satu-satunya bintang laut beracun, racun A. planci

terdapat pada durinya. Penusukan oleh duri A. planci menyebabkan gejala

menyakitkan pada manusia seperti luka yang sangat perih, kulit merah dan

pembengkakan. Racun diperkirakan diproduksi oleh sel asidofili pada epidermis

duri. Telah ditemukan bahwa racun dari A. planci itu tersebut adalah enzim

protein phosphatidylcholine 2-acylhydrolase 2 atau sering disebut phospholipase-

A2 (www.uniprot.org/uniprot/Q3C2C1) dan Dnase II.

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 17: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

6

Universitas Indonesia

2.1 State Of The Arts

Tabel 2. STATE OF THE ARTS

Peneliti (tahun) Topik Penelitian Hasil Penelitian

Shiomi (1984) Aktivitas biologi racun duri A.

planci

Racun ditemukan

mematikan pada LD50 2,7

mg/kg

Karasudani

(1995)

Aktivitas kontraksi otot dan

peningkatan permeabilitas

vaskular racun A. planci

Penyebab aktivitas kontraski

otot dan peningkatan

permeabilitas disebabkan

fosfolipase

Shiomi (1997) Pemurnian dan karakterisasi

fosfolipase-A2 racun A. planci

Properti dan karakterisasi

PLA 2 didapatkan

Koyama (1998) Situs aktif antikoagulan racun A.

planci

Situs antikoagulan terletak

pada langkah aktivasi

protrombin

Shiomi (2004) Pemurnian plancitoxin sebagai

DNAse II pada racun A. planci

Plancitoxin sebagai faktor

mematikan pada racun

merupakan DNAse II

Ota (2005) Pengkloningan molekul racun

fosfolipase-A2 A. planci

Dua jenis PLA2 berhasil

dikloning

Ota (2006) Aktivitas hepatotoksisitas dari

plancitoxin I pada racun A. planci

Plancitoxin I mampu

memasuki nukleus dan

merusaknya

Pada penelitian (Shiomi et al., 1997) tentang pemurnian fosfolipase-A2

dari A. planci menyebutkan dua fosfolipase-A (AP-PLA2-I dan II) dimurnikan

dari racun. Kedua enzim tersebut telah dipastikan merupakan fosfolipase-A2

berdasarkan hasil yang menunjukkan aktivitas hemolitik hanya dengan kehadiran

fosfatidilkolin dan juga melepaskan asam lemak fluoresens dari fosfatidilkolin

pada posisi sn-2. PLA2 mempunyai massa molekul sebesar 12 kDa dengan gel

filtrasi atau 15 kDa dengan SDS-PAGE. Aktivitas enzim meningkat 180% dengan

adanya Ca2+

tetapi berkurang 10-20% dengan adanya Cu2+

dan Zn2+

. Pemurnian

dilakukan dengan dialisis menggunakan fosfat bufer pH 7 lalu diaplikasikan ke

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 18: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

7

Universitas Indonesia

dalam kolom CM-cellulose (2 x 48; Brown, Berlin, U.S.A.). Fraksi yang aktif

diendapkan dengan ammonium sulfat hingga 80% konsentrasi akhir, lalu

dimasukkan ke dalam kolom Phenyl Sepharose CL-4B (2 x 40 cm; Pharmacia,

Uppsala, Sweden). Pengukuran protein menggunakan metode Lowry,

menggunakan bovine serum albumin sebagai standar.

Telah ditemukan ada suatu peptida baru yang berfungsi sebagai

antikoagulan yang dinamakan plancinin (Karasudani et al., 1996). Plancinin

memperpanjang waktu aktivasi tromboplastin dan protrombin tetapi tidak

memperpanjang waktu trombin untuk terbentuk. Hasil mengindikaskan aksi situs

antikoagulan berlokasi pada faktor II dan X langkah aktivasi dengan kompleks

koagulan darah. Pada penelitian situs aktif plancinin (Koyama et al, 1998),

plancinin dimurnikan dengan kolom DEAE selulosa (Nacalai tesqua, Kyoto,

Japan). Dipekatkan dengan ultrafiltrasi (Amicon 10, Japan Grace, Tokyo, Japan)

menggunakan gas nitrogen lalu diaplikasikan menggunakan kolom Sephadex G-

50 (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden). Analisis peptida

menggunakan SDS-PAGE, dan pengukuran kandungan menggunakan metode

Lowry. Semua prosedur pemurnian dilakukan di dalam chromatochamber pada

4oC.

Pengkloningan molekul pernah dilakukan (Ota et al., 2005) terhadap racun

PLA2 dari A. planci. Pengkloningan ini dimaksudkan untuk mengetahui lokasi

aksi racun-racun tersebut pada level molekul. Pemurniannya dilakukan dengan

kombinasi kromatografi hidrofobik, gel filtrasi dan reverse phase HPLC. Protein

diukur dengan menggunakan metode Lowry.

Aktivitas biologi dari ekstrak kasar racun A. planci pernah dilakukan

(Shiomi et al., 1984). Racun kasar diekstrak dari duri dan diuji aktivitasnya.

Aktivitas hemolitik terjadi terhadap eritrosit hewan tanpa adanya lesitin, aktivitas

lebih tinggi terjadi diketahui dengan adanya kehadiran lecitin, membuktikan racun

mengandung faktor hemolitik secara langsung dan tidak langsung, yaitu

fosfolipase A yang bisa mengubah lesitin menjadi lysolesitin yang mempunyai

aktivitas hemolitik. Racun mematikan untuk tikus ketika disuntikan pada dosis

LD50 2,7 mg/kg, kecepatan dari gejala tergantung dari jumlah dosis.

Pengekstrakan dilakukan dengan cara homogenisasi dengan fosfat bufer, dan

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 19: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

8

Universitas Indonesia

pengukuran kadar protein diukur dengan metode Lowry dengan bovine serum

albumin sebagai standar.

Racun pada duri A. planci menyebabkan kontraksi pada uterus tikus dan

menaikkan permeabilitas vaskular pada kelinci (Karasudani et al., 1995). Hasil ini

menyimpulkan aksi kontraksi uterus disebabkan oleh prostaglandin sebagai

mediator dan sebagian dikontribusi oleh aktivitas fosfolipase pada racun.

Preparasi racun dari duri A. planci menggunakan Polytron homogeniser dengan

fosfat bufer pH 7.0 dan disentrifugasi 4000xg selama 30 menit, lalu diendapkan

menggunakan ammonium sulfat 50%, supernatan dinamakan venom A dan

endapan dinamakan venom B, endapan didialisis menggunakan air dan digunakan

sebagai percobaan biologi.

Penelitian ditemukannya DNAse II (Shiomi et al., 2004) menjelaskan

tentang adanya dua faktor mematikan (plancitoxins I dan II) dengan LD50 yang

sama dari 140 mg/kg yang dimurnikan dari duri bintang laut A. planci. Injeksi

dosis sublethal plancitoxin I atau II ke tikus menunjukan peningkatan kadar serum

glutamic oxaloacetic transaminase dan glutamic pyruvic transaminase, hal

tersebut berarti bahwa kedua racun tersebut berpotensi hepatotoxic. Analisis

dengan SDS-PAGE menunjukkan bahwa kedua plancitoxins terdiri dari dua

subunit (a-subunit 10 kDa dan b-subunit 27 kDa) yang dijembatani oleh ikatan

disulfida. Berdasarkan N-terminal sekuen asam amino ditentukan a-dan b-subunit.

Alfa-Subunit (92 residu asam amino) dan beta-subunit (240 residu) yang

dikodekan dalam urutan oleh cDNA yang sama. Menariknya, sekuens asam amino

menyimpulkan bahwa plancitoxin ini menunjukkan homologi 40-42 % dengan

deoxyribonucleases mamalia II (Dnases II). Selain itu, plancitoxin menunjukkan

aktivitas DNA merendah pada pH optimum 7,2. Plancitoxin I merupakan contoh

pertama dari Dnases II.

Prosedur pemurnian dalam penelitian ini dilakukan dengan cara

mengumpulkan 100 gram duri dari tiga spesimen A. planci. Kemudian duri

tersebut diekstraksi dua kali dengan dua volume sebesar 0,01 M buffer fosfat (pH

7,0). Crude toxin tersebut didialisis dengan buffer yang sama. Kolom dicuci

bersih dengan buffer yang sama untuk menghilangkan protein unadsorbed dan

kemudian dielusi dengan sekitar 40 ml/jam. Toksin yang mengandung fraksi

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 20: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

9

Universitas Indonesia

dikumpulkan, didialisis terhadap air suling dan lyophilized. Bahan kering

dilarutkan dalam 10 ml 0,01 M buffer fosfat (pH 6,0) dan dilakukan kromatografi

protein FPLC pada SHR5 aMono / 5 kolom (0,5 5 cm; Amersham Pharmacia,

Buckinghamshire, Inggris). Kolom dielusi dengan NaCl gradien linier (0,0-0,3

Min 60 menit) dalam buffer yang sama dengan laju alir 1 ml / menit. Dua fraksi

beracun sesuai dengan plancitoxins I dan II secara individual dikumpulkan dan

digunakan untuk penentuan aktivitas biologis tertentu.1,0 M NaCl dalam

buffer. 10 ml fraksi dikumpulkan pada laju alir. Hasil penelitian ini

menyimpulkan bahwa setelah dianalisis dengan SDS-PAGE, plancitoxins

memberikan sebuah band tunggal yang menunjukkan homogenitas

mereka. Homogenitas dari plancitoxins dimurnikan lebih lanjut didukung oleh

HPLC pada TSKgel ODS-120T, di mana setiap persiapan plancitoxin muncul di

puncak tunggal.

Uji toksisitas Plancitoxin I sebagai faktor mematikan utama (Ota et al.,

2006) dari bintang laut A. planci, cukup unik bukan hanya dalam menunjukkan

potensi hepatotoksisitas tapi juga dalam urutan homologi dengan

deoxyribonulease II mamalia. Dalam penelitian ini, perubahan morfologi dan

biokimia dalam sel hati tikus epitel (TRL 1215 sel) diamati kemudian diperiksa

untuk memahami mekanisme plancitoxin I yang bersifat hepatotoksisitas.

AlamarBlue assay menetapkan bahwa plancitoxin I bersifat cytolethal untuk TRL

1215 sel. Apoptosis diamati terbukti menjadi independen dari caskade caspase 3

yang umumnya diterima sebagai efektor dari proses apoptosis. Percobaan

menggunakan FITC-plancitoxin I membuktikan bahwa racun bisa masuk ke inti

sel TRL 1215. Prosedur penelitian ini dilakukan dengan cara Plancitoxin I

dimurnikan dari punggung A. planci oleh kombinasi kromatografi kolom CM-

selulosa dan fast protein liquid chromatography pada Mono S. Hasil penelitian

kami menunjukkan bahwa plancitoxin I menginduksi apoptosis sel TRL 1215

melalui prosedur berikut: mengikat ke reseptor khusus di membran sitoplasma,

masuk sel, memasuki inti dan DNA merendahkan.

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 21: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

10

Universitas Indonesia

2.2 Prinsip Dasar Isolasi Protein

Protein merupakan kelompok biomakromolekul yang sangat heterogen.

Ketika berada di luar makhluk hidup atau sel, protein sangat tidak stabil. Untuk

mempertahankan fungsi dan strukturnya, setiap jenis protein membutuhkan

kondisi tertentu ketika diekstraksi dari normal biological milieu. Protein yang

diekstraksi hendaknya dihindarkan dari proteolisis atau dipertahankan aktivitas

enzimatiknya. Untuk menganalisa protein yang ada di dalam sel tersebut,

diperlukan prosedur fraksinasi sel yaitu (1)memisahkan sel dari jaringannya,

(2)menghancurkan membran sel untuk mengambil kandungan sitoplasma dan

organelnya serta (3)memisahkan organel-organel dan molekul penyusunnya.

Prosedur (1) dan (2) dinamakan homogenasi dapat dilakukan dengan

menggunakan alat yang paling sederhana seperti homogeniser atau mortal sampai

alat yang paling mutakhir seperti pemakaian vibrasi dan sonikasi tergantung pada

bahan yang akan dihomogenasi. Prosedur (3) dilakukan dengan menggunakan

sentrifus dengan kecepatan dan lama sentrifugasi tertentu. Sebagian besar protein

merupakan molekul yang mudah rusak bila tidak berada pada kondisi

fisiologisnya. Karena itu, untuk mempertahankan struktur dan fungsi protein,

fraksinasi dilakukan pada suhu rendah (0-4oC) dalam buffer dan pH tertentu

(tergantung dari jenis protein yang akan dianalisa).

Beberapa teknik analisa protein membutuhkan prosedur isolasi yaitu

memisahkan protein dari makromolekul yang lain atau memisahkan protein

dengan sifat tertentu dari protein lain yang tidak diinginkan dalam analisa. Suatu

teknik isolasi dan identifikasi protein harus mempertimbangkan sifat-sifat fisik,

kimiawi dan kelistrikan suatu protein sedemikian rupa sehingga konformasi dan

aktivitasnya tidak berubah. Pada tahap awal isolasi, biasanya digunakan metode

yang memiliki daya pemisah terendah seperti pengendapan dengan ammonium

sulfat. Pengendapan ini dipengaruhi oleh berbagai faktor antara lain jumlah dan

posisi gugus polar, berat molekul, pH dan temperatur larutan.

2.3 Teknik-Teknik Isolasi Protein

2.3.1 Pemanasan Protein

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 22: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

11

Universitas Indonesia

Protein-protein dalam suatu organisme memiliki tingkat kestabilan

terhadap suhu dan pH yang berbeda-beda. Ada protein-protein yang stabil

pada suhu tinggi seperti protein-protein dalam bakteri termofilik dan ada

pula yang mudah rusak akibat pemanasan. Perbedaan tingkat kestabilan

suatu protein ditentukan oleh urutan asam amino-asam amino penyusun

protein dan interaksi-interaksi intramolekulnya. Fungsi suatu enzim akan

dipertahankan selama struktur protein globular tidak berubah. Ada tiga

jenis interaksi non kovalen yang berhubungan dengan tingkat kestabilan

struktur protein tersier (Lehninger, 1977). Pertama, yaitu ikatan hidrogen

antara gugus-gugus rantai samping residu asam amino pada simpul yang

berdekatan di dalam rantai. Kedua, yaitu gaya tarik menarik ionik antara

gugus-gugus rantai samping yang muatannya berlawanan. Yang ketiga,

yaitu interaksi hidrofobik. Gugus-gugus rantai hidrofobik dari beberapa

residu asam amino menghindari lingkungan air dan cenderung untuk

berkelompok bersama-sama di bagian dalam struktur globular yang

terlindung dari air. Interaksi-interaksi hidrofob tersebut akan melipat

molekul protein membentuk struktur yang paling stabil dengan energi

bebas yang paling kecil. Jika suatu protein yang tidak tahan panas berada

dalam lingkungan yang suhunya tinggi, maka lipatan protein yang

hidrofobik akan membuka (terdenaturasi). Protein-protein yang telah

mengalami pembukaan lipatan akan saling berinteraksi satu sama lain

membentuk suatu agregat dan akhirnya akan mengendap.

Fosfolipase-A2 merupakan enzim yang tahan panas stabil sampai

suhu 75oC dalam waktu inkubasi 5 menit (Karasudani et al,.1995). atas

dasar ini maka enzim fosfolipase-A2 bisa dimurnikan menggunakan teknik

pemanasan pada suhu 60oC.

2.3.2 Sonikasi

Kebanyakan molekul protein berada dalam sel, dan kemungkinan

besar terdapat di dalam organel pada sel, dan pada kasus ini membuka sel

dan organel dibutuhkan. Sonikasi frekuensi tinggi adalah metode yang

banyak digunakan untuk menghancurkan sel dan organel. Aplikasi

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 23: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

12

Universitas Indonesia

gelombang suara frekuensi tinggi adalah metode yang efektif untuk

merusak sel yang bisa diaplikasikan ke mikroorganisme. Mekanismenya

melibatkan microcavitation yang menghasilkan perbedaan tekanan yang

akan merusak dinding sel. Efisiensi perusakan sel dipengaruhi oleh

kekuatan yang dipakai pada instrument, durasi pemaparan dan volume

material proses. Pendinginan dibutuhkan untuk mencegah peningkatan

panas (Koelman, 2005).

2.3.3 Fraksinasi Ammonium Sulfat

Fraksinasi tergolong ke dalam metode pemurnian yang telah lama

digunakan. Cara ini mudah dan cukup efektif dalam memisahkan

campuran protein ekstrak kasar. Fraksinasi dilakukan atas dasar perbedaan

kelarutan protein-protein di dalam campuran. Garam netral, seperti

(NH4)2SO4, ditambahkan ke dalam larutan protein dalam jumlah tertentu.

Pengaruh garam netral terhadap kelarutan protein merupakan fungsi dari

kekuatan ioniknya, suatu ukuran konsentrasi dan jumlah muatan listrik

sumbangan kation dan anion garam. Efek salting-in disebabkan oleh

kecenderungan perubahan gugus-gugus rantai samping dalam protein yang

terdisosiasi untuk mengion. Tetapi bila kekuatan ionik meningkat lebih

lanjut, kelarutan protein mulai menurun. Pada kekuatan ionik yang cukup

tinggi, protein akan mengendap dengan sempurna (salting-out). Garam

pada konsentrasi tinggi menarik molekul air di permukaan molekul protein

sehingga mengurangi kelarutan protein tersebut (Deutscher, 1990).

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 24: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

13

Universitas Indonesia

Gambar 2.2 Grafik Hubungan Konsentrasi Garam dengan Kelarutan

(Koelman, 2005)

2.3.4 Dialisis

Protein globular dalam larutan dengan mudah dapat dipisahkan

dari zat terlarut yang berbobot molekul kecil (misalnya garam) dengan

menggunakan cara dialisis. Membran semipermiabel (tabung dialisis yang

biasanya terbuat dari selofan) digunakan untuk menahan molekul-molekul

protein, sedangkan molekul terlarut kecil (seperti glukosa dan (NH4)2SO4)

dan air dibiarkan lewat. Proses dialisis dikendalikan oleh perbedaan

konsentrasi terlarut dalam kedua sisi yang dipisahkan membran. Setelah

kesetimbangan konsentrasi tercapai, proses difusi zat terlarut menembus

membran menjadi setimbang. Penggantian molekul garam dengan air atau

bufer berkekuatan ion rendah dari luar membran menyebabkan konsentrasi

molekul terlarut kecil di dalam larutan protein berkurang.

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 25: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

14

Universitas Indonesia

Gambar 2.3 Proses Dialisis

(Koelman, 2005)

2.3.5 Gel Filtrasi

Gel filtrasi dilakukan menggunakan butiran berpori. Kolom yang

dibangun dengan butiran tersebut akan mempunyai dua pengukuran

volume cairan, volume eksternal, yaitu cairan diantara pori, dan volume

internal, yaitu cairan yang berada diantara pori-pori butiran. Molekul besar

hanya melewati volume eksternal ketika molekul kecil melewati volume

internal dan eksternal. Campuran protein dilewatkan melalui bagian atas

kolom gel filtrasi dan dibiarkan perkolasi melewati kolom. Yang

terpenting pada gel filtrasi adalah diameter pori yang dapat memasuki

volume internal dan diameter hidrodinamik molekul protein. Protein yang

mempunyai diameter hidrodinamik kecil yang sama dengan diameter rata-

rata pori-pori butiran akan memasuki volume internal dan akan menjadi

bagian matriks gel. Protein yang mempunyai diameter hidrodinamik besar

tidak akan memasuki volume internal dan akan keluar dari kolom

(Deutscher, 1990).

2.3.6 Kromatografi Penukar Ion

Teknik ini menggunakan zeolitas, resin organik atau anorganik

sebagai penukar ion. Senyawaan yang mempunyai ion-ion dengan

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 26: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

15

Universitas Indonesia

afinitas yang berbeda terhadap resin yang digunakan dapat dipisahkan.

Kromatografi pertukaran ion (ion-exchange chromatography) biasa

digukanan untuk pemurnian materi biologis, seperti asam amino, peptida,

protein. Metode ini dapat dilakukan dalam dua tipe, yaitu dalam kolom

maupun ruang datar (planar). Terdapat dua tipe pertukaran ion, yaitu

pertukaran kation (cation exchange) dan pertukaran anion (anion

exchange).

Pada pertukaran kation, fase stasioner bermuatan negatif;

sedangkan pada pertukaran anion, fase stasioner bermuatan positif.

Molekul bermuatan yang berada pada fase cair akan melewati kolom.Jika

muatan pada molekul sama dengan kolom, maka molekul tersebut akan

terelusi. Namun jika muatan pada molekul tidak sama dengan kolom,

maka molekul tersebut akan membentuk ikatan ionik dengan kolom.Untuk

mengelusi molekul yang menempel pada kolom diperlukan penambahan

larutan dengan pH dan kekuatan ionik tertentu (Deutscher, 1990).

2.3.7 Ultrafiltrasi

Ultrafiltrasi adalah variasi dari membran filtrasi dimana tekanan

hidrostatis mendorong cairan melewati membran semipermeabel. Endapan

padat dan campuran dengan berat molekul besar tertahan, sedangkan air

dan campuran dengan berat molekul kecil melewati membran. Proses

pemisahan ini digunakan pada industri dan penelitian untuk memurnikan

dan memekatkan campuran molekul makro (103 – 10

6 Da), terutama untuk

campuran protein. Ultrafiltrasi tidak jauh berbeda dari mikrofiltrasi,

nanofiltrasi, kecuali dalam ukuran molekul yang tertahan (Deutscher,

1990).

2.3.8 Ekstraksi pelarut

Penyarian zat aktif yang dilakukan dengan cara merendam serbuk

simplisia dalam cairan pencari yang sesuai selama beberapa hari pada

temperatur kamar terlindung dari cahaya, cairan pencari akan masuk ke

dalam sel melewati dinding sel. Isi sel akan larut karena adanya perbedaan

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 27: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

16

Universitas Indonesia

konsentrasi antara larutan di dalam sel dengan di luar sel. Larutan yang

konsentrasinya tinggi akan terdesak keluar dan diganti oleh cairan pencari

dengan konsentrasi rendah (proses difusi). Peristiwa tersebut berulang

sampai terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di

dalam sel. Selama proses maserasi dilakukan pengadukan dan penggantian

cairan pencari setiap hari. Endapan yang diperoleh dipisahkan dan

filtratnya dipekatkan.

2.3.9 Metode Ekstraksi Gelombang Mikro

Ekstraksi dengan Bantuan Gelombang Mikro Ekstraksi dengan

bantuan gelombang mikro yang merupakan proses ekstraksi yang

memanfaatkan energi yang ditimbulkan oleh gelombang mikro dalam

bentuk radiasi non-ionisasi elektromagnetik (Armstrong, 1999). Energi ini

dapat menyebabkan pergerakan molekul dengan migrasi ion dan rotasi

dari dua kutub, tetapi tidak mengubah struktur molekulnya. Pada

umumnya ekstraksi menggunakan pelarut polar sebagai

pengekstraknya, tetapi ekstraksi juga dapat dilakukan dengan

menggunakan pelarut nonpolar, seperti heksana dan toluena dengan

cara menambahkan aditif polar ataupun serat yang dapat menyerap

gelombang mikro (Armstrong, 1999).

2.4 Sodium Dodesil Sulfat-Gel Poliakrilamid (SDS-PAGE)

Protein biasanya memiliki muatan positif atau negatif yang mencerminkan

campuran muatan asam amino yang dikandungnya. Bila medan listrik

diaplikasikan pada larutan yang mengandung molekul protein, protein akan

bermigrasi dengan laju yang tergantung pada muatan netto, bentuk, dan

ukurannya. Teknik tersebut adalah elektroforesis dan dipergunakan untuk

memisahkan campuran protein, baik pada larutan bebas maupun pada larutan

dengan matriks berpori solid seperti pati (Alberts et al., 1994).

SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate-polyacrilamide-gel

electrophoresis) menggunakan cross-linked gel poliakrilamid sebagai matriks

inert di mana protein akan bermigrasi. Gel biasanya disiapkan sebelum

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 28: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

17

Universitas Indonesia

dipergunakan. Ukuran pori gel dapat disesuaikan sehingga cukup kecil untuk

memperlambat migrasi molekul protein yang dikehendaki. Protein-protein

tersebut tidak berada pada larutan biasa tetapi pada larutan yang mengandung

deterjen yang bermuatan negatif sangat kuat, yakni Sodium Dodesil Sulfat (SDS).

Deterjen tersebut mengikat daerah hidrofobik molekul protein sehingga

menyebabkannya terurai menjadi rantai polipeptida yang panjang. Molekul

protein individu dilepaskan dari asosiasinya dengan protein lain dan lipid, serta

bebas terlarut pada larutan deterjen. Agen reduksi seperti merkaptoetanol

ditambahkan untuk mengurai pautan S-S protein sehingga semua konstituen

polipeptida pada molekul multisubunit dapat dianalisis secara terpisah (Alberts et

al., 1994).

Tiap molekul protein mengikat sejumlah besar molekul deterjen

bermuatan negatif yang menyelubungi muatan intrinsik protein dan

menyebabkannya bermigrasi menuju elektroda positif ketika dikenai tegangan

listrik. Protein yang berukuran sama cenderung berperilaku identik karena

(Alberts et al., 1994) :

1. Struktur aslinya terurai secara sempurna oleh SDS sehingga memiliki bentuk

yang sama

2. Protein tersebut mengikat jumlah SDS yang sama sehingga memiliki jumlah

muatan negatif yang sama. Semakin besar protein, dengan muatan yang

lebih banyak, akan diperlakukan dengan gaya listrik yang lebih besar, dan

juga tarikan yang lebih besar. Pada larutan yang bebas, kedua efek tersebut

dapat ditiadakan, tetapi pada jaring-jaring gel poliakrilamid, yang berperan

sebagai saringan molekuler, protein yang berukuran lebih besar memiliki

hambatan yang lebih besar daripada protein yang berukuran lebih kecil.

Hasilnya, campuran kompleks protein akan mengalami fraksinasi

membentuk serangkaian pita protein diskret yang tersusun berdasarkan berat

molekulnya. Protein mayor dapat dideteksi dengan pewarnaan gel

menggunakan Coomassie blue, protein minor dapat diwarnai dengan silver

stain.

SDS-PAGE merupakan prosedur yang lebih baik daripada analisis protein

lainnya karena dapat dipergunakan untuk memisahkan semua jenis protein,

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 29: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

18

Universitas Indonesia

termasuk protein yang tidak dapat larut dalam air. Protein membran, komponen

protein sitoskeleton, dan protein yang merupakan bagian agregat molekul besar

dapat pula di-resolvasi. Metode ini memisahkan polipeptida berdasarkan

ukurannya sehingga metode ini juga memberikan informasi tentang berat molekul

dan komposisi subunit dari setiap kompleks protein (Alberts et al., 1994).

Protein spesifik dapat diidentifikasi setelah fraksinasi baik pada gel satu dimensi

maupun pada gel dua dimensi dengan mengekspose semua protein yang tersedia

pada antibodi spesifik yang telah dipasangkan dengan isotop radioaktif, dengan

enzim yang mudah dideteksi, ataupun dengan pewarna fluoresen. Untuk

kemudahan, hal ini biasanya dilakukan setelah semua protein yang dipisahkan

ditransfer pada helaian kertas nitroselulosa. Metode deteksi protein disebut

western blotting (Alberts et al., 1994).

2.5 Fosfolipase-A2

Fosfolipase-A2 termasuk ke dalam kelas enzim stabil terhadap panas dan

mengandalkan kalsium sebagai katalisnya untuk menghidrolisis 2-asil dari ikatan

3-n-fosfogliserida. Enzim ini mempunyai berat molekul 15.000 dalton.

Fosfolipase-A2 diaktivasi oleh Ca2+

, diinhibisi oleh zink, barium, dan ion mangan.

Gambar 2.4 Mekanisme Kerja Enzim PLA2

(www.worthington.com)

2.6 Uji Aktivitas Fosfolipase-A2

Setelah melewati prosedur pemurnian, aktivitas PLA2 dilakukan dengan

pengukuran penjernihan kuning telur sesuai dengan metode Marinetti (1965).

Kuning telur merupakan sumber protein fosfatidilkolin atau sejenis lesitin yang

dapat dijadikan substrat bagi enzim PLA2, suspensi kuning telur dalam enzim

akan berkurang absorbansinya pada panjang gelombang 900 nm.

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 30: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

19

Universitas Indonesia

2.7 Uji Aktivitas Kaseinolitik

Selain mendegradasi peptida, protease juga dapat mendegradasi ikatan

amida pada protein globular. Metode kaseinolitik merupakan suatu metode untuk

menguji aktivitas protease yang menggunakan kasein (protein susu) sebagai

substrat. Pada uji kaseinolitik, sampel enzim direaksikan dengan substrat kasein

pada suhu, pH, dan lama waktu tertentu. Reaksi enzim dihentikan dengan

menambahkan larutan TCA (trikloroasetat) sehingga enzim dan sisa substrat

terdenaturasi, kecuali produk-produk peptida. Produk-produk peptida yang larut

dalam campuran reaksi tadi dipisahkan dengan cara disentrifugasi menggunakan

alat sentrifuga klinis dan ditentukan serapannya dengan menggunakan metode-

metode pengukuran serapan protein (seperti metode Anson di 650 nm dan metode

pengukuran serapan di 280 nm). Aktivitas protease dari sampel yang ditentukan

sebanding dengan serapan yang terukur.

2.8 Uji Kadar Protein Lowry

Uji protein Lowry adalah biokimia assay untuk menentukan tingkat total

protein dalam suatu larutan. Konsentrasi total protein ditunjukkan oleh perubahan

warna larutan sampel secara proporsional dengan konsentrasi protein, yang

kemudian dapat diukur dengan menggunakan teknik kolorimetri. Ini adalah nama

untuk ahli biokimia Oliver H. Lowry yang mengembangkan teknik di tahun 1940.

Teknik ini termasuk yang paling sering digunakan dalam makalah biologi.

Metode ini menggabungkan reaksi ion tembaga dengan ikatan peptida dalam

kondisi basa (hasil uji Biuret) dengan residu oksidasi aromatik protein. Metode

Lowry ini paling baik digunakan dengan protein konsentrasi 0,01-1,0 mg/mg dan

didasarkan pada reaksi Cu2+

yang dihasilkan oleh oksidasi ikatan peptida dengan

pereaksi Folin Ciocalteu (campuran asam fosfotungstat dan asam fosfomolibdat

pada pereaksi Folin Ciocalteu). Mekanisme reaksi belum dipahami dengan baik,

tetapi melibatkan reduksi reagen Folin dan oksidasi residu aromatik (terutama

triptofan juga tirosin). Konsentrasi pereaksi Folin yang tereduksi diukur dengan

absorbansi 750 nm. Sebagai hasilnya, konsentrasi total protein dalam sampel

dapat disimpulkan dari konsentrasi residu triptofan dan tirosin yang mengurangi

reagen Folin. Kerugian dari metode ini adalah waktu inkubasi yang panjang dan

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 31: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

20

Universitas Indonesia

sering ada gangguan dengan buffer yang umum digunakan. Metode ini juga

dikenakan untuk variasi protein-protein karena hubungan intensitas warna

tergantung pada isi tirosin dan triptofan di dalam protein.

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 32: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

21

Universitas Indonesia

BAB III

METODE PENELITIAN

Penelitian dilakukan di Laboratorium Rekayasa Bioproses Departemen

Teknik Kimia Universitas Indonesia, Depok dan Laboratorium Mikrobiologi

Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, Cibinong. Diagram alir penelitian

ekstraksi enzim fosfolipase-A2 ditunjukkan pada Gambar 3.1 di bawah ini :

Sampel Homogenasi Fraksinasi

Uji Aktivitas Penentuan Kadar SDS-PAGE

Gambar 3.1 Diagram Alir Penelitian

Tahapan awal penelitian adalah studi literatur nasional maupun

internasional yang dapat memberikan informasi mengenai A. planci, enzim

fosfolipase, pemurnian protein, fraksinasi ammonium sulfat, dan SDS-PAGE.

3.1 Preparasi Sampel Protein Enzim

Langkah selanjutnya adalah preparasi bahan dan alat. Spesimen A. planci

diambil dari beberapa tempat, yaitu :

Tanjung Setan – Desa Morela, Kec. Leihitu, Kab. Maluku Tengah

Pulau Pombo, Kec. Salahutu, Kab. Maluku Tengah

Kalauli – Desa Hila, Kec. Leithitu, Kab. Maluku Tengah

Desa Suli, Tial dan Tengah-Tengah, Kec. Salahutu, Kab. Maluku Tengah

Desa Hutumuni dan Leahari, Kec. Leitimur Selatan, Kota Ambon

Lalu spesimen disimpan dalam lemari es suhu -20oC sampai digunakan. Duri dari

A. planci digunting dan dikumpulkan.

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 33: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

22

Universitas Indonesia

Duri Acanthaster planci

(50 gr) Sonikasi Sentrifugasi

Supernatan

Pemanasan

Sentrifugasi

Supernatan

Endapan

Endapan

Tes antikoagulan

Gambar 3.2 Diagram Alir Preparasi Sampel

Sampel duri yang telah dikumpulkan (50 gr) direndam dalam bufer fosfat

0.01 M, pH 7.0 sebanyak 100 ml dan 10 ml CaCl 0,1 M lalu dihomogenisasi

dengan cara sonikasi. Semua dilakukan dalam suhu 4oC. Untuk membuktikan

keluarnya racun dari duri dilakukanlan tes antikoagulan menggunakan darah

manusia. Antikoagulan merupakan ciri khas racun duri A. planci yang ditandai

dengan larutnya koagulan darah. Sampel hasil sonikasi dimasukkan ke dalam

substrat darah manusia untuk diamati aktivitas antikoagulannya.

Setelah sampel dalam bufer fosfat telah disiapkan selanjutnya di

refrigerasi sentrifuse 15.000g selama 30 menit untuk dipisahkan pengotornya.

Supernatan lalu dipanaskan di dalam waterbath selama 30 menit pada suhu 60oC

dan setiap 10 menit diaduk dengan magnetic stirrer, lalu dipisahkan kembali

dengan sentrifugasi 15.000g selama 30 menit. Supernatannya digunakan untuk

tahap berikut.

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 34: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

23

Universitas Indonesia

3.2 Fraksinasi Ammonium Sulfat

Supernatan Fraksi 20% Sentrifugasi

SupernatanFraksi 20-40%Sentrifuse

Supernatan Fraksi 40-60% Sentrifugasi

SupernatanFraksi 60-80%Sentrifugasi

Supernatan

Endapan F1

Endapan F2

Endapan F3

Endapan F4

Gambar 3.3 Diagram Alir Fraksinasi Ammonium Sulfat

Kemudian supernatan hasil preparasi mulai diendapkan protein enzimnya

dengan garam ammonium sulfat secara bertahap (fraksinasi) 20%, 40%, 60%, dan

80% menurut derajat kelarutannya. Setiap pengendapan dilakukan menggunakan

magnetic stirrer dan wadah sampel direndam dalam es supaya terjaga suhunya.

Pemisahan endapan dilakukan dengan refrigerasi sentrifuse 15.000g selama 30

menit. Endapan hasil sentrifuse masing-masing fraksi dilarutkan dalam bufer

fosfat 0,01 M, pH 7.0, sebanyak 10 ml dan diberi kode F1, F2, F3, F4, dan F5

(supernatan hasil fraksi 60-80% tidak perlu diendapkan karena merupakan fraksi

100%).

3.3 Uji Aktivitas Kaseinolitik

Sampel enzim protease dari papain 50 µl ditambahkan ke dalam sejumlah

larutan kasein 2% (b/v) sebanyak 0,5 ml dan 0,5 ml bufer fosfat 0,01 M, pH 7.0,

di-vortex dan diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit untuk mendegradasi

protein peptida pada kasein, reaksi dihentikan setelah 10 menit tersebut dengan

penambahan 0,4 ml TCA 10% untuk mendenaturasi enzim dan sisa substrat.

Peptida yang masih terlarut dipisahkan dengan sentrifugasi klinis. Supernatan

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 35: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

24

Universitas Indonesia

yang mengandung peptida diukur setelah penambahan 2 ml NaOH 0,5 M dan 0,5

ml reagen Folin Fenol Ciocalteau dengan jeda waktu tertentu. Aktivitas protease

dari sampel yang ditentukan sebanding dengan serapan yang terukur (650 nm).

Hasil kualitatif metode ini dapat dilihat pada Lampiran C.

3.4 Uji Aktivitas Fosfolipase-A2

Kuning telur sebanyak 0,2 gr dilarutkan dalam labu ukur 100 ml bufer

fosfat 0,01 M, pH 7.0. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 900 nm

selama 5 menit menggunakan spektrofotometer. Sebanyak 0,2 ml sampel enzim

dimasukkan 3 ml substrat kuning telur, di-vortex lalu diukur pengurangan

absorbansinya selama 5 menit. Blanko substrat diukur tanpa menggunakan sampel

enzim.

Sampel Substrat

Vortex

Spektrofotometer

0,2 ml 3 ml

900 nm5 menit

Gambar 3.4 Diagram Alir Uji Aktivitas PLA2

3.5 Penentuan Kadar Protein Metode Lowry

Pengujian kadar protein Metode Lowry menggunakan larutan Biuret (1 ml

larutan CuSO4 1% dan larutan 1 ml NaK-Tartrat 1% dimasukan ke dalam 100 ml

larutan Na2CO3 2%) dan reagen Folin Fenol Ciocalteu 1N. Kurva standarnya

menggunakan protein bovine serum albumin (BSA) 200µg/ml. Rentang waktu

inkubasi antara memasukkan larutan biuret dan reagen Folin adalah 3 menit,

sedangkan rentang waktu inkubasi antara reagen Folin dan pengukuran absorbansi

adalah 12 menit. Setelah memasukan larutan biuret dan Folin harus dicampur

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 36: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

25

Universitas Indonesia

menggunakan vortex mixer. Serapan masing-masing larutan diukur tepat pada

menit ke-12 yang ditetapkan pada panjang gelombang 750 nm.

Sampel Larutan biuret Inkubasi

Larutan Folin FenolInkubasi

Spektrofotometer

100 µl 2,5 ml 3 menit

250 µl

10 menit

750 nm

Gambar 3.5 Diagram Alir Metode Lowry

3.6 Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrilamide Gel Electrophoresis (SDS-

PAGE)

Plate pembentuk gel disusun seperti petunjuk yang diberikan. Gel pemisah

dibuat dengan cara menyiapkan tabung polipropilen 50 ml. Sebanyak 3.125 ml

stok akrilamid dimasukkan dalam tabung, kemudian sebanyak 2.75 ml 1M Tris-

pH 8.8 juga dimasukkan. Akuabides dimasukkan sebanyak 1.505 ml. SDS 10%

kemudian dimasukkan sebanyak 75 ml. Sebanyak 6.5 ml TEMED dimasukkan,

kemudian tabung ditutup dan digoyang secara perlahan. APS 10% dimasukkan

sebanyak 75 ml, tabung. Larutan segera dituang ke dalam plate pembentuk gel

menggunakan mikropipet 1 ml (dijaga agar tidak terbentuk gelembung udara),

hingga batas yang terdapat pada plate. Akuades perlahan ditambahkan di atas

larutan gel dalam plate sehingga permukaan gel tidak bergelombang. Gel

dibiarkan memadat selama kurang lebih 30 menit (ditandai dengan terbentuknya

garis transparan di antara batas air dan gel yang terbentuk). Air yang menutupi gel

pemisah selanjutnya dibuang. Bila gel pemisah telah memadat, gel penumpuk 3%

disiapkan dengan cara yang sama, tetapi dengan volume larutan yang meliputi :

30% acrylamide-bis sebanyak 0.45 ml, 1 M Tris-pH 6.8 sebanyak 0.38 ml,

akuabides sebanyak 2.11 ml, 10% SDS sebanyak 30 ml, TEMED sebanyak 5 ml,

dan 10% APS sebanyak 30 ml. Setelah gel penumpuk dimasukkan, maka

selanjutnya sisiran diletakkan di atasnya.

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 37: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

26

Universitas Indonesia

Plate yang sudah berisi gel dimasukkan ke dalam chamber elektroforesis.

Elektroda buffer dituang sampai bagian atas dan bagian bawah gel terendam.

Gelembung udara yang mungkin terbentuk pada dasar gel atau di antara sumur

sampel harus dihilangkan. Sampel dimasukkan ke dalam dasar sumur gel secara

hati-hati menggunakan Hamilton syringe. Syringe dibilas sampai tiga kali dengan

air atau dengan elektroda buffer sebelum dipakai untuk memasukkan sampel yang

berbeda pada sumur gel berikutnya.

Perangkat elektroforesis dihubungkan dengan power supply untuk

memulai pemisahan. Pemisahan dilakukan pada arus konstan 20 mA selama

kurang lebih 40-50 menit atau sampai tracking dye mencapai 0.5 cm dari dasar

gel. Bila pemisahan telah selesai, elektroda buffer dituang dan gel diambil dari

plate.

Tahapan ini memerlukan larutan staining untuk mewarnai protein pada gel

dan larutan destaining untuk menghilangkan warna pada gel dan memperjelas pita

protein yang terbentuk. Larutan staining 1 liter terdiri atas Coomassie Blue R-250

sebanyak 1.0 g, metanol sebanyak 450 ml, akuades sebanyak 450 ml dan asam

asetat glasial sebanyak 100 ml. Larutan destaining 1 liter terdiri atas metanol

sebanyak 100 ml, asam asetat glasial sebanyak 100 ml, dan akuades sebanyak 800

ml. Gel direndam dalam 20 ml larutan staining sambil digoyang selama kurang

lebih 15 menit. Setelah itu, larutan staining dituang kembali pada wadahnya. Gel

direndam dalam 50 ml larutan destaining setelah dicuci dengan air beberapa kali,

sambil digoyang selama kurang semalaman atau sampai band protein terlihat

jelas.

3.7 Bahan dan Alat

3.7.1 Bahan Kimia

Bahan-bahan yang digunakan pada saat penelitian adalah sebagai berikut :

Pembuatan fosfat bufer pH 7.0 :

1. K2HPO4 (Mr.174,17)

2. KH2PO4 (Mr.136,08)

3. Aquades

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 38: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

27

Universitas Indonesia

Pembuatan Ekstrak Protein :

1. Garam (NH4)2SO4

2. Lateks papaya

3. Bufer fosfat pH 7.0

Penentuan Kadar Protein Lowry :

1. BSA 200 µg/mL

2. dH2O

3. NaOH 0,1N

4. CuSO4 1% (CuSO4.5H2O 1,56 gr + dH2O)

5. NaK-Tartrat 1% (NaK-Tartrat 2,37 gr + dH2O)

6. Na2CO3 2% (NaOH 2 gr + Na2CO3 10 gr + dH2O)

7. Larutan Biuret (5 ml larutan CuSO4 1% dan larutan 5 ml NaK-Tartrat

1% dimasukan ke dalam 500 ml larutan Na2CO3 2%)

8. Reagen Fenol Folin Ciocalteu 1N

Penentuan Uji Aktivitas Kaseinolitik :

1. Trikloroasetat (TCA) 20%

2. Larutan kasein 2%

3. NaOH 0,5 M

4. Reagen Fenol Folin Ciocalteu 1N

5. Bufer fosfat, pH 7.0

Uji Aktivitas Fosfolipase-A2

1. CaCl 0,1 M

2. Kuning telur 2 mg/ml

3. Fosfat bufer pH 7.0

Bahan-bahan SDS-PAGE

1. Aquades

2. Akrilamid 29,2 gr

3. (bis)akrilamid

4. Sodium Dedosil Sulfat 10%

5. Larutan HCl

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 39: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

28

Universitas Indonesia

6. Ammonium persulfat (APS) 10%

7. 2-mercaptoetanol 0.1 ml

8. Gliserin 2 ml

9. Glisin 7,2 gr

10. Bromofenol biru (BPB)

11. Coomassie Brilliant Blue 1 gr

12. Metanol absolut 300 mL

13. Asam asetat glasial 100 mL

14. N,N,N’,N’-tetrametil-etilendiamin (TEMED)

3.7.2 Alat

Alat-alat yang digunakan pada penelitian adalah sebagai berikut :

1. Tabung reaksi

2. Beaker glass

3. Vortex mixer

4. SDS-PAGE

5. Pipet tetes

6. Pipet ukur

7. Mikropipet

8. Labu ukur

9. Gelas ukur

10. Neraca massa

11. Spatula

12. Termometer

13. Waterbath

14. Refrigerasi sentrifuse

15. Sonikator

16. Spektrofotometer

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 40: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

29

Universitas Indonesia

BAB IV

PEMBAHASAN

4.1 Hasil Preparasi Enzim dan Pemanasan

Dalam pemurnian enzim keberhasilan sangat ditentukan oleh faktor-faktor

yang dapat merusak/mendenaturasi protein, faktor-faktor tersebut adalah pH,

suhu, dan kontaminasi. Maka dari itu peranan dari bufer fosfat pH 7.0 yaitu untuk

mempertahankan pH, dimana enzim umumnya stabil dan mempunyai aktivitas

pada pH netral, pH terlalu rendah atau terlalu tinggi bisa merusak enzim. Faktor

lainnya yaitu suhu, enzim mempunyai batas ketahanan suhu yang bisa diterima

untuk menjaga struktur proteinnya masing-masing dan enzim juga mempunyai

suhu aktivitas optimum dan minimum. Berikutnya faktor yang tidak dapat

dihindari adalah kontaminan mikroorganisme, biasanya terbawa oleh udara dan

masuk ke dalam sampel, sehingga suhunya harus dijaga sekitar 4oC dimana pada

suhu ini aktivitas dan laju pertumbuhan bakteri secara umum berkurang.

Kebersihan alat-alat laboratorium juga harus diperhatikan, untuk meminimalkan

kontaminan mikroorganisme sebelum dipakai alat-alat dibilas menggunakan

alkohol 70% untuk disinfektan lalu dibilas lagi menggunakan aquades.

Untuk memulai tahap ekstraksi, duri dari A. planci digunting dan disimpan

dalam suhu 20oC. Duri sebanyak 50 gr direndam dalam 100 ml fosfat bufer 0,01

M pH 7.0 dan 10 ml CaCl 0,1 M lalu disonikasi selama 8 menit, fosfat bufer ini

berfungsi untuk menjaga kestabilan pH enzim dimana enzim sangat mudah

terdenaturasi bila terjadi perubahan pH, sedangkan ion Ca2+

akan menambah

aktivitas enzim fosfolipase-A2 sebanyak 180%, tetapi akan berkurang sebanyak

10-20% oleh Cu2+

dan Zn2+

(Shiomi, 1997). Hasil sonikasi lalu disentrifugasi

refrigerasi dengan kekuatan 15.000g pada suhu 4oC selama 30 menit,

supernatannya merupakan sampel crude venom hasil sonikasi (CV).

Sampel CV dipanaskan di dalam waterbath dengan suhu tidak melebihi

batas ketahanan enzim, fosfolipase-A2 (PLA2) terdenaturasi pada suhu 75oC

(Karasudani et al,. 1997), sehingga keduanya bisa dipanaskan dalam suhu 60oC.

Pemanasan ini dapat menyebabkan lipatan-lipatan protein yang tidak tahan panas

akan membuka (terdenaturasi) dan bagian-bagian residu yang tersikap keluar

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 41: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

30

Universitas Indonesia

(pelarut) saling berinteraksi dengan protein terdenaturasi lain membentuk suatu

agregat yang akhirnya mengendap. Namun, protein yang bersifat termostabil

seperti fosfolipase-A2 dan papain tidak membentuk agregat sehingga tidak mampu

terendapkan. Larutan sampel akan menjadi pucat disebabkan protein-protein lain

yang tidak diinginkan terdenaturasi membentuk emulsi halus yang bisa dipisahkan

dengan sentrifuse. Sentrifuse dilakukan pada 15.000g pada suhu 4oC selama 30

menit, supernatan dipisahkan sebagai sampel racun hasil pemanasan (PV).

4.2 Hasil Uji Aktivitas Antikoagulan

Homogenisasi sangat penting pada penelitian ini. Tujuan dari

homogenisasi untuk mendapatkan racun kasarnya terlarut dalam larutan bufer

fosfat. Teknik homogenisasi penelitian ini adalah dengan menggunakan sonikasi.

Duri dari A. planci dimasukkan dalam bufer fosfat dan disonikasi. Untuk

membuktikan racun kasar telah keluar dilakukan tes antikoagulan. Antikoagulan

sebagai efek dari racun duri A. planci dimasukkan ke dalam darah manusia. Hasil

pengamatannya diperlihatkan pada Gambar 4.1.

Gambar 4.1 Hasil Pengamatan Aktivitas Antikoagulan. (1)darah, (2)darah

dengan bufer fosfat, (3)darah dengan racun

Pengamatan dilakukan pada 3 substrat darah, yaitu: darah (botol 1), darah

dengan bufer fosfat pH 7.0 (botol 2), dan darah dengan racun hasil sonikasi (botol

3). Pada botol 1 membuktikan bahwa darah yang dijadikan substrat mempunyai

kemampuan untuk koagulasi sehingga bisa dijadikan substrat pada uji aktivitas

ini, botol 2 tidak membuktikan adanya aktivitas antikoagulan karena darah yang

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 42: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

31

Universitas Indonesia

menggumpal masih terlihat padat, sedangkan cairan disekelilingnya hanya

campuran serum dan bufer fosfat, botol 3 terlihat aktivitas antikoagulan yang

ditandai dengan cairan gumpalan darah disekeliling gumpalan darah, cairan

disekelilingnya terlihat warna merah pekat yang merupakan sel darah merah yang

telah rusak.Metode sonikasi mampu mengeluarkan enzim yang ada pada

spesimen.

4.3 Hasil Fraksinasi Ammonium Sulfat

Cara ini didasarkan bahwa dengan penambahan garam yang mudah larut

(ammonium sulfat 20, 40, 60, dan 80% jenuh) ke dalam larutan protein akan

menyebabkan suatu keadaan dimana pada kelarutan tertentu protein akan

berkurang kelarutannya dan mengendap (termasuk enzim fosfolipase-A2), karena

kemampuan ion-ion garam untuk terhidrasi lebih besar sehingga membuat

molekul-molekul protein mengendap (salting out). Pengadukan juga dilakukan

menggunakan magnetic stirrer sekaligus dijaga suhunya untuk menghindarkan

penumpukan kadar elektrolit pada satu tempat dan meningkatkan kontak

pengendapan dengan enzim. Pengadukan dengan magnetic stirrer tidak boleh

terjadi gelembung yang berlebihan karena dapat merusak enzim di dalam larutan.

Pemberian ammonium sulfat dilarutkan sedikit demi sedikit supaya enzim

mengendap dengan baik. Setelah diendapkan lalu disentrifuse dengan kekuatan

30.000g, 4oC, selama 30 menit. Endapan lalu dilarutkan dengan fosfat bufer pH

7.0 secukupnya.

Setelah setiap endapan fraksi didapatkan maka sampel-sampel tersebut

diuji kadar proteinnya dengan menggunakan Metode Lowry dengan BSA

200µg/ml sebagai standarnya. Kadar protein fosfolipase-A2 dapat dilihat dalam

Lampiran A. Fraksi 20%, 40%, 60%, dan 80% berturut-turut dinamakan F1, F2,

F3, dan F4. Untuk diketahui pada fraksi mana mempunyai hasil ekstraksi papain

dan fosfolipase-A2 tertinggi dilakukan uji aktivitas kaseinolitik dan fosfolipase-

A2.

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 43: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

32

Universitas Indonesia

Tabel 4.1 Kadar Protein Metode Lowry

Sampel Absorbansi Berat protein (µg) Kadar protein (mg/ml)

CV 0,393 86,55 1,73

PV 0,346 72,30 1,45

F1 0,196 26,85 0,54

F2 0,453 104,73 2,09

F3 0,606 151,09 3,02

F4 1,128 309,27 6,19

F5 0,568 139,58 2,79

4.4 Hasil Uji Aktivitas Kaseinolitik

Papain merupakan enzim protease yang didapat dari getah pepaya muda

yang berumur 3-4 bulan, sering dipakai di industri makanan sebagai meat

tenderizer (pengempuk daging). Papain yang berhasil diekstrak dari lateks papaya

merupakan kontrol positif metode penelitian ini. Keberhasilan hasil ekstraksi

papain merupakan pembuktian bahwa metode penelitian ini bisa dilakukan.

Protease mampu mendegradasi larutan kasein sehingga sering digunakan

sebagai uji aktivitas protease suatu enzim. Sejumlah sampel enzim papain

direaksikan dengan larutan kasein 2%. Larutan kasein ini merupakan sumber

nutrisi mikroorganisme sehingga tidak bisa disimpan pada suhu ruang harus

dalam lemari es, penyimpanan pada suhu ruang berakibat timbulnya bau tidak

sedap akibat hasil metabolik mikroorganisme. Reaksi enzim-substrat

menghasilkan produk-produk peptida yang larut dan stabil sehingga untuk

menghentikaan reaksi, ke dalam masing-masing tabung ditambahkan TCA

(trikloroasetat) 10% (b/v) yang akan menyebabkan protein enzim dan sisa substrat

kasein terdenaturasi dan membentuk agregat yang berukuran besar. Protein-

protein yang telah terdenaturasi ini terlihat berupa gumpalan-gumpalan berwarna

putih yang mudah dipisahkan. Dengan sentrifugasi protein terdenaturasi akan

dapat dipisahkan dari peptida yang terlarut dalam supernatan. Aktivitas

kaseinolitik sebanding dengan jumlah peptida terlarut, maka dilakukan

pengukuran serapan dari masing-masing sampel fraksi pengendapan

menggunakan Metode Anson. Yaitu dengan mengambil supernatan peptida

terlarut yang dinetralkan terlebih dahulu dengan NaOH 0,5 M lalu ditambahkan

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 44: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

33

Universitas Indonesia

Fenol Folin Ciocalteu. Prinsip dasar Metode Anson yaitu reagen Folin mampu

mendeteksi residu tirosin dalam peptida karena gugus fenolik residu tersebut

mereduksi fosfotungstat dan fosfomolibdat pada Folin menjadi tungsten dan

molibdenum berwarna biru yang menunjukan serapan pada daerah merah dari

spektrum sinar tampak. Dalam hal ini serapan diukur pada panjang gelombang

650 nm. Hasil dari aktivitas kaseinolitik hanya sebatas pengamatan visual

(kualitatif) seperti pada Gambar 4.2 dibawah.

Gambar 4.2 Hasil Kualitatif Uji Aktivitas

Sampel 1 merupakan blanko yang terlihat lebih jernih dari sampel lainya,

sampel 2, 3, 4, 5, 6, 7, dan 8 berturut-turut adalah CP, PE, F1, F2, F3, F4, dan F5

yang memberikan warna biru yang lebih pekat dari blanko kecuali sampel 4 dan 8

dimana fraksi tersebut adalah fraksi 20% dan 100% mempunyai aktivitas

kaseinolitik yang rendah, aktivitas tertinggi terlihat pada sampel 5, 6, 7 yaitu

fraksi 40%, 60% dan 80%. Sampel 2 dan 3 merupakan enzim kasar dan enzim

hasil pemurnian pemanasan dimana memberikan suatu aktivitas tetapi belum bisa

dikatakan murni.

4.5 Hasil Uji Aktivitas Fosfolipase-A2 (PLA2)

Uji aktivitas dilakukan berdasarkan penjernihan substrat suspensi kuning

telur oleh fosfolipase-A2 (PLA2) (Marinetti, 1965). Kuning telur mengandung

fosfotidilkolin yang akan bereaksi dengan PLA2 membentuk 1-asil-

gliserofosfokolin dan asam karboksilat. Sehingga dengan penambahan enzim

fosfolipase-A2 akan menjernihkan suspensi kuning telur dari serapan panjang

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 45: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

34

Universitas Indonesia

gelombang 900 nm. Satu unit enzim didefinisikan sebagai pengurangan 0,01

abs/menit, pengurangan dilakukan pada inisial waktu 5 menit.

Gambar 4.3 Mekanisme Kerja Enzim

(www.worthington.com)

Dari hasil perhitungan pada Lampiran B, aktivitas spesifik fosfolipase-A2

dan tingkat kemurnian masing-masing sampel dapat dilihat pada Tabel 4.1.

Tabel 4.2 Aktivitas Spesifik PLA2

Sampel Aktivitas Spesifik (unit/mg) Purity Level

CV 5,23 1

PV 6,22 1,19

F1 (0-20%) 108,48 20,75

F2 (20-40%) 16,45 3,15

F3 (40-60%) 2,91 0,56

F4 (60-80%) 2,31 0,44

Aktivitas tertinggi terlihat pada F1 (fraksi 0-20%) sebanyak 108,48

unit/mg dengan tingkat kemurnian 20,75 kali lebih besar dari crude venom (racun

kasar). Aktivitas juga ditemui pada F2 tetapi tidak signifikan. Ini membuktikan

pada pengendapan fraksi ammonium sulfat 20% cukup untuk mengendapkan

enzim fosfolipase-A2 yang terdapat pada racun duri A. planci.

Jika dibandingkan dengan penelitian-penelitian sebelumnya yang telah

berhasil memurnikan enzim PLA2 dari berbagai macam spesies dan kromatografi

akan terlihat bahwa metode ini cukup efektif, seperti yang dilakukan oleh Kazuo

Shiomi dan kawan-kawannya (1997) mengenai karakterisasi enzim PLA2 dari

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 46: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

35

Universitas Indonesia

spesies yang sama (A. planci) setelah dimurnikan didapatkan kemurnian yang

sama sebanyak 20 kali lipat (AP-PLA2-II).

Tabel 4.3 Hasil Pemurnian PLA2 Penelitian Kazuo Shiomi

(Shiomi et al., 1997)

Terlihat pada tabel aktivitas spesifik setelah melalui berbagai macam

kolom kromatografi didapatkan AP-PLA2-I 7830 units/mg dan AP-PLA2-II

16.600 units/mg.

Perbandingan terhadap penelitian lain yang berhasil memurnikan enzim

PLA2 dari spesies bintang laut Plazaster borealis (Koyama et al,. 2004)

didapatkan kemurnian sebanyak 12 kali lipat setelah melewati tahap-tahap

kromatografi.

Tabel 4.4 Hasil Pemurnian PLA2 Racun Bintang Laut Plazaster borealis

(Koyama et al,. 2004)

Spesies lain yang mempunyai kandungan enzim PLA2 dari racunnya

adalah ular berbisa Echis ocellatus (Sallau et al,. 2008) berhasil dimurnikan

dengan tingkat kemurnian 13,50 kali dari racun kasarnya.

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 47: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

36

Universitas Indonesia

Tabel 4.5 Hasil pemurnian PLA2 Racun Echis ocellatus

(Sallau et al,. 2008)

Spesies ular kobra India Naja naja juga mempunyai racun dengan

kandungan enzim PLA2 yang dimurnikan dengan tingkat kemurnian tertinggi

pada fraksi NND-IV sebanyak 13,6 kali lipat. Penelitian ini dilakukan oleh Satish

dan kawan-kawannya (2004).

Tabel 4.6 Hasil Pemurnian PLA2 Racun Kobra India Timur (Naja naja)

(Satish et al., 2004)

4.6 Hasil Uji SDS-PAGE

Protein biasanya memiliki muatan positif atau negatif yang mencerminkan

campuran muatan asam amino yang dikandungnya. Bila medan listrik

diaplikasikan pada larutan yang mengandung molekul protein, protein akan

bermigrasi dengan laju yang tergantung pada muatan netto, bentuk, dan

ukurannya. Teknik tersebut adalah elektroforesis dan dipergunakan untuk

memisahkan campuran protein, baik pada larutan bebas maupun pada larutan

dengan matriks berpori solid seperti pati.

SDS-PAGE menggunakan cross-linked gel poliakrilamid sebagai matriks

inert di mana protein akan bermigrasi. Gel biasanya disiapkan sebelum

dipergunakan. Ukuran pori gel dapat disesuaikan sehingga cukup kecil untuk

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 48: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

37

Universitas Indonesia

memperlambat migrasi molekul protein yang dikehendaki. Protein-protein

tersebut tidak berada pada larutan biasa tetapi pada larutan yang mengandung

deterjen yang bermuatan negatif sangat kuat, yakni Sodium Dodesil Sulfat (SDS).

Deterjen tersebut mengikat daerah hidrofobik molekul protein sehingga

menyebabkannya terurai menjadi rantai polipeptida yang panjang. Molekul

protein individu dilepaskan dari asosiasinya dengan protein lain dan lipid, serta

bebas terlarut pada larutan deterjen.

Gambar 4.4 Hasil Band Protein SDS-PAGE

Fosfolipase-A2 mempunyai band protein 15 kDa (Shiomi et al., 1997).

Sehingga hasil dari SDS-PAGE membuktikan adanya band tersebut sebagai hasil

pemurnian PLA2. Pada gel hanya terlihat sepintas tipis pada band 15 kDA, ini

dikarenakan sampel protein terlalu encer. Sampel sebanyak 50 gr dimasukkan

sebanyak 100 ml bufer fosfat 0,01 M, pH 7.0 membuat band protein terlihat

samar-samar.

Pada penelitian Shiomi juga didapatkan hasil yang sama pada Gambar 4.5

menunjukkan band protein 15 kDa pada AP-PLA2-I dan AP-PLA2-II. Jalur A

merupakan protein standar dan jalur B dan C berturut-turut adalah AP-PLA2-I dan

AP-PLA2-II.

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 49: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

38

Universitas Indonesia

Gambar 4.5 SDS-PAGE Penelitian Shiomi

(Shiomi et al., 1997)

Pada penelitian yang dilakukan Shiomi, racun diambil dari spesies yang

sama yaitu A. planci menggunakan duri sebanyak 227 gr yang diekstrak dua kali

menggunakan bufer fosfat 0,01 M, pH 7.0 sehingga racun yang dikeluarkan

(terbilas) ke dalam sampel lebih banyak dan lebih pekat membuat penampakan

pada SDS-PAGE lebih nyata dibandingkan dengan hanya dengan sekali ekstrak

menggunakan dua kali volume dari berat sampel (50 gr) di penelitian ini.

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 50: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

39

Universitas Indonesia

BAB V

KESIMPULAN

Enzim papain yang digunakan sebagai kontrol positif metode penelitian ini

berhasil diekstrak, hasilnya ditunjukkan secara kualitatif dengan sampel fraksi

ammonium sulfat yang terlihat lebih pekat dibandingkan dengan blanko yang

lebih jernih. Setiap fraksi memberikan kejernihan berbeda-beda sebagai bukti

fraksinasi ammonium sulfat mampu memisahkan enzim papain.

Metode sederhana yang digunakan yaitu dengan pemanasan crude venom

setinggi 60oC yang diteruskan dengan pengendapan fraksinasi ammonium sulfat

20, 40, 60 dan 80%. Tujuan dari pemanasan ini untuk mendenaturasi protein-

protein lain yang terkandung dalam sampel yang umumnya tidak tahan terhadap

panas, karena enzim PLA2 termasuk enzim yang stabil terhadap panas yaitu 75oC

selama 4 menit (Karasudani et al,. 1997). Enzim PLA2 yang diekstrak dari duri A.

planci sebanyak 50 gr didapatkan aktivitas tertinggi pada F1 (fraksi 20%)

sebanyak 108,48 unit/mg dengan tingkat kemurnian 20,75 kali lebih besar dari

crude venom (racun kasar). Band protein terlihat samar-samar berkisar pada 15

kDa pada SDS-PAGE.

Umumnya pemurnian enzim menggunakan berbagai macam jenis

kromatografi dan berulang-ulang dilakukan tergantung dari sampelnya dimana

kromatografi termasuk cara pemurnian yang relatif mahal dan rumit untuk

dilakukan. Metode ini memberikan keefektifan yang sama dan jauh lebih murah

dan mudah dibandingkan penelitian yang pernah dilakukan oleh Shiomi (1997)

terhadap spesies yang sama (A. planci). Pada penelitian Shiomi yang berjudul

“Purification and Properties of Phospholipases-A2 from the crown-of-thorns

Starfish (Acanthaster planci) Venom” didapatkan tingkat kemurnian yang sama

yaitu sebesar 20 kali crude venom menggunakan CM-selulosa, kromatografi

Phenyl Sepharose CL-4B, superose 12, TSKgel ODS-120T.

Sehingga bisa disimpulkan metode ini mampu memberikan keefektifan

yang sama dan secara keekonomisan jauh lebih murah dibandingkan penelitian

yang pernah dilakukan (Shiomi et al,. 1997). Hal-hal yang bisa ditingkatkan untuk

mendapatkan kemurnian yang lebih baik dan penampakan pada SDS-PAGE yang

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 51: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

40

Universitas Indonesia

lebih jelas dari metode penelitian ini adalah cara pengekstrakkan racun dari duri,

penambahan jumlah sampel, dan pelarut bufer fosfat yang secukupnya.

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 52: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

41

Universitas Indonesia

DAFTAR PUSTAKA

Deutscher, Murray. 1990. Guide to Protein Purification. Farmington : University

of Connecticut Health Center.

De’ath, G. and P.J. Moran. 1997. Factors affecting the behaviour of Crown-of-

thorns starfish (Acanthaster planci L.) on the Great Barrier Reef: 2: Feeding

Preferences. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology.

220(1998): 107-126.

Moran, P. 1988. Crown-of-thorns Starfish: Questions and Answers. Australian

Institute of Marine Sciences, Townsville MC. Queensland, Australia. pp. 11-

29.

Pratchett, M.S. 2001. Influence of coral symbionts on feeding preferences of

crown-of-thorns starfish Acanthaster planci in the western Pacific. Mar Ecol

Prog Ser. 214(2001): 111-119.

Porter, J.W. 1972. Predation by Acanthaster and its Effect on Coral Species

Diversity. The American Naturalist. 106(950): 487-492.

Sahlan, Muhamad. 2002. Eksplorasi Enzim Fibrinolitik dari Cacing Tanah

Pheretima sp. Galur Lokal. Skripsi. Institut Teknologi Bandung.

Shiomi, K., Kazama, A., Shimakura, K., Nagashima, Y., 1998. Purification and

properties of phospholipases-A2 from the crown-of-thorns starfish

(Acanthaster planci) venom. Toxicon 36, 589– 599.

Karasudani, I., Koyama, T., Nakandakari, S. and Aniya, Y. 1996. Purifcation of

anticoagulant factor from the spine venom of the crown-of-thorns starfish

Acanthaster planci. Toxicon 34, 871-879.

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 53: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

42

Universitas Indonesia

Koelman J, Roehm KH, Color Atlas Biochemistry. 2nd ed. Marburg: Thieme,

2005.

Koyama, N., Kishimura, H., Hayashi K. 2004. Partial purification and

characteristics of phospholipase-A2 from pyloric ceca of starfish Plazaster

borealis. Hokkaido University.

Lehninger, A. L., Dasar-dasar biokimia, Jilid 1, Maggy Thenawidjaja

(Penerjemah), Penerbit Gramedia, Jakarta, 1993.

Lowry, N.; Rosenbroug, A.; Farr; Randall, R. “Protein Measurement with the

folin phenol reagent”. J. Biol. Chem., 193, 265-275, 1951.

Marinetti, G. V. (1965) The action of phospholipase A on lipoproteins. Biochim.

Biophys. Acta 98, 554-565.

Ota E, Nagashima Y, Shiomi K, et al. Caspase-independent apotosis induced in

rat liver cells by plancitoxin I, the major lethal factor from the crown-of-

thorns starfish Acanthaster planci venom. Toxicon. 2006;48:1002–1010.

Ota E, Nagai H, Nagashima Y, Shiomi K. 2004. Molecular cloning of two toxic

phospholipases A2 from the crown-of-thorns starfish Acanthaster planci

venom. Elsevier. Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 143

(2006) 54 – 60.

Sallau A.B., Ibrahim M.A., Salihu A., Patrick F.U. Characterization of

phospholipase-A2 (PLA2) from Echis ocellatus venom. Department of

Biochemistry, Ahmadu Bello University, Zaria-Nigeria.

Satish, S. 2004. Purification of a Class B1 platelet aggregation inhibitor

phospholipase-A2 from Indian cobra (Naja Naja) venom. Elsevier. University

of Mysore.

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 54: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

43

Universitas Indonesia

Shiomi, K., Itoh, K., Yamanaka, H. and Kikuchi, T. 1985. Biological activity of

crude venom from the crown-of-thorns starfish Acanathaster planci. Nippon

Suisan Gakkaishi 51, 1151-1154.

Shiomi, K., Yamamoto, S., Yamanaka, H. and Kikuchi, T. 1988. Purification and

characterization of a lethal factor in venom from the crown-of-thorns starfish

(Acanthaster planci). Toxicon 26, 1077-1083.

Shiomi, K., Nagai, K., Yamanaka, H. and Kikuchi, T. 1989. Inhibitory effect of

anti-inflammatory agents on cutaneous capillary leakage induced by six

marine venoms. Nippon Suisan Gakkaishi 55, 131-134.

Shiomi, K., Yamamoto, S., Yamanaka, H., Kikuchi, T. and Konno, K. 1990. Liver

damage by the crown-of- thorns starfish (Acanthaster planci) lethal factor.

Toxicon 28, 469-475.

Shiomi K, Midorikawa S, Ishida M, Nagashima Y, Nagai H. Plancitoxins, lethal

factors from the crown-of-thorns starfish Acanthaster planci, are

deoxyribonucleases II. Toxicon. 2004;44:499–506.

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 55: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

44

Universitas Indonesia

LAMPIRAN A

Penentuan Kadar Protein Metode Lowry

Tabel Kurva Standar

Tabung BSA (µg) Abs750

1 0 0

2 80 0,31

3 100 0,369

4 120 0,44

5 140 0,5

6 160 0,551

7 180 0,623

8 200 0,669

Gambar Kurva Standar Protein BSA

Penentuan Kadar Protein Sampel

Kurva standar protein antara absorbansi pada panjang gelombang 750 nm dan

kadar protein (µg) didapat persamaan garis

y = 0,0033x + 0,0244R² = 0,9939

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 50 100 150 200 250

Ab

sorb

ansi

BSA (µg)

Kurva Standar Protein

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 56: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

45

Universitas Indonesia

Dengan y adalah nilai absorbansi sampel dan x adalah nilai kadar protein dalam

µg.

Contoh perhitungan :

Absorbansi sampel crude venom (CV) sebesar 0,31, maka kadar proteinnya

Maka didapat kadar CV sebesar 86,54 µg, karena sampel yang digunakan sebesar

50 µl, maka 86,54 µg/50 µl = 1,73 mg/ml

Tabel Kadar Protein Enzim

Sampel Absorbansi Berat protein (µg) Kadar protein (mg/ml)

CV 0,393 86,55 1,73

PV 0,346 72,30 1,45

F1 0,196 26,85 0,54

F2 0,453 104,73 2,09

F3 0,606 151,09 3,02

F4 1,128 309,27 6,19

F5 0,568 139,58 2,79

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 57: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

46

Universitas Indonesia

LAMPIRAN B

Penentuan Aktivitas Spesifik PLA2

Unit (abs/menit)

1 unit didefinisikan sebagai jumlah serapan yang berkurang 0,01 absorbansi pada

panjang gelombang 900 nm per menit.

Contoh sampel CV selama 5 menit berkurang 0,116 absorbansi, sehingga 0,166

absorbansi/(5 menit . 0,01) = 2,33 unit

2,33 unit – 0,52 unit (blanko) = 1,81 unit

Aktivitas Enzim (unit/ml)

Aktivitas enzim didefinisikan sebagai unit per ml sampel enzim PLA2 yang

digunakan.

Contoh : aktivitas sampel CV = 1,81 unit/0,2 ml = 9,05 unit/ml

Unit Total (unit)

Merupakan aktivitas keseluruhan sampel enzim PLA2 yang didapat.

Contoh : unit total sampel CV = aktivitas x volume total sampel enzim = 9,05

unit/ml x 107 ml = 968,35 unit

Jumlah Protein Total (mg)

Merupakan jumlah protein keseluruhan yang terdapat dalam sampel enzim yang

telah ditentukan sebelumnya (dari metode Lowry)

Contoh : jumlah protein CV = konsentrasi sampel CV x volume total CV = 1,73

mg/ml x 107 ml = 185,20 mg

Aktivitas Spesifik (unit/mg)

Aktivitas spesifik didefinisikan sebagai unit total per protein total (mg).

Contoh : aktivitas spesifik CV = 968,35 unit/185,20 mg = 5,23 unit/mg

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 58: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

47

Universitas Indonesia

Tingkat Kemurnian Enzim

Tingkat kemurnian enzim didefinisikan sebagai perbandingan antara aktivitas

spesifik enzim yang telah dimurnikan dan aktivitas spesifik crude venom (CV).

Contoh aktivitas spesifik CV dan PV berturut-turut adalah 5,23 unit/mg dan 6,22

unit/mg, maka tingkat kemurnian sampel PV adalah 6,22/5,23 = 1,19

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010

Page 59: UNIVERSITAS INDONESIA - lib.ui.ac.idlib.ui.ac.id/file?file=digital/20281859-S680-Kombinasi metode.pdf · Terimakasih untuk berbagi ilmu dan kebersamaannya. 6. Teman-teman Ekstensi

TABEL HASIL PEMURNIAN ENZIM

Sampel Kons.protein

mg/ml

Vol.total

(ml) Unit

Aktivitas

(unit/ml)

Aktivitas total

(unit)

Protein total

(mg)

Akt.spesifik

(unit/mg)

Tingkat

kemurnian

CV 1,73 107 1,81 9,05 968,35 185,21 5,23 1

PV 1,45 101 1,8 9 909 146,05 6,22 1,19

F1 0,54 5 11,65 58,25 291,25 2,68 108,48 20,75

F2 2,09 5 6,89 34,45 172,25 10,47 16,45 3,15

F3 3,02 5 1,76 8,8 44 15,11 2,91 0,56

F4 6,19 5 2,86 14,3 71,5 30,93 2,31 0,44

Kombinasi metode ..., Respatiphala Ardha Satwika, FT UI, 2010