uji spesifisitas primer 12s dna mitokondria kambing...

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

UJI SPESIFISITAS PRIMER 12S DNAMITOKONDRIA KAMBING (Capra hircus)

MENGGUNAKAN REAL-TIME POLYMERASE CHAINREACTION

SKRIPSI

RIZKI MARTA PUTRI1113102000049

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATANPROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTAJULI 2017

ii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

UJI SPESIFISITAS PRIMER 12S DNAMITOKONDRIA KAMBING (Capra hircus)

MENGGUNAKAN REAL-TIME POLYMERASE CHAINREACTION

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi

RIZKI MARTA PUTRI1113102000049

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATANPROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTAJULI 2017

iii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

Skripsi ini adalah hasil karya saya sendiri,

dan semua sumber baik yang dikutip maupun dirujuk

telah saya nyatakan dengan benar

Nama : Rizki Marta Putri

NIM : 1113102000049

Tanda Tangan

Tanggal : 31 Juli 2017

iv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING

Nama : Rizki Marta Putri

NIM : 1113102000049

Program Studi : Strata-1 Farmasi

Judul : Uji Spesifisitas Primer 12S DNA Mitokondria Kambing

(Capra hircus) menggunakan Real-Time Polymerase

Chain Reaction

Disetujui Oleh :

Pembimbing 1 Pembimbing 2

Ofa Suzanti Betha, M.Si., Apt. Dr. Zilhadia, M.Si.,Apt.NIP: 197501042009122001 NIP: 197308222008012007

Mengetahui,Ketua Program Studi Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu KesehatanUIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Dr. Nurmeilis, M.Sc.,Apt.NIP: 197404302005012003

v UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI

Skripsi ini diajukan oleh

Nama : Rizki Marta PutriNIM : 1113102000049Program Studi : FarmasiJudul : Uji Spesifisitas Primer 12S DNA Mitokondria Kambing

(Capra hircus) menggunakan Real-Time PolymeraseChain Reaction

Telah berhasil dipertahankan dihadapan Dewan Penguji dan diterimasebagai bagian persyaratan yang diperlukan untuk memperoleh gelarSarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran danIlmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

DEWAN PENGUJI

Pembimbing I : Ofa Suzanti Betha, M.Si.,Apt. ( )

Pembimbing II : Dr. Zilhadia, M.Si.,Apt. ( )

Penguji I : Hendri Aldrat, M.Si, PhD., Apt. ( )

Penguji II : Chris Adhiyanto, M.Biomed., Ph.D. ( )

Ditetapkan di : CiputatTanggal : 31 Juli 2017

vi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRAK

Nama : Rizki Marta PutriProgram Studi : FarmasiJudul Skripsi : Uji Spesifisitas Primer 12S DNA Mitokondria Kambing

(Capra hircus) menggunakan Real-Time PolymeraseChain Reaction

Sampai saat ini, upaya pemalsuan produk pangan masih sering terjadi. Salah satuhewan yang sering kali dipalsukan adalah daging kambing. Pengembanganmetode identifikasi spesies pada produk pangan dan obat yang berasal dari hewandiharapkan dapat melindungi konsumen dari pemalsuan. Salah satu metodeanalisis yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi spesies hewan adalah RT-PCR. Salah satu kunci keberhasilan deteksi dengan RT-PCR adalah kespesifikanprimer. Primer yang spesifik akan mengamplifikasi DNA secara spesifik pulasehingga hasil analisa yang dihasilkan akan lebih akurat. Oleh sebab itu, perludilakukan uji spesifisitas primer yang akan digunakan dalam analisa. Primer yangdigunakan adalah primer yang tertarget pada DNA mitokondria region 12S.Penggunaan mtDNA didasarkan pada alasan jumlah kopi molekul mtDNA yangtinggi dalam sel dibandingkan dengan DNA inti. Penelitian ini bertujuan untukmengetahui kespesifikan primer 12S DNA mitokondria kambing dalammengamplifikasi DNA kambing. Sample DNA yang digunakan adalah dagingkambing dan sapi segar. DNA sampel diisolasi menggunakan kit komersial. IsolatDNA daging kambing didapatkan sebanyak 22.529 ng/µl dan 6.296 ng/µl dengankemurnian masing-masing 1.70 dan 1.98 sedangkan isolat DNA daging sapididapatkan sebanyak 50.772 ng/µl dan 12.452 ng/µl dengan kemurnian masing-masing 1.79 dan 1.87. Primer kambing diujikan pada DNA kambing dan DNAsapi dan hasil kurva menunjukkan primer kambing yang tertarget pada DNAmitokondria region 12S dapat mengamplifikasi DNA kambing dan DNA sapi.Berdasarkan hasil BLAST, primer kambing 12S yang digunakan memiliki nilaimaksimum identitas 100%. Adanya hasil amplifikasi pada DNA sapimenggunakan primer kambing disebabkan karena suhu anneling (60oC) yangdigunakan tidak spesifik.

Kata Kunci : Real Time Polymerase Chain Reaction, Kambing, mtDNA, Primer.

vii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRACT

Name : Rizki Marta PutriMajor : PharmacyTitle : Primary Specificity Test of 12S Goat (Capra hircus)

Mitochondrial DNA Using Real-Time Polymerase ChainReaction

Until now, food product counterfeiting efforts are still common. One of theanimals that are often forged is goat meat. The development of speciesidentification methods on food products and medicines from animals is expectedto protect consumers from counterfeiting. One of the analytical methods that canbe used to identify animal species is the RT-PCR. One of the keys to successfuldetection with RT-PCR is the primary specificity. Specific primers will amplifythe DNA specifically so that the resulting analysis will be more accurate.Therefore, it is necessary to test the primary specificity that will be used in theanalysis. Primer used is primer targeted on mitochondrial DNA of 12S region.The use of mtDNA is based on the reason for the high number of copies ofmtDNA molecules in the cell compared with core DNA. This study aims todetermine the primary specificity of 12S goat mitochondrial DNA in goat DNAamplification. DNA samples used are goat meat and fresh cattle. DNA sampleswere isolated using a commercial kit. Goat DNA isolate was obtained 22.529 ng/μl and 6.296 ng/μl with purity of 1.70 and 1.98 respectively while beef DNAisolate was obtained 50.772 ng/μl and 12.452 ng/μl with purity of each 1.79 and1.87. The goat primer is tested on goat DNA and cow's DNA and the curve resultsshow targeted goat primers in mitochondrial DNA of the 12S region can amplifygoat DNA and cow's DNA. Based on BLAST results, the 12S goat primer usedhas a maximum identity value of 100%. The presence of amplification results incow's DNA using goat primer due to the anneling temperature (60oC) used is notspecific.

Key word : Real time Polymerase Chain Reaction, Goat, mtDNA, primary

viii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, segala puja dan puji syukur selalu terpanjatkan atas segala

nikmat, karunia, dan ilmu yang bermanfaat yang diberikan oleh Allah subhanahu

wa ta’ala, sehingga penulis dapat menyelesaikan penulisan skripsi yang berjudul

“Uji Spesifisitas Primer 12S DNA Mitokondria Kambing menggunakan Real-

Time Polymerase Chain Reaction”. Shalawat dan salam senantiasa terlimpahkan

kepada junjungan kita Nabi Muhammad SAW, teladan bagi umat manusia dalam

menjalani kehidupan.

Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat menempuh ujian

akhir guna mendapatkan gelar Sarjana Farmasi (S.Far) pada program Studi

Farmasi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri

Syarif Hidayatullah Jakarta.

Selama proses penyusunan dan penulisan laporan ini, penulis menyadari

begitu banyak bantuan dari berbagai pihak yang telah meluangkan waktunya,

mendidik dan membimbing, dan mendoakan yang terbaik kepada penulis. Maka

pada kesempatan kali ini, penulis menyampaikan penghargaan setinggi-tingginya

dan rasa terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:

1. Bapak Dr. H. Arief Sumantri, SKM., M.Kes, selaku Dekan Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif

Hidayatullah Jakarta.

2. Ibu Ofa Suzanti Betha M.Si., Apt, selaku pembimbing pertama serta ibu Dr.

Zilhadia M.Si., Apt, selaku pembimbing kedua yang telah membantu,

membimbing dan memberikan ilmu kepada saya, serta meluangkan waktu,

tenaga dan pikiran dari awal penelitian sampai pada penyusunan skripsi ini

selesai.

3. Ibu Dr. Nurmeilis M.Si., Apt. selaku Ketua Program Studi Farmasi Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

4. Bapak dan Ibu staf pengajar, serta karyawan yang telah memberikan ilmu

pengetahuan, bimbingan dan bantuan kepada penulis

ix UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

5. Seluruh laboran Laboratorium Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta yang telah membantu dalam hal

penggunaan alat dan bahan selama penelitian.

6. Kedua orang tua, ayahanda tersayang Ahmad Tantowi dan ibunda tercinta

Marwiyah yang selalu setia melantunkan doa-doa dan memberikan dukungan

moral, material, dan semangat sehingga penulis dapat menyelesaikan studi di

jurusan farmasi FKIK UIN Jakarta

7. Teman-teman Farmasi angkatan 2013 yang telah menorehkan kenangan indah

yang tak mungkin terlupakan, senang bisa bersama kalian selama kurang

lebih 4 tahun ini

8. Temen seperjuanganku Afri yanti serta kak Vesti dan kak Safizah yang selalu

meluangkan waktunya untuk bekerja sama, berdiskusi, memberikan masukan,

membantu penulis dalam melakukan penelitian serta memberikan dukungan

doa dan semangat kepada penulis dalam penyelesaian skripsi ini.

9. Tim Roche Indonesia: Mbak Helen, mba Frida, dan mba Christine yang telah

membantu dalam mendesign primer yang digunakan penulis dalam penelitian

ini.

10. Dan kepada semua pihak yang telah membantu penulis selama ini yang tidak

dapat disebutkan namanya satu persatu

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih belum sempurna. Oleh karena

itu, kritik dan saran yang membangun sangat penulis harapkan. Penulis berharap

semoga hasil dari penelitian ini dapat bermanfaat baik bagi kalangan akademis

dan dunia ilmu pengetahuan, khususnya bagi mahasiswa farmasi serta bagi

masyarakat pada umumnya.

Akhir kata, penulis berharap semoga Allah SWT mencatat dan memberikan

balasan yang berlipat ganda atas segala kebaikan semua pihak yang telah

membantu dalam menyelesaikan skripsi ini.

Ciputat, 31 Juli 2017

Penulis

x UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGASAKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif HidayatullahJakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini :

Nama : Rizki Marta PutriNIM : 1113102000049Program Studi : FarmasiFakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah saya,dengan judul :

UJI SPESIFISITAS PRIMER 12S DNA MITOKONDRIAKAMBING (Capra hircus) MENGGUNAKAN REAL-TIME

POLYMERASE CHAIN REACTION

untuk dipublikasi atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu DigitalLibrary Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakartauntuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta.

Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengansebenarnya.

Dibuat di : CiputatPada Tanggal : 31 Juli 2017

Yang menyatakan,

(Rizki Marta Putri)

xi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ..................................................................................... iHALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ......................................... iiiHALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ......................................... ivHALAMAN PENGESAHAN ....................................................................... vABSTRAK .................................................................................................... viABSTRACT ................................................................................................... viiKATA PENGANTAR ................................................................................... viiiHALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH .............. xDAFTAR ISI .................................................................................................. xiDAFTAR TABEL ......................................................................................... xiiiDAFTAR GAMBAR ..................................................................................... xivDAFTAR LAMPIRAN ................................................................................. xvDAFTAR SINGKATAN ............................................................................... xviBAB I PEMDAHULUAN.............................................................................. 1

1.1 Latar Belakang.................................................................................. 11.2 Rumusan Masalah............................................................................. 41.3 Hipotesis .......................................................................................... 41.4 Tujuan Penelitian ............................................................................. 41.5 Manfaat Penelitian ........................................................................... 4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA.................................................................... 52.1 Sel .................................................................................................... 52.2 DNA ................................................................................................. 6

2.2.1 Struktur DNA ...................................................................... 62.2.2 Sifat Fisika DNA.................................................................. 72.2.3 Ekstraksi dan Purifikasi DNA.............................................. 8

2.3 DNA Mitokondria............................................................................. 92.3.1 Struktur DNA Mitokondria .................................................. 9

2.4 Polymerase Chain Reaction (PCR) .................................................. 112.4.1 Pengertian PCR .................................................................... 112.4.2 Komponen PCR ................................................................... 122.4.3 Tahapan PCR ....................................................................... 12

2.5 Real-Time PCR dan Kuantifikasinya ............................................... 132.6 Perancangan Primer .......................................................................... 17

BAB III METODOLOGI PENELITIAN .................................................... 193.1 Waktu dan Tempat Penelitian........................................................... 19

3.1.1 Tempat ................................................................................. 193.1.2 Waktu ................................................................................... 19

3.2 Alat dan Bahan ................................................................................ 19

xii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.2.1 Alat ...................................................................................... 193.2.2 Bahan ................................................................................... 19

3.3 Posedur Penelitian ........................................................................... 203.3.1 Ektraksi dan isolasi DNA .................................................... 203.3.2 Pengukuran Kemurnian dan Kuantitas DNA ...................... 213.3.3 Uji Spesifisitas Primer dan Probe dengan NCBI ................. 223.3.4 Amplifikasi DNA dengan RT-PCR ..................................... 22

3.3.4.1 Pembuatan Larutan Primer 50 µM ......................... 22

3.3.4.2 Pembuatan Larutan Primer 5 µM ........................... 223.3.4.3 Pembuatan UPL Mastermix .................................... 223.3.4.4 Loading Sampel dan Mastermix .............................. 23

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................... 244.1 Isolasi DNA ................................................................................... 244.2 Hasil Analisis Isolat DNA dengan Spektrofotometri UV .............. 264.3 Hasil Uji Spesifisitas Primer Kambing dengan NCBI ................... 284.4 Amplifikasi DNA Daging Kambing dengan RT-PCR................... 29

4.4.1 Hasil Amplifikasi DNA Daging Kambing, Daging Sapidan NTC Menggunakan Primer Kambing........................... 31

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................... 33DAFTAR PUSTAKA..................................................................................... 37LAMPIRAN.................................................................................................... 41

xiii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 3.1 Urutan Basa Primer 12S Gen Mitokondria dan UPL 83 kambingdan Sapi dengan modifikasi ............................................................ 20

Tabel 3.2 Pengaturan Program Amplifikasi Real-Time PCR ......................... 23Tabel 4.1 Konsentrasi dan Kemurnian Isolat DNA ......................................... 27Tabel 4.2 Urutan Primer 12S DNA Mitokondria Kambing dan Sapi hasil

rancangan Roche (BioScience)......................................................... 28Tabel 4.3 Program Amplifikasi yang Digunakan ............................................ 30

xiv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1 Sel Prokariot dan Eukariot ........................................................... 5Gambar 2.2 Struktur Kimia DNA ................................................................... 6Gambar 2.3 Basa Purin dan Pirimidin ............................................................. 7Gambar 2.4 DNA Mitokondria Manusia ........................................................ 11Gambar 2.5 Tahapan Amplifikasi PCR .......................................................... 13Gambar 2.6 Tiga Fase Utama pada Proses PCR ............................................. 14Gambar 4.1 Hasil Uji Spesifisitas Primer Kambing dengan NCBI ................. 29Gambar 4.2 Hasil Uji Spesifisitas Primer Sapi dengan NCBI ......................... 29Gambar 4.3 Kurva Amplifikasi Daging Kambing, Daging Sapi dan NTC

Menggunakan Primer Kambing (Isolat Pertama) ........................ 31Gambar 4.4 Kurva Amplifikasi Daging Kambing, Daging Sapi dan NTC

Menggunakan Primer Kambing (Isolat Kedua) ........................... 32Gambar 4.3 Kurva Amplifikasi Daging Sapi, Daging Kambing, dan NTC

Menggunakan Primer Sapi .......................................................... 34

xv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Konsentrasi dan Kemurnian Isolat DNA.................................. 42Lampiran 2. Perhitungan Pembuatan Larutan Primer................................... 43Lampiran 3. Perhitungan TM (Melting Temperature) Primer ..................... 44Lampiran 4. Campuran Reaksi Mastermix Untuk Amplifikasi DNA........... 45Lampiran 5. Halaman Depan Software NCBI yang Digunakan

untuk Uji Spesifisitas Primer Kambing dan Sapi..................... 46Lampiran 6. Hasil Uji Spesifisitas Primer Kambing dan Sapi ..................... 47Lampiran 7. Konsentrasi dan Kemurnian Isolat DNA ................................ 51Lampiran 8. Kurva Amplifikasi DNA Daging Kambing, Daging Sapi,

dan NTC Menggunakan Primer Kambing .............................. 52Lampiran 9. Kurva Amplifikasi DNA Daging Kambing, Daging Sapi

dan NTC Menggunakan Primer Sapi ...................................... 53Lampiran 10. Gambar Alat dan Bahan yang Digunakan ............................... 56

xvi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR SINGKATAN

AFL : Arbitrary Fluorescence Level

ATP : Adenosine Triphosphate

CP : Crossing Point

dATP : Deoxyadenosine Triphosphate

dCTP : Deoxycytidine Triphosphate

dGTP : Deoxyguanosine Triphosphate

DNA : Deoxyribonucleic Acid

dNTP : Deoxyribonucleaside Triphosphate

dTTP : Deoxythimidine Triphosphate

EDTA : Ethylenediaminetetraacetic Acid

mtDNA : mitochondrial Deoxyribonucleic Acid

NCBI : National Center for Biotechnology Information

NLS : Nuclei Lysis Solution

PCR : Polymerase Chain Reaction

Primer-BLAST: Primer-Basic Local Alligment Search Tool

PPS : Protein Precipitation Solution

RNA : Ribonucleic Acid

rRNA : ribosomal Ribonucleic Acid

RT-PCR : Real Time Polymerase Chain Reaction

Tm : Melting Temperature

tRNA : transfer Ribonucleic Acid

SDS : Sodium Dodecyl Sulfate

UPL : Universal Probe Library

UV : Ultra Violet

1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Makanan merupakan kebutuhan dasar bagi kehidupan manusia. Islam

sebagai agama yang peduli terhadap umatnya sangat memperhatikan segala

sesuatu yang berkaitan dengan kehidupan manusia salah satunya adalah makanan.

Allah memerintahkan manusia untuk memakan makanan yang halal dan toyyib

yang tercantum dalam QS Al-Baqarah(2):168. Makanan yang halal adalah

makanan yang diperbolehkan oleh agama dari segi hukumnya, halal zatnya, serta

didapat dan diolah dengan cara yang benar menurut agama. Adapun makanan

yang baik adalah makanan yang berguna dan tidak membahayakan bagi tubuh

manusia dilihat dari sudut kesehatan. Makanan yang halal belum tentu baik bagi

orang tertentu, artinya makanan yang baik sifatnya kondisional dengan orang

yang akan mengkonsumsinya. Oleh karena itu, sudah menjadi kewajiban umat

muslim untuk mengkonsumsi dan menggunakan produk yang halal dan baik

(Syaiful, 2012).

Daging merupakan salah satu makanan yang sering dikonsumsi masyarakat.

Konsumsi daging kambing di Indonesia menempati urutan ketiga teratas

(Yusmichad, 2014). Bagi umat Islam selain untuk dikonsumsi sehari-hari, daging

kambing juga digunakan untuk menjalankan ibadah sunnah yaitu qurban dan

akikah. Daging yang digunakan untuk ibadah harus terjamin keasliannya. Untuk

kebutuhan akikah sudah banyak yang menawarkan jasa masak daging akikah yang

tidak menutup kemungkinan akan terjadi pemalsuan ataupun pencampuran

daging.

Meskipun pemerintah sudah berusaha melindungi konsumen dengan adanya

Undang-undang (UU No. 8 Tahun 1999 tentang Perlindungan Konsumen) dan

Peraturan Pemerintah (Peraturan Pemerintah Nomor 28 Tahun 2004 tentang

Keamanan, Mutu, dan Gizi Pangan). Sampai saat ini, masih banyak kasus

pencampuran daging dalam produk olahan maupun daging mentah yang marak

terjadi.

2

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Pada Januari 2016 lalu ditemukan kasus sate daging kambing yang

dicampur dengan daging anjing (Anonim, 2016). Selain itu, pada tahun 2015 juga

ditemukan kasus pembuatan daging kambing palsu dari campuran daging rubah,

musang dan tikus yang ditambahkan dengan bahan kimia lainnya di Beijing,Cina

(Deniawan, 2014). Hal ini tentu meresahkan masyarakat khususnya umat muslim.

Oleh karena itu, untuk melindungi konsumen dari pemalsuan ataupun penggantian

dengan spesies lain yang tidak di harapkan yang memiliki nilai lebih rendah perlu

dilakukan analisis keaslian suatu bahan yang digunakan pada industri makanan

dan obat-obatan. Salah satu bahan yang perlu di ketahui keasliannya adalah

daging kambing.

Dewasa ini, banyak metode analisis yang dapat digunakan dalam menilai

keaslian produk. Identifikasi spesies hewan pada produk daging olahan maupun

mentah dapat dilakukan melalui analisis pada tingkat protein maupun DNA. Salah

satu metode analisis yang menggunakan DNA adalah metode Real-Time

Polymerase Chain Reaction (RT-PCR).

Metode analisis dengan menggunakan DNA memiliki beberapa

keuntungan, yaitu DNA dapat ditemukan di semua tipe sel pada suatu individu

dengan informasi genetik yang identik. DNA merupakan molekul yang stabil

dalam proses ekstraksi, dan analisis DNA sangat mungkin dikerjakan dari

beberapa tipe sampel yang berbeda (Jain, 2004).

Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu teknik biologi

molekuler yang digunakan untuk memperbanyak sekuens DNA spesifik hingga

jutaan kali semula. Prinsip kerja dari PCR adalah menggandakan segmen DNA

tertentu dengan memanfaatkan enzim sebagai penginisiasi replikasi (Roche

diagnostics 2006:9).

Untuk mengamplifikasi DNA dengan menggunakan RT-PCR diperlukan

beberapa komponen seperti DNA template, primer, DNA polimerase,

buffer/dapar, dan dNTPs. Salah satu komponen penting dalam amplifikasi

DNA template yang akan dianalisis adalah primer.

Primer adalah suatu polimer asam nukleat pendek (oligonukleotida)

yang mempunyai urutan nukleotida yang komplementer dengan urutan

nukleotida DNA template, dNTPs (deoxynucleotide triphosphates), buffer

3


PCR, dan enzim DNA polimerase (Reece 2004:153). Primer berfungsi sebagai

pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi dan sekaligus

menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3’ yang diperlukan untuk

proses eksistensi DNA.

Analisis PCR dengan target DNA mitokondria telah banyak dipilih

(Bellagamba dkk., 2001; Fumiere dkk., 2006; Marlina dkk., 2013; Shabani dkk.,

2015; Wardani, 2015). Analisis dengan target DNA mitokondria dinilai lebih

menguntungkan karena DNA mitokondria tersedia dalam jumlah hingga ratusan

ribu kopi pada tiap sel, sehingga dapat digunakan untuk analisis dengan jumlah

sampel sangat terbatas serta dapat memberikan kemungkinan yang lebih besar

untuk mendapatkan hasil pengujian yang positif bahkan saat DNA telah

terfragmentasi akibat dari proses pengolahan (Bellagamba dkk., 2001; Randi,

2009).

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui spesifisitas primer 12S DNA

mitokondria kambing yang dirancang dalam mendeteksi DNA kambing dengan

DNA sapi sebagai kontrol. Daging sapi dijadikan kontrol karena tingkat konsumsi

yang tinggi dan kekerabatannya yang dekat dengan kambing, keduanya

merupakan vertebrata. Selain itu, pemilihan sapi ini juga didasarkan pada adanya

pengembangan dalam pembuatan gelatin sehingga diharapkan dari penelitian ini

dapat diketahui apakah primer kambing dapat digunakan untuk membedakan

gelatin yang terbuat dari kulit kambing dan kulit sapi.

Pengujian dilakukan melalui amplifikasi DNA menggunakan RT-PCR. Pada

RT-PCR jumlah DNA yang diamplifikasi bisa langsung diamati secara real-time

sehingga tidak memerlukan analisis dengan elektroforesis gel untuk mengetahui

produk PCR. RT-PCR lebih dikenal sebagai quantitative PCR karena kemampuan

analisanya yang akurat, sensitif dan spesifik sehingga mengurangi kesalahan pada

hasil (Burns et al, 2005).

Diharapkan penelitian ini dapat memberikan informasi tentang primer

kambing yang dapat digunakan untuk mendeteksi DNA kambing dalam produk

olahan maupun mentah dalam rangka autentifikasi keaslian produk daging

kambing yang beredar di pasaran.

4


1.2 Rumusan Masalah

Belum diketahuinya kespesifikan primer 12S DNA mitokondria

kambing yang digunakan dengan menggunakan RT-PCR

1.3 Hipotesis

Primer 12S DNA mitokondria kambing spesifik untuk identifikasi DNA

daging kambing

1.4 Tujuan Penelitian

Untuk mengetahui kespesifikan primer 12S DNA mitokondria kambing

untuk mengamplifikasi DNA daging kambing

1.5 Manfaat Penelitian

Untuk uji keaslian atau autentifikasi daging kambing .


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Sel

Sel dalam bahasa latin artinya rongga kecil, atau terkenal dengan nama

cellula, yaitu unit kehidupan terkecil. Sel adalah kumpulan materi paling

sederhana yang dapat hidup dan merupakan unit penyusun semua makhluk hidup.

Sel mampu melakukan semua aktivitas kehidupan dan sebagian besar reaksi kimia

untuk mempertahankan kehidupan berlangsung di dalam sel. Sel pertama kali

ditemukan oleh Robert Hooke pada tahun 1665, dengan mengamati gabus

menggunakan mikroskop. Semua makhluk hidup tubuhnya tersusun dari sel, bisa

terdiri dari satu sel (uni selular) maupun banyak sel (multiselular) (Yuwono,

2005).

Gambar 2.1 Sel prokariot dan eukariot (Raven et al, 2005)

Di alam, sel dapat di bagi ke dalam dua kelompok, yaitu sel prokariot dan

sel eukariot. Sel prokariot pada umumnya memiliki ukuran yang lebih kecil

dengan struktur sederhana, sedangkan sel eukariot memiliki ukuran yang lebih

besar dan strukturnya lebih kompleks. Perbedaan utama antara sel prokariot dan

sel eukariot adalah terletak pada lokasi materi genetiknya (DNA). DNA sel

eukariot dibatasi oleh membran inti, sedangkan pada sel prokariot tidak dibatasi

oleh membran inti (Sumadi dan Marianti, 2007).

6


2.2 DNA

DNA merupakan kependekan dari deoxyribonucleic acid, yang merupakan

molekul asam nukleat. Terdapat dua tipe asam nukleat yaitu DNA dan RNA

(ribonucleic acid). Disebut sebagai asam nukleat karena awalnya molekul ini di

isolasi dari nukleus sel eukariotik (Clark, 2005).

2.2.1 Struktur DNA

Secara struktural, DNA merupakan suatu polimer linier yang tersusun atas

unit-unit nukleotida. Tiap nukleotida terdiri atas tiga komponen yaitu gugus

fosfat, gula pentosa, dan basa nitrogen. Gula pentosa penyusun DNA merupakan

gula deoksiribosa yang mana posisi 5’ mengikat satu gugus fosfat yang te-

esterkan, sementara satu basa nitrogen terikat pada cincin gula pada posisi 1’.

Antar nukleotida satu dengan lainnya terikat secara kovalen, yang mana terdapat

gula pentosa dan gugus fosfat saling terikat pada posisi 3’ dan 5’ dari cincin gula

membentuk ikatan fosfodiester, struktur tersebut kemudian membentuk rangka

utama atau backbone dari DNA (Clark, 2005; Karp, 2009).

Gambar 2.2 Struktur kimia DNA (Madeleine Price Ball, 2014)

7


DNA memiliki 4 jenis basa nitrogen yaitu adenin (A), guanin (G),

sitosin(C), dan timin (T), sedangkan pada RNA timin digantikan dengan

urasil(U). Basa-basa tersebut dikelompokkan menjadi dua yaitu purin dan

pirimidin. Basa purin mempunyai 2 cincin heterosiklik, sedangkan basa

pirimidin hanya mengandung 1 cincin heterosiklik. Basa purin meliputi adenin,

dan guanin, sementara sitosin, timin, dan urasil merupakan basa pirimidin.

Basa nitrogen tersebut saling berkomplemen, yang mana adenin selalu

berpasangan dengan timin yang dihubungkan oleh 2 ikatan hidrogen,

sedangkan guanin berpasangan dengan sitosin dan terhubung oleh 3 ikatan

hidrogen. Pasangan-pasangan basa nitrogen tersebut menghubungkan 2

backbone DNA sehingga membentuk DNA untai ganda dengan struktur double

helix seperti yang diusulkan oleh Watson dan Crick (1953) (Clark, 2005).

Gambar 2.3 Basa purin dan pirimidin (Yuwono, 2009)

2.2.2 Sifat Fisika DNA

DNA memiliki stabilitas yang tinggi (Fumiere dkk., 2006). Meskipun

demikian DNA dapat mengalami degradasi yang mengakibatkan terjadinya

fragmentasi atau terpotongnya rantai DNA menjadi lebih kecil. Selain karena

aktivitas endonuklease dan eksonuklease, degradasi DNA juga dapat

disebabkan oleh pengaruh lingkungan diantaranya waktu penyimpanan, suhu,

kelembaban udara, paparan cahaya, dan berbagai zat kimia (Rudin dan Inman

2001; Sinden, 1994).

8


2.2.3 Ekstraksi dan Purifikasi DNA

Prinsip isolasi DNA adalah memisahkan DNA dari komponen sel

lainnya. Isolasi DNA dari organisme eukariot dilakukan melalui proses

penghancuran membran sel (lisis), pemusnahan protein dan RNA, dan

pemanenan DNA (Muladno, 2010). Membran sel dilisis dengan menambahkan

buffer yang mengandung satu atau lebih deterjen, contohnya SDS (B), NP-40

atau Triton X-100 untuk membebaskan isinya. Kotoran sel yang ditimbulkan

akibat pengrusakan oleh deterjen tersebut dibersihkan dengan cara sentrifugasi.

Pada ekstrak sel tersebut kemudian ditambahkan proteinase yang berfungsi

untuk mendegradasi protein dan RNAse yang berfungsi untuk mendegradasi

RNA, sehingga hanya DNA yang tertinggal. Selanjutnya ekstrak tersebut

dipanaskan sampai suhu 90oC untuk menginaktivasi enzim yang mendegradasi

DNA. Larutan DNA kemudian di presipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan

lagi dengan air (Gaffar, 2007).

Isolasi DNA kini lebih mudah dengan bantuan teknologi canggih yang

disebut purifikasi DNA yang menghasilkan isolat DNA dengan kemurnian

yang tinggi, hasil yang cepat, dan penggunaan yang mudah (Saiyed, 2008).

Purifikasi DNA menggunakan seperangkat mesin dengan reagen kit pemurnian

DNA yang bekerja secara otomatis, singkat dan efisien. Pemurnian DNA dapat

dilakukan dari darah, sel-sel, dan sampel jaringan. Instrumen ini dapat

memproses sampai dengan 16 sampel dalam waktu 30-45 menit. DNA yang

telah dimurnikan dapat digunakan langsung dalam berbagai aplikasi termasuk

PCR, restriksi oleh enzim endonuklease, dan elektroforesis gel agarosa.

Intrumen ini dapat memproses sampel cair dan padat. Dilengkapi dengan

cartridge yang berisi lysis buffer, Magnesil® PMPs dan wash buffer (Promega,

2007). Pada mesin purifikasi DNA, sampel yang telah dilisis oleh buffer lisis,

dicuci dengan wash buffer dan dielusi dengan elution buffer menggunakan

bantuan Magnesil® PMPs (Promega, 2007).

9


2.3 DNA Mitokondria

Mitokondria (tunggal: mitokondrion) adalah organel berbentuk batang

dengan membran ganda yang ditemukan pada sel eukariot. Tiap sel dapat

memiliki 100 hingga 100.000 mitokondria. Mitokondria bertanggungjawab dalam

pembentukan energi melalui proses respirasi, yang mana enzim-enzim respirasi

yang diperlukan terdapat pada membran dalam dari organel lain (Clark, 2005;

Randi, 2009).

Material genetik pada sel eukariot juga ditemukan di mitokondria pada

hewan dan plastida pada tumbuhan. Molekul DNA yang terdapat di mitokondria

(DNA mitokondria) merupakan DNA untai ganda, biasanya berbentuk cincin,

berukuran kecil dan berupa molekul haploid sederhana, serta tidak mengalami

rekombinasi. DNA mitokondria biasanya hanya diturunkan oleh ibu, dan

diturunkan secara utuh dari generasi ke generasi. Laju mutasi DNA mitokondria

terjadi 5-10 kali lebih sering dibanding DNA nukleus, namun terdapat conserved

region yang mengkode protein yang mana susunan sekuennya tetap sama dan

bertahan hingga puluhan juta tahun (Randi, 2009).

DNA mitokondria memiliki fungsi penting antara lain sebagai penyandi 2

RNA ribosom besar subunit 16 (rRNA-12S) dan ribosom kecil subunit 12 (rRNA

12S). DNA mitokondria juga mengkode enzim-enzim yang terlibat dalam rantai

respiratorik, meliputi apositokrom b, 4-8 subunit NADH (NADH-1 sampai

dengan 7, dan NADH-4L). 1-3 subunit sitokrom oksidase C (COX-1, COX-2, dan

COX-3), serta 1-3 ATP (ATP-6, ATP-8, ATP-9) (Randi, 2009).

2.3.1 Struktur DNA Mitokondria

DNA mitokondria (mtDNA) berukuran 16569 pasang basa dan terdapat

dalam matriks mitokondria, berbentuk sirkuler serta memiliki untai ganda yang

terdiri dari untai heavy (H) dan light (L). Dinamakan seperti ini karena untai H

memiliki berat molekul yang lebih besar dari untai L, disebabkan oleh banyaknya

kandungan basa purin (Anderson et al, 1981).

MtDNA terdiri dari daerah pengkode (coding region) dan daerah yang

tidak mengkode (non-coding region). MtDNA mengandung 37 gen pengkode

untuk 2 rRNA, 22 tRNA, dan 13 polipeptida yang merupakan subunit kompleks

enzim yang terlibat fosforilasi oksidatif, yaitu: subunit 1, 2, 3, 4, 4L, 5, dan 6 dari

10


kompleks I, subunit b (sitokrom b) dari kompleks III, subunit I, II, dan III dari

kompleks IV (sitokrom oksidase) serta subunit 6 dan 8 dari komples V.

Kebanyakan gen ini di transkripsikan dari untai H, yaitu 2 rRNA, 14 dari 22

tRNA dan 12 polipeptida. MtDNA tidak memiliki intron dan semua gen pengkode

terletak berdampingan (Anderson et al, 1981; Wallace et al, 1992; Zeviani et al

1998), sedangkan protein lainnya yang juga berfungsi dalam fosforilasi oksidatif

seperti enzim-enzim metabolisme, DNA dan RNA polimerase, protein ribosom

dan mtDNA regulatory factors semuanya dikode oleh gen inti, disintesis dalam

sitosol dan kemudian di impor ke organel (Wallace et al, 1997).

Daerah yang tidak mengkode dari mtDNA berukuran 1122 pb, dimulai

dari nukleotida 16024 hingga 576 dan terletak di antara gen tRNApro dan

tRNAphe. Daerah ini mengandung daerah yang memiliki variasi tinggi yang

disebut displacement loop (D-loop). D-lopp merupakan daerah beruntai tiga

(tripple stranded) untai ketiga lebih dikenal sebagai 7S DNA. D-lopp memiliki

dua daerah dengan laju polymorphism yang tinggi sehingga urutannya sangat

bervariasi antar individu, yaitu hypervariable I (HVSI) dan hypervariable II

(HVSII). Daerah non-coding juga mengandung daerah pengontrol karena

mempunyai origin of replication untuk untai H (OH) dan promoter transkripsi

untuk untai H dan L (PL dan PH) (Anderson et al, 1981). Selain itu, daerah non-

coding juga mengandung tiga daerah lestari yang disebut dengan conserved

sequence block (CSB) I, II, III. Daerah yang lestari ini diduga memiliki peranan

penting dalam replikasi mtDNA (Anderson et al, 1981).

11


Gambar 2.4 DNA mitokondria (Shane & Knopkind, 2008)

2.4 Polymerase Chain Reaction (PCR)

2.4.1 Pengertian PCR

Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu teknik biologi

molekuler yang dikembangkan oleh Kary Mullis pada tahun 1984. PCR berguna

dalam mengamplifikasi sekuen DNA. PCR dapat digunakan untuk

mengamplifikasi suatu fragmen DNA yang jumlahnya sangat kecil, dan dapat

menghasilkan DNA hingga jutaan kopi, sehingga cukup sensitif. Metode PCR

menghasilkan amplifikasi yang cukup baik bahkan ketika DNA sampel telah

terdegrasi. Saat ini teknik PCR digunakan dalam bidang diagnosis klinis, analisis

genetik, genetic engineering, dan analisis forensik (Bellagamma dkk., 2001;

Clark, 2005; Joshi dan Deshpande, 2010).

Prinsip dari PCR adalah bahwa secara in vitro terjadi sintesis dari sekuen

DNA spesifik secara enzimatik, menggunakan sepasang primer oligonukleotida

yang berhibridisasi pada daerah DNA target (Elrich, 1989).

12


2.4.2 Komponen PCR

Komponen-komponen dari PCR meliputi :

a. Molekul DNA awal yang disebut sebagai DNA template dan segmen yang

ingin diamplifikasi yang disebut sebagai sekuen target.

b. Sepasang primer berupa oligonukleotida untai tunggal yang

berkomplemen dengan daerah awal dan akhir dari sekuen target. Primer

berguna dalam mengawali sintesis DNA.

c. Enzim DNA polimerase yang digunakan untuk menghasilkan salinan

DNA. Prosedur dalam PCR memerlukan beberapa tahap perubahan suhu,

sehingga dibutuhkan suatu enzim DNA polimerase yang tahan terhadap

suhu. Saat ini banyak digunakan enzim Taq polymerase yang diisolasi dari

bakteri Thermus aquaticus. Enzim ini stabil hingga suhu 94oC.

d. Suplai nukleotida berupa nukleotida trifosfat adenin(A), timin(T),

sitosin(C), dan guanin(G) yang akan digunakan oleh enzim polimerase

untuk membentuk DNA baru.

e. Mesin PCR berupa thermocycler yang akan mengkondisikan beberapa

tahap suhu yang diperlukan dalam proses amplifikasi, dan mengulangnya

sebanyak siklus yang diperlukan (Clark, 2005; Jhosi dan Deshpande,

2010)

2.4.3 Tahapan PCR

Terdapat tiga tahapan utama yang terjadi dalam proses PCR yaitu

denaturasi(D), penempelan atau annealing(A), dan perpanjangan atau ekstensi(E).

Pada tahap pertama DNA didenaturasi pada temperatur tinggi antara 90-97oC

sehingga terbentuk dua DNA untai tunggal. Pada tahap kedua yaitu annealing,

primer menempel pada sekuen target untuk memulai ekstensi, proses ini terjadi

pada suhu 50-60oC. Pada tahap ekstensi atau perpanjangan,terjadi sintesis DNA

oleh enzim polimerase yang dimulai pada daerah primer membentuk salinan DNA

yang komplemen, tahap ini terjadi pada suhu 72oC selama 2-5 menit (Joshi dan

Deshpande, 2010). Pada proses ini, DNA baru yang terbentuk akan menjadi

template pada amplifikasi selanjutnya, sehingga terjadi penggandaan jumlah DNA

13


pada tiap siklusnya. Secara matematis proses PCR selama 20 kali siklus akan

menghasilkan salinan hingga satu juta kalinya (2020) (Elrich, 1989). Pada akhir

siklus biasanya dilakukan tahap tambahan yang disebut sebagai perpanjangan

akhir atau ekstensi akhir pada 72oC selama 5 menit untuk memastikan sintesis dari

produk PCR telah berhasil (Joshi dan Deshpande, 2010)

Gambar 2.5 Tahapan amplifikasi PCR (Lukianto, 2010)

2.5 Real-time PCR dan Kuantifikasinya

Pada awalnya analisis PCR menggunakan teknik gel elektroforesis untuk

memvisualisasikan fragmen DNA hasil amplifikasi (amplikon), teknik ini disebut

juga sebagai PCR konvensional. Selanjutnya pada beberapa dekade terakhir telah

dikembangkan teknologi RT-PCR yang mana dapat dilakukan analisis terhadap

amplikon saat reaksi sedang berlangsung. Teknik ini disebut juga sebagai

quantitative PCR (qPCR) karena memungkinkan untuk melakukan kuantifikasi

terhadap amplikon yang dihasilkan (Shafique, 2012; VanGuilder dkk., 2008).

14


Dalam RT-PCR, penanda fluoresen berfungsi sebagai detektor. Visualisasi

dari sinyal fluoresen tersebut selama proses PCR berlangsung akan membentuk

sebuah plot amplifikasi. Plot tersebut menggambarkan jumlah amplikon seiring

bertambahnya siklus dalam PCR, yang mana secara umum terbagi menjadi tiga

fase. Fase pertama disebut sebagai fase eksponensial yang mana jumlah substrat

melimpah dan produk yang dihasilkan masih sedikit. Pada fase ini terjadi

penambahan jumlah produk yang dihasilkan masih sedikit. Pada fase ini terjadi

penambahan jumlah produk secara eksponensial dan efisiensi reaksi mencapai

100%. Pada fase kedua, yaitu fase linier, akumulasi produk semakin bertambah

namun efisiensinya semakin berkurang dan jumlah reagen mulai terbatas sampai

pada akhirnya memasuki fase ketiga, yaitu fase mendatar yang mana

pembentukan produk mulai terhenti dikarenakan jumlah reagen yang habis

dan/atau aktivitas enzim yang menurun (VanGuilder dkk., 2008).

Gambar 2.6 Tiga fase utama pada proses PCR (Lukianto, 2010)

RT-PCR memiliki prinsip kerja yang sama dengan PCR konvensional,

hanya pada RT-PCR digunakan penanda (probe) flouresen yang dapat

berinteraksi dengan produk amplikon selama proses berlangsung sehingga

memungkinkan pengukuran secara kinetik dari akumulasi amplikon (Shafique,

2012).

15


Beberapa sistem penanda flouresen yang ada saat ini dapat dibagi menjadi

tiga kategori berdasarkan mekanisme sinyal fluoresen yang dihasilkan, (1)

penanda berbasis reaksi hidrolisis, contohnya TaqMan® (Applied Biosystems,

USA); (2) penanda berbasis hibridisasi dengan produk amplikon, misalnya

LightCycler® (Roche), LUX ®(Invitrogen, USA), dan Molecular Beacons; (3)

pewarna interkalasi contohnya SYBR Green (VanGuilder dkk., 2008).

Semua metode kuantifikasi PCR didasarkan pada kurva amplifikasi yang

mana sinyal flouresensi dan kenaikannya pada tiap siklus diplotkan terhadap

jumlah siklus. Pada kurva tersebut saat fase eksponensial, jumlah amplikon

berbanding lurus dengan jumlah awal DNA target (template). Dari fase

eksponensial tersebut digunakan istilah Ct (threshold cycle) yang merupakan

jumlah siklus saat tercapai akumulasi sinyal flouresen yang secara signifikan lebih

tinggi dari pada sinyal baseline atau background (Heid dkk., 1996). Dalam

prakteknya, nilai Ct ditentukan dari garis threshold. Nilai Ct adalah jumlah siklus

saat sinyal flouresen memotong threshold. Threshold sendiri merefleksikan

kenaikan sinyal yang signifikan dari sinyal baseline. Biasanya, perangkat lunak

instrumen RT-PCR secara otomatis memberikan threshold sebagai nilai 10 kali

nilai standar deviasi dari nilai sinyal baseline. Namun posisi dari threshold dapat

ditetapkan pada titik manapun pada fase eksponensial (Anonim, 2014a).

Nilai Ct proporsional terhadap jumlah awal DNA target (template). Ketika

konsentrasi template lebih besar maka sinyalnya akan memotong threshold lebih

awal (Ct lebih kecil), sehingga dari data Ct seri pengenceran template dapat dibuat

suatu kurva baku dengan meregresikan nilai seri log konsentrasi template (sumbu

x) versus nilai Ct (sumbu y) pada masing-masing konsentrasi tersebut sehingga

dihasilkan suatu garis linier (Anonim, 2014a); Smith dan Osborn, 2009). Dari

kurva baku tersebut kemudian dapat ditentukan berbagai parameter amplifikasi

diantaranya adalah kemiringan (slope), efisiensi amplifikasi (E) dan koefisien

regresi linier (r2) (Smith dan Osborn, 2009). Nilai efisiensi amplifikasi

menunjukkan kedekatan perolehan amplikon dengan jumlah amplikon teoritis

yang seharusnya dicapai menurut prinsip penggandaan dalam PCR (Pelt-Verkuil

dkk., 2008). Nilai efisiensi dapat ditentukan melalui persamaan berikut :

E= 10 (-1/slope) -1

16


Idealnya, efisiensi suatu PCR sebesar 100% (slope = -3,32), yang berarti

bahwa template menggandakan diri pada setiap akhir siklus selama fase

eksponensial. Nilai efisiensi aktual dapat memberikan informasi yang penting dari

reaksi. Faktor eksperimental seperti panjang amplikon, struktur sekunder, GC

content dari produk amplikon dapat mempengaruhi efisiensi. Nilai efisiensi reaksi

yang rendah dapat disebabkan oleh perancangan primer yang kurang bagus,

dinamika dari reaksi itu sendiri, penggunaan reagen dengan konsentrasi yang

tidak optimal serta kualitas enzim yang rendah. Nilai efisiensi yang lebih dari

100% dapat disebabkan oleh kesalahan pemipetan dalam atau amplifikasi dari

produk non-spesifik seperti primer dimer (Anonim, 2014a, 2006a). Sebaiknya

nilai efisiensi amplifikasi mendekati 100% yang berarti nilai slope-nya berada

pada rentang -2,9 hingga -3,3 (Anonim, 2010).

Data kurva leleh juga didapatkan dalam RT-PCR. Kurva leleh diperoleh dari

pengamatan perubahan fluoresensi ketika DNA untai ganda dengan molekul

warna yang terikat berdisosiasi, atau meleleh menjadi DNA untai tunggal seiring

dengan kenaikan suhu pada saat reaksi. Ketika DNA untai ganda yang berikatan

dengan suatu pewarna interkalasi dipanaskan, penurunan fluoresensi secara tiba-

tiba terdeteksi ketika suhu mencapai titik leleh (Tm), karena terjadinya disosiasi

dari DNA untai ganda dan pelepasan pewarna. Kurva leleh diperoleh dengan

memplotkan sinyal fluoresensi versus suhu. Analisis kurva leleh pada setelah

amplifikasi adalah cara yang praktis dan cepat untuk memeriksa adanya primer-

dimer pada reaksi PCR, serta digunakan untuk memastikan spesifitas reaksi.

Karakterisasi produk PCR dengan menggunakan analisis kurva leleh dapat

mengurangi pemakaian waktu, karena tidak lagi diperlukan prosedur

elektroforesis gel (Anonim, 2014a).

2.6 Perancangan Primer

Perancangan primer dalam analisis PCR merupakan tahap yang sangat

krusial dalam menentukan kesuksesan dari reaksi PCR, terlebih lagi jika analisis

dilakukan dengan menggunakan metode RT-PCR dengan penanda non-spesifik

seperti UPL (Universal Probe Library). Analisis UPL membutuhkan primer yang

spesifik dan berbagai optimasi terhadap primer untuk memastikan spesifisitas dari

reaksi PCR (Borah, 2011; Handoyo dan Rudiretna, 2000; Smith dan Osborn,

17


2009). Primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan

diamplifikasi sekaligus menyediakan gugus hidroksi(-OH) pada ujung 3’ yang

mana DNA polimerase dapat menambahkan building block DNA (dNTP) yang

diperlukan untuk proses perpanjangan (Handoyo dan Rudiretna, 2000; Joshi dan

Deshpande, 2010).

Pada Proses perancangan primer diperlukan informasi mengenai sekuen

DNA terutama sekuen target yang ingin diamplifikasi (Clark, 2005). Bank

database genom berbagai spesies salah satunya terdapat di laman National Center

for Biotechnology Information (NCBI) dan dapat digunakan sebagai acuan dalam

merancang suatu primer. Laman NCBI juga menyediakan fasilitas Primer-Basic

Local Alignment Search Tool (Primer-BLAST) yang dapat digunakan untuk

merancang primer yang spesifik secara in-siliko (Wardani, 2015).

Beberapa pertimbangan yang harus diperhatikan dalam perancangan

primer adalah sebagai berikut (Borah, 2011; Handoyo dan Rudiretna, 2000) :

a. Panjang primer

Umumnya panjang primer berkisar antara 18-30 basa. Primer dengan

ukuran tersebut dianggap cukup panjang untuk mendapatkan spesifisitas

yang diinginkan, serta cukup pendek sehingga primer akan dengan mudah

berhibridisasi dengan sekuen target pada suhu annealing. Primer yang

terlalu pendek akan mengalami mispriming (penempelan primer ditempat

lain yang tidak diinginkan) sehingga mengurangi spesifisitasnya. Primer

yang terlalu panjang juga akan menjadi tidak ekonomis dan tidak

meningkatkan spesifisitas secara signifikan.

b. Komposisi primer

Dalam merancang suatu primer, urutan nukleotida yang sama (repeat)

perlu dihindari karena dapat menurunkan spesifisitas dengan

meningkatkan kemungkinan terjadinya mispriming. Jumlah guanin dan

sitosin (G+C) dalam primer hendaknya sebanyak 40-60%. Primer dengan

% (G+C) yang rendah diperkirakan tidak akan mampu menempel secara

efektif pada target DNA sehingga akan menurunkan efisiensi dari PCR.

18


Selain itu, pada 5’ basa terakhir ujung 3’ sebaiknya mengandung

nukleotida G atau C, disebabkan adanya basa tersebut membantu primer

untuk berikatan secara spesifik dengan template.

c. Suhu leleh (Tm) dan suhu penempelan (Ta)

Suhu leleh (Tm) merupakan temperatur yang mana 50 % dari untai ganda

DNA terpisah menjadi untai tunggal. Secara teoritis Tm suatu primer dapat

ditentukan dengan rumus [2(A+T)+ 4(G+C)]. Sebaiknya Tm berkisar

antara 50-65oC. Tm mengindikasikan stabilitas hibrida sehingga juga

menentukan suhu penempelan dalam PCR. Suhu leleh yang terlalu tinggi

mengakibatkan rendahnya tingkat hibridisasi primer dengan template

sehingga menurunkan efisiensi dari reaksi PCR. Suhu leleh yang terlalu

rendah juga dapat menghasilkan produk yang tidak spesifik akibat

terjadinya mispriming.

d. Interaksi primer-primer

Interaksi primer-primer seperti self-homology (terbentuknya hairpin) dan

cross-homology harus dihindari, demikian juga dengan terjadinya

mispriming pada daerah lain yang tidak dikehendaki. Untuk

memastikannya dapat dilakukan analisis BLAST melalui laman NCBI.

Adanya interaksi primer-primer dapat menyebabkan spesifisitas primer

menurun selain itu konsentrasi primer yang digunakan menjadi berkurang

dengan terjadinya mispriming. Keadaan tersebut akan berpengaruh pada

efisiensi proses PCR.


BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

3.1.1 Tempat

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Analisis Obat dan Pangan halal,

Laboratorium Penelitian 2, Laboratorium Kimia Obat, Laboratorium Biologi, dan

Laboratorium Biokimia dan Patologi Klinik, Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan, Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

3.1.2 Waktu

Penelitian ini dilakukan pada bulan Februari 2017 hingga Juni 2017.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Mesin RT-PCR (Light Cycler® 480-Roche), multiwell plate 96 (Roche),

sealing foil (Roche), mikropipet 0,5-10 µl (Biorad), mikropipet 20-200 µl

(Biorad), mikropipet 100-1000 µl (Biorad), microtips volume 10 µl, 200 µl dan

1000 µl (Genfollower), spektrofotometer UV DNA (DeNovix®), sentifugator

(5417R- Eppendorf), vortex, microsentrifuge tube volume 1,5 ml (Biogenix),

digital waterbath (SB-100 Eyela), autoklaf, alluminium foil, gelas beaker (Pyrex),

pisau steril, blender, hair dryer, sterofoam, dan timbangan analitik.

3.2.2 Bahan

Daging sapi segar, daging kambing segar, satu set kit komersial High Pure

Template Preparation Promega® (meliputi : Nuclei Lysis Buffer, RNAse Solution,

Protein Precipitation Solution, dan DNA Rehidration), probe master (dNTP mix,

enzim FastStart Taq DNA Polimerase, dan 6,4 mM MgCl2), aquabidest, etanol

70%, isopropanol, primer-probe kambing, dan primer-probe sapi ( Tabel 3.1).

20


Tabel 3.1 Urutan basa primer 12S DNA mitokondria dan UPL 83 kambingdan sapi (Roche® ) yang digunakan

Nama Primer Runutan Basa

Kambing Forward 5’-CGCCGTATTCCTGTTAGCTT-3’Reverse 5’-ACCAGGGTTGGTAAATCTCGT-3’UPL 5’-(FAM)-CAGCCACC-3’

Sapi Forward 5’-TGAGGGGGTGTGTTGAGTG-3’Reverse 5’-TACTATTCGCACCCGACCTC-3’UPL 5’-(FAM)-GACCCAGA-3’

3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1 Ekstraksi dan Isolasi DNA

Proses ekstraksi dan isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan kit

komersial High Pure PCR Template Preparation (Promega®).

1. Preparasi Sampel (Promega®, 2012)

Daging sapi segar dan daging kambing segar dicincang menggunakan

pisau steril. Setelah daging cukup hancur dihaluskan kembali

menggunakan blender sampai daging benar-benar halus. Sebanyak 20 mg

masing-masing daging dimasukkan ke dalam microsentrifuge tube.

Kemudian ke dalam tube tersebut masing-masing ditambahkan 600 µl

Nuclei Lysis Buffer. Campuran di vortex selama 1 menit kemudian di

inkubasi dalam digital waterbath pada suhu 65oC selama 15-30 menit.

Larutan yang diperoleh kemudian digunakan untuk tahap isolasi DNA.

2. Proses Ekstraksi dan Isolasi DNA (Promega®, 2012)

Larutan daging sapi dan daging kambing yang telah di inkubasi,

masing-masing ditambahkan 3 µl RNase solution. Campuran di vortex

selama 10 detik dan di inkubasi kembali dalam digital waterbath pada

suhu 37oC selama 30 menit. Kemudian didinginkan pada suhu ruang

(25oC). Campuran ditambahkan 200 µl protein precipitation solution.

Campuran divortex dan didinginkan dalam es salju selama 5 menit.

Setelah itu disentrifugasi dengan kecepatan 13.000-16.000 x g selama 4

menit.

21


Supernatan dipisahkan kemudian dimasukkan ke dalam microtube

yang berisi 600 µl isopropanol, campur dengan membolak-balik

microtube. Setelah itu sentrifugasi dengan kecepatan 13.000-16.000 x g

selama 1 menit. Supernatan di buang dan di tambahkan 600 µl etanol 70%,

vortex dan sentrifugasi kembali. Supernatan di buang dan pellet yang

terbentuk dikeringkan menggunakan hair dryer kemudian tambahkan 100

µl DNA Rehydration Solution kemudian diinkubasi pada suhu 65oC

selama 1 jam atau pada suhu 4oC selama 1 malam (overnight). DNA yang

telah di purifikasi di simpan pada suhu 2-8 oC.

3.3.2 Pengukuran Kemurnian dan Kuantitas DNA

Kemurnian dan kuantitas DNA di ukur dengan menggunakan

spektrofotometer UV-DNA (DeNovix ®). Proses pengukuran mengikuti

protokol dari (DeNovix®) dengan cara pada layar spektrofotometer UV DNA

(DeNovix®) dipilih Nucleat Acid. Selanjutnya, sample port dibersihkan

menggunakan tissue steril. Kemudian sample port di teteskan aquabides 1 µl

sebagai blanko (tekan tombol blank). Sebanyak 1 µl isolat DNA dari masing-

masing sampel (daging sapi, dan daging kambing) diteteskan ke bagian sample

port untuk di ukur kemurnian dan kuantitas DNA dengan menekan tombol

measure. Tunggu beberapa detik akan muncul data kemurnian dan kuantitas

DNA.

3.3.3 Uji Spesifisitas Primer dan Probe dengan Database NCBI

Uji spesifisitas primer dan probe dilakukan dengan melakukan BLAST

melalui database NCBI. Pada halamam “BLAST”, dipilih menu “nucleotide

blast”. Kemudian pada kolom “Enter Query Sequence” dimasukkan urutan basa

primer yang akan diuji. Tombol “BLAST” kemudian diklik. Data hasil

pengujian berupa daftar spesies yang memiliki kemiripan 99-100% dengan

urutan basa primer yang diuji (NCBI).

3.3.4 Amplifikasi DNA dengan metode Real-Time PCR (Roche®,2006)

3.3.4.1 Pembuatan Primer 50 µM dari Larutan Induk 100 µM

Larutan induk primer dengan konsentrasi 100 µM dibuat dan dimasukkan

ke dalam tube. Kemudian larutan primer tersebut di encerkan menjadi 50 µM

22


dengan mengambil 50 µM larutan primer dan menambahkan aquabidest 50 µl

kemudian di simpan dalam tube lainnya. Larutan dihomogenkan dengan menaik-

turunkan pegas pada mikropipet.

3.3.4.2 Pembuatan Primer 5 µM dari Larutan Induk 50 µM

Primer diencerkan kembali menggunakan aquabidest menjadi 5 µM.

Diambil 3 µl larutan induk primer 50 µM lalu ditambahkan aquabidest 27 µl lalu

homogenkan dengan menaik-turunkan pegas pada mikropipet.

3.3.4.3 Pembuatan Universal ProbeLybrary Mastermix

Master mix dibuat dengan volume total 20 µl yang terdiri dari 5 µl DNA

template, 3.8 µl Aquabidest, 0.4 µl primer forward konsentrasi 5 µM, 0.4 µl

primer reverse konsentrasi 5 µM, 0,4 µl probe konsentrasi 10 µM dan 10 µl

LyghtCycler®480 probe master (enzim Taq DNA Polymerase, dNTP mix, dan 6.4

mM MgCl2).

3.3.4.4 Loading Sampel dan UPL Mastermix

Sebanyak 5 µl DNA template dan 15 µl master mix dimasukkan ke

dalam multiwell plate pada well yang diinginkan dan ditutup dengan sealing foil.

Dilakukan proses pengaturan program LightCycler® 480 Real-Time PCR yang

akan digunakan untuk proses amplifikasi. Setelah campuran reaksi total PCR dan

program amplifikasi telah siap, campuran reaksi total PCR kemudian diletakkan

pada mesin RT-PCR. Instrumen RT-PCR akan mengamplifikasi DNA secara

otomatis dan langsung memberikan hasil amplifikasi melalui monitor dalam

bentuk kurva.

23


Tabel 3.2 Pengaturan program amplifikasi RT-PCR

Analisis dengan Primer-probe KambingJumlah Siklus Suhu (oC) Waktu

Pre-incubation 1 95 10 menitAmplification 45 95

6072

10 detik30 detik1 detik

Cooling 1 40 30 detik

Analisis dengan Primer-probe SapiJumlah Siklus Suhu (oC) Waktu

Pre-incubation 1 95 10 menitAmplification 45 95

6072

10 detik30 detik1 detik

Cooling 1 40 30 detik


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pada penelitian ini, dilakukan uji spesifisitas primer kambing terhadap DNA

daging sapi dengan menggunakan metode RT-PCR. Spesifisitas primer dilihat

melalui hasil kurva amplifikasi dan nilai CP (crossing point) yang muncul. Dari

hasil kurva amplifikasi dilihat apakah primer kambing dapat mengamplifikasi

DNA kambing secara spesifik atau tidak. Hasil analisis didapat melalui beberapa

tahap diantaranya isolasi DNA, pengukuran kemurnian dan kuantifikasi DNA

hasil isolasi, amplifikasi DNA dan analisis hasil amplifikasi.

4.1 Isolasi DNA

Isolasi DNA dilakukan terhadap daging sapi dan daging kambing. Metode

isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan Wizard Genomic DNA Purification

Kit Promega®. Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu

sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan

substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya

sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan

substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut

dilakukan di dalam sebuah mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi,

contohnya 2500 rpm (rotasi per menit) atau 3000 rpm (Kimball 2005:4; Lewiston

2002:1-3).

Isolasi DNA dalam jaringan hewan secara umum memiliki beberapa tahap

diantaranya preparasi jaringan hewan, pelisisan sel, degradasi RNA, presipitasi

dan purifikasi dan rehidrasi DNA. Sebelum masuk ke dalam tahap isolasi,

dilakukan preparasi jaringan hewan dengan cara menghaluskan daging kambing

dan daging sapi menggunakan pisau steril dan blender. Hal ini bertujuan untuk

merusak dinding sel secara mekanik sehingga DNA dapat keluar dari dalam sel.

Tahap kedua adalah pelisisan membran sel dan nukleus secara kimia yang

dilakukan dengan menambahkan Nuclei Lysis Solution (NLS).

25


NLS adalah senyawa yang mengandung detergen seperti etilendiamin tetra asetat

(EDTA) atau sodium dodesil sulfat (SDS). EDTA berperan dalam

mempertahankan integritas DNA hasil isolasi dengan cara mengikat ion

magnesium yang merupakan kofaktor esensial bagi enzim nuklease yang mampu

mendegradasi DNA sedangkan SDS merupakan detergen yang dapat merusak

integritas membran sel dengan cara mengikat lipid yang terdapat pada membran

sel sehingga struktur membran akan rusak dan melisiskan isi sel. (Izzah, 2014;

Yagi et.al 1996). NLS dapat berperan sebagai pengganti senyawa kimia yang

mampu merusak dinding dan membran sel. NLS digunakan untuk melisiskan

membran sel dan nukleus dengan mengganggu ikatan kimia membran sel

(Nurfadila, 2015). Daging kambing dan daging sapi yang telah ditambahkan NLS

dihomogenkan selama 10 detik lalu diinkubasi pada suhu 65oC selama 30 menit.

Hal ini bertujuan untuk mengoptimalkan proses pelisisan membran sel dan

nukleus.

Tahap ketiga yaitu penambahan RNAse solution. RNAse merupakan enzim

yang dapat mendegradasi RNA. Penambahan RNAse berfungsi untuk

menghancurkan RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh. Suhu inkubasi

yang digunakan setelah RNAse ditambahkan yaitu selama 30 menit pada suhu 37oC.

Hal ini bertujuan untuk mengoptimalkan proses pendegradasian RNA oleh RNAse

(Nurfadila, 2015). Setelah degradasi RNA, tahap keempat dilakukan penambahan

protein precipitation solution (PPS) untuk membersihkan debris protein. Peran

dari PPS untuk mengendapkan protein agar DNA yang akan diekstraksi tidak

terkontaminasi oleh protein-protein sel. Proses pembersihan debris protein dapat

dimaksimalkan dengan menginkubasi on-ice selama 5 menit lalu disentrifugasi

pada 13.000 x gravitasi selama 4 menit. DNA dipisahkan dari debris jaringan dan

protein dengan sentrifugasi dengan landasan bahwa debris sel dan protein dengan

molekul lebih besar akan mengendap (Angelin, 2009). PPS dapat mengendapkan

protein dengan cara menurunkan kelarutan protein. Kandungan yang terdapat

didalam PPS biasanya terdiri dari garam netral seperti amonium sulfat, pelarut

organik seperti etanol atau aseton, dan zat pengendap lainnya seperti asam

trikloroasetat (Ngili, 2013).

26


Tahap kelima dilakukan penambahan isopropanol pada supernatan yang

telah dipisahkan dari debris sel dan protein. Penambahan isopropanol ini

bertujuan untuk melarutkan lemak, garam alkohol dan mengendapkan DNA.

Menurut Angelin (2009) presipitasi DNA dengan alkohol dapat dilakukan dengan

menggunakan alkohol absolut atau isopropanol. Kedua alkohol tersebut memiliki

sifat berbeda, yaitu: (1) Etanol lebih volatil dibandingkan dengan isopropanol

sehingga pelet dapat di keringudarakan tanpa vakum, (2) Etanol lebih efektif

dibandingkan dengan isopropanol dalam melarutkan garam sehingga garam tidak

tertinggal pada pelet DNA, (3) Etanol membutuhkan 2.5 kali volume total

suspensi DNA untuk dapat mempresipitasi DNA, sedangkan isopropanol cukup

dengan 1 kali volume total, dan (4) Akibat kepolarannya, etanol lebih lama

mengendapkan DNA dibandingkan dengan isopropanol.

Setelah DNA mengendap, supernatan kemudian dibuang dan ditambahkan

etanol 70%. Etanol 70% akan melarutkan garam NH3+ yang masih terdapat pada

isolat DNA, tanpa melarutkan asam nukleat (Angelin, 2009). Sentrifugasi

dilakukan kembali untuk mengendapkan DNA. DNA yang telah murni lalu

ditambahkan DNA rehydration solution untuk melarutkan DNA. DNA yang telah

ditambahkan DNA rehydration solution diinkubasi pada suhu 65oC selama 1 jam

yang bertujuan untuk mempercepat proses pelarutan DNA kemudian disimpan

pada suhu 4oC.

4.2 Hasil Analisis Isolat DNA dengan Spektrofotometri UV

Isolat DNA yang diperoleh dari proses isolasi DNA, dilakukan pengukuran

konsentrasi dan kemurnian dengan menggunakan spektrofotometri DNA

(DeNovix®). Pengukuran isolat dilakukan pada panjang gelombang 260 nm dan

280 nm, sedangkan tingkat kemurnian DNA dapat ditentukan dengan cara

menghitung rasio antara nilai A260 dan A280 (Muladno, 2010). DNA murni dapat

menyerap sinar ultraviolet karena keberadaan basa-basa purin dan pirimidin. Pita

ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada panjang gelombang 260 nm

sedangkan kontaminan protein akan menyerap cahaya pada panjang gelombang

280nm (Fatchiyah dkk, 2011).

27


Hasil pengukuran terlihat pada tabel dibawah ini :

Tabel 4.1 Konsentrasi dan kemurnian isolat DNA

No Sampel Konsentrasi Kemurnian (A260/280)

1 DNA DagingKambing

22.529 ng/µl 1,70

6.296 ng/µl 1,98

2 DNA Daging Sapi50.772 ng/µl 1,7912.452 ng/µl 1,87

Berdasarkan hasil pengukuran konsentrasi isolat DNA yang terlihat pada

tabel 4.1, konsentrasi DNA tertinggi terdapat pada DNA daging sapi yaitu sebesar

50.772 ng/µl, sedangkan konsentrasi DNA terendah terdapat pada DNA daging

kambing yaitu sebesar 6.296 ng/µl. Meskipun konsentrasi DNA daging kambing

rendah, namun masih dapat dipakai untuk tahap amplifikasi DNA menggunakan

RT-PCR karena batas konsentrasi minimal isolat DNA untuk RT-PCR adalah 0.1-

500 ng (Roche). Perbedaan konsentrasi DNA yang dihasilkan dapat disebabkan

oleh beberapa faktor. Salah satu faktor yang mempengaruhi adalah jumlah

sampel. Bobot sampel yang terlalu besar akan mempersulit proses penghancuran

sampel di dalam tabung effendorf, sedangkan jika bobot sampel yang digunakan

terlalu sedikit maka akan sedikit pula konsentrasi DNA yang dihasilkan

(Aryahiyyah, 2014). Kondisi daging dan tingkat kehalusannya juga dapat

mempengaruhi konsentrasi DNA yang dihasilkan. Hilangnya DNA saat

pemindahan serial juga dapat menyebabkan rendahnya konsentrasi DNA yang

dihasilkan (Fatchiyah dkk, 2011).

Pengukuran kemurnian isolat DNA menunjukkan bahwa DNA daging sapi

dan daging kambing hasil isolasi kedua memiliki nilai kemurnian berkisar antara

1.8-2.0, sedangkan DNA daging sapi dan daging kambing hasil isolasi pertama

memiliki nilai kemurnian dibawah 1.8-2.0. Nilai rasio yang lebih rendah dari 1.8

menunjukkan adanya kontaminasi protein sedangkan nilai rasio melebihi 2.0

menunjukkan adanya kontaminasi RNA (Teare et al, 1997). Kemurnian DNA

daging sapi dan daging kambing hasil isolasi pertama masih berada dibawah 1.8

yang menunjukkan kemungkinan adanya kontaminasi protein. Hal ini dapat

disebabkan oleh proses presipitasi protein yang kurang optimal. Ketelitian dalam

28


pengambilan supernatan yang mengandung DNA sangat diperlukan untuk

mendapatkan isolat DNA yang murni.

4.3 Hasil Uji Spesifisitas Primer dan Probe dengan Database NCBI

Runutan basa primer dan probe yang diperoleh dari hasil rancangan yang

dilakukan oleh pihak Roche®, dianalisa secara in silico dengan cara BLAST

berdasarkan informasi database NCBI melalui internet. Tujuan dari proses ini

adalah untuk mengetahui apakah primer dan probe yang digunakan merupakan

primer-probe spesifik yang hanya mengamplifikasi satu jenis spesies. Hasil

rancangan primer yang dilakukan oleh Roche® mempunyai urutan basa sebagai

berikut :

Tabel 4.2 Urutan primer 12S DNA mitokondria kambing dan sapi hasilrancangan Roche®

Nama Primer Runutan Basa

Kambing Forward 5’-CGCCGTATTCCTGTTAGCTT-3’Reverse 5’-ACCAGGGTTGGTAAATCTCGT-3’UPL 5’-(FAM)-CAGCCACC-3’

Sapi Forward 5’-TGAGGGGGTGTGTTGAGTG-3’Reverse 5’-TACTATTCGCACCCGACCTC-3’UPL 5’-(FAM)-GACCCAGA-3’

Hasil BLAST dari database NCBI, primer forward kambing, primer reverse

kambing, dan probe kambing menunjukkan bahwa primer-probe yang digunakan

spesifik untuk DNA kambing dengan nilai maksimum identitas 100%. Dari uji

spesifisitas ini tidak terdapat kemiripan dengan sapi. DNA target yang akan

diamplifikasi adalah DNA mitokondria region 12S. Analisis dengan target DNA

mitokondria dinilai lebih menguntungkan karena DNA mitokondria tersedia

dalam jumlah hingga ratusan ribu kopi pada tiap sel, sehingga dapat digunakan

untuk analisis dengan jumlah sampel sangat terbatas serta dapat memberikan

kemungkinan yang lebih besar untuk mendapatkan hasil pengujian yang positif

bahkan saat DNA telah terfragmentasi akibat dari proses pengolahan (Bellagamba

dkk., 2001; Randi, 2009).

29


Gambar 4.1 Hasil Uji spesifisitas primer kambing dengan BLAST melaluidatabase NCBI

Hasil BLAST dari database NCBI pada primer-probe sapi juga

menunjukkan bahwa primer-probe sapi yang digunakan spesifik untuk DNA sapi

dengan nilai maksimum identitas 100%. Dari uji spesifisitas ini tidak terdapat

kemiripan dengan kambing. DNA target yang akan diamplifikasi adalah DNA

mitokondria region sitokrom b (cyt b).

Gambar 4.2 Hasil Uji spesifisitas primer sapi dengan BLAST melaluidatabase NCBI

4.5 Amplifikasi DNA Daging Kambing Menggunakan RT-PCR

Amplifikasi DNA daging kambing dilakukan dengan menggunakan primer

kambing. Penggunaan primer kambing digunakan untuk mengkonfirmasi bahwa

primer kambing tersebut hanya bisa mengamplifikasi DNA kambing. Konsentrasi

primer pada PCR yang dianjurkan berkisar antara 0,1- 0,5 µM. Pada penelitian ini

digunakan konsentrasi primer yang rendah yaitu 0,1 µM. Konsentrasi primer yang

tinggi (≥ 0,5 µM) dapat meningkatkan kesalahan penempelan primer pada DNA

30


cetakan, sehingga menyebabkan penumpukan primer yang tidak spesifik. Namun,

penggunaan konsentrasi primer yang terlalu rendah akan memberikan hasil

amplifikasi yang tidak jelas (Vesti, 2017). Program amplifikasi yang digunakan

pada RT-PCR dipilih berdasarkan penanda yang digunakan. Penelitian ini

menggunakan UPL sebagai penanda pada reaksi RT-PCR sehingga program yang

digunakan dapat di lihat pada tabel 4.3 di bawah ini:

Analisis kurva amplifikasi dilihat dari kenaikan kurva dan nilai CP

(crossing point) pada kurva amplifikasi. Cp adalah jumlah siklus dimana sampel

mulai terbaca diatas arbitraty fluorescence level (AFL) yang menunjukkan awal

mulainya fase pertumbuhan eksponensial. Oleh karena itu, semakin rendah nilai

CP maka semakin tinggi konsentrasi DNA target. Tm adalah suhu dimana 50%

bagian dari DNA telah terbuka menjadi untai tunggal. Nilai Tm tergantung dari

jumlah basa A, G, T dan C. Primer yang akan menghasilkan satu puncak Tm pada

DNA target (Sambrook et al, 2001; Izzah, 2014).

31


4.4.1 Hasil Amplifikasi DNA Daging Kambing, Daging Sapi, dan NTC

Menggunakan Primer Kambing

Amplifikasi DNA dilakukan dengan menggunakan primer kambing.

Amplifikasi ini dilakukan untuk mengetahui apakah primer kambing yang

digunakan spesifik atau tidak terhadap daging kambing. Kurva amplifikasi DNA

daging kambing, daging sapi, dan NTC menggunakan primer kambing dapat

dilihat pada gambar di bawah ini :

Gambar 4.3 Kurva amplifikasi daging kambing, daging sapi, dan NTCmenggunakan primer kambing (isolat pertama)

Keterangan : PKK = Primer Kambing, DNA Kambing; PKS = Primer Kambing, DNA Sapi; NTCPS = No Template Control Primer Kambing

Pada gambar 4.3, nilai CP hasil amplifikasi DNA daging kambing 12.61 dan

daging sapi 11.46, sedangkan pada NTC tidak terdapat nilai CP. Nilai CP yang

dihasilkan oleh daging kambing dan daging sapi menunjukkan telah terjadi proses

amplifikasi sedangkan pada NTC tidak terjadi proses amplifikasi.

Teramplifikasinya daging sapi menggunakan primer kambing bisa disebabkan

oleh beberapa faktor diantaranya terjadi primer dimer, adanya kontaminasi daging

kambing pada isolat daging sapi, kondisi PCR yang tidak optimum atau karena

primer yang digunakan tidak spesifik untuk daging kambing. Primer dimer

merupakan proses saling berikatannya primer yang teramplifikasi dan

32


terkuantifikasi sehingga menghasilkan data false-positive (Pestana et al, 2010).

Terjadinya primer dimer dapat dilihat dengan teramplifikasinya NTC, namun pada

kurva yang dihasilkan tidak terjadi amplifikasi pada NTC. Faktor yang kedua

adalah adanya kemungkinan terjadi kontaminasi dan kondisi PCR yang tidak

optimum. Untuk mengkonfirmasi adanya kontaminasi dan kondisi PCR yang

tidak optimum maka dilakukan isolasi DNA kembali dan di running dengan

kondisi PCR yang sama. Kurva hasil amplifikasi DNA daging kambing (isolat

kedua), daging sapi (isolat kedua), dan NTC menggunakan primer kambing dapat

dilihat pada gambar dibawah ini:

Gambar 4.4 Kurva amplifikasi daging kambing, daging sapi dan NTCmenggunakan primer kambing (isolat kedua)

Keterangan : PKK = Primer Kambing, DNA Kambing; PKS = Primer Kambing, DNA Sapi; NTCPS = No Template Control Primer Kambing

Pada gambar 4.4, DNA daging sapi masih dapat teramplifikasi

menggunakan primer kambing. Hal ini ditandai dengan dihasilkannya nilai CP

pada daging sapi yaitu 19.30, sedangkan nilai CP untuk daging kambing adalah

17.10. Meskipun sudah dilakukan isolasi DNA kembali, namun masih terdapat

produk non spesifik pada kurva amplifikasi. Berdasarkan hasil uji spesifisitas

dengan menggunakan database NCBI, primer kambing memiliki nilai similarity

sebesar 100% dengan DNA cetakan. Hal ini menunjukkan bahwa primer kambing

33


tersebut spesifik. Munculnya produk non spesifik kemungkinan disebabkan oleh

kondisi PCR yang tidak sesuai untuk primer yang digunakan.

Menurut Borah (2011), analisis yang dilakukan dengan menggunakan

metode RT-PCR dengan penanda non-spesifik seperti UPL membutuhkan primer

yang spesifik dan berbagai optimasi terhadap primer tersebut untuk memastikan

spesifisitas dari reaksi PCR. Altshuter (2006) juga menyebutkan bahwa

munculnya produk non spesifik dapat dikurangi dengan optimasi kondisi running.

Salah satu tahap yang penting dalam reaksi PCR adalah tahap annealing.

Pada tahap annealing ini yang mempengaruhi keberhasilan amplifikasi adalah

suhu karena penempelan primer pada utas DNA yang terbuka memerlukan suhu

yang optimal. Jika suhu terlalu tinggi akan menyebabkan gagalnya amplifikasi

karena tidak terjadi penempelan primer sebaliknya jika suhu terlalu rendah

menyebabkan primer menempel pada sisi lain genom akibatnya DNA yang

terbentuk memiliki spesifisitas rendah, sehingga sangat penting untuk mencari

suhu annealing yang optimum bagi proses amplifikasi (Rybicky, 1996).

Pada penelitian ini, suhu annealing yang digunakan adalah 60oC, namun

suhu annealing ini tidak sesuai untuk primer kambing sehingga muncul produk

non spesifik (DNA sapi dapat teramplifikasi). Perlu dilakukan optimasi suhu

annealing menggunakan PCR konvensional untuk mengetahui kondisi yang

spesifik dan melihat besar amplikon yang terbentuk. Tujuan optimasi suhu

annealing adalah untuk mengetahui pengaruh suhu annealing terhadap

keberhasilan amplifikasi DNA sehingga didapat suhu annealing yang paling

optimum untuk mendapatkan kualitas DNA hasil PCR yang cukup banyak dengan

spesifisitas yang cukup tinggi.

Untuk mendapatkan kondisi PCR yang optimal secara umum dapat

dilakukan dengan cara memvariasikan kondisi yang digunakan pada proses PCR

tersebut.Variasi suhu annealing yang dapat digunakan dalam optimasi kondisi

PCR berkisar antara suhu 50-65oC. Menurut Sambrook dan Russel (2001:8.8),

suhu annealing yang baik berkisar antara 3-5oC dari nilai melting temperature

(Tm) primer.

34


Berdasarkan hasil uji spesifisitas menggunakan database NCBI diketahui

bahwa kedua primer yang digunakan tidak memiliki kemiripan dengan Bos taurus

dan Capra hircus namun primer forward kambing memiliki kemiripan dengan

Bos grunniens dan primer forward sapi memiliki kemiripan dengan Capra

silindricornis. Untuk mengkonfirmasi apakah kemiripan dengan spesies yang

berbeda ini berpengaruh terhadap spesifisitas primer, maka dilakukan amplifikasi

sampel menggunakan primer sapi. Kurva amplifikasi DNA daging sapi, daging

kambing dan NTC dapat dilihat pada gambar dibawah ini :

Gambar 4.5 Kurva amplifikasi daging sapi, daging kambing, dan NTCmenggunakan primer sapi

Keterangan : PSK = Primer Sapi, DNA Kambing; PSS = Primer Sapi, DNA Sapi; NTC PS = NoTemplate Control Primer Sapi

Pada tabel 4.5, nilai CP hasil amplifikasi DNA daging sapi adalah 22.11

sedangkan pada DNA daging kambing dan NTC tidak terdapat nilai CP. Nilai CP

yang dihasilkan oleh daging sapi menunjukkan telah terjadi proses amplifikasi

sedangkan pada daging kambing dan NTC tidak terjadi proses amplifikasi. Hal ini

menunjukkan bahwa primer sapi dapat mengamplifikasi DNA daging sapi secara

spesifik. Berdasarkan hasil amplifikasi tersebut, maka primer sapi ini dapat

digunakan untuk membedakan antara DNA daging kambing dan daging sapi.

35


Meskipun primer sapi memiliki kemiripan dengan Capra silindricornis,

namun primer sapi yang dipakai dapat mengamplifikasi DNA daging sapi secara

spesifik. Hal ini menunjukkan bahwa kemiripan tersebut tidak terlalu berpengaruh

terhadap spesifisitas primer.

Kondisi running RT-PCR yang digunakan pada penelitian ini berupa

denaturasi 95oC (10 detik), annealing 60oC (30 detik) dan ekstensi 72oC (1 detik)

spesifik untuk primer sapi dan tidak spesifik untuk primer kambing yang

digunakan yang memiliki suhu disosiasi (melting temperatur) sebesar 60oC untuk

primer forward dan 62oC untuk primer reverse. Untuk mengetahui suhu optimum

primer kambing perlu dilakukan optimasi suhu annealing.


BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Kondisi running yang digunakan dalam penelitian yang meliputi denaturasi

95oC (10 detik), annealing 60oC (30 detik) dan ekstensi 72oC (1 detik) tidak

spesifik untuk primer kambing (Capra hircus) dengan urutan basa primer

forward 5’CGCCGTATTCCTGTTAGCTT-3’ dan basa reverse 5’-

ACCAGGGTTGGTAAATCTCGT-3’ sehingga muncul produk non spesifik.

5.2 Saran

Optimasi suhu annealing perlu dilakukan untuk mendapatkan suhu optimum

yang sesuai untuk running primer kambing dengan urutan basa primer forward

5’CGCCGTATTCCTGTTAGCTT-3’ dan basa primer reverse

5’ACCAGGGTTGGTAAATCTCGT-3’ agar diperoleh kurva amplifikasi yang

lebih baik dengan spesifisitas tinggi.


DAFTAR PUSTAKA

Altshuler ML. 2006. PCR Troubleshooting: The Essential Guide. CaisterAcademic Press. Moscow

Anderson, S., et al. 1981. Sequence and Organization of Human MitochondrialGenome. International weekly journal of science. Vol 290, 457-465. doi:10.1038/290457a0.

Anonim, 2006a. Real-Time PCR Applications Guide. Bio-Rad Laboratories Inc,USA.

Anonim, 2010. Guidelines On Performace Criteria and Validation of Methods forDetection, Identification and Quantification of Specifik DNA Sequences andSpecific Protein in Foods. Codex Alimentarus Comission,74: 1–22.

Anonim, 2014a. Real-Time PCR Handbook, Ketiga. ed. Thermo Fisher Scientific

Anonim, 2016. Waspadalah! Beredar Sate Daging Kambing DiCampur DagingAnjing.http://www.jurnalmuslim.com/2016/01/waspadalah-beredar-sate-daging-kambing-dicampur-daging-anjing.html. diakses tanggal 23 februari2017 pukul 22.00

Angelin. 2009. Studi Streptococcus Pneumoniae pada Rongga Mulut [Skripsi].Makassar (ID): Universitas Hasannudin.

Aryahiyyah, I. 2014. Verifikasi Metode Ekstraksi Fenol Kloroform untuk IsolasiDNA pada Daging dan Produk Olahan [skripsi]. Bogor (ID): InstitutPertanian Bogor.

Bellagamba, F., Moretti, V.M., Comincini, S., dan Valfre, F., 2001. Identificationof Species in Animal Feedstuffs by Polymerase Chain Reaction-RestrctionFragment Length Polymorphism Analysis of Mitochondrial DNA. Journal ofAgricultural and Food Chemistry, 49: 3775–3781.

Borah, P., 2011. Primer Designing for PCR. Science Vision, , Colloquium 11:134–136.

Burns, Malcolm J., Gavin J Nixon., Carole A Foy., Neil Harris. 2005.Standardisation of Data from Real-time Quantitative PCR Methods –Evaluation of Outliers and Comparison of Calibration Curves. BMCBiotecnology doi.10.1186/1472-6750-5-31

Campbell, A. N. J. B. Reece & L. G. Michell. 2014. Biologi. Edisi 8 jilid 1. terj.Erlangga. Jakarta

Clark,D.P.2005. Molecular Biology. Academic Press. New York: 789 hlm.

38


Elrich, H.A., 1989. PCR Technology: Principles and Applications for DNAAmplification. Stockton Press, New York, USA.

Fatchiyah, Widyarti, Sri dkk., 2011. Biologi Molekuler Prinsip Dasar Analisis.Jakarta: Erlangga

Fumiere, O., M. Dubois, V. Baeten, C. von Holst, and G. Berben. 2006. EffectivePCR Detection of Animal Species in Highly Processed Animal by Productsand Compound Feeds. Anal. Bioanal. Chem. 385:1045–1054

Gaffar, Shabrani, M.Si. 2007. Buku Ajar Bioteknologi Molekul. Bandung :Universitas Padjajaran

Handoyo, D. dan Rudiretna, A., 2000. Prinsip Umum Dan PelaksanaanPolymerase Chain Reaction (Pcr).Unitas, 9: 17–29.

Hidayat, Rian. 2015. Perbandingan Metode Kit Komersial Dan SDS Untuk IsolasiDNA Babi Dan DNA Sapi Pada Simulasi Cangkang Kapsul Keras UntukDeteksi Kehalalan Menggunakan Real Time PCR (Polymerase ChainReaction). Skripsi. Program Studi Farmasi. Fakultas Kedokteran dan IlmuKesehatan. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Heid, C.A., Stevens, J., Livak, K.J., dan Williams, P.M., 1996. Real-timeQuantitative PCR.Genome Research, 6: 986–994.

Izzah, A. N. 2014. Perbandingan antara Metode SYBR Green dan MetodeHydrolisis Probe dalam Analisis DNA Gelatin Sapi dan DNA Babi denganmenggunakan Real-Time PCR. Skripsi. Program Studi Farmasi. FakultasKedokteran dan Ilmu Kesehatan. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Jain, Shally. 2004, Use Of Cytochrome B Gene Variability In Detecting MeatSpecies By Multiplex PCR Assay, Department Of Veterinary Public Health,College Of Veterinary Science & Animal Husbandry, Anand AgriculturalUniversity, Anand.

Joshi, M. dan Deshpande, J.D., 2010. Polymerase Chain Reaction: Methods,Principles, and Application. International Journal of Biomedical Research,1: 81–97.

Karp, Gerald. 2009. Cell and Molecular Biology Concept and Experiment 6thedition.New York : John Willey & Sons, Inc.

Kimball. J.W. 2005. Biologi Jilid 3 Edisi Kelima. Jakarta. Erlangga.

Lewiston, R. 2002. Human genetics: Concepts and Applications. The McGraw-Hills Company, Inc., Boston: xviii + 454 hlm.

39


Marlina, Mutalib, S.A., Islami, S.N., Sari, H.K., dan Fitria, A., 2013.Pengembangan Metode PCR dan Southern Hybridization untuk Deteksi GenBabi pada Cangkang Kapsul. Dipresentasikan pada Prosiding SeminarPerkembangan Terkini Sains Farmasi dan Klinik III, Padang, Indonesia.

Muladno, 2010. Teknologi Rekayasa Genetik Edisi Kedua. Bogor : IPB Press

Ngili, Yohanis. 2013. Biokimia Dasar. Bandung: Rekayasa Sains

Nurfadila, Mifa. 2015. Isolasi DNA Stomatopoda Sp dan DrosophilaMelanogaster. Blokspot.co.id

Panggabean, Syaiful Rahmad. 2012. Prinsip Kehalalan dan Keharaman PanganDalam Islam. http://10262198.siap-sekolah.com/2012/01/03/prinsip-kehalalan-dan-keharaman pangan-dalam-islam/#WOJrKSc-Ywg/. diakses 2April 2017 pukul 22:46

Pratami, Dienar Fitri. 2011. Analisis Cemaran Daging Babi Pada Produk BurgerSapi yang Beredar Di Wilayah Ciputat Melalui Amplifikasi DNAmenggunakan Real-Time PCR. Skripsi.Program Studi Farmasi, FakultasKedokteran dan Ilmu Kesehatan. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Pelt-Verkuil, E. van, Belkum, A. van, dan Hays, J.P., 2008. Principles andTechnical Aspects of PCR Amplification. Springer Science & BusinessMedia.

Pestana EA, Belak S, Diallo A, Crowther JR, Viljoen GJ. 2010. Early, Rapid, andSensitive Veterinary Molecular Diagnostics Real-Time PCR Application.Springer. Dordrecht

Promega. 2007. Technical Manual Maxwell® 16 Instrument Operating Manual.http://www.promega.com. diakses pada 06 April 2017 pukul 18.08

Promega. 2012. Wizard Genomic DNA Purification Kit. Promega Corp, USA:21 hlm

Randi, E., 2009. Mitochondrial DNA, dalam: Molecular Methods in Ecology.John Wiley & Sons, Oxford, hal. 136.

Rybicky,E.P. 1996. PCR Primer Design and Reaction Optimisation. In MoleculerBiology Techniques Manual. Ed. V.E. Coyne, M.D. James,S.J. Reid &E.P.Rybicki.Dept.Of Microbiology.Univ. Cape Town

Robert W, Carter. 2007. Mitochondrial Diversity within Modern HumanPopulations. Nucleic Acids Research. Vol.35.No 9.3039-3045.

Rudin, N. dan Inman, K., 2001. An Introduction to Forensic DNA Analysis,Second Edition. CRC Press.

40


Roche diagnostics GmbH. 2006. PCR Application Manual. Mannheim,Germany: 340 hlm

Saiyed. Z.M., C.N. Ramchand. 2007. Extraction of Genomic DNA UsingMagnetic Nanoparticle (Fe3O4) as Solid-Phase Support. American Journalof Infectious Disease 3 (4): 225-229, 2007

Sambrook, J., E.F. Fritsch dan T. Manuatis.2001. Molecular Cloning, ALaboratory Manual. Edisi ketiga. New York: Cold Spring HarbourLab.Press

Shabani, H., Mehdizadeh, M., Mousavi, S.M., Dezfouli, E.A., Solgi, T.,Khodaverdi, M., dkk., 2015. Halal Authenticity of Gelatin using SpeciesSpecific PCR. Food Chemistry, 184: 203–206.

Shafique, S., 2012. Polymerase Chain Reaction. Lap Lambert AcademicPublishing

Sinden, R.R., 1994. DNA Structure and Function. Gulf Professional Publishing.

Smith, C.J. dan Osborn, A.M., 2009. Advantages and Limitations of QuantitativePCR (Q-PCR)-based Approaches in Microbial Ecology. FEMSMicrobiology Ecology, 67: 6–20.

Sumadi,Mariati.2007. Biologi Sel. Yogyakarta: Graha ilmu

Teare, J.M., R. Islam., R. Flanagan., S. Gallagher., M.G Davies., C. Grabau.(1997). Measurement of Nucleic Acid Concentrations Using the DNAQuantTM and the GeneQuantTM. BioTechniques 22 : 1170 – 1174.

Tommy, Deniawan., 2014. Kombinasi Daging Rubah, Tikus, dan Musang MenjelmaMenjadi Daging “Kambing”. http://joglosemar.co/2014/12/kombinasi-daging-rubah-tikus-dan-musang-menjelma-menjadi-daging-kambing.html. Diaksestanggal 23 februari 2017 pukul 22.00

VanGuilder, H., Vrana, K.E., dan Freeman, W.M., 2008. Twenty-five Years ofQuantitative PCR for Gene Expression Analysis: A Review. BioTechniques,44: 619–626.

Vesti, AT., 2017. Analisis Cemaran Daging Babi Pada Produk Sosis Sapi YangBeredar Di Wilayah Bumi Serpong Damai Menggunakan Metode Real TimePolymerase Chain Reaction (RT-PCR). Skripsi. Program Studi Farmasi.Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Wallace, D.C., 1992. Diseases of the Mitochondrial DNA. Annu Rev Biochem 61:1175-1212

41


Wallace, D.C., 1997. Diseases of the Mitochondrial DNA. Annu Rev Biochem 61:1532-1678

Wardani, H.S., 2015. Analisis DNA Babi dalam Cangkang Kapsul MenggunakanPrimer D-Loop DNA Mitokondria Babi dengan Metode Real TimePolymerase Chain Reaction, Tesis. Universitas Gadjah Mada,Yogyakarta.

Widowati, Esti., 2013. Desain Primer Sitokrom B (Cyt B) Sebagai Salah SatuKomponen PCR (Polymerase Chain Reaction)Untuk Deteksi DNA Babi.Lembaga Penelitian. Universitas Islam Negeri Sunan Kalijaga.Yogyakarta

Yagi, K., Tsuruta, H., kanda, K. And Minami,K. (1996). Effect Of WaterManagementon Methane Emission From A Japanese Rice Paddy Field:Automated Methane Monitoring. Global Biogeochemical Cucles 10: doi:10.1029/96GB00517.issn: 0886-6236

Yuwono, Triwibowo.,2009. Biologi Molekular. Jakarta: Erlangga

Yusmichad,Yusdja., 2014. Prospek Usaha Peternakan Kambing Menuju 2020.Puslitbang Sosial Ekonomi Pertanian, Badan Penelitian dan PengembanganPertanian

Zeviani, M., Tiranti V., Piantadosi C., 1998. Mitochondrial disorders. Medicine(Baltimore) 77: 59-72


Lampiran 1. Kerangka Penelitian

Kesimpulan

Daging kambing Daging sapi

Analisa DNA hasil isolasidengan spektrofotometri UV

Isolasi DNA

Uji spesifisitasprimer dengandatabase NCBI

Isolat DNA

Amplifikasi dengan Real Time PCR

Analisa Hasil

Daging segar

DNAterisolasi

?

ya

Tidak

43


Lampiran 2. Perhitungan Pembuatan Larutan Primer

a. Membuat Larutan Induk Primer 100 μM

Jenis Nama Oligo nmol To make 100 μMKambing Forward 30.0 Add 300 μl ddH2O

Reverse 30.0 Add 300 μl ddH2OSapi Forward 30.0 Add 300 μl ddH2O

Reverse 30.0 Add 300 μl ddH2O

b. Membuat Larutan Primer Konsentrasi 50 µM

V1. M1 = V2.M2

X. 100 µM = 100 µl. 50 µM

X = 5000

100

X = 50 µl

Maka, Diambil 50 µl dari masing-masing primer lalu ditambahkan 50 µl

ddH2O

c. Membuat Larutan Primer Konsentrasi 5 µM

V1. M1 = V2.M2

X. 50 µM = 30 µl. 5 µM

X = 150

50

X = 3 µl

Maka, Diambil 3 µl dari masing-masing primer lalu ditambahkan 27 µl

ddH2O

44


Lampiran 3. Perhitungan Tm (Melting Temperature) Primer

Rumus Tm = 20C (A+T) + 40C (G+C)

Sapi = 20C (2+6) + 40C (11+0) Kambing = 20C (2+8) + 40C (4+6)(Forward) = 20C (8) + 40C (11) (Forward) = 20C (10) + 40C (10)

= 160C + 440C = 200C + 400C= 600C = 600C

Sapi = 20C (4+5) + 40C (2+8) Kambing = 20C (5+6) + 40C (6+4)(Reverse) = 20C (9) + 40C (10) (Reverse) = 20C (11) + 40C (10)

= 180C + 400C = 220C + 400C= 580C = 620C

Primer sapi = 600C + 580C Primer Kambing = 600C + 620C2 2

= 590C = 610C

54 0C 56 0C

* Temperatur penempelan yang digunakan biasanya 50C di bawah Tm (Muladno,2010)

45


Lampiran 4. Campuran Reaksi Mastermix untuk Amplifikasi DNA

KonsentrasiAkhir

KonsentrasiAwal

Jumlah yangDigunakan

Primer Forward 0.1 µM 5 µM 0.4 µlPrimer Reverse 0.1 µM 5 µM 0.4 µlProbe 0.2 µM 10 µM 0.4 µlDNA Polimerase*(LC 480 ProbeMaster)

1x 2x 10 µl

ddH2O - - 3.8 µlDNA Template - - 5 µl

Total Volume Reaksi 20 µl

*Terdiri dari: - Fast Start Taq DNA Polymerase- Buffer- dNTP (termasuk dUTP dan dTTP)- 6.4 mM MgCl2

46


Lampiran 5. Halaman depan software NCBI yang digunakan untuk ujispesifisitas primer kambing dan sapi

47


Lampiran 6. Hasil Uji Spesifisitas Primer Kambing dan Sapi dengan

database NCBI

a. Spesifisitas Primer Reverse Kambing

48


b. Spesifisitas Primer Forward Kambing

49


c. Spesifisitas Primer Reverse Sapi

50


d. Spesifisitas Primer Forward Sapi

51


Lampiran 7. Konsentrasi dan Kemurnian Isolat DNA

Sampel Gambar

Konsentrasi dan

Kemurnian A

260/280)

Daging Kambing

Isolat 1

Konsentrasi 22.529 ng/µl

Kemurnian 1.70

Daging Kambing

Isolat 2


Kemurnian 1.98

Daging Sapi

Isolat 1


Kemurnian 1.79

Daging Sapi

Isolat 2


Kemurnian 1.87

52


Lampiran 8. Kurva Amplifikasi DNA Daging Kambing, Daging Sapi dan

NTC Menggunakan Primer Kambing

a. Amplifikasi DNA Daging Kambing, Daging Sapi dan NTC Menggunakan

Primer Kambing (Isolat Pertama)

53


b. Amplifikasi DNA Daging Kambing, Daging Sapi dan NTC Menggunakan

Primer Kambing (Isolat Kedua)

54


Lampiran 9. Kurva Amplifikasi DNA Daging Kambing, Daging Sapi dan

NTC Menggunakan Primer Sapi

55


Keterangan : PSK = Primer Sapi, DNA Kambing; PSS = Primer Sapi, DNA Sapi;NTC PS = No Template Control Primer Sapi; PKK = Primer Kambing , DNAKambing; PKS = Primer Kambing, DNA Sapi; NTC PK = No Template ControlPrimer Kambing

56


Lampiran 10. Gambar Alat dan Bahan yang Digunakan dalam Penelitian

Gambar 1. Mikropipet (1)Vol 1000 µl; (2) Vol 200

µl;(3) Vol 10 µl

Gambar 2. Mikrotips

Gambar 3. Multiwell plate Gambar 4. Alat untukmenghancurkan daging yang

akan diisolasi

Gambar 5. Seperangkat alatReal Time PCR

Gambar 6. Spektrofotometri UVDNA

57


Gambar 7. Vortex Gambar 8. Sealing Foil

Gambar 9. microsentrifugator Gambar 10. Kit isolasi DNA

Gambar 11. Daging Sapi Gambar 12. Daging Kambing

uji spesifisitas primer 12s dna mitokondria kambing...

Documents