Penetapan Potensi AntibiotikSecara Mikrobiologi

Marlia Singgih WibowoSchool of Pharmacy ITB

Mengapa antibiotik perlu ditentukankadar atau potensinya?

Efek penggunaan antimikrobayang meningkat, sehinggameningkatkan pula efek resistensiberbagai mikroba patogenMikroba patogen dan virus baru : HIV, Avian Flu VirusEfektivitas daya hambat atau dayabunuh antimikroba sangattergantung pada jumlah dankekuatan zat aktif nya

Pengertian kadar vs potensi

Kadar jumlah per satuan berat/volumePotensi ukuran kekuatan /daya hambatatau daya bunuh zat aktif terhadapmikroorganisme tertentu

Mengapa harus dengan caramikrobiologi?

Respons mikroba terhadap antibiotikberbeda-bedaSpesifikSensitif

Spektrum beberapa antibiotika

Skema analisispatogen dan metode

analisis yang digunakan

•ELISA untuk analisis antigen spesifik pada mikroba patogen

•Uji senyawa antibiotik untukpenentuan KHM antibiotikterhadap mikroba suspect

Estimasi dari potensi antibiotik melaluiperbandingan langsung antara sampel(antibiotik uji) dengan antibiotik standaryang telah disahkan penggunaannya, terkalibrasi dengan baik, dan umumdigunakan sebagai rujukan.

Prinsip uji potensi antibiotik berdasarkanFarmakope Indonesia edisi IV 1995

Tujuan uji

Sebagai standar untuk mengatasikeraguan tentang kemungkinan

hilangnya aktivitas (potensi)antibiotik terhadap efek daya

hambatnya pada mikroba.

Metode Umum1. Lempeng (silinder /

kertas cakram)

2. Turbidimetri(tabung)

Metode Lempeng Silinder

Difusi antibiotik dari silinder yang dipasangtegak lurus pada lapisan agar padat dalam

cawan petri atau lempeng yang berisi biakanmikroba uji pada jumlah tertentu

Mikroba dihambat pertumbuhannya

Hambatan pertumbuhan biakan mikrobadalam larutan serba sama antibiotik, dalammedia cair yang dapat menumbuhkanmikroba dengan cepat bila tidak terdapatantibiotik

Metode turbidimetri digunakan pada sampelyang sulit larut dalam air, contoh: Gramisidin

Metode Turbidimetri

Persiapan uji

MikroorganismeBahanAlat

Cuci bersih sebelum dan sesudah digunakan

Sterilkan dengan pemanasan kering atau uapair

Peralatan

Selama inkubasi dalam penetapanpada lempeng dan tabung

Metode lempeng ± 0,5°C

Metode turbidimetri ± 0,1°Csuhu dapat diperoleh dengan sirkulasiudara dan air.

Pengendalian Termostatik

Wadah (1)

Metode Lempeng Silinder:1. Cawan petri kaca atau plastik ukuran 20 x

100 mm2. Silinder dari besi tahan karat atau porselen

diameter luar 8 mm, diameter dalam 6 mm, tinggi 10 mm

3. Bersihkan dengan asam nitrat 2 N bila perlu

Metode Turbidimetri:1. Tabung reaksi kaca/plastik ukuran dan

ketebalan seragam2. Tabung Spektrofotometer harus steril

dan sesuai3. Semua residu dihilangkan serta selalu

sterilisasi sebelum dan sesudah

Wadah (2)

Media dan Larutan DaparMedia Larutan Dapar

Media 1 pH 6,6Media 2 pH 6,6Media 3 pH 7,0Media 5 pH 7,9Media 8 pH 5,9Media 9 pH 7,2Media 10 pH 7,2Media 11 pH 8,3Media 13 pH 5,6Media 19 pH 6,1Media 32 pH 6,6Media 34 pH 7,0Media 35 pH 7,0Media 36 pH 7,3Media 39 pH 7,9

Dapar nomor 1 pH 6,0Dapar nomor 3 pH 8,0Dapar nomor 4 pH 4,5Dapar nomor 10 pH 10,5Dapar nomor 16 pH 7,0

Cat: untuk pelarut lainAir murniFormaldehide encerInjeksi larutan NaCl

Unit danBaku PembandingPotensi Antibiotik

Adalah antibiotik dimana potensinya yang dinyatakan dalam “unit” atau “µg” aktivitasantibiotik per mg zat kering telah ditetapkansecara nasional (BPFI).“µg” aktivitas dianggap terdiri dari bahankimia tunggalunit merupakan baku pembanding apabilaterdapat lebih dari satu bahan aktif antibiotikdalam suatu obat antibiotik.

Definisi

Penyiapan BakuLarutan persediaan: larutkan sejumlah atauseluruh isi vial baku pembanding antibiotikseperti pada tabel 1Simpan dalam lemari pendingin dan gunakandalam waktu yang ditentukanPada hari penetapan, buat pengenceran darilarutan persediaan (5), umumnya denganperbandingan 1 : 1,25 untuk lempengsilinder atau lebih kecil pada turbidimetri

Ampisilin : buat enceran larutan bakupembanding dan larutan uji secara bersamaan

Zink Basitrasin : tiap enceran larutan bakuharus mengandung asam klorida sejumlahsama dengan larutan uji.

Secara umum pengeringan dilakukan padaoven hampa udara 5 mmHg, 60°C, selama 3 jam.

Ketentuan

Penyiapan Contoh

Buat larutan serta enceran larutan ujisesuai dengan antibiotik pembanding.

Penetapan hanya membutuhkan 1 tingkatdosis uji yang sesuai dengan dosis tengahbaku pembandingDosis uji (U) = Dosis S3

Mikroba Uji dan Inokula

Mikroba UjiMikroba uji untuk masing-masing antibiotiktertera pada Tabel 2, pelihara pada agar miring dan inkubasikan sesuai dengan Tabel 3Mikroba uji harus merupakan galur murni dandipindahkan setiap minggu.Pada Klebsiella pneumoniae gunakan biakantidak berkapsul

Penyiapan Inokula

1. Inokulasikan biakan segar ke 250 ml media agar dalamtabung Roux, sebarkan secara merata, inkubasikanpada suhu dan waktu tertentu.

2. Larutkan biakan permukaan ke dalam 50 ml larutanNaCl 0,9 % steril.

3. Atur perbandingan hingga inokula mempunyaitransmitans 25 % terhadap blangko.

4. Untuk penetapan turbidimetri, optimalkan hubunganantara dosis dan respon.

5. Pada penetapan lempeng silinder, atur larutan suspensihingga menghasilkan batas daerah hambatan yang memuaskan; yaitu 14 mm-16 mm

Cara Pengujian:1. Desain penetapan2. Metode lempeng silinder3. Metode Turbidimetri4. Cara perhitungan

Desain Penetapan (1)Pada penetapan lempeng silinder, perbandingan pokok dibatasi pada hubunganpengukuran diameter hambatan antarlempeng.Pada penetapan turbidimetri, perbandinganpokok dibatasi pada hubungan antarakekeruhan yang diamati pada tiap rak.Dianjurkan hanya menggunakan satu arasdosis dengan suatu kurva baku danpengenceran larutan minimal 5 atau lebih

Penetapan potensi antibiotik secaramikrobiologi dipengaruhi oleh variabel intra dan antar penetapan.Awali dengan penyiapan larutan baku dan ujisecara terpisah, dan ulangi pada hari yang berbeda.Jika hasil yang diperoleh berbeda signifikan, lakukan satu atau lebih penetapan tambahan

Desain Penetapan (2)

Metode Turbidimetri1 ml larutan uji dan larutan baku tiap dosis pada 3 tabung reaksi;

buat triplo dan letakkan acak

Buat 2 tabung kontrol

Tambahkan 9,0 ml inokula ke dalam tiap tabung

Letakkan tabung dalam tangas air atau inkubator pada suhu (36-37,5)°C; selama 2 jam

Setelah inkubasi tambahkan 0,5 ml larutan formaldehide encer

Ukur transmitans atau serapan pada 530 nm

Metode Turbidimetri (2)Pada desain penetapan 5 aras dosis:1. Buat 20 sediaan uji yang sama dengan S3 baku2. Buat juga pengenceran S3 lain sebagai rujukan uji

pertumbuhan3. Tambahkan 1 ml larutan uji ke dalam 3 tabung

dan 1 ml pengencer bebas antibiotik ke dalam 6 tabung

4. Tambahkan 9,0 ml inokula5. Inkubasi6. Tambahkan 0,5 ml larutan formaldehide encer7. Hitung transmitan atau serapan pada 530 nm

Metode Lempeng SilinderPada cawan petri dibuat lapisan dasar yang licin

Tambahkan 4,0 ml lapisan inokula

Jatuhkan 6 buah silinder pada permukaan agar dalam radius 2,8 cm; pada ketinggian 12 mm

Isi silinder selang seling dengan dosis tengah baku (S3); buat triplo

Inkubasikan pada suhu 32-35°C selama 16-18 jam

Ukur diameter hambatan yang terbentuk pada agar

Desain pengujianDipilih berdasarkan hasil akhir yang diinginkan, presisi tinggi atau tidak. Desain yang digunakan :2+2 : yaitu satu baku pembanding dan satu sampel, masing-masing dengan dua tingkat dosis yang diperlakukan dalam satu lempeng (cawan) agar3+3 : yaitu satu baku pembanding dan satu sampel, masing-masing dengan tiga tingkat dosis yang diperlakukan dalam satu lempeng (cawan) agar5+1 : yaitu satu baku pembanding dengan 5 tingkatdosis dan satu sampel dengan satu tingkat dosisyang setara dengan dosis menengah (dosis acuan) baku pembanding.

Desain Pengujian 3+3

Larutan baku pembanding : sejumlah tertentubaku pembanding dilarutkan dalam pelarutyang sesuai sedemikian sehingga diperolehlarutan induk yg setara dgn 1000 IU/mL. Pengenceran dibuat sehingga diperolehlarutan baku dosis rendah, dosis menengahdan dosis tinggi dengan pebandingan yang relatif sama, misalnya 1:2, 2:3 atau 3:4

Larutan uji : ditimbang sejumlahtertentu sampel, dilarutkan dalampelarut yang sesuai sehingga diperolehlarutan sampel induk yg setara dengan1000 IU/mL. Pengenceran dilakukan dengan dosisyang kira-kira sama dengan larutanbaku pembanding.

Masing-masing larutan dimasukkan ke dalamselinder atau serapkan pada kertas cakramsebanyak 100 μL di atas media agar yang telah diinokulasikan mikroba uji.Pre-inkubasi selama 1 jam, lalu inkubasi pada35-37 ºC selama 18-24 jam.Setelah masa inkubasi, daerah hambat yang terbentuk diukur garis tengahnya.

Dosis baku

Dosis sampel

Desain pengujian 5+1

Larutan baku pembanding yang dibuatsama dengan desain 3+3, hanya dibuatpengenceran S1, S2, S3, S4 dan S5 dengan tingkat perbandingan 1,25.Dosis tengah ditetapkan dulu, misalnya10 IU/mL, maka: S2=8,0 IU/mL, S1=6,4 IU/mL, S4=12,5 IU/mL danS5=15,6 IU/mL

Larutan uji/sampel dibuat larutan induk danpengenceran yang sama dengan larutan bakupembanding.Larutan S3 (pembanding dosis tengah) selanjutnya selalu ditempatkan pada setiapmedia agar yg digunakan, dan ke dalamselinder pencadang atau kertas cakram ygdigunakan dimasukkan 100 μL larutanpembanding lainnya (S1, S2, S4, S5) danlarutan uji (U) , masing-masing triplo.

Masing-masing larutan dimasukkan ke dalamselinder atau serapkan pada kertas cakramsebanyak 100 μL di atas media agar yang telah diinokulasikan mikroba uji.Pre-inkubasi selama 1 jam, lalu inkubasi pada35-37 ºC selama 18-24 jam.Setelah masa inkubasi, daerah hambat yang terbentuk diukur garis tengahnya.

Pola letak uji pada desain (5+1)

Dosis S3

Dosis lainnyaS3

S1S3

S2

S3

S4

S3

S5

S3

U

Cara Perhitungan

Desain pengujian (3+3)

Cara perhitungan dengan desain 3+3 terdapat pada Farmakope Indonesia edisi III, tahun 1979Analisis meliputi : analisis variansi, perhitungan potensi dan bataskeyakinan potensi hasil penetapan

Desain pengujian (5+1)

Sebelum menghitung potensi , dilakukan terlebih dahulu koreksi garistengah rata-rata diameter daerahhambat dosis larutan baku S1, S2, S4 dan S5Cara :

Hitung diameter rata-rata S3 di semuacawan (Y3T)Hitung diameter rata-rata S3 padamasing-masing cawan larutan bakuS1,2,4 dan 5 (Y31, Y32, Y34 dan Y35)Hitung diameter S1,2,4 dan 5 (Y1, Y2, Y4dan Y5)

Maka diameter koreksi masing-masinglarutan baku adalah :

S1 (a) = Y1 + (Y3T – Y31) S2 (b) = Y2 + (Y3T – Y32) S3 (c) = Y3T

S4 (d) = Y4 + (Y3T – Y34)S5 (e) = Y5 + (Y3T – Y35)

Untuk kurva baku, dihitung diameter dosis terendah dan tertinggi yaitu :

YT =(3e + 2d + c – a )

5

YR =(3a + 2b + c – e )

5

YR = diameter hambat

dosis terendah

YT = diameter hambat

dosis tertinggi

Selanjutnya dibuat kurva baku padakertas semilog : Sumbu X : log dosisSumbu Y : diameter hambatHubungkan titik-titik untuk S1 (YR) sampai S5 (YT)

Sebelum Perhitungan potensi sediaan uji, dilakukan koreksi diameter larutan sampel U:

YU koreksi = YS + (YU – Y3U)Y3U = diameter rata-rata S3 pada pengujian

larutan UYU = diameter rata-rata U pada cawan

larutan UYS = Hasil interpolasi S3 pada kurva baku

Cara Perhitungan potensi sampel

Perhitungan Potensi sampel

Potensi sediaan uji ditentukan denganmenginterpolasi YU pada sumbu Y ke gariskurva baku dan tarik garis ke sumbu X (diperoleh XU)Dosis U = XU/S3 x dosis S3Potensi U = dosis U x faktor pengenceran

Cara Perhitungan (1)Potensi antibiotik dihitung denganmenggunakan metode garis lurustransformasi log dengan penyesuaiankuadrat terkecil dan uji linearitas.

Apabila dilakukan lebih dari satu penetapanpotensi dari bahan uji yang sama; makadapat dirata-ratakan.

Diameter daerah hambat

Pencadang