Uji Fenotipik

Uji fenotipik adalah uji yang paling umum digunakan untuk uji kerentanan CMV termasuk Plaque Reduction Assay (PRA) dan uji hibridisasi DNA. Namun, setiap uji kuantitatif baik yang mengukur pertumbuhan virus secara langsung (pertumbuhan dari penularan virus pada sel sensitif, seperti dalam PRA) atau tidak langsung (produksi DNA virus, RNA, atau protein) dapat digunakan untuk tujuan ini. Sebuah pertimbangan praktis, khususnya masalah CMV, adalah bahwa titer yang terisolasi harus disiapkan untuk digunakan dalam fase kerentanan pengujian tersebut. Dengan virus yang pertumbuhannya lambat seperti CMV, beberapa minggu dan beberapa bagian dalam kultur sel mungkin diperlukan untuk mendapatkan isolasi dengan virus yang cukup infeksius yang dapat digunakan di tahap akhir pengujian tersebut. Hal ini secara teoritis menjadi perhatian yaitu bahwa bagian yang terisolasi ini mungkin tidak mencerminkan komposisi asli dari spesimen yang diperoleh dari pasien dalam hal proporsi mutan dibandingkan asli tipe virus yang asli. Artinya, mungkin ada seleksi dari pseudotipe lain atau varian dari virus infeksius yang asli. Selain itu, uji fenotipik telah dikembangkan, mungkin berguna dan praktis dalam beberapa situasi.

PRA. Uji ini adalah gold standar untuk mendeteksi dan mengkuantitasi resitensi obat pada CMV. Baru-baru ini sebuah protokol standar telah diterbitkan 39, yang seharusnya membantu dalam kesesuaian cara untuk melakukan pengujian ini. Stok atau simpanan virus dibuat dengan subkultur dari tabung kultur positif sampai diperoleh sebuah kultur dimana 25-50% dari sel-selnya menunjukkan virus CPE dalam beberapa hari inokulasi. Stok ini kemudian dapat dititrasi dalam uji plak, atau dengan pengalaman yang cukup, seseorang dapat membuat perkiraan titer dan membuat pengenceran yang tepat untuk digunakan dalam PRA. PRA dilakukan dengan membuat monolayer sel (biasanya MRC-5 sel). Monolayer tumbuh di microwell dalam plate, terinfeksi 50 sampai 100 PFU virus dengan inkubasi selama 1,5 sampai 2 jam pada 37'C, selama berjalannya inkubasi,plate digoncangkan secara lembut setiap 15 menit untuk meratakan distribusi virus di sekitar dinding plate. Pada akhir inkubasi ini, inokulum dihapus, sel monolayer dicuci, dan monolayer diinkubasi dalam media pertumbuhan yang mengandung 1% imunoglobulin spesifik CMV (untuk mencegah pembentukan plak sekunder yang diproduksi oleh virus di plak primer) dan berbagai konsentrasi obat yang sedang diuji. Pada akhir hari ke-7, sel-sel terfiksir dan sudah diwarnai, biasanya dengan Giemsa. Plak (daerah kecil karakteristik CPE) yang dihitung, dan sensitivitas virus terhadap obat ditentukan dengan grafik atau analisis komputer berdasarkan jumlah plak di dindng plate yang bebas obat dan di dinding yang mengandung peningkatan konsentrasi obat. Hasilnya menunjukkan konsentrasi obat yang menghambat pembentukan plak sebesar 50%, atau 50% konsentrasi hambat obat (IC50).

Tidak ada kesepakatan universal pada IC50 yang mendefinisikan untaian virus yang resisten. Hal ini berlaku bahwa IC50 GCV> 12 uM {sekitar 3 ug / ml) merupakan virus GCV resisten, tapi nilai ini mungkin berbeda antara laboratorium yang melakukan PRA 46,50. Laboratorium kami telah mendefinisikan IC50 > 1 dan