uji aktivitas antibakteri fraksi dari ekstrak …repository.usd.ac.id/32881/2/158114025_full.pdf ·...

$: UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI FRAKSI DARI EKSTRAK …repository.usd.ac.id/32881/2/158114025_full.pdf · Pav. leaf chloroform extract showed that the inhibition zone produced by fraction$
UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI FRAKSI DARI EKSTRAK

KLOROFORM DAUN Piper crocatum Ruiz & Pav. TERHADAP

Staphylococcus aureus RESISTEN AMPICILLIN

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Diajukan oleh:

Nadia Chandra Prasdiyanti

NIM : 158114025

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2018

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i

UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI FRAKSI DARI EKSTRAK

KLOROFORM DAUN Piper crocatum Ruiz & Pav. TERHADAP

Staphylococcus aureus RESISTEN AMPICILLIN

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Diajukan oleh:

Nadia Chandra Prasdiyanti

NIM : 158114025

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2018


ii


iii

9


iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

Kupersembahkan untuk:

Tuhan Yesus Kristus sebagai sumber berkat dan pengharapanku

Bapak, Ibu, dan Adik serta keluarga tercinta yang selalu mendukungku

Arsa, sahabat dan teman-teman tercinta

Serta almameterku Universitas Sanata Dharma


v


vi


vii

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas

segala rahmat dan berkat kasih-Nya yang melimpah sehingga penulis dapat

menyelesaikan penelitian skripsi yang berjudul “UJI AKTIVITAS

ANTIBAKTERI FRAKSI DARI EKSTRAK KLOROFORM DAUN Piper

crocatum Ruiz & Pav. TERHADAP Staphylococcus aureus RESISTEN

AMPICILLIN” dengan baik.

Penulis menyadari dalam penyusunan skripsi ini mendapatkan banyak

bantuan, dukungan, bimbingan, dan doa dari berbagai pihak. Pada kesempatan ini,

penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada:

1. Tuhan Yesus Kristus dan Bunda Maria karena atas berkat-Nya yang luar

biasa sehingga penulis diberikan kelancaran untuk menyelesaikan skripsi

ini.

2. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, Apt. selaku dekan Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, Dosen Pembimbing Akademik,

sekaligus Dosen Pembimbing skripsi yang dengan sabar telah memberikan

dukungan, bimbingan, saran dan doa selama proses penyusunan skripsi ini

sehingga dapat terselesaikan dengan baik.

3. Ibu Damiana Sapta Candrasari, S.Si., M.Sc., selaku Kepala Laboratorium

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma sekaligus dosen penguji

skripsi atas kritik dan saran yang diberikan selama penyusunan skripsi.

4. Ibu Dr. Erna Tri Wulandari, Apt. selaku dosen penguji skripsi atas kritik

dan saran yang diberikan selama penyusunan skripsi.

5. Mas Antonius Dwi Priyana dan Mas Sarwanto selaku Sekretariat S1

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang memberikan informasi

mengenai perkuliahan dan proses pengerjaan skripsi.

6. Pak Wagiran dan Mbak Intan yang telah membantu proses pengerjaan

skripsi ini di laboratorium.


viii


ix

ABSTRAK

Latar belakang : Penyakit infeksi masih merupakan salah satu masalah

kesehatan masyarakat yang penting dan biasa diobati dengan antibiotik.

Penggunaan antibiotik yang tidak rasional menyebabkan terjadinya resistensi

antibiotik. Salah satu bakteri yang mengalami resistensi adalah Staphylococcus

aureus. Adanya resistensi bakteri mendorong penggalian obat dari bahan alam.

Piper crocatum Ruiz & Pav. adalah salah satu bahan alam yang memiliki aktivitas

antibakteri. Dalam penelitian ini, fraksi hasil VLC dari ekstrak kloroform daun

Piper crocatum Ruiz & Pav. diuji untuk melihat aktivitas antibakteri terhadap

Staphylococcus aureus resisten ampicillin.

Metode : Uji aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi sumuran,

dilanjutkan dengan uji KHM dan KBM secara dilusi cair, serta metode

bioautografi terhadap bakteri Staphylococcus aureus resisten ampicillin. Uji

statistic dilakukan menggunakan Kruskal-Wallis dilanjutkan dengan Mann-

Whitney.

Hasil : Hasil uji aktivitas antibakteri fraksi dari ekstrak kloroform daun Piper

crocatum Ruiz & Pav. menunjukkan zona hambat yang dihasilkan oleh fraksi 2

adalah 10,3333±0,7638 mm dan zona hambat yang dihasilkan oleh fraksi 3 adalah

7,8333±0,5774 mm, dengan nilai KBM 125 mg/ml. Analisis statistik dengan post

hoc Mann-Whitney menunjukkan adanya perbedaan bermakna dari tiap perlakuan

dengan nilai signifikansi <0,05.

Kesimpulan : fraksi 2 dari ekstrak kloroform daun Piper crocatum Ruiz & Pav.

memiliki aktivitas antibakteri dengan diameter zona hambat 10,3333±0,7638 mm

dan nilai KBM 125 mg/ml.

Kata kunci : Staphylococcus aureus, resistensi, daun Piper crocatum Ruiz &

Pav., antibakteri, bioautografi.


x

ABSTRACT

Background : Infection is one of the most important public health problems and

is usually avoided by antibiotics. Irrational use of antibiotics causes antibiotic

resistance, such as in the bacteria Staphylococcus aureus. Therefore, it is

necessary to explore antibacterial drugs from natural ingredients. Piper crocatum

Ruiz & Pav. Is a plant species that contain natural ingredient with antibacterial

activity. In this study, the chloroform extract fraction of the Piper crocatum Ruiz

& Pav. leaf was tested to determine its antibacterial activity against ampicillin-

resistant Staphylococcus aureus.

Metode : Diffusion method was used to test the antibacterial activity, liquid

dilution method used to determine MIC and MBC, bioautography was apply on

ampicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteria. Data of inhibition zone was

statistically tested with Kruskal-Wallis followed by Mann-Whitney.

Result : The results of the antibacterial activity test of the Piper crocatum Ruiz &

Pav. leaf chloroform extract showed that the inhibition zone produced by fraction

2 was 10.3333 ± 0.7638 mm and the inhibition zone produced by fraction 3 was

7.8333 ± 0.5774 mm, with a KBM value of 125 mg / ml. The post hoc Mann-

Whitney statistical analysis showed a significant difference of each treatment with

the significance value <0.05.

Conclusion : fraction 2 of Piper crocatum Ruiz & Pav. leaf chloroform extract

has antibacterial activity with inhibitory zone diameter of 10.3333 ± 0.7638 mm

and KBM value of 125 mg / ml.

Keyword : Staphylococcus aureus, resistance, Piper crocatum Ruiz & Pav.

leaf, antibacterial, bioautography


xi

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ........................................................................................... i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................. ii

HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................. iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ......................................................................... iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................................. v

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI.............................. vi

PRAKATA .......................................................................................................... vii

ABSTRAK .......................................................................................................... ix

ABSTRACT .......................................................................................................... x

DAFTAR ISI ....................................................................................................... xi

DAFTAR TABEL ............................................................................................... xii

DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xiii

DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xiv

PENDAHULUAN .............................................................................................. 1

METODE PENELITIAN .................................................................................... 2

HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................................... 8

KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................................... 20

DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 21

LAMPIRAN ........................................................................................................ 24

BIOGRAFI PENULIS ........................................................................................ 31


xii

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Hasil uji aktivitas antibakteri ................................................................ 13

Tabel 2. Nilai Rf dan warna hasil uji KLT ......................................................... 18


xiii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Profil KLT fraksi VLC dari ekstrak kloroform daun sirih merah ... 11

Gambar 2. Uji resistensi bakteri Staphyloccous aureus .................................... 12

Gambar 3. Kontrol media dan kontrol pertumbuhan ......................................... 12

Gambar 4. Zona hambat fraksi VLC dari ekstrak kloroform daun sirih merah 13

Gambar 5. Uji KHM fraksi VLC dari ekstrak kloroform daun sirih merah ...... 14

Gambar 6. Uji KBM fraksi VLC dari ekstrak kloroform daun sirih merah ...... 15

Gambar 7. Fraksi pada plat KLT untuk uji bioautografi kontak ....................... 15

Gambar 8. Uji aktivitas antibakteri dengan metode bioautografi kontak .......... 16

Gambar 9. Uji kualitatif senyawa flavonoid dengan uji tabung ........................ 17

Gambar 10. Uji kualitatif senyawa flavonoid dengan KLT ............................. 18


xiv

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat determinasi tanaman Piper crocatum Ruiz & Pav. ............... 24

Lampiran 2. Surat identifikasi bakteri Staphyloccous aureus ............................. 25

Lampiran 3. Sertifikat pengujian statistik dengan SPSS ..................................... 26

Lampiran 4. Hasil perhitungan statistic .............................................................. 27


1

PENDAHULUAN

Penyakit infeksi masih merupakan salah satu masalah kesehatan

masyarakat yang penting, khususnya di negara berkembang. Salah satu obat

andalan untuk mengatasi masalah tersebut adalah antimikroba antara lain

antibakteri/antibiotik, antijamur, antivirus, antiprotozoa (Kemenkes RI, 2011).

Berbagai jenis antibiotik digunakan untuk menanggulangi penyakit infeksi.

Penggunaan antibiotik yang tidak rasional sebagai terapi terutama pada pasien

kelompok usia 0-14 tahun dapat berisiko resistensi antibiotik dini. Penggunaan

obat dikatakan rasional apabila memenuhi syarat yaitu tepat indikasi pasien, tepat

pemilihan obat, tepat penilaian kondisi pasien, tepat dosis, tepat lama pemberian,

dan tepat interval waktu pemberian (Kemenkes RI, 2011).

Salah satu permasalahan yang cukup meresahkan adalah munculnya

resistensi bakteri Staphylococcus aureus terhadap antibiotik golongan penisilin

atau biasa disebut dengan bakteri Methicillin Resistant Staphylococcus aureus

(MRSA). MRSA menyebabkan berbagai penyakit, dari infeksi kulit dan luka

hingga pneumonia dan infeksi aliran darah yang dapat menyebabkan sepsis dan

kematian (CDC, 2013). Menurut data Centers for Disease Control and Prevention

(2013), terdapat 80.461 kasus infeksi MRSA dan sebanyak 11.285 kasus kematian

terjadi pada tahun 2013. Adanya bakteri yang resisten terhadap antibakteri

mendorong pentingnya penggalian sumber obat-obatan antimikroba dari bahan

alam (Hertiani, 2003). Penggunaan obat herbal meningkat di masyarakat

khususnya di negara berkembang dan dipercaya dapat mengobati berbagai

penyakit, salah satunya adalah penyakit infeksi (Wendakoon, Calderon, dan

Gagnon, 2012).

Sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) adalah salah satu tumbuhan

yang digunakan sebagai obat alternatif oleh masyarakat. Daun sirih merah

mengandung senyawa golongan flavonoid, alkaloid, tanin-polifenol, steroi-

terpenoid, dan saponin (Parfati dan Windono, 2016). Senyawa-senyawa yang

terdapat pada daun sirih merah memiliki aktivitas antimikroba terhadap bakteri

Gram positif dan Gram negatif (Reveny, 2011). Daun sirih merah berpotensi


2

sebagai antibakteri untuk mengatasi infeksi (Wardani dkk, 2012). Hasil penelitian

yang dilakukan oleh Soleha, dkk. (2015) menunjukkan bahwa ekstrak daun sirih

merah lebih kuat menghambat pertumbuhan bakteri gram positif yaitu

Staphylococcus aureus dibandingkan dengan bakteri gram negatif yaitu

Salmonella typhi. Juliantina, dkk. (2010), melaporkan bahwa ekstrak etanol daun

sirih merah dengan kuat dapat menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus

aureus dan Escherchia coli dengan menggunakan metode dilusi. Hasil penelitian

yang dilakukan oleh Thie (2018) menunjukkan bahwa ekstrak kloroform daun

sirih merah memiliki zona hambat terhadap bakteri Staphylococcus aureus

resisten ampicillin, dengan nilai KHM 12,5 mg/ml dan nilai KBM 50 mg/ml.

Berdasarkan uraian diatas, peneliti ingin mengetahui potensi fraksi hasil VLC dari

ekstrak kloroform daun sirih merah dalam penghambatan pertumbuhan bakteri

Staphylococcus aureus resisten antibiotik dengan metode difusi sumuran.

Dilakukan juga uji KHM dan KBM terhadap fraksi teraktif hasil VLC dari ekstrak

kloroform daun sirih merah. Selain itu dalam penelitian ini dilakukan uji

bioautografi kontak terhadap fraksi teraktif hasil VLC ekstrak kloroform daun

sirih merah untuk melihat aktivitas antibakteri yang terdapat didalamnya serta

dilakukan uji kualitatif senyawa flavonoid untuk melihat ada tidaknya senyawa

flavonoid pada fraksi tersebut.

METODE PENELITIAN

Alat dan Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun sirih merah,

bakteri Staphylococcus aureus, media Nutrient Agar, Nutrient Broth, DMSO

100%, Buffer Pepton Water, etil asetat, n-heksana, kloroform, metanol, aquadest

steril, antibiotik ciprofloxacin, cakram ampisilin 10µg, standar kuarsetin, dan

alkohol 70%.

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah erlenmeyer, tabung

reaksi, corong, labu ukur, pipet tetes, glasfirn, pipet volume, cawan petri, batang

pengaduk, gelas ukur, sendok, pelubang sumuran, platform shaker (Innova 2100),


3

autoclave (Model KT-40, ALP Co. Ltd Hamurasi Tokyo Japan, oven (Memmert),

rotary evaporator, incubator, microbiology safety cabinet, bunsen, jarum ose,

spreader, flakon, chamber, mikrokapiler, kertas saring, lempeng KLT, timbangan

analitik, mistar, ayakan no 50, vortex.

Penyiapan Bahan Uji dan Determinasi Tanaman Sirih

Tanaman sirih merah didapatkan dari Kabupaten Sleman, Yogyakarta.

Bagian yang diambil adalah bagian daun. Daun sirih merah yang dipilih adalah

daun sirih dengan permukaan halus, tidak berlubang, berwarna merah keperakan,

dan berdiameter 5-8cm. Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium

Sistematika Tumbuhan, Fakultas Biologi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

Pembuatan Simplisia Daun Sirih

Daun sirih merah yang telah dikumpulkan dipisahkan dari pengotor,

dicuci dengan air mengalir sebanyak 3 kali, kemudian dikeringkankan dengan

oven dengan suhu 40°C. Daun yang telah kering kemudian dipisahkan dari bahan

pengganggu, lalu diserbuk dengan blender dan di ayak dengan pengayak nomor

50, dan kemudian disimpan (Direktorat Jendral Bina Kefarmasian dan Alat

Kesehatan RI, 2011).

Penetapan Kadar Air

Penetapan kadar air dilakukan dengan metode destilasi toluena

(Direktorat Jendral Bina Kefarmasian dan Alat Kesehatan RI, 2011). Pereaksi

toluena jenuh air disiapkan dengan cara mengocok toluene P dengan sedikit air

kemudian air dipisahkan menggunakan corong pisah. Simplisia kering sebanyak

10 gram dan 200 ml dimasukkan toluena jenuh air ke dalam labu. Toluena jenuh

air dimasukkan ke tabung penerima melalui pendingin sampai leher alat

penampung dan labu dipanaskan selama 15 menit. Setelah toluena mulai

mendidih, penyulingan diatur dengan kecepatan lebih kurang 2 tetes tiap detik,

hingga sebagian besar air tersuling, kemudian kecepatan penyulingan dinaikkan

hingga 4 tetes tiap detik selama 5 menit. Setelah selesai, tabung penerima


4

didinginkan hingga suhu ruang dan kemudian volume air dibaca setelah air dan

toluena terpisah.

Kadar air dihitung dengan rumus:

Pembuatan Ekstrak Kloroform Daun Sirih Merah

Pembuatan ekstrak kloroform daun sirih merah dilakukan dengan

maserasi menurut Badan Pengawas Obat dan Makanan RI (2010) dengan jumlah

serbuk yang dimaserasi adalah 10 gram dan pelarut kloroform sebanyak 100 ml.

Serbuk daun sirih merah sebanyak 10 gram (10 bagian serbuk) dimasukkan ke

dalam Erlenmeyer kemudian dilarutkan dalam 100 ml pelarut kloroform. Maserasi

dilakukan selama 1x24 jam dengan bantuan shaker. Hasil maserat yang diperoleh

disaring dengan corong Buchner yang dilapisi kertas saring Whatman No. 1

dengan menggunakan bantuan pompa vakum. Serbuk hasil penyaringan

dimaserasi dengan pelarut baru sebanyak 75 ml selama 1x24 jam. Kemudian

diremaserasi sekali lagi menggunakan 25 ml pelarut baru selama 1x24 jam.

Maserat pertama, kedua, dan ketiga kemudian diuapkan dengan rotary evaporator

pada suhu 60°C untuk menghilangkan pelarut pada ekstrak. Selanjutnya ekstrak

diletakkan pada cawan porselen dan diuapkan kembali dengan menggunakan

waterbath pada suhu 60°C untuk menghilangkan sisa pelarut yang mungkin

masih ada dalam ekstrak. Ekstrak yang didapat merupakan ekstrak kental dengan

bobot tetap sesuai yang dipersyaratkan.

Rendemen dihitung dengan rumus:

Pembuatan Fraksi dari Ekstrak Kloroform Daun Sirih Merah

Ekstrak klorofom daun sirih merah difraksinasi lebih lanjut dengan

metode Vacuum Liquid Chromatography (VLC). Sintered Glass Buchner dan

Erlenmeyer serta vakum yang digunakan untuk fraksinasi disiapkan dan dipasang.


5

Kertas saring dimasukkan ke dalam kolom sesuai diameter kolom. Sillica Gel

GF254 dimasukkan ke dalam kolom sedikit demi sedikit sambil di vakum sebagai

fase diam. Bobot Silica Gel GF254 yang digunakan sebagai fase diam adalah

sebanyak ± 4 kali bobot esktrak yang didapat. Kemudian Sillica Gel GF254

disiapkan lagi sebanyak ± 2 kali bobot esktrak dan dicampurkan dengan ekstrak

kering menggunakan mortir dan stamper sambil diaduk perlahan hingga

didapatkan campuran homogen dan kering (free flowing). Serbuk ekstrak free

flowing dimasukkan sedikit demi sedikit ke dalam sintered glass Buchner diatas

fase diam sambil divakum. Dua lembar kertas saring sebesar diameter kolom

dimasukkan diatas serbuk ekstrak free flowing. Sebanyak 200ml pelarut

dituangkan secara perlahan-lahan pada permukaan kertas saring melalui dinding

sambil divakum. Pelarut yang digunakan berturut-turut metanol, metanol -

kloroform (7:3 v/v), metanol - kloroform (5:5 v/v), metanol - kloroform (3:7 v/v),

dan kloroform. Hasil fraksinasi ditampung dalam cawan porselen. Fraksi yang

didapat kemudian dianalisis menggunakan KLT dengan fase diam silika gel

GF254, fase gerak metanol : klorofom dengan perbandingan 9:1, dan deteksi UV

dengan panjang gelombang 365 nm. Fraksi dengan profil KLT yang mirip akan

digabungkan menjadi satu fraksi.

Preparasi Bakteri Uji

Bakteri Staphylococcus aureus disiapkan dengan cara kultur bakteri

diambil dengan jarum ose dan diinokulasikan ke dalam media Nutrient Broth

(NB) steril, setelah itu diinkubasi pada suhu 37oC selama 20 jam untuk

mendapatkan stok bakteri uji (CLSI, 2017).

Berikutnya dilakukan pengujian sebagai penegasan bahwa bakteri

tersebut adalah bakteri yang resisten terhadap ampicillin. Sebanyak 5 ml Nutrient

Agar (NA) steril dituangkan ke dalam cawan petri steril, dibiarkan memadat

sebagai base layer agar. Sebanyak 1 ml bakteri uji diinokulasikan ke dalam 15 ml

media NA secara pour plate, kemudian dituangkan secara merata sebagai seed

layer agar di atas base layer agar, dan dibiarkan memadat. Paper disk berisi

antibiotik ampicillin 10µg diletakkan di bagian tengah pada seed layer dan


6

diinkubasi selama 24 jam kemudian diamati zona jernih yang terbentuk. Bakteri

dikatakan z h h h ≤28 ,

z h ≥29 CLSI, 2017).

Apabila sudah dipastikan bahwa bakteri yang didapatkan adalah bakteri

resisten, stok bakteri diambil dan diencerkan dengan Bufferd Pepton Water

(BPW) kemudian disetarakan kekeruhnnya dengan larutan Mac Farland 0,5

menggunakan alat nephelometer.

Pembuatan Kontrol Pertumbuhan Bakteri

Sebanyak 5 ml Nutrient Agar (NA) steril dituangkan ke dalam cawan

petri steril, dibiarkan memadat sebagai base layer agar. Kemudian diambil 1 ml

suspensi bakteri uji, diinokulasikan ke dalam 15 ml media NA secara pour plate,

kemudian dituangkan secara merata sebagai seed layer agar di atas base layer

agar, dan dibiarkan memadat.

Pembuatan Kontrol Kontaminasi Media

Sebanyak 20 ml media Nutrient Agar (NA) dituangkan ke dalam petri

steril dan ditunggu hingga memadat.

Pembuatan Larutan Stok Antibiotik

Tablet ciprofloxacin 500 mg digerus dan dilarutkan dalam 100 ml

aquadest sehingga didapatkan konsentrasi 5mg/ml. Kemudian diambil 1 ml dan

ditambahkan 100 ml aquadest steril sehingga didapatkan konsentrasi 50 µm/ml.

Uji Daya Antibakteri Fraksi dari Ekstrak Kloroform Daun Sirih Merah

Sebanyak 5 ml Nutrient Agar (NA) steril dituangkan ke dalam cawan

petri steril, dibiarkan memadat sebagai base layer agar. Kemudian diambil 1 ml

suspensi bakteri uji, diinokulasikan ke dalam 15 ml media Nutrient Agar (NA)

dalam tabung reaksi dan divortex. NA yang telah dicampur dengan suspensi

bakteri tersebut kemudian dituang ke dalam petri steril sebagai seed layer agar di

atas base layer agar kemudian digoyang-goyangkan hingga merata dan dibiarkan

memadat. Selanjutnya dibuat 4 sumuran menggunakan pelubang sumuran no. 4


7

berdiameter 6 mm pada NA yang sudah disiapkan. Setiap sumuran diberikan

masing-masing 50 µl larutan kontrol positif (antibiotik), larutan kontrol negatif

(pelarut), dan dua fraksi uji dengan konsentrasi yang sama yaitu 250 mg/ml.

Kemudian dilihat fraksi yang memiliki aktivitas antibakteri paling baik. Aktivitas

antibakteri yang dihasilkan dilihat dari zona hambat yang dihasilkan. Zona

hambat yang diukur adalah zona disekitar sumuran yang keruh tetapi sudah

berkurang kekeruhannya dibandingkan dengan daerah sekitarnya.

Preparasi Fraksi Teraktif

Fraksi yang memiliki aktivitas antibakteri paling baik dibuat variasi

konsetrasi 250 mg/ml; 125 mg/ml; 62,5 mg/ml; 31,3 mg/ml; 15,6 mg/ml; 7,8

mg/ml; 3,9 mg/ml; dan 1,9 mg/ml. Pembuatan variasi konsentrasi ini dilakukan

dengan cara pengenceran terhadap fraksi menggunakan pelarut DMSO 100%.

Penentuan Kadar Hambat Minimum (KHM) dan Kadar Bunuh Minimum

(KBM)

Sebanyak 8 tabung reaksi steril disiapkan kemudian 1 ml suspensi bakteri

diinokulasikan ke dalam 20 ml Nutrient Broth (NB) dan ditambahkan 8 variasi

konsentrasi ekstrak kemudian divortex kemudian diinkubasi selama 24 jam.

Setelah itu kekeruhannya dibandingkan menggunakan kontrol media dan kontrol

bakteri uji untuk menentukan KHM.

Sebanyak 20 ml Nutrient Agar (NA) dituangkan ke dalam cawan petri

steril dan dibiarkan memadat. Dibuat masing-masing 4 kuadran. Masing-masing

tabung reaksi yang berisi bakteri dan variasi konsentrasi fraksi kemudian di streak

plate pada masing-masing kuadran. Variasi konsentrasi terendah dari fraksi yang

tidak menunjukkan adanya pertumbuhan bakteri ditentukan sebagai KBM.

Identifikasi Kualitatif Senyawa Flavonoid

Fraksi dilarutkan dalam metanol 50% (1-2 mL), dengan pemanasan

kemudian ditambahkan logam Mg dan 5-6 tetes asam hidroklorida, larutan akan

menjadi merah apabila mengandung flavonol dan berwarna oranye untuk

flavanon. Uji KLT dengan silica gel sebagai fase diam dan etil asetat : toluena


8

(9:1 v/v) sebagai fase gerak, adanya flavonoid ditunjukkan dengan terbentuknya

warna kuning pada sinar tampak, pemadaman pada sinar UV 254 nm, dan warna

hitam, kuning, biru atau hijau pada sinar UV 365 nm (Hartini, 2013). Kemudian

kromatogram disemprot dengan FeCl3.

Uji Bioautografi

Senyawa antibakteri pada fraksi teraktif hasil VLC dari ekstrak

kloroform daun sirih merah dideteksi dengan metode bioautografi kontak, dengan

KLT fase diam Silica Gel GF254 dan fase gerak etil asetat : toluen (9:1 v/v). Fraksi

yang memiliki daya antibakteri paling tinggi kemudian ditotolkan pada plat KLT

dan dielusi dalam chamber yang berisi fase gerak yang sudah dibuat. Plat KLT

kemudian ditempelkan pada media NA yang sudah diinokulasikan bakteri dan

sudah memadat. Ditunggu 45 menit kemudian plat diangkat. Media NA kemudian

diinkubasi selama 24 jam untuk melihat daya hambatnya.

Teknik Analisis Data Penelitian

Data analisis seecara statistik diawali dengan menguji distribusi

normalitas dengan uji Shapiro-Wilk. Uji homogenitas dilakukan dengan uji

Levene. Apabila data yang didapatkan terdistribusi normal (nilai P > 0,05), maka

dilanjutkan dengan uji One Way ANOVA, dan apabila ditemukan perbedaan

maka dilanjutkan dengan Post-Hoc Tukey pada taraf kepercayaan 95%.

Sedangkan apabila didapakan data yang tidak terdistribusi normal (nilai P < 0,05),

maka dilanjutkan dengan uji Kurskal-Wallis, dan apabila ditemukan perbedaan

maka dilanjutkan dengan uji Mann-Whitney pada taraf kepercayaan 95%.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Determinasi tanaman bertujuan untuk menghindari kesalahan dalam

penelitian dan memastikan bahwa tanaman yang digunakan adalah sirih merah

(Piper crocatum Ruiz & Pav.). Determinasi dilakukan dengan melihat ciri-ciri

tanaman yang digunakan dalam penelitian ini. Determinasi ini dilakukan di

Laboratorium Sistematika Tumbuhan Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada,

Yogyakarta. Hasil determinasi menunjukkan bahwa tanaman yang digunakan


9

dalam penelitian ini merupakan tanaman sirih merah (Piper crocatum Ruiz &

Pav.) seperti yang tercantum dalam surat keterangan (Lampiran 1).

Sirih merah yang dipanen dipisahkan antara salur dan daunnya,

ditimbang, lalu dilakukan sortasi basah untuk memisahkan dari kotoran dan bahan

asing, selanjutnya ditimbang kembali. Daun sirih merah kemudian dicuci dengan

air mengalir lalu dipotong-potong dan dikeringkan. Pengeringan bertujuan untuk

mengurangi kadar air pada daun sirih merah dan dilakukan hingga daun sirih

merah mudah hancur saat diremas. Selanjutnya simplisia kering diserbuk dan

diayak. Hasil penyerbukan simplisia yang didapatkan adalah 236 gram.

Penetapan kadar air yang dilakukan mengacu pada Farmakope Herbal

(2011) yaitu dengan destilasi toluena. Serbuk simplisia daun sirih merah yang

ditimbang adalah 10,2294 gram dan volume air yang didapatkan adalah 0,5 ml

sehingga kadar air serbuk simplisia daun sirih merah yang didapatkan yaitu

4,8879%. Hal ini berarti bahwa serbuk simplisia yang digunakan sudah memenuhi

h ≤ .

Metode yang dilakukan untuk pembuatan ekstrak kloroform daun sirih

merah adalah maserasi. Pada metode maserasi, serbuk simplisia akan kontak

dengan pelarut, dan dengan bantuan pengadukan maka senyawa aktif simplisia

akan larut dan berpindah ke pelarut. Daun sirih merah mengandung senyawa

thermolabile seperti flavonoid dan minyak atsiri sehingga metode maserasi dipilih

untuk porses ekstraksi karena metode ini sederhana dan tidak membutuhkan

pemanasan sehingga cocok untuk senyawa thermolabile (Pandey, 2014). Hasil

maserasi kemudian disaring menggunakan corong buchner dan dengan bantuan

vakum. Hasil penyaringan kemudian diuapkan dengan rotary evaporator pada

suhu 60°C untuk menguapkan pelarut pada ekstrak. Setelah didapatkan ekstrak

kental kemudian dilakukan bobot tetap untuk memastikan bahwa pelarut yang

digunakan sudah tidak ada lagi didalam ekstrak. Bobot tetap diperoleh apabila

perbedaan dua kali penimbangan selama 1jam berturut-turut tidak melebihi 0,5mg

(Direktorat Jendral Bina Kefarmasian dan Alat Kesehatan, 2011). Bobot ekstrak


10

kloroform yang didapatkan adalah 19,3952 gram dan rendemen yang didapatkan

adalah 9,6902 %.

Ekstrak klorofom daun sirih merah difraksinasi lebih lanjut dengan

metode Vacuum Liquid Chromatography (VLC). Fraksinasi dilakukan dengan

metode VLC karena metode ini dapat digunakan untuk fraksinasi dengan jumlah

ekstrak dalam skala besar dan dalam waktu yang singkat. Pertama-tama Sintered

Glass Buchner dan Erlenmeyer serta vakum yang digunakan untuk fraksinasi

disiapkan dan dipasang. Kertas saring dimasukkan ke dalam kolom sesuai

diameter kolom. Sillica Gel GF254 dimasukkan ke dalam kolom sedikit demi

sedikit sambil di vakum sebagai fase diam. Bobot Silica Gel GF254 yang

digunakan sebagai fase diam adalah sebanyak ± 4 kali bobot esktrak yang didapat.

Kemudian Sillica Gel GF254 disiapkan lagi sebanyak ± 2 kali bobot esktrak dan

dicampurkan dengan ekstrak kering menggunakan mortir dan stamper sambil

diaduk perlahan hingga didapatkan campuran homogen dan kering (free flowing).

Serbuk ekstrak free flowing dimasukkan sedikit demi sedikit ke dalam sintered

glass Buchner diatas fase diam sambil divakum. Dua lembar kertas saring sebesar

diameter kolom dimasukkan diatas serbuk ekstrak free flowing. Sebanyak 200ml

pelarut dituangkan secara perlahan-lahan pada permukaan kertas saring melalui

dinding sambil divakum. Pelarut yang digunakan berturut-turut metanol (fraksi a),

metanol - kloroform (7:3) (fraksi b), metanol - kloroform (5:5) (fraksi c), metanol

- kloroform (3:7) (fraksi d), dan kloroform (fraksi e). Hasil fraksinasi ditampung

dalam cawan porselen. Fraksi yang didapat kemudian dianalisis menggunakan

KLT dengan fase diam silika gel GF254, fase gerak metanol : kloroform dengan

perbandingan 9:1, dan deteksi UV 365 nm. Fase gerak metanol : kloroform

dengan perbandingan 9:1 yang digunakan untuk metode KLT ini dipilih setelah

sebelumnya dilakukan optimasi fase gerak. Fraksi yang memiliki profil KLT yang

mirip akan digabungkan menjadi satu fraksi. Berdasarkan kemiripan profil KLT,

dilihat dari warna, bercak, posisi, dan bentuknya, fraksi tersebut digabungkan

menjadi tiga fraksi yaitu fraksi 1 yang terdiri dari fraksi a; fraksi 2 yang terdiri

dari fraksi b, fraksi c, dan fraksi d; serta fraksi 3 yang terdiri dari fraksi e. Fraksi


11

tersebut kemudian diuapkan dengan rotary evaporator pada suhu 60°C untuk

menguapkan pelarut pada fraksi.

(a) UV 254 nm (b) UV 365 nm

Gambar 1. Profil KLT fraksi VLC dari ekstrak kloroform daun sirih

merah

Keterangan: a. fraksi dengan fase gerak metanol; b. fraksi dengan fase

gerak metanol - kloroform (7:3); c. fraksi dengan fase gerak metanol -

kloroform (5:5); d. fraksi dengan fase gerak metanol - kloroform

(3:7); e. fraksi dengan fase gerak kloroform

Selanjutnya dilakukan uji aktivitas antibakteri untuk melihat fraksi

teraktif dari tiga fraksi yang didapatkan. Fraksi 1 tidak dilanjutkan untuk

penelitian ini karena jumlahnya tidak memenuhi untuk pengujian. Masing-masing

fraksi diencerkan menggunakan DMSO 100% hingga konsentrasi 250 mg/ml.

Pengujian fraksi teraktif dilakukan dengan difusi sumuran. Bakteri yang

digunakan dalam penelitian ini adalah Staphylococcus aureus resisten ampicillin.

Bakteri Staphylococcus aureus dikatakan resisten terhadap ampicillin apabila

z h ≤ 28 dan dikatakan intermediet dan sensitive bila

z h ≥29 (CLSI, 2017). Zona hambat yang didapatkan adalah 1 mm

sehingga disimpulkan bahwa bakteri uji telah resisten terhadap ampicillin

(Gambar 2).


12

Gambar 2. Uji resistensi bakteri Staphyloccous aureus

Kontrol media (Gambar 3a) yang dibuat tampak bening yang

menunjukkan bahwa tidak terdapat kontaminasi. Pada kontrol pertumbuhan

(Gambar 3b) bakteri tampak keruh merata yang berarti bahwa bakteri

Staphylococcus aureus resisten ampicillin dapat tumbuh pada media Nutrient

Agar (NA).

(a) (b)

Gambar 3. Kontrol media (a) dan kontrol pertumbuhan (b)

Pada setiap petri dibuat 4 sumuran yang masing-masing berisi kontrol

positif yaitu ciprofloxacin 50µg/ml, kontrol negatif yaitu DMSO 100%, fraksi 2,

dan fraksi 3 dengan konsentrasi masing-masing 250mg/ml. Potensi antibakteri

pada metode difusi dilihat berdasarkan pengamatan zona jernih yang terbentuk di

sekitar tempat penginokulasian senyawa karena terdifusinya senyawa tersebut

(Jawetz, dkk., 2005). Dari hasil pengamatan diketahui bahwa fraksi 2 memiliki

aktivitas antibakteri yang lebih besar daripada fraksi 3. Hasil pengamatan

menunjukkan juga menunjukkan bahwa DMSO 100% tidak menghambat

pertumbuhan bakteri dilihat dari tidak adanya zona hambat yang terbentuk


13

sehingga dapat digunakan sebagai pelarut. Hal ini serupa dengan penelitian yang

dilakukan oleh Cahyono (2013) dan Yulianingsih (2012), pelarut DMSO 100%

tidak memiliki daya hambat terhadap bakteri, dilihat dari tidak terbentuknya zona

hambat disekitar sumuran yang berisi DMSO 100%.

Gambar 4. Zona hambat fraksi dari ekstrak kloroform daun sirih merah

Keterangan gambar: 1. DMSO 100% ; 2. Ciprofloxacin 50µm/ml ;

3. Fraksi 2 konsentrasi 250mg/ml ; 4. Fraksi 3 konsentrasi 250mg/ml

Dilakukan 3 kali replikasi pada uji aktivitas antibakteri dengan data sebagai

berikut:

Tabel 1. Hasil uji aktivitas antibakteri

Replikasi Kontrol Positif Kontrol

Negatif

Fraksi 2

( 250 mg/ml)

Fraksi 3

(250 mg/ml)

I 18,5 mm 0 mm 10,5 mm 7,5 mm

II 18,5 mm 0 mm 9,5 mm 7,5 mm

III 16 mm 0 mm 11 mm 8,5 mm

Mean±SD 17, 6667±1, 4434 0±0 10,3333±0,7638 7,8333±0,5774

Setelah diketahui bahwa fraksi 2 adalah fraksi teraktif maka dilanjutkan

pengujian selanjutnya. Dilakukan pengujian KHM dan KBM pada fraksi 2 hasil

VLC dari ekstrak kloroform daun sirih merah. Penentuan KHM dilakukan

menggunakan dilusi cair. Penentuan KHM dilihat berdasarkan pertumbuhan

bakteri pada media NB dengan cara membandingkan dengan kontrol media dan

kontrol pertumbuhan. Dari hasil pengamatan tidak bisa ditentukan KHM karena


14

masing-masing tabung terlihat keruh akibat penambahan masing-masing variasi

konsentrasi fraksi sehingga pengamatan tidak bisa terlihat jelas (Gambar 5).

Gambar 5. Uji KHM fraksi 2 VLC dari ekstrak kloroform daun sirih merah

Keterangan: 1. Kontrol media ; 2. Kontrol pertumbuhan ; 3. Fraksi 2

konsentrasi 250mg/ml ; 4. Fraksi 2 konsentrasi 125mg/ml ; 5. Fraksi 2

konsentrasi 62,5mg/ml ; 6. Fraksi 2 konsentrasi 31,25mg/ml ; 7. Fraksi 2

konsentrasi 15,625mg/ml ; 8. Fraksi 2 konsentrasi 7,8125mg/ml ; 9. Fraksi

2 konsentrasi 3,90625mg/ml ; 10. Fraksi 2 konsentrasi 1,953125mg/ml

Kemudian dilanjutkan penentuan nilai KBM dengan cara sub kultur dari

media NB ke dalam media NA steril secara streak plate lalu diinkubasi selama 24

jam. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa pada konsentrasi 250mg/ml dan

125mg/ml tidak menunjukkan adanya pertumbuhan bakteri sehingga nilai KBM

dari fraksi 2 ekstrak kloroform daun sirih merah adalah pada konsenstrasi

125mg/ml (Gambar 6). Menurut penelitian yang dilakukan oleh Thie (2018),

ekstrak kloroform daun sirih merah memiliki nilai KBM 50mg/ml. Hal ini

menunjukkan bahwa daya antibakteri pada ekstrak kloroform daun sirih merah

lebih baik daripada fraksi dari ekstrak kloroform daun sirih merah. Hal ini bisa

dikarenakan adanya aktivitas antibakteri yang sinergi dari beberapa senyawa yang

terdapat pada ekstrak.


15

Gambar 6. Uji KBM fraksi 2 VLC dari ekstrak kloroform daun sirih

merah

Keterangan: 1. Fraksi 2 konsentrasi 250mg/ml ; 2. Fraksi 2 konsentrasi

125mg/ml ; 3. Fraksi 2 konsentrasi 62,5mg/ml ; 4. Fraksi 2 konsentrasi

31,25mg/ml

Metode bioautografi merupakan metode kombinasi KLT dengan deteksi

biologi (Marston, 2011). Metode bioautografi dapat digunakan untuk mendeteksi

komponen senyawa aktif pada suatu sampel (Chomnawang, et al, 2009). Pada

metode bioautografi kontak, adalah dengan memindahkan senyawa antibakteri

melalui proses difusi dari plat KLT ke media agar yang sudah diinokulasikan

bakteri (Hamburger and Cordell, 1987). Fraksi yang akan diuji dengan

bioautografi kontak ditotolkan pada plat KLT (Gambar 7) kemudian ditempelkan

pada permukaan agar yang sudah diinokulasikan bakteri Staphylococcus aureus

resisten ampicillin (Gambar 8a).

(a) UV 254 nm (b) UV 365 nm

Gambar 7. Fraksi pada plat KLT untuk uji bioautografi kontak

Hasil bioautografi menunjukkan adanya aktivitas antibakteri pada fraksi

2 dari ekstrak kloroform daun sirih merah (Gambar 8b). Aktivitas antibakteri


16

dapat dilihat dari adanya zona jernih yang terbentuk. Pada penelitian yang

dilakukan oleh Sudirman (2005), didapatkan 3 spot zona jernih yang menandakan

adanya aktivitas antibakteri. Tiga spot zona jernih ini dapat dihitung nilai Rf dari

masing-masing spot dan dapat dideteksi kemungkinan senyawa yang berperan

dalam pembentukan zona hambat ini. Hal ini karena adanya pemisahan antara

spot zona jernih yang dihasilkan sehingga dapat dihitung Rf dari spot-spot

tersebut lalu dibandingkan dengan kromatogram yang digunakan untuk

menentukan senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri melalui Rf yang

didapatkan. Hasil penelitian ini berbeda dengan yang dilakukan oleh Sudirman

(2005), yaitu belum dapat ditentukan senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri

karena zona jernih yang terbentuk tidak berbentuk spot sehingga tidak bisa

dihitung Rf dari senyawa tunggal yang memiliki aktivitas antibakteri. Hal ini

dikarenakan fraksi belum mengalami pemisahan dengan baik sehingga belum bisa

dideteksi senyawa antibakteri teraktif pada fraksi 2 ekstrak kloroform daun sirih

merah. Pada penelitian ini, fraksi yang digunakan untuk uji bioautografi kontak

adalah 10 totol fraksi. Salah satu penyebab pemisahan yang kurang baik ini bisa

dikarenakan totolan fraksi pada plat KLT yang belum kering sempurna. Hal ini

bisa diatasi dengan penggunaan hairdryer untuk pengeringan fraksi pada plat

KLT. Untuk menghindari kerusakan senyawa pada fraksi maka penggunaan

hairdryer diberi jarak sedikit jauh dari plat KLT. Hal-hal lain yang dapat

berpengaruh pada hasil bioautografi kontak adalah loading mass fraksi pada plat

KLT dan juga lamanya kontak plat KLT dengan agar.

(a) Penempelan plat KLT pada agar (b) Hasil uji bioautografi kontak

Gambar 8. Uji aktivitas antibakteri dengan metode bioautografi kontak


17

Selanjutnya dilakukan uji kualitatif kandungan senyawa flavonoid pada

fraksi 2 hasil VLC dari ekstrak klorofrom daun sirih merah, dilakukan 2 uji

kualitatif yaitu dengan uji tabung dan uji KLT. Pada penelitian yang dilakukan

oleh Thie (2018), pada ekstrak kloroform daun sirih merah tidak terdeteksi

adanya senyawa flavonoid. Pada penelitian ini tetap dilakukan uji kualitatif

kandungan senyawa flavonoid pada fraksi 2 hasil VLC dari ekstrak kloroform

daun sirih merah untuk melihat apakah pada fraksi tersebut terdeteksi adanya

senyawa flavonoid. Hal ini dikarenakan kandungan senyawa pada fraksi

seharusnya lebih besar daripada yang terdapat pada ekstrak.

(a) Sebelum penambahan reagen (b) sesudah penambahan reagen

Gambar 9. Uji kualitatif kandungan senyawa flavonoid dengan uji tabung

Hasil pengamatan menunjukkan bahwa tidak terdapat perubahan warna

menjadi warna merah setelah dilakukan uji tabung pada fraksi 2 hasil VLC dari

ekstrak kloroform daun sirih merah. Hal ini menunjukkan bahwa pada fraksi

tersebut tidak terdeteksi adanya senyawa flavonoid. Tidak terdeteksinya senyawa

flavonoid ini bisa dikarenakan tidak adanya senyawa flavonoid dalam fraksi

ataupun jumlah / kuantitas senyawa flavonoid yang rendah sehingga tidak dapat

terdeteksi dengan uji tabung.

Selanjutnya dilakukan uji kualitatif kandungan senyawa flavonoid pada

fraksi 2 hasil VLC dari ekstrak kloroform daun sirih merah, dan digunakan

kuersetin sebagai marker. Kuersetin adalah aglikon yang sangat tidak larut dalam

air dingin, tidak larut dalam air panas, tetapi cukup larut pada alkohol dan lipid


18

(Kelly, 2011). Kloroform merupakan pelarut non polar sehigga kuersetin dipilih

sebagai marker karena dapat larut dalam pelarut non polar. Jarak elusi pada KLT

yang dilakukan adalah 10 cm.

(a) UV 254 nm (b) UV 365 nm

Gambar 10. Uji kualitatif kandungan senyawa flavonoid dengan metode KLT

Keterangan gambar : 1. Marker kuersetin; 2. Fraksi 2 hasil VLC dari

ekstrak kloroform daun sirih merah; a. Senyawa dengan Rf 0,77; b. Senyawa

dengan Rf 0,93; c. Senyawa dengan Rf 1; d. Senyawa dengan Rf 0,49; e. Senyawa

dengan Rf 0,65

Tabel 2. Nilai Rf dan warna hasil uji KLT

Deteksi Bercak yang

didapatkan

Nilai Rf Senyawa Warna

UV 254 nm Marker kuersetin 0,88 hijau kehitaman

Bercak a 0,77 Biru

Bercak b 0,93 Biru

Bercak c 1 Hijau kehitaman

UV 365 nm Marker kuersetin 0,88 Biru

Bercak c 1 Ungu kemerahan

a

b c

d

e

c

b

c

(c) Penyemprotan

FeCl3

1 2 1 2 1 2


19

Bercak d 0,49 Ungu kemerahan

Bercak e 0,65 Ungu kemerahan

Penyemprotan

FeCl3

Marker kuersetin 0,88 Hitam

Bercak b 0,93 Putih

Bercak c 1 Coklat kehitaman

Fase diam yang digunakan pada KLT ini adalah plat Silica Gel GF254.

Plat ini akan menampakkan bercak pada saat disinari UV 254 nm serta plat dan

bercak akan tampak gelap saat disinari UV 365 nm. Pada uji KLT didapatkan

hasil bahwa fraksi tersebut tidak terdeteksi adanya kuersetin yang merupakan

senyawa golongan flavonoid. Hal ini bisa dilihat dari hasil KLT yang

menunjukkan bahwa sampel menghasilkan warna bercak serta Rf senyawa yang

berbeda dengan marker. Fraksi 2 hasil VLC dari esktrak kloroform daun sirih

merah kemungkinan mengandung flavonoid lain selain kuersetin. Hal ini dapat

dilihat dari adanya fluorosensi pada UV 254 nm pada kromatogram yang

menandakan adanya flavonoid (Wagner and Bladt, 1996) dan berwarna kuning

(Skorek et al., 2016). Selain itu, adanya bercak ungu kemerahan pada

kromatogram dibawah UV 365 nm menunjukkan adanya klorofil ataupun

senyawa lain yang tertutupi oleh klorofil (Wagner and Bladt, 1996). Menurut

Harborne (1987), deteksi senyawa fenol dengan penambahan FeCl3 akan

menghasilkan warna hijau, merah, coklat, ungu, biru, atau hitam yang kuat.

Kromatogram setelah disemprot dengan FeCl3 coklat kehitaman menunjukkan

adanya senyawa fenol pada fraksi.

Aktivitas antibakteri yang dihasilkan oleh fraksi VLC dari ekstrak

kloroform daun sirih merah selain karena aktivitas antibakteri dari flavonoid

diduga juga karena adanya daya antibakteri dari minyak atsiri. Menurut Tiwari

(2011), pelarut kloroform dapat digunakan untuk mengekstraksi senyawa

flavonoid dan terpenoid. Minyak atsiri merupakah salah satu senyawa golongan

terpenoid yang memiliki aktivitas antibakteri.


20

Berdasarkan analisis statistik (lampiran 4), uji Shapiro-Wilk untuk

melihat mormalitas data dengan nilai signifikansi <0,05 menunjukkan data tidak

terdistribusi secara normal. Uji Levene untuk melihat homogenitas data dengan

nilai signifikansi <0,05 menunjukkan distribusi data tidak homogen, sehingga

dilanjutkan uji Kruskal-Wallis yang menunjukkan adanya perbedaan signifikan

pada data dengan nilai signifikansi <0,05 selanjutnya dilanjutkan uji Post-Hoc

Mann-Whitney. Diameter zona hambat fraksi 2 dan fraksi 3 berbeda bermakna

secara statistik terhadap kontrol negatif dan kontrol positif. Adanya perbedaan

bermakna dengan kontrol positif dikarenakan diameter zona hambat yang

dihasilkan oleh kontrol positif jauh lebih besar daripada zona hambat yang

dihasilkan oleh fraksi 2 dan fraksi 3 yaitu 17,6667±1,4434 mm untuk kontrol

positif, 10,3333±0,7638 untuk fraksi 2, dan 7,8333±0,5774 untuk fraksi 3.

Sedangkan perbedaan bermakna dengan kontrol negatif dikarenakan tidak

dihasilkannya zona hambat oleh kontrol negatif. Hasil pengujian statistik juga

menunjukkan bahwa ada perbedaan bermakna antara zona hambat yang dihasilkan

fraksi 2 dan fraksi 3. Hal ini dikarenakan zona hambat yang dihasilkan oleh kedua

fraksi memiliki selisih yang besar. Dari hasil penelitian didapatkan bahwa fraksi 2

memiliki daya antibakteri yang lebih besar daripada fraksi 3 dengan konsentrasi

fraksi 250 mg/ml.

KESIMPULAN DAN SARAN

Fraksi dari ekstrak kloroform daun sirih merah memiliki daya antibakteri

dengan diameter zona hambat yang dihasilkan oleh fraksi 2 adalah

10,3333±0,7638 mm dan zona hambat yang dihasilkan oleh fraksi 3 adalah

7,8333±0,5774 mm, dengan nilai KBM 125 mg/ml.

Saran, pengujian dengan metode bioautografi kontak sebaiknya

digunakan untuk senyawa yang memiliki daya antibakteri kuat dan juga dilakukan

uji identifikasi senyawa minyak atsiri.


21

DAFTAR PUSTAKA

Badan Pengawas Obat dan Makanan RI, 2010. Acuan Sediaan Herbal.

Volume 5, Edisi 1, Jakarta: Badan Pengawas Obat dan Makanan, 6-8.

Cahyono, W., 2013. Aktivitas Antibakteri Kombinasi Ekstrak Etanol Daun

Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz And Pav) dan Kloramfenikol

terhadap Bakteri Salmonella typhi, Shigella dysenteriae, dan

Staphylococcus aureus beserta Bioautografinya. Skripsi. Surakarta:

Universitas Muhammadiyah Surakarta.

Centers for Disease Control and Prevention, 2013. Antibiotic Resistance

Threats.United States: Department of Health and Human Service.

Chomnawang, M. T., Surassmo, S., Wongsariya, K., and Bunyapraphatsara,

N., 2009. Antibacterial Activity of Thai Medical Plants against

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Fitoterapia, 80, 102-104.

Clinical and Laboratory Standards Institute, 2017. Performance Standards for

Antimicrobial Susceptibility Testing, 27 th Edition, 62.

Davis, W. W., and Stout, T. R., 1971., Disc Plate Methode of Microbiological

Antibiotic Assay. Journal of Microbiology. 22 (4), 666-670.

Direktorat Jendral Bina Kefarmasian Kefarmasian dan Alat Kesehatan RI,

2011. Farmakope Herbal. Suplemen II. Edisi I, Jakarta: Kementerian

Kesehatan RI, 101-102, 105-111.

Hamburger, O. M., dan Cordell, G. A., 1987. A Direct Bioutographic TLC

Assay for Compounds Possessing Antibacterial Activity. Journal of

Natural Products. 50(1), 19-22.

Harborne, J.B., 1987. Phytochemical Methods: A Guide to Modern Technique

of Plant Analysis, New York: Champman and Hall, 34.

Hartini, Y. S., Wahyuono, S., Widyarini, S., dan Yuswanto, A., 2013. Uji

Aktivitas Fagositosis Makrofag Fraksi-fraksi dari Ekstrak Metanol

Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) Secara In Vitro.

Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia, 11 (2), 108-115.


22

Hertiani T., Palupi, I. S., Sanliferianti, & Nurwindasari, H. D., 2003. Uji

Potensi Antimikroba terhadap S. aureus, E. coli, Shigella dysentriae,

dan Candida albicans dari Beberapa Tanaman Obat Tradisional untuk

penyakit Infeksi, Jurnal Farmasi Indonesia Pharmacon, 4 (2), 89-95.

Jawetz, Melnick, Adelberg, Brooks, Butel, dan Ornston, 2005. Mikrobiologi

Kedokteran Edisi 20, Jakarta: EGC.

Juliantina R., Farida, dkk., 2009. Manfaat Sirih Merah (Piper crocatum)

Sebagai Agen Antibakterial Terhadap Bakteri Gram Positif dan Gram

Negatif. Jurnal Kedokteran dan Kesehatan Indonesia.

Kelly, G. S., 2011. Quercetin. Alternative Medicine Review. 16 (2), 172-194.

Kementrian Kesehatan RI, 2011. Modul Penggunaan Obat Rasional. Jakarta:

Kementrian Kesesehatan RI.

Kementrian Kesehatan RI., 2011, Pedoman Umum Penggunaan Antibiotik.

Jakarta: Kementrian Kesehatan RI.

Marston, A., 2011. Thin-Layer Chromatography with Biological Detection in

Phytochemistry, Journal of Chromatography A. 1281, 2676-2683.

Pandey, A., and Tripathi, S., 2014. Concept of Standardization, Extraction and

Pre Phytochemical Screening Strategies for Herbal Drug. Journal of

Pharmacognosy and Phytochemistry, 2(5), 115-119.

Parfati, N., dan Windono, T., 2016. Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.)

Kajian Pustaka Aspek Botani, Kandungan Kimia, dan Aktivitas

Farmakologi. Media Pharmaceutica Indonesiana. 1(2), 106-115.

Reveny, J., 2011, Daya Antimikroba Ekstrak dan Fraksi Daun Sirih Merah

(Piper betle Linn.), Daya Antimikroba, 12 (1), 6-12.

Skorek, M., JurcZYK, k., Sajewicz, M., abd Kowalska, T., 2016. Thin-Layer

Chromatographic Identification of Flavonoids and Phenolic Acids

Contained in Cosmetic Raw Material. Journal of Liquid

Chromatograohy & Related Technologires. 39(5-6), 286-291.

Soleha, T. U., Corolia, N., and Kurniawan, S. W., 2015. The Inhibition Of

Red Betel Leaves (Piper crocatum) Towards Staphylococcus aureus

and Salmonella typhi. J Majority. 5 (5), 117-122.


23

Sudirman, L. L., 2005., Deteksi Senyawa Antimikroba yang Diisolasi dari

Beberapa Lentinus Tropis dengan Metode Bioautografi, Hayati. 12(2),

67-72.

Thie, A. S., 2018. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kloroform Daun Sirih

Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) terhadap Staphylococcus aureus

Resisten Ampicillin. Skripsi. Yogyakarta: Universitas Sanata Dharma.

Tiwari, P., Kumar, B., Kaur, M., Kaur, G., and Kaur, H., 2011. Phytochemical

screening and Extraction: A Review. Internationale Pharmaceutica

Sciencia. 1(1), 98-106.

Wagner, H., and Bladt, S. 1996. Plant Drug Analysis, A Thin Layer

Chromatography Atlas, 2nd Ed., Berlin: Springer Verlag, 195-197.

Wardani, R, K., Tjahjaningsih, W., & Rahardja, B, S., 2012. Uji Eefektifitas

Ekstrak Daun Sirih Merah (Piper rocatum) terhadap Bakteri

Aeromonas hydrophila Secara In Vitro, Jurnal Ilmiah Perikanan dan

Kelautan, 4 (1), 59-64.

Wendakoon, C., Calderon, P., and Gagnon, D., 2012. Evaluation of Selected

Medicinal Plants Extracted in Different Ethanol Concentrations for

Antibacterial Activity against Human Pathogens, Journal of

Medicinally Active Plants. 1, 60-68.

Yulianingsih, S.N., 2012, Aktivits Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Belimbing

Wuluh (Averrhoa bilimbi L.) terhadap Staphylococcus aureus dan

Staphylococcus epidermidis. Skripsi. Surakarta: Universitas

Muhammadiyah Surakarta.


24

Lampiran 1. Surat determinasi tanaman sirih merah


25

Lampiran 2. Surat identifikasi bakteri Staphyloccous aureus


26

Lampiran 3. Sertifikat pengujian statistik dengan SPSS


27

Lampiran 4. Hasil perhitungan statistik

Hasil Uji Levene

Test of Homogeneity of Variances

Levene

Statistic df1 df2 Sig.

Zona

Hambat

Based on Mean 6.444 3 8 .016

Based on Median .542 3 8 .667

Based on Median and

with adjusted df

.542 3 3.151 .685

Based on trimmed

mean

5.334 3 8 .026

Hasil Uji Shapiro-Wilk

Tests of Normality

Perlakua

n

Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk

Statistic df Sig. Statistic df Sig.

Zona

Hambat

1 .385 3 . .750 3 .000

2 . 3 . . 3 .

3 .253 3 . .964 3 .637

4 .385 3 . .750 3 .000

Hasil Uji Kruskal-Wallis

Test Statisticsa,b

Zona Hambat

Kruskal-Wallis

H

10.607

df 3


28

Asymp. Sig. .014

Hasil Uji Mann-Whitney kontrol positif dan kontrol negative

Test Statisticsa

Zona Hambat

Mann-Whitney U .000

Wilcoxon W 6.000

Z -2.121

Asymp. Sig. (2-tailed) .034

Exact Sig. [2*(1-tailed

Sig.)]

.100b

Hasil Uji Mann-Whitney kontrol positif dan fraksi 2 dari ekstrak kloroform daun

sirih merah

Test Statisticsa

Zona Hambat

Mann-Whitney U .000

Wilcoxon W 6.000

Z -1.993



Sig.)]

.100b


29

Hasil Uji Mann-Whitney kontrol positif dan fraksi 3 dari ekstrak kloroform daun

sirih merah

Test Statisticsa

Zona Hambat

Mann-Whitney U .000

Wilcoxon W 6.000

Z -2.023



Sig.)]

.100b

Hasil Uji Mann-Whitney kontrol negatif dan fraksi 2 dari ekstrak kloroform daun

sirih merah

Test Statisticsa

Zona Hambat

Mann-Whitney U .000

Wilcoxon W 6.000

Z -2.087



Sig.)]

.100b


30

Hasil Uji Mann-Whitney kontrol negatif dan fraksi 3 dari ekstrak kloroform daun

sirih merah

Test Statisticsa

Zona Hambat

Mann-Whitney U .000

Wilcoxon W 6.000

Z -2.121



Sig.)]

.100b

Hasil Uji Mann-Whitney fraksi 2 dan fraksi 3 dari ekstrak kloroform daun sirih

merah

Test Statisticsa

Zona Hambat

Mann-Whitney U .000

Wilcoxon W 6.000

Z -1.993



Sig.)]

.100b


31

BIOGRAFI PENULIS

Penulis bernama lengkap Nadia Chandra Prasdiyanti lahir

di Surakarta, 27 Mei 1996. Penulis merupakan anak

pertama dari 3 bersaudara dari pasangan Bapak I Made

Budiarsa dan Ibu Niken Satuti Nur Handayani. Penulis

menempuh pendidikan di SD Percobaan 2 Yogyakarta,

SMP Negeri 1 Depok Yogyakarta, SMA Stella Duce 1

Yogyakarta dan pada tahun 2015 melanjutkan pendidikan

di Program Studi Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Penulis aktif

dalam kegiatan kepanitiaan antara lain sebagai anggota divisi Expo kegiatan

INSADHA tahun 2016, kordinator divisi konsumsi kegiatan Desa Mitra 1,

anggota divisi perlengkapan kegiatan Desa Mitra 2 serta menjadi volunteer

kegiatan Faction #2. Penulis pernah menjadi asisten dosen praktikum

Farmakognosi-Fitokimia (2018), Farmakokinetika-Biofarmasetika (2018), serta

Formulasi dan Teknologi Sediaan Farmasi (2018).


uji aktivitas antibakteri fraksi dari ekstrak …repository.usd.ac.id/32881/2/158114025_full.pdf ·...

Documents