tugas fitokimia ii,sec
TRANSCRIPT
8/8/2019 Tugas Fitokimia II,Sec
http://slidepdf.com/reader/full/tugas-fitokimia-iisec 1/19
TUGAS FITOKIMIA II
SIZE EXCLUSION
CHROMATOGRAPHY(SEC)
Disusun oleh:
Seffy Aulia 0305050574Sherly Natalia 0305050582
Susanto 030505059Y
Syatiani Arum S. 0305050604
Vania Gones 0305050612
Ventry F. Effendy 030505062Y
Vergina Sitar O.B. 0305050647
DEPARTEMEN FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS INDONESIA
DEPOK
2008
8/8/2019 Tugas Fitokimia II,Sec
http://slidepdf.com/reader/full/tugas-fitokimia-iisec 2/19
BAB I
PENDAHULUAN
Size exclusion chromatography (SEC) disebut juga gel permeation
chromatography (GPC), gel filtration chromatography (GFC), gel chromatography,
steric exclusion chromatography, dan exclusion chromatography, merupakan metode
kromatografi yang menggunakan partikel berpori untuk memisahkan molekul dengan
ukuran yang berbeda. Teknik SEC pertama kali ditemukan oleh Grant Henry Lathe
dan Colin R Ruthven. SEC umumnya diaplikasikan untuk kompleks makromolekuler
sperti protein dan polimer industry terutama digunakan untuk memisahkan molekul
biologis, untuk menentukan bobot molekul dan distribusi bobot molekul dari polimer.
Molekul yang lebih kecil dari ukuran pori dapat memasuki partikel dan mempunyai
jalur dan waktu transit yang lebih panjang dibandingkan molekul besar yang tidak
dapat memasuki partikel. Semua molekul yang lebih besar dari ukuran pori tidak
tertahan dan terelusi bersama. Molekul yang memasuki pori akan mempunyai waktu
tinggal dalam partikel yang tergantung pada ukuran dan bentuk molekul. Molekul
yang berbeda mempunyai waktu transit yang berbeda untuk melewati kolom. Ketika
larutan aqueous digunakan untuk transport sampel melalui kolom, tehnik tersebut
disebut gel filtration chromatography yang digunakan ketika pelarut organik
digunakan sebagai fase gerak.
Gambar 1. Skema kolom size exclusion chromatography
8/8/2019 Tugas Fitokimia II,Sec
http://slidepdf.com/reader/full/tugas-fitokimia-iisec 3/19
Kelebihan SEC :
• Waktu pemisahan yang cepat dan hasil yang baik.
• Frekuensi tajam sensitivitas baik.
•Bebas dari kehilangan sampel, pelarut tidak berinteraksi dengan fase stasioner.
• Variasi larutan dapat diaplikasikan tanpa menganggu proses filtrasi, sementara
mempersiapkan aktivitas biologis partikel untuk memisah.
Kekurangan SEC :
• Hanya sejumlah frekuensi terbatas dapat diakomodasi karena skala waktu
kromatogram pendek.
•Tidak dapat digunakan untuk sampel dengan ukuran seragam, seperti isomer.
Diperlukan sedikitnya perbedaan 10 % pada berat molekul untuk resolusi yang
masuk akal.
Teori
Kolom SEC mengandung partikel berpori dengan garis tengah pori yang
berbeda. Linarut yang disuntikkan ke dalam kolom tersebut berdifusi ke dalam pori
yang garis tengahnya lebih besar daripada garis tengah efektif linarut. Walaupun bobot molekulnya sama, garis tengah efektifnya berbeda, dan komponen yang garis
tengahnya efektifnya paling besar akan terelusi lebih dahulu. Dengan bertambah
besarnya garis tengah efektif linarut, jumlah pori yang dapat dimasuki dan
kemampuannya berdifusi dalam pori menurun. Jadi, jika linarut bergaris tengah
sedemikian rupa sehingga tidak dapat berdifusi ke dalam pori yang mana pun, maka
linarut tersebut dikatakan tereksklusi sempurna dan tidak tertahan, artinya linarut
tersebut terelusi dalam volume mati kolomVo. Linarut yang mampu berdifusi
sempurna ke dalam semua pori dikatakan bermeasi sempurna ke dalam kemasan.
Linarut jenis ini memerlukan volume pelarut yang jauh lebih besar untuk
mengelusinya dari kolom. Pemisahan komponen dapat dicapai jika komponen itu
terelusi dengan volume tambat antara Vo dan volume permeasi total.
Volume SEC terdiri dari tiga komponen, yaitu :
1. Volume mati (Vo), volume ruang antar partikel yang ditempati fase gerak
yang mengalir
2. Volume yang ditempati oleh bagian padat kemasan
8/8/2019 Tugas Fitokimia II,Sec
http://slidepdf.com/reader/full/tugas-fitokimia-iisec 4/19
3. Volume pori (Vp), volume yang ditempati fase gerak yang tertahan
Koefisien distribusi (K) linarut merupakan jumlah volume pori yang dapat dimasuki
linarut (VA) dan volume pori total (Vp), yaitu :
K = VA/Vp
Maka, volume linarut yang tertahan (VR) dinyatakan sebagai: VR=Vo+K.Vp
Rentang K antara 0 sampai 1, karena jika linarut dieksklusi seluruhnya, maka K=0
dan jika pelarut berpermeasi ke dalam pori seluruhnya maka K=1. Maka untuk
memperoleh pemisahan semaksimum mungkin diperlukan Vo yang lebih kecil dan
Vp yang besar.
Mekanisme SEC
Buffer dipompa melewati kolom oleh alat yang diatur oleh komputer. Saat
campuran molekul dan ion-ion yang terlarut dalam pelarut diaplikasikan pada ujung
atas kolom, molekul-molekul yang lebih kecil (dan ion) didistribusikan melalui
volume pelarut yang lebih besar daripada yang tersedia unutk molekul besar. Molekul
yang lebih kecil dari ukuran pori dapat masuk ke dalam partikel dan karenanya
memiliki jalur yang lebih panjang serta waktu transit yang lebih panjang
dibandingkan molekul besar yang tidak dapat memasuki partikel. Seluruh molekul
yang lebih besar ukurannya dibandingkan ukuran yang tidak tertahan dan akan dielusi
bersamaan. Molekul yang dapat masuk ke dalam pori akan memiliki waktu tinggal
rata-rata dalam partikel, yang bergantung dari bentuk serta ukuran molekulnya.
Karena itu, molekul besar bergerak lebih cepat melewati kolom, dan dengan inilah
campuran tersebut dapat dipisahkan menjadi komponen-komponennya.
8/8/2019 Tugas Fitokimia II,Sec
http://slidepdf.com/reader/full/tugas-fitokimia-iisec 5/19
Gambar 2. Pemisahan SEC untuk dua ukuran makromolekul : (1) campuran sampel
sebelum memasuki column packing; (2) campuran sampel pada bagian atas kolom ;
(3) pemisahan ukuran dimulai; (4) hasil akhir.
Prinsip SEC
Prinsip dari kromatografi eksklusi adalah terjadinya pemisahan molekul
polimer sesuai dengan volume hidrodinamiknya ketika sampel diinjeksikan ke dalam
kolom. Volume hidrodinamik yang dihasilkan dari system kromatografi ini terbagi
menjadi tiga macam volume, yaitu:
• Volume interstisial (Vi) merupakan volume elusi yang diperoleh jika
molekul polimer memiliki ukuran yang lebih besar daripada ukuran pori-pori
sehingga tidak mampu masuk ke pori-pori.
• Volume interstisial dan Volume pori (Vi + V p) merupakan volume elusi
yang diperoleh jika molekul polimer memiliki ukuran yang lebih kecil daripada
ukuran pori-pori sehingga mampu melewati dan masuk ke dalam pori-pori.
• Volume elusi (Ve) merupakan volume pori untuk molekul polimer yang
memiliki ukuran diantara kedua molekul polimer sebelumnya. Untuk volume
ini, dapat dirumuskan dengan persamaan:
Ve = Vi + K sec.Vp
Dimana K sec adalah nilai konstan pada kromatografi eksklusi (0 < K sec < 1)
8/8/2019 Tugas Fitokimia II,Sec
http://slidepdf.com/reader/full/tugas-fitokimia-iisec 6/19
Prinsip SEC dijelaskan oleh skema di bawah ini :
Gambar 3. Prinsip size exclusion chromatography
Gambar 4. Pemisahan SEC
8/8/2019 Tugas Fitokimia II,Sec
http://slidepdf.com/reader/full/tugas-fitokimia-iisec 7/19
Gambar 5. Kurva kalibrasi SEC
8/8/2019 Tugas Fitokimia II,Sec
http://slidepdf.com/reader/full/tugas-fitokimia-iisec 8/19
BAB II
SISTEM PERALATAN
Peralatan penting yang biasanya digunakan pada kromatografi eksklusi ( size
exclusion chromatography), antara lain pompa untuk mempertahankan aliran yang
konstan, kolom dengan jenis molekul tertentu, dan detektor untuk hasil yang
kuantitatif.
Berikut adalah skematis dari system kromatografi eksklusi
8/8/2019 Tugas Fitokimia II,Sec
http://slidepdf.com/reader/full/tugas-fitokimia-iisec 9/19
Komponen yang digunakan pada sistem kromatografi ini, yaitu:
a. Kolom
Memilih Kolom
Pemilihan ukuran pori kolom tergantung pada ukuran molekul linarut yang akandipisahkan. Sampel yang ukurannya (bobot molekul) bermacam-macam tidak mampu
dipisahkan jenis-jenis molekulnya jika digunakan satu ukuran pori-pori dari kolom.
Setiap kolom eksklusi dengan ukuran pori tertentu hanya memiliki satu kurva
kalibrasi tertentu. Batas eksklusi dan rentang kerja BM tidak didefinisikan dengan
tajam karena distribusi pori kolom tidak sempit. Jika distribusi pori lebar maka akan
dihasilkan kurva dengan kemiringan yang tajam. Dengan demikian, senyawa-senyawa
yang memiliki ukuran molekul hampir sama akan dihasilkan daya pisah yang rendah
jika rentang kerja BM-nya besar. Sebaliknya, jika distribusinya sempit maka akan
didapat kurva yang lebih mendatar. Sehingga, rentang kerja BM akan menjadi lebih
kecil tetapi daya pisah molekul yang memiliki ukuran hampir sama akan meningkat.
Pemisahan optimum komponen-komponen suatu senyawa sampel yang
memiliki distribusi bobot molekul lebar dapat diperoleh jika kolom eksklusi memiliki
rentang kerja BM yang berbeda. Pada setiap rangkaian kolom dapat dihasilkan kurva
kalibrasi tersendiri dimana perolehan kurva kalibrasi ini didapat dengan
menyuntikkan senyawa baku (standar baku) yang diketahui bobot molekulnya,
kemudian menentukkan VR masing-masing.
Dengan demikian, kromatografi eksklusi merupakan suatu metode cepat yang
dapat digunakan untuk memperoleh perkiraan harga bobot molekul (BM) suatu
sampel dengan membandingkan empirisnya pada senyawa standar baku. Untuk
memperoleh nilai perbandingan yang bagus, struktur antara sampel dengan senyawa
standar baku haruslah sama.
Jenis Kolom
Kolom yang biasa digunakan pada system kromatografi eksklusi ini dapat
dikelompokkan menjadi tiga golongan, yaitu:
∞ Setengah kaku
Bahan kolom setengah kaku ini merupakan turunan dari polistirena yang telah
disambung silang dengan divinilbenzen dalam berbagai persentase untuk
mendapatkan struktur setengah padat. Contoh fase diam untuk kolom setengah
8/8/2019 Tugas Fitokimia II,Sec
http://slidepdf.com/reader/full/tugas-fitokimia-iisec 10/19
kaku ini, antara lain gel Styragel dan gel TSK untuk memisahkan cuplikan yang
rumit seperti karet dan plastik.
Pemisahan yang baik dapat diperoleh dengan penggunaan laju alir yang
rendah. Namun, hal ini dapat berakibat pada waktu analisis yang semakin panjang.
Pada partikel berukuran kecil yang dikromatografi eksklusi dengan kolom berpori
kecil akan menghasilkan daya pisah yang tinggi sehingga partikel dengan bobot
molekul rendah (100-1000) dapat dipisahkan.
Kolom ini memiliki efisiensi yang tinggi dan rentang pori yang lebar serta
merupakan kolom yang paling popular atau banyak digunakan untuk
memfraksinasi polimer sintetik. Fase diam kolom ini dapat bercampur dengan
sebagian besar pelarut organik. Akan tetapi, kelemahan kolom ini yaitu dapat
menjerap senyawa-senyawa polar.
∞ Kolom kaku
Bahan untuk kolom kaku ini terbuat dari kaca atau silica serta tersedia dalam
berbagai ukuran pori dan bergaris tengah (diameter) kecil atau besar.
Kelebihan kolom ini, yaitu kemampuannya menghilangkan pembatas laju
aliran karena dapat dipakai pada tekanan tinggi serta kemudahannya dan
keefisiensinya dalam pembuatannya. Pada pembatasan laju aliran tersebut dapat
digunakan pelarut air atau pelarut organik. Namun, perlu diperhatikan bahwa
larutan basa dengan pH > 7,5 pada kolom ini harus dihindari sebab keadaan ini
dapat melarutkan bahan silika dan kaca.
Sedangkan penjerap pada kolom ini akan mempersulit proses pemisahan
senyawa sampel. Sebagai contoh, bahan yang bersifat polar akan terjerap kuat dan
membentuk ekor sehingga akan menimbulkan masalah seperti perubahan pada
kurva kalibrasi serta dapat menyebabkan molekul besar keluar pada volume elusi
yang sesuai dengan volume untuk senyawa bermolekul kecil. Pengaruh penjerap
ini dapat diperkecil dengan beberapa pendekatan. Pendekatan pertama, yaitu
menambahkan carbowax 400 atau polietilen glikol dengan cara yang sama seperti
pada pembuatan kolom kromatografi gas. Pendekatan lainnya, yaitu
menambahkan berbagai pereaksi siliasi dengan konsentrasi 0,1% sampai 1% pada
larutan carbowax yang dilarutkan dengan pelarut untuk mengaktifkan carbowax
sehingga dapat memperkecil pengaruh penjerap.
∞ Gel lunak
8/8/2019 Tugas Fitokimia II,Sec
http://slidepdf.com/reader/full/tugas-fitokimia-iisec 11/19
Kolom gel lunak ini dapat menggembung dalam pelarut yang dipakai
(biasanya air) sehingga perlu dilakukan perendamanan dalam pelarut sekurang-
kurangnya selama semalam untuk mencegah terjadinya perubahan volume ketika
digunakan. Kolom gel lunak ini berguna untuk memisahkan senyawa yang larut
dalam air dengan rentang bobot molekul 102 – 2,5 x 107 sehingga banyak
digunakan untuk protein dan enzim.
Kolom ini sangat rapuh dan tidak dapat menahan tekanan tinggi yang lebih
dari sekitar 150 psi sehingga tidak dapat digunakan dalam KCKT. Selain itu,
bahan gel lunak ini dapat diuraikan oleh bakteri yang dapat menyebabkan
hilangnya kinerja kolom serta sangat mudah dimampatkan dan mudah dirusak
oleh laju aliran tinggi tetapi memiliki kapasitas cuplikan tertinggi.
Berikut adalah bahan gel lunak yang dapat digunakan pada kolom
kromatografi eksklusi
Nama Jenis Rentang BM
Bio-Bead S Stirena-divinilbenzen Sampai 1,4 x 104
Bio-Gel A Agarosa 2 x 104 – 1,5 x 108
Bio-Gel P Poliakrilamid 102 – 4 x 105
Merckogel OR Polivinilasetat Sampai 106
Sephadex G Dekstran Sampai 106
Sephadex LH-20 Turunan Dekstran 102 – 104
Sepharose Agarosa 105 – 108
Enzacyl Poli(N-akriloillmorfolina) 102 – 108
b. Fase Gerak
Fase gerak dalam SEC harus merupakan pelarut polimer yang baik untuk menghindari efek noneksklusi. Sampel harus terdisolusi pada suhu yang sesuai dan
bertahan cukup lama sebelum akhirnya disuntikkan. Hal tersebut bertujuan agar
pelipatan dapat mengembang dalam fase gerak atau dengan kata lain memecahkan
agregat. Bila sampel hanya terlarut sebagian dalam fase gerak, maka dapat terjadi
peningkatan tekanan pada kolom karena ukuran partikel yang terlalu besar. Efek
tersebut dapat diatasi dengan cara: 1) memilih pelarut lain, atau 2) meningkatkan
temperatur kolom.
8/8/2019 Tugas Fitokimia II,Sec
http://slidepdf.com/reader/full/tugas-fitokimia-iisec 12/19
Pada beberapa kondisi, perlu adanya penambahan elektrolit agar terjadi
disagregasi. Beberapa polimer, seperti polyolefin, biasa digunakan untuk analisis
pada suhu tinggi (140-150oC). Bila analisis dilakukan pada kondisi tersebut, maka
fase gerak yang bersifat toksik tidak dapat digunakan (contoh: triklorobenzen),
sehingga perlu dipilih fase gerak yang lain. Fase gerak dalam SEC terbagi menjadi
dua bagian besar, yaitu:
1. Fase gerak SEC untuk protein dan polimer larut air, dan
2. Fase gerak SEC untuk polimer polar dan polimer larut dalam pelarut organik.
Fase gerak SEC untuk protein dan polimer larut air
SEC sering digunakan untuk mengisolasi protein, menghilangkan agregat,
desalting sampel protein, memisahkan fraksi asam nukleat, atau untuk mengetahui
sifat polimer larut air yang digunakan dalam makanan, cat, sediaan farmasi, dan
sebagainya. Fase gerak yang digunakan disesuaikan dengan fase diam, antara lain:
1. Silika
Jenis kolom: SW, SWxI, dan SuperSW digunakan untuk menganalisis protein
dan asam nukleat menggunakan aqueous buffer sebagai fase gerak.
2. Polimetakrilat
Jenis kolom: PW dan PWxI digunakan untuk menganalisis polimer industry,
oligosakarida, asam nukleatm virus menggunakan fase gerak berupa aqueous
buffer atau larutan garam. Kolom PWxI yang digunakan untuk menganalisis
polimer kationik menggunakan fase gerak berupa larutan garam encer.
Pelarut yang mengandung air harus memiliki sifat-sifat sebagai berikut:
1. Kestabilan mekanis yang tinggi (tahan terhadap tekanan)
2. Perubahan volume yang minimum
Pelarut harus tidak memberi perubahan volume yang berarti pada saat terjadi
perubahan pH, atau pada saat penambahan garam.
3. Stabil secara kimia
Tahan terhadap asam dan basa.
4. Memberi puncak kromatogram yang tajam
5. Stabil pada suhu tinggi
6. Tahan terhadap kontaminasi mikroba
7. Afinitas sesuai terhadap sampel yang berupa protein, enzim, dan lain-lain
8/8/2019 Tugas Fitokimia II,Sec
http://slidepdf.com/reader/full/tugas-fitokimia-iisec 13/19
Contoh pelarut mengandung air yang sering digunakan sebagai fase gerak
dalam SEC antara lain:
1. Buffer fosfat (pH 7,0)
2. Larutan KCl
3. Larutan NaCl
Fase gerak SEC untuk polimer polar dan polimer larut dalam pelarut organik
SEC sering digunakan untuk mengetahui sifat polimer organic polar dan
polimer larrut dalam pelarut organik. Pemilihan pelarut organic didasarkan atas efek
partisi dan adsorpsi pelarut. Jenis fase gerak yang digunakan disesuaikan dengan fase
diam, antara lain:
1. Polimetakrilat (high % X-linking )
Jenis kolom: Alpha dan SuperAW menggunakan fse gerak berupa pelarut
organic polar seperti methanol, asetonitril, DMF, DMSO, THF, dan HFIP.
2. Polistirena
Ada dua jenis kolom, yaitu kolom Ultra-low adsorption (contoh: SuperHZ,
SuperMultiporeHZ, HxI dan Multipore) menggunakan pelarut yang terbatas,
dan kolom Low adsorption (contoh: SuperH dan Hhr) dapat menggunakan
pelarut yang lebih bervariasi.
Tabel 1. Kolom polistirena dan fase geraknya
Jenis kolom Pelarut yang
umum
Pelarut alternative
SuperHZ dan
HXL
Tetrahidrofuran
(THF)
Benzene, toluene, kloroform, xylene,
diklormetan, dikloroetanAseton CCl4, o-Diklorobenzen, Dimetilformamid
(DMF), dodekan, dimetil sulfoksida,
dioksan, etil asetat, heksan, piridin, metal
etil keton,
heksafluoroisopropanol/kloroform,
kuinolin, sikloheksan
Kloroform m-kresol dalam kloroform, 10%
heksafluoroisopropanol/kloroformDMF Dimetil sulfoksida, dioksan,
8/8/2019 Tugas Fitokimia II,Sec
http://slidepdf.com/reader/full/tugas-fitokimia-iisec 14/19
tetrahidrofuran, toluene
o-Diklorobenzen 1-Kloronaftalen, triklorobenzen
SuperH dan
HHR
THF Aseton, dekahidronaftalen, etanol,
kuinolin, benzene, o-diklorobenzen, etil
asetat, tetrafluoroetilen, CCL4,
diklorometan, n-heksan, toluene, metal
etil keton, piridin, metal sulfoksida
c. Detektor
Setelah pemisahan sampel polimer, molekul dapat dideteksi dengan sistem
detektor yang berbeda-beda, misalnya dengan refraktometer atau detektor UV-Vis.
Intensitas detektor direkam sebagai fungsi volume pelarut eluen. Sistem dikaliberasi
dengan menggunakan polimer sampel yang diketahui berat molekulnya, dapat
dilakukan dengan evaluasi berat molekul dan distribusi berat molekul menggunakan
detektor sinar menyebar (light scatter detector), berat molekul polimer dapat
ditentukan secara langsung dan tidak perlu dikaliberasi terlebih dahulu.
Peralatan SEC
Gambar 6. Size exclusion chromatography (german: GPC) Calibration versus PS-
Standards, solvent normally THF, Mw range 600- 3000000 g/mol
8/8/2019 Tugas Fitokimia II,Sec
http://slidepdf.com/reader/full/tugas-fitokimia-iisec 15/19
Gambar 6. A generic size exclusion chromatograph.
8/8/2019 Tugas Fitokimia II,Sec
http://slidepdf.com/reader/full/tugas-fitokimia-iisec 16/19
BAB III
APLIKASI
1. SEC untuk analisis dan karakterisasi selulosa dan derivatnya
a. Selulosa trinitrat
8/8/2019 Tugas Fitokimia II,Sec
http://slidepdf.com/reader/full/tugas-fitokimia-iisec 17/19
b. Selulosa asetat
c. Selulosa trikarbanilat
8/8/2019 Tugas Fitokimia II,Sec
http://slidepdf.com/reader/full/tugas-fitokimia-iisec 18/19
d. Derivat selulosa lainnya
2. Teknik menggunakan size exclusion chromatography (SEC) dengan on-line
light-scattering, UV absorbance, dan refractive index detectors untuk karakterisasi
berat molekul polipeptida dari simple protein atau glikoprotein atau untuk
menentukan stoikiometri dari kompleks protein. Dua keuntungan unik dari
pendekatan ini adalah pengukuran berat molekul tidak bergantung pada posisi elusi
dan dapat meniadakan pengaruh karbohidrat. Ketika sebuah protein atau komlpeks
berisi tanpa karbohidrat , metode 2 deteksi yaitu: light scattering dikombinasi dengan
refractive index dapat digunakan untuk menghitung berat molekul. Ketika protein
mengandung karbohidrat metode 3 detektor digunakan untuk menghitung berat
molekul dari polipeptida sendiri. Pada akhirnya, metode tiga detektor digunakan
untuk menentukan stoikiometri kompleks protein yang mengandung karbohidrat.
8/8/2019 Tugas Fitokimia II,Sec
http://slidepdf.com/reader/full/tugas-fitokimia-iisec 19/19
BAB VIII
DAFTAR PUSTAKA
Wen Jie, Tsutomu Arakawa, and John S. Philo. ANALYTICAL BIOCHEMISTRY:
Size-Exclusion Chromatography with On-Line Light-Scattering, Absorbanc
and Refractive Index Detectors for Studying Proteins and Their Interactions.
Protein Chemistry Department, Amgen Inc., Thousand Oaks, California. 1996
Chi-san Wu. Handbook of Size Exclusion Chromatography. MARCEL DEKKER,
INC. New York. 1995
http://www.polymer.uni-karlsruhe.de/english/310.php
http://www.impactanalytical.com/applications/sec.aspx
http://elchem.kaist.ac.kr/vt/chem-ed/sep/lc/size-exc.htm
http://www.kfunigraz.ac.at/~trathnig/2032-_a.pdf
http://www.separations.us.tosohbioscience.com/Products/HPLCColumns/ByMode/Siz
eExclusion/