TRANSFORMASI GENETIK PADI INDICA DENGAN GEN OsMADS18

MENGGUNAKAN Agrobacterium tumefaciens UNTUK MERAKIT

VARIETAS PADI UMUR PENDEK

MUJIBUR RAHMAN

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2013

ABSTRAK

MUJIBUR RAHMAN. Transformasi Genetik Padi Indica dengan Gen

OsMADS18 Menggunakan Agrobacterium tumefaciens untuk Merakit Varietas

Padi Umur Pendek. Dibimbing oleh I MADE ARTIKA.

Padi adalah makanan pokok lebih dari setengah populasi manusia di dunia.

Kebutuhan padi setiap tahunnya terus meningkat seiring bertambahnya penduduk.

Penelitian ini bertujuan untuk merakit varietas padi berumur pendek dengan

mengintroduksikan gen OsMADS18 ke dalam genom tanaman menggunakan

Agrobacterium tumefaciens. Gen OsMADS18 merupakan gen umur pendek yang

berhasil dikonstruksi ke vektor pCAMBIA 1301 di bawah promotor konstitutif

CaMV35S. Hal ini dibuktikan dengan munculnya pita DNA dengan ukuran 12561

bp, ukuran ini merupakan gabungan antara vektor pCAMBIA 1301 (11819 bp)

dan gen OsMADS18 (742 bp). Kemudian vektor pCAMBIA 1301-OsMADS18

ditransformasikan ke Agrobacterium tumefaciens EHA105 melalui metode Heat-

shock. Keberhasilan transformasi Agrobacterium tumefaciens ditandai dengan

tumbuhnya koloni putih pada media LB padat yang telah diberikan antibiotik, X-

gal, dan IPTG. Kemudian bakteri tersebut digunakan untuk mentransformasikan

50 kalus padi Indica dengan cara merendam kalus tersebut ke dalam koloni

bakteri selama 20 menit. Kalus di pindahkan ke media seleksi yang mengandung

higromisin. Setelah 14 hari, kalus yang tidak mengalami nekrotik di pindahkan ke

media regenerasi R3B untuk ditumbuhkan sebagai tanaman transgenik. Dari

penelitian diperoleh 18 planlet transforman Indica. Keberhasilan uji gus-A di

tunjukkan dengan munculnya warna biru pada jaringan daun. Sedangkan analisis

PCR terhadap 18 planlet transgenik menghasilkan pita berukuran 742 bp.

Kata kunci : Agrobacterium tumefaciens, Transformasi genetik, Transgenik,

OsMADS18

ABSTRACT

MUJIBUR RAHMAN. Genetic Transformation of Indica rice by OsMADS18

gene using Agrobacterium tumefaciens to assemble short life plant.

Supervised by I MADE ARTIKA.

Rice is the staple food of more than half the world's human population. The

need of rice each year continues to increase with increasing population. This study

aimed to assemble a short-lived rice varieties by introducing OsMADS18 gene

into the genome of plants using Agrobacterium tumefaciens. OsMADS18 gene is a

short age gene which has been successfully constructed to pCAMBIA1301 vector

under CaMV35S constitutive promoter. This is evidenced by the emergence of

12561 bp DNA band size, this measure is a combination among vector pCAMBIA

1301 (11819 bp) and OsMADS18 genes (742 bp). Then the vector pCAMBIA

1301 that contains OsMADS18, was used to transform Agrobacterium tumefaciens

strain EHA105 through Heat-shock method. The success of transformation

marked by the growth of the white colonies Agrobacterium tumefaciens on solid

media LB, this media contained antibiotic, X-gal and IPTG. Then the bacteria are

used to transforms 50 calli Indica rice by soaking the calli into colonies for 20

minutes. The calli moved to selection media that contains hygromycin. After 14

days, calli that resistant to hygromycin moved to regeneration media R3B grown

for transgenic plant. 18 transformants plantlets were obtained. Gus-A successful

test on the show with the appearance of blue color in leaf tissues. While PCR

analysis of the 18 transgenic plantlets produced 742 bp sized bands.

Keywords: Agrobacterium tumefaciens, Genetic Transformation, Transgenic,

OsMADS18.

TRANSFORMASI GENETIKA PADI INDICA DENGAN GEN OsMADS18

MENGGUNAKAN Agrobacterium tumefaciens UNTUK MERAKIT

VARIETAS PADI UMUR PENDEK

MUJIBUR RAHMAN

Skripsi

Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar

Sarjana Sains pada

Departemen Biokimia

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2013

Judul Skripsi : Transformasi Genetika Padi Indica dengan Gen OsMADS18

Menggunakan Agrobacterium Tumefaciens untuk Merakit

Varietas Padi Umur Pendek

Nama : Mujibur Rahman

NIM : G84070020

Disetujui,

Dr. I Made Artika, M.App.Sc

Pembimbing

Diketahui,

Dr. I Made Artika, M.App.Sc

Ketua Departemen Biokimia

\

Tanggal Lulus :

KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis ucapkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas segala

berkah dan rahmat-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah yang

berjudul “Transformasi Genetika Padi Indica dengan Gen OsMADS18

Menggunakan Agrobacterium Tumefaciens untuk Merakit Varietas Padi Umur

Pendek”. Karya ilmiah ini disusun berdasarkan kegiatan penelitian yang dilakukan

dari bulan Februari 2011 hingga bulan Mei 2012, di Laboratorium Kultur

Jaringan, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, IPB.

Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr. I Made Artika M.App.Sc

selaku pembimbing yang telah memberikan bimbingan, masukan, dan arahan

selama penulisan karya ilmiah ini, Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi dan

Kementerian Riset dan Teknologi RI yang telah mendanai penelitian ini. Selain

itu penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Indra Kurniawan S, Harryade

Putra, Ridho Pratama, Putri Jumiarti, Cinthya Lestari HD dan Dian Rachmawati

atas bantuan teknis, teoritis maupun materil selama pengerjaan penelitian ini.

Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada orang tua dan seluruh keluarga

yang telah mendukung secara moril, dan juga kepada semua pihak yang telah

membantu terselesaikannya skripsi ini.

Penulis menyadari bahwa tulisan ini belum sempurna sehingga saran dan

kritik yang membangun sangat penulis harapkan. Akhirnya penulis berharap

semoga karya ilmiah ini dapat dimanfaatkan bagi kemajuan pengetahuan,

pendidikan, dan penelitian.

Bogor, Februari 2013

Mujibur Rahman

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Aceh Utara pada tanggal 16 Februari 1989 sebagai

putra kedua dari lima bersaudara pasangan Bapak Zainal Abidin (alm) dan Ibu

Nurul Hidayat. Penulis tinggal dan dibesarkan di Krueng Geukuh dan sekolah di

SD 06 Kec. Dewantara, pada tahun 1998 penulis pindah dan menetap di kota

Banda Aceh dan pada tahun 2001 penulis lulus dari SD 105 Lam Ujong, Ulee

Kareng dan melanjutkan pendidikan ke SMP 10 Lam Teh. Setelah lulus pada

tahun 2004, penulis melanjutkan sekolah ke SMA 4 Negeri Banda Aceh dan

Lulus pada tahun 2007. Pada tahun yang sama penulis diterima di Institut

Pertanian Bogor pada Mayor Biokimia, Departemen Biokimia, Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB, melalui jalur Undangan Seleksi

Masuk IPB (USMI).

Selama duduk di bangku perkuliahan, penulis aktif di berbagai organisasi

kemahasiswaan. Tahun 2007-2008 penulis aktif sebagai Ketua ROHIS A18.

Selain itu penulis juga aktif di Organisasi Mahasiswa Daerah (OMDA) Ikatan

Mahasiswa Tanah Rencong (IMTR). Pada tahun 2009-2010 penulis aktif sebagai

pengurus dan kepanitian Himpunan Keprofesian CREB’s, BEM-G, dan beberapa

Unit Kegiatan mahasiswa (UKM) di lingkup IPB. Diantaranya pernah menjabat

sebagai Ketua Divisi Keilmuan Metabolisme CREB’s pada tahun 2009/2010,

Ketua Pelaksana PEMIRA dan MUBES CREB’s 2010, Kepanitian Kajian Ilmiah

CREB’s, LKIP, BCL 2010 (Biochemistry Champion League), MPD BIOKIMIA

45, The CEBOCH, anggota BP CREB’s 2011, dan berbagai kegiatan lainnya.

Tahun 2011-2012 penulis pernah menjadi finalis BIOFRONT ITB, finalis TUN

Mipa Untuk Negeri UI 2012, mendapatkan hibah dana penelitian dari DIKTI

melalui Program Kreativitas Mahasiswa (PKM-P dan PKM-GT), mendapatkan

penghargaan setara emas di Penunjang PIMNAS XXIV di Universitas

Hasanuddin, Makassar 2011. Finalis PIMNAS XXV dan mendapatkan mendali

setara emas di Universitas Muhammadiyah Yogyakarta 2012. Selain itu penulis

juga berkesempatan menjadi peserta dalam 4th World Congress of Industrial

Biotechnology China 2011, dan peserta dalam annual Meeting of the German

society for Genetic Engineering Jerman 2011.

Sebagai pengalaman profesi, penulis juga aktif sebagai asisten praktikum

Biologi Dasar untuk mahasiswa Tingkat Persiapan Bersama (TPB) IPB tahun

2008. Pada semester 7, penulis menjalani praktik lapang (PL) di Balai Besar

Litbang Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian (BB-BIOGEN), dan

melanjutkan dengan magang pada tahun 2010-2011, pada tahun 2011-2012

penulis mengerjakan proyek dari kementerian Negara Riset dan Teknologi RI.

Selain itu, penulis juga aktif sebagai tentor matematika di lembaga Bimbingan

Belajar Bintang Pelajar pada tahun 2007-2009 dan kegiatan dakwah antar kampus.

DAFTAR ISI

DAFTAR GAMBAR ………………………………………………………………

DAFTAR LAMPIRAN ……………………………………………………………

PENDAHULUAN………………………………………………………………….

TINJAUAN PUSTAKA……………………………………………………………

Padi………………………………………………………………………………

MADS Box………………………………………………………………………

Transformasi Genetik……………………………………………………………

Konstruksi DNA Rekombinan……………………………………………….….

Vektor……………………………………………………………………………

Plasmid pCAMBIA 1301……………………………………………………….

Agrobacterium tumefaciens…………………………………..…………………

Analisis Tanaman Transgenik…………………………………………………..

BAHAN DAN METODE…………………………………………………………..

Alat dan Bahan………………………………………………………………….

Metode…………………………………………………………………………..

HASIL DAN PEMBAHASAN…………………………………………………….

Plasmid rekombinan pembawa Gen OsMADS18………………….……………

Agrobacterium tumefaciens Pembawa vektor pCAMBIA 1301-OsMADS18...

Tranformasi dan Regenerasi Tanaman………………………………………….

Tanaman Transgenik……………………………………………………………

KESIMPULAN…………………………………………………………………….

SARAN…………………………………………………………………………….

DAFTAR PUSTAKA………………………………………………………………

LAMPIRAN ………………………………………………………………….…

ix

ix

1

2

2

2

2

2

3

3

4

4

5

5

5

8

8

9

9

10

10

11

11

15

Halaman

DAFTAR GAMBAR

1. Elektroforegram DNA pGEM-T Easy-OsMADS18 ….…………………. ……...

2. Elektroforegram pemotongan pCAMBIA 1301 dengan enzim restriksi ….……

3. Koloni Agrobacterium tumefaciesn EHA 105 hasil transformasi ………………

4. Transformasi genetik padi Indica ……………………………………………….

5. Hasil uji β-glucuronidase terhadap daun tanaman padi ………………………..

6. Elektroforegram PCR terhadap gen OsMADS18………………………………

DAFTAR LAMPIRAN

1. Diagram alir penelitian …………………………………………………………

2. Proses umum isolasi plasmid ……………………………………………………

3. Peta Plasmid pCAMBIA 1301 ……………………………………………….

4. Proses umum reaksi ligasi ………………………………………………………

5. Proses purifikasi DNA dengan metode dari QiAgen (2006) ……………………

6. Proses umum isolasi DNA tanaman …………………………………………….

7. Bahan-bahan pembuatan media ……………………………………………...

Halaman

16

17

18

18

19

20

21

Halaman

8

9

9

10

10

11

1

PENDAHULUAN

Padi adalah makanan pokok lebih dari

setengah populasi di dunia. Sebagian besar

tanaman padi di produksi dan dikonsumsi di

Asia (Kibria et al. 2008). Padi memegang

peranan paling penting di antara berbagai

sumber bahan pangan lainnya di Indonesia,

terutama dalam penyediaan pangan yang

mendukung ke arah ketahanan pangan

nasional dan pemberdayaan ekonomi rumah

tangga petani. Mutu suatu varietas sangat

mempengaruhi besarnya pendapatan petani

(Lestari et al. 2007). Kebutuhan pangan dunia

setiap tahunnya semakin meningkat seiring

dengan bertambahnya jumlah penduduk dan

perkembangan industri pangan. Menurut data

dari BPS (2012), produksi gabah pada tahun

2012 sebesar 65,39 juta ton. Namun, jumlah

ini belum mampu untuk memenuhi kebutuhan

lebih dari 259 juta penduduk Indonesia. Maka

diperlukan suatu inovasi untuk memenuhi

permintaan konsumen tersebut, salah satunya

dengan melakukan pemuliaan tanaman

(Herman 2010).

Pemuliaan tanaman merupakan suatu

metode yang menggali potensi genetik suatu

tanaman untuk memaksimumkan ekspresi dari

potensi tersebut pada suatu kondisi lingkungan

tertentu (Wangxia 2003, Joseph et al. 2011).

Salah satunya dengan merakit varietas padi

berumur pendek. Pemulian tanaman bisa

dilakukan melalui tranformasi genetik, yaitu

dengan menyisipkan gen asing ke dalam

genom tanaman ( Heryati 2002). Transformasi

genetik dapat dilakukan melalui berbagai

metode antara lain elektroporasi (Widodo

2002), polyethylene glycol (Rachmawati

2010), penggunakan serat silicon carbide

(Herman 2010), penembakan partikel DNA

(Frame et al. 2000, Sutrisno et al. 2000) dan

perantara Agrobacterium tumefaciens

(Belarmino dan Mii 2000, Joseph et al. 2011).

Teknik penyisipan gen dengan menggunakan

metode tersebut sudah berhasil dilakukan

(Schroeder et al. 2000, Chuanfeng et al.

2010). Penggunaan Agrobacterium untuk

proses transformasi genetik pada tanaman

monokotil seperti padi, masih belum efisien,

akan tetapi beberapa penelitian telah

menunjukkan keberhasilan (Cheng et al. 2004,

Rachmawati et al. 2004, Rajesh et al. 2008)

Tantangan lain dari teknik transformasi

genetik adalah penggunaan promotor yang

tidak sesuai, sehingga ekspresi gen yang

diinginkan tidak terjadi (Yina et al. 2004).

Selain itu teknik penyisipan gen pada tanaman

padi dengan Agrobacterium tumefaciens

kurang efektif (Enriquez-Obregon et al. 2000,

Opabode 2006). Hal ini disebabkan tidak

efektifnya infeksi Agrobacterium tumefaciens

pada tanaman monokotil karena tidak adanya

respon pelukaan yang menghasilkan senyawa

fenolik yang digunakan oleh bakteri untuk

menginduksi gen-gen vir (Lucca et al. 2001,

Gao et al. 2005), akan tetapi masalah ini bisa

diatasi dengan melakukan penyesuaian

kondisi, yaitu dengan menambahkan senyawa

fenolik, monosakarida, dan penggunaan

vektor ekspresi seperti pCAMBIA (Zupan et

al. 2000, Cheng et al. 2004). Agrobacterium

tumefaciens dapat menginfeksi tanaman

secara alami karena memiliki plasmid Ti (tumor inducer), yaitu vektor (pembawa

DNA) untuk menyisipkan gen asing (Madigan

dan Martinko 2006). Gen asing yang ingin

dimasukkan ke dalam tanaman dapat

disisipkan di dalam plasmid Ti tersebut.

Selanjutnya, Agrobacterium tumefaciens

secara langsung akan memindahkan gen pada

plasmid tersebut ke dalam genom tanaman

(Olhoft et al. 2004).

Teknik tranformasi genetik yang bertujuan

untuk membuat varietas padi berumur pendek

mulai dikembangkan di Indonesia. Salah satu

gen yang membawa sifat umur pendek adalah

gen OsMADS18 (Masiero et al. 2002). Gen

OsMADS18 merupakan gen yang memiliki

sifat dalam mempercepat masa transisi

tanaman sehingga tanaman dapat berbunga

lebih awal (Xiao et al. 2003). Selain itu gen

ini juga berfungsi dalam proses perkembangan

tanaman, seperti dalam proses pengendalian

masa transisi reproduksi vegetatif pada

tanaman jagung (Pelucchi et al. 2002),

penentu identitas organ pada Antirrhinum

(Muller et al. 2001), dan pengaturan

pematangan buah (Masiero et al. 2002, Favoro

et al. 2003, Xiao et al. 2003).

Penelitian ini bertujuan untuk merakit

varietas padi berumur pendek dengan

mengintroduksikan gen OsMADS18 ke dalam

genom tanaman menggunakan Agrobacterium

tumefaciens. Sedangkan hipotesis penelitian

adalah, Gen OsMADS18 dapat diintroduksikan

ke dalam genom tanaman padi dengan

menggunakan Agrobacterium tumefaciens,

sehingga akan diperoleh tanaman padi

berumur pendek. Hasil penelitian ini

diharapkan mampu memberikan informasi dan

wawasan ilmiah terkait dengan kegiatan

rekayasa genetika pada tanaman. Kemudian

pengetahuan ini dapat di arahkan ke program

pemuliaan tanaman dalam meningkatkan

produktivitas tanaman padi, khususnya dalam

perakitan tanaman padi berumur pendek.

2

TINJAUAN PUSTAKA

Padi

Padi (Oryza sativa L.) merupakan tanaman

pangan terpenting pada wilayah tropis maupun

sub tropis. Upaya peningkatan produksi padi

merupakan salah satu strategi untuk

menghadapi peningkatan kebutuhan pangan

akibat pertambahan populasi penduduk

(KOMPAS 2011). Selain itu padi juga dapat

digunakan sebagai organisme model dalam

kajian genetika tumbuhan karena memiliki

ukuran kromosom yang relatif kecil, yaitu

1.6~2.3 × 108 pasangan basa (Garris 2004).

Dari hasil kajian biologi molekuler padi di

bagi ke dalam dua subspesies utama, yaitu

indica dan japonica . Selain itu juga terdapat

subspesies minor yang beradaptasi

berdasarkan ekosistemnya seperti aus, royada,

ashina, dan aromatic (Zohary dan Hopf 2000)

Regenerasi tanaman dari protoplast padi

indica lebih sulit dibandingkan japonica.

Untuk memecahkan masalah ini Christou et

al. (1991) melakukan bombardment terhadap

embrio muda padi indica menggunakan emas

pembawa DNA. Tanaman transgenik padi

indica terbukti dapat dihasilkan dari kalus

hasil transformasi, hal ini membuka peluang

pengembangan sistem transformasi padi

indica tanpa kultur protoplas. Dalam

perkembangan selanjutnya, Datta et al. (1992)

berhasil melakukan transformasi pada

protoplas padi kelompok indica kultivar IR72.

Regenerasi tanaman dari protoplas

beberapa varietas padi indica telah dilaporkan.

Datta et al. (1990) mengembangkan teknik

regenerasi dari protoplas padi indica

Chinsurah Boro dan mentransformasikan gen

hygromycin phosphotransferase glycol.

Regenerasi tanaman dari protoplas IR54 telah

dilaporkan peng et al. (1992) dan diperoleh

tanaman dengan gen neomycin

phosphotransferase. Hal ini membuktikan

transformasi menggunakan protoplas dapat

dilakukan pada padi indica, akan tetapi

kelemahan dari teknik ini adalah terbatasnya

keberhasilan pada kultivar tertentu.

MADS Box

MADS Box merupakan protein faktor

trankripsi yang mengendalikan perkembangan

tanaman (Masiero et al. 2002). Hasil beberapa

penelitian terdahulu menunjukkan bahwa gen

homolog MADs Box yang di isolasi dari

spesies yang berbeda memiliki fungsi yang

sama (Xiao et al. 2003). Misalnya OsMADS18

yang diisolasi dari padi (Oryza sativa)

memiliki fungsi dalam perkembangan

tanaman seperti dalam proses pengendalian

masa transisi reproduksi vegetatif pada

tanaman jagung (Pelucchi et al. 2002), selain

itu gen ini juga menjadi penentuan identitas

organ, dan pengaturan pematangan buah

(Favoro et al. 2003). Gen OsMADS18 banyak

terakumulasi pada meristem, ekspresi gen ini

lebih awal dapat menentukan faktor histologi

yang menunjukkan pembentukan tunas aksiler

meristem akan dipercepat (Ferrandiz et al.

2000). OsMADS18 merupakan keluarga dari

MADS Box, gen inilah yang menyandi

ekspresi umur genjah pada berbagai jenis

tanaman (Pelucchi et al. 2002).

Transformasi Genetik

Transformasi genetik merupakan salah satu

metode yang dapat dimanfaatkan untuk

mempelajari regulasi gen, identifikasi fungsi

gen, pengujian metabolisme, mempelajari

fisiologi serta perkembangan tanaman

(Walkerpeach dan Velten 1994, Utomo 2005).

Transformasi genetik tidak hanya

dipergunakan untuk studi dasar dalam ilmu

tanaman, tetapi juga telah menjadi salah satu

cara untuk pengembangan varietas baru.

Keberhasilan proses transformasi gen melalui

Agrobacterium tumefaciens sangat ditentukan

oleh berbagai hal antara lain kesesuaian antara

strain Agrobacterium tumefaciens dengan

jenis tanaman dan plasmid vektor yang

dipergunakan, kerapatan sel Agrobacterium

yang digunakan pada saat proses tranformasi

genetik, lama waktu ko-kultivasi, tingkat

kemasaman media, kondisi kultur in vitro dan

sebagainya (Zupan et al. 2000, Cheng et al.

2004). Disamping itu pemanfaatan

Agrobacterium tumefaciens pada proses

transformasi genetik jenis tanaman monokotil

masih memerlukan berbagai penyesuaian

dalam upaya meningkatkan efisiensi

transformasi (Klee 2000, Utomo 2004). Hal

ini disebabkan secara alami bakteri patogen

tanah tersebut hanya menginfeksi tanaman

dikotil dengan cara mengintroduksi T-DNA

dari plasmid Ti bakteri ke dalam inti sel

tanaman (Le et al. 2001, Olhoft et al. 2004).

Konstruksi DNA Rekombinan

Teknik DNA rekombinan merupakan

teknik pembentukan kombinasi baru dari

DNA dengan cara melakukan penyisipan

molekul-molekul DNA yang dikerjakan di

luar sel dalam suatu vektor dan

diintroduksikan ke dalam sel inang sehingga

gen tersebut akan berkembang dalam sel inang

tersebut (Sarkar et al. 2002). Teknologi DNA

rekombinan atau rekayasa genetika pada

3

intinya adalah proses kloning gen. Gen

merupakan sekuen nukleotida yang menyandi

RNA yang dibatasi oleh promotor dan

terminator (Watson et al. 2007). Teknologi

DNA rekombinan memungkinkan sejumlah

gen dari sumber berbeda disatukan untuk

membentuk DNA rekombinan. Tahapan

dalam kloning gen meliputi: penyisipan

fragmen DNA yang mengandung gen target

ke dalam molekul DNA vektor, vektor

rekombinan dimasukkan kedalam sel inang,

vektor dalam sel inang akan diperbanyak

seiring dengan pembelahan sel inang (Pray

2008).

Komponen penting dalam rekombinasi

DNA adalah enzim-enzim manipulasi DNA

serta vektor. Bernard and Pasternak (2002)

membagi enzim manipulasi berdasarkan jenis

dan reaksi yang dikatalisnya menjadi lima

golongan yaitu : a) nuklease yaitu enzim yang

mampu memotong molekul asam nukleat, b)

ligase adalah enzim yang berfungsi

menyatukan molekul asam nukleat, c)

polimerase adalah enzim yang dapat

mensintesis DNA, d) enzim modifikasi yang

mampu menghilangkan atau menambahkan

gugus kimia, dan e) topoisomerase adalah

enzim yang mengubah DNA tertutup secara

kovalen menjadi DNA supercoil. Pada

pengklonan gen hanya dua jenis enzim yang

berperan yaitu enzim restriksi endonuklease

dan enzim ligase.

Vektor

Vektor kloning adalah agen pembawa

fragmen DNA masuk ke dalam sel makhluk

hidup yang berfungsi untuk memperbanyak

fragmen DNA. Beberapa vektor kloning yang

umum digunakan adalah plasmid, vektor

lamda, virus, kromosom bakteri buatan,

kromosom khamir buatan, dan cosmid

(Primrose dan Twyman 2006). Suatu vektor

kloning harus dapat disambungkan atau

menyatu dengan fragmen DNA yang ingin

ditransfer kemudian dapat dimasukkan ke

dalam sel. Di dalam sel tersebut, fragmen

DNA akan diperbanyak jumlahnya. Untuk

memilih vektor kloning yang cocok dalam

penelitian, beberapa hal yang harus

dipertimbangkan adalah ukuran fragmen DNA

yang akan ditransfer, jumlah salinan,

inkompatibilitas (ketidaksesuaian), marka

pemilihan (selectable marker) untuk seleksi,

situs kloning, dan fungsi khusus dari suatu

vektor (Casali et al. 2003). Dalam penelitian

ini vektor yang digunakan adalah pGEM-T

Easy, vektor ini mempunyai multiple cloning

site, serta tidak perlu dipotong lagi ketika

digunakan. Sedangkan vektor ekspresi yang

digunakan adalah pCAMBIA 1301.

Plasmid pCAMBIA 1301

DNA vektor adalah molekul DNA yang

dapat bereplikasi secara mandiri dan dapat

digunakan sebagai pembawa molekul DNA

lain yang tidak memiliki kemampuan

bereplikasi sendiri di dalam sel. DNA yang

sering digunakan adalah plasmid bakteri.

Plasmid adalah bahan genetik

ekstrakromosom yang diwariskan secara tetap

(Dworkin et al. 2006). Ciri-ciri plasmid antara

lain berukuran kecil dan hanya mengandung

beberapa gen, membawa informasi genetik,

terlepas dari DNA kromosom atau kadang-

kadang dapat berintegrasi dengan DNA

kromosom, dan dapat diisolasi dengan mudah

dari sel bakteri. Ciri lain plasmid adalah

mempunyai situs untuk memulai replikasi

yang disebut ORI (origin of replication) (Tsen

et al. 2002)

Plasmid pCAMBIA 1303 merupakan

plasmid yang dikonstruksi sebagai vektor

DNA dalam metode transformasi langsung

dan menggunakan Agrobacterium tumefaciens

(Opabode 2006). Plasmid pCAMBIA 1301

berukuran 11.837 pb (pasang basa) dan cocok

untuk tranformasi pada tanaman padi (Listanto

et al. 2005). Plasmid ini mempunyai beberapa

kelebihan, diantaranya adalah ukurannya yang

relatif kecil, jumlah salinan yang banyak

dalam E. coli, rangkaiannya lengkap,

mempunyai pBR 322 ori untuk replikasi

dalam E.coli dan A. tumefaciens (Zipursky

and Marians 2001), mengandung situs LacZ

(Sambrook and Russel 2001), mempunyai

multiple cloning site (MCS) dengan 10 sisi

unik, dan mengandung promotor CaMV 35S

(cauliflower mosaic virus) yang

memungkinkan pembuatan klon langsung ke

dalam T-DNA plasmid, Hal ini

memungkinkan pembuatan klon langsung ke

dalam T-DNA plasmid. Tersedianya promotor

aktif yang kuat sangat diperlukan untuk

ekspresi suatu gen pada tanaman baik

monokotil maupun dikotil. Beberapa hasil

penelitian menyatakan bahwa CaMV35S

adalah promotor konstitutif yang aktif pada sel

tanaman monokotil, tetapi kekuatannya sedikit

menurun pada sel tumbuhan dikotil dan tidak

aktif pada beberapa tipe sel seperti pollen.

Selain itu, pCAMBIA 1303 mempunyai gen

gusA. Gen gusA (β-glucuronidase) dalam

plasmid pCAMBIA 1303 berfungsi sebagai

gen reporter untuk memonitor proses

transformasi dan introduksi gen yang

direkayasa (Tzfira & Citovsky 2002).

4

Plasmid pCAMBIA 1301 (Lampiran 3)

mengandung T-DNA, yang merupakan

untaian DNA yang akan ditransfer ke sel

tanaman. T-DNA pCAMBIA 1301 memiliki

gen neomisin fosfotranferase II (nptII) dan

gen higromisin fosfotransferase (hpt). Gen npt

II menyandi enzim neomisin fosfotranferase

yang digunakan untuk menyeleksi bakteri.

Gen hpt untuk menyandikan enzim higromisis

fosfotransferase sebagai penyeleksi untuk

mengetahui telah terintegrasinya T-DNA dari

A.tumefaciens ke dalam genom tanaman

(Dobhal et al. 2010). Plasmid pCAMBIA

1301 juga mempunyai gen penanda yaitu Gus-

A yang disisipkan dibagian yang dapat

menyandikan, sehingga ekspresi gen hanya

mungkin terjadi bila sudah terintegrasi pada

tanaman (Ghasemi et al. 2008).

Agrobacterium tumaficiens

Agrobacterium tumefaciens merupakan

bakteri tanah gram positif yang bersifat

fitopatogen pada tanaman dikotil. Bakteri ini

secara alami mempunyai kemampuan untuk

mentransfer potongan DNA atau disebut T-

DNA (transfer DNA) ke dalam genom

tanaman dan menyebabkan terbentuknya

tumor (crown gall). Tumor ini merupakan

sumber makanan atau sebagai sumber karbon

bagi Agrobacterium (Rajesh et al. 2008).

Terdapat tiga komponen genetik penting

terlibat dalam proses pembentukan tumor

(Tzfira et al. 2004). Pertama, gen virulen

kromosom (chromosomal virulence), yang

terdapat pada kromosom Agrobacterium dan

berfungsi dalam pelekatan bakteri dengan sel

tanaman. Kedua, sekelompok gen virulen (vir)

yang terdapat dalam plasmid Ti (Tumor

inducing), berukuran 200 kb yang berperan

dalam menginduksi transfer dan integrasi T-

DNA. Ketiga, daerah T-DNA yang juga

terletak pada plasmid Ti (Daerah T-DNA,

dibatasi oleh LB (left border) dan RB (right

border), mengandung gen penting bagi

Agrobacterium (Matthews et al. 2001, Zhou et

al. 2003, Sha et al. 2004). Daerah T-DNA

mengandung gen iaaH, iaaM, dan ipt yang

menyandikan enzim-enzim penting dalam

biosintesis auksin dan sitokinin, yaitu zat

penting untuk pembelahan sel sehingga terjadi

pembelahan sel yang tidak terkontrol dan

menyebabkan terbentuknya tumor

(Azhakanandam et al. 2000).

Analisis Tanaman Transgenik

Tujuan utama dalam proses transformasi

genetik adalah mendapatkan ekspresi dari gen-

gen asing yang diintroduksikan ke dalam sel

atau jaringan tanaman target. Proses transfer

gen dalam tanaman tidakk menjamin bahwa

gen asing yang diintroduksikan akan selalu

terekspresi. Oleh karena itu diperlukan

serangkaian analisis untuk memastikan

keberadaan gen yang telah diintroduksikan ke

genom tanaman.

Analisis tanaman transgenik dalam proses

transformasi genetik tanaman dapat dilakukan

pada berbagai tahapan, yaitu; 1) introduksi

gen, 2) transkripsi, 3) translasi, 4) pengujian

efektifitas protein yang dihasilkan. Saat ini

telah dikembangkan berbagai teknik analisis

tanapan trasgenik, seperti uji histokimia b-

glucuronidase (uji Gus), analisis polymerase

chain reaction (PCR), analisis Southern Blot,

Nothern, Western, Elysa, dan lainnya.

1. Uji Gus (Glucuronidase)

Uji histokimia β-glucuronidase (uji Gus)

dapat dilakukan pada tahap awal setelah ko-

kultivasi maupun setelah gen terintegrasi

dengan stabil dalam kromosom. Warna biru

yang muncul pada sel atau jaringan

menunjukkan hasil transformasi positif.

Warna biru disebabkan oleh reaksi substrat X-

gluc (5-bromo-4-chromo-3-indolyl-B-D-

glucuronide) dengan enzim β-glucuronidase

menjadi suatu senyawa perantara yang

kemudian melalui reaksi dimerisasi oksidatif

membentuk senyawa dichloro-dibromoindigo

(CIBr-Indigo) yang berwarna biru (Stomp

1992). Warna biru tersebut menunjukkan telah

terekspresinya gen gus-A.

Pemakainan gen gus-A sebagai gen

penanda pada proses transformasi genetik

sangat menguntungkan karena produk gen ini

dapat diamati secara in vivo pada irisan

jaringan tanaman dengan menggunakan teknik

histokimia, dapat berupa daun, batang, dan

bagian akar tanaman transforman. Sehingga

gen gus-A sering dipergunakan sebagai

penanda dalam kondisi pemakaian antibiotik

tidak memungkinkan bagi regenerasi tanaman

(Lal dan Lal 1993). Gen gus banyak

digunakan sebagai penanda pada sistem

transformasi tanaman (Jefferson 1987) dan

seringkali digunakan untuk mempelajari

fungsi promotor (Stomp 1992). Hiei et al.

(1997) berhasil mentransfer gen gus-A ke

tanamam padi melalui Agrobacterium dan

membuktikan bahwa gen tersebut dapat

berekspresi sampai beberapa generasi

tanaman. Kelemahan dari uji GUS adalah

bersifat destruktif sehingga jaringan yang diuji

tidak dapat dikembangkan lebih lanjut,

memerlukan waktu dan penanganan khusus

untuk pengujian.

5

2. Analisis PCR (Polmerase Chain Reaction)

Teknik PCR merupakan salah satu

komponen utama teknologi DNA rekombinan

dan pertama kali ditemukan oleh Kary B.

Mulis pada tahun 1983. Teknik ini merupakan

amplifikasi in vitro sejumlah sekuens DNA

dengan menggunakan 2 oligonukleotida

sebagai primer yang berhibridisasi secara

berlawanan pada sisi daerah target DNA yang

diinginkan. PCR mampu mengamplifikasi

secara selektif sekuens DNA spesifik, hal

inilah yang membuat penggunaan teknik PCR

semakin meluas disamping kesederhanaan

metodenya (Dieffenbach & Dveksler 2003).

Reaksi PCR adalah tiruan dari proses

replikasi DNA, penempatan primer, dan

perpanjanagan rantai DNA baru oleh DNA

polimerase dari arah 5’ ke 3’, hanya saja pada

teknik PCR tidak menggunakan enzim ligase

dan primerRNA. Secara ringkas, teknik PCR

dilakukan dengan cara mencampurkan sampel

DNA dengan primer oligonukleotida,

deoksiribonukleotida trifosfat, enzim

termostabil Taq DNA polimerase dalam

larutan yang sesuai, kemudian menaikkan dan

menurunkan suhu campuran secara berulang

selama beberapa jam sampai diperoleh jumlah

sekuen DNA yang diinginkan.

Satu siklus pada teknik PCR terdiri atas

tiga tahap, yaitu denaturasi, annealing dan

ekstensi. Denaturasi dilakukan pada suhu 90-

950C, sehingga terjadi pemisahan utas ganda

DNA menjadi dua utas tunggal DNA yang

menjadi cetakan (template) tempat

penempelan primer dan tempat kerja DNA

polimerase. Selanjutnya suhu diturunkan

untuk penempelan primer oligonukleotida

pada sekuen yang komplementer pada

molekul DNA cetakan. Tahap ini disebut

annealing. Suhu annealing tiap sekuen DNA

sifatnya spesifik dan merupakan penentu

utama keberhasilan suatu reaksi PCR. Tahap

terakhir adalah tahap ekstensi yang dilakukan

pada suhu 720C. Suhu ini merupakan suhu

optimum untuk kerja enzim Taq DNA

polimerase. Sintesis DNA komplemen dengan

DNA cetakan terjadi pada rahap ekstensi.

Ketiga tahap tersebut disusun berulang kali

dalam mesin PCR, umumnya antara 25-40

siklus, bergantung pada jumlah DNA yang

diinginkan. Primer oligonukleotida yang

digunakan dalam teknik PCR harus memenuhi

beberapa syarat, antara lain memiliki susunan

basa yang acak, sehingga tidak terjadi

polipurin atau polipirimidin, memiliki jumlah

purin dan pirimidin yang seimbang, memiliki

titik leleh saling mendekati satu sama lain, dan

sedikit mungkin memiliki basa yang

komplementer.Panjang primer yang umum

digunakan berkisar 20-30 (Mikkelsen &

Corton 2004).

BAHAN DAN METODE

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian

ini adalah pipet mikro, tip, tabung Eppendorf,

neraca analitik, autoklaf, laminar, vorteks,

sentrifus, inkubator bergoyang, cawan petri,

alumuniumfoil, stopwatch, penangas air,

microwave, mesin PCR, spektrofotometri

OD600, elektroforesis, UV illuminator

Chemidoc EQ Biorad, cawan petri, api

spiritus, erlenmeyer, sheld, parafilm, wadah

air, kompor, rak tabung Eppendorf, QIAquick

tube, waterbath, cutter.

Bahan-bahan yang digunakan adalah

primer OL13F-(GGATTCGGGAGAGGGCC

GGTGC) dan OL14R-(GTCGACTCATG

TGTGACTTGTCCGGAG) (Masiero et al.

2002), enzim restriksi BamHI, enzim restriksi

SalI, Plasmid vektor pCambia 1301 yang

disisipi CaMV35S promotor pada MCS, air

steril, 2x ligasi buffer, enzim T4 ligase, LB

cari, LB padat, glukosa, 1 M Tris-Cl pH 8, 0,5

M EDTA pH 8, 10 N NaOH, 10% SDS, 5 M

Kalium asetat, Asam asetat glasial, EtOH

70%, EtOH 95%, TE Buffer, dNTP, MgCl2,

10x PCR buffer, enzim platinum taq

polimerase, TAE buffer, leader 1 kb, loading

dye, etidium bromida, buffer QG, isopropanol,

asetosiringon, buffer PE, buffer EB, Detergen,

Baycline, Agrapt, Banlok, Agar, Media MS,

media R3B, Media AAM, Media LB

padat/cari, Media IK3, Media seleksi I dan II.

Sel bakteri yang digunakan adalah E. coli

DH5α yang membawa vektor pGEM-T Easy-

OsMADS18, Agrobacterium tumefaciens

strain EHA105, dan padi yang digunakan

adalah Indica.

Metode

Perbanyakan E.coli DH5α yang

mengandung pGEM-T Easy

(Sambrook dan Russel 2001)

Eschericia coli (E.coli) diperbanyak dalam

media LB yang mengandung antibiotik.

Perbanyakan E.coli yang mengandung pGEM-

T Easy dilakukan dengan memasukkan 1

koloni putih E.coli ke dalam media LB cair

yang mengandung Ampisilin 100 mg/l,

kemudian suspensi diinkubasi pada suhu 370C

selama semalam (24 jam) sambil digoyangkan

pada 250 rpm.

6

Isolasi DNA Plasmid (QIAGEN 2006)

Isolasi DNA plasmid dilakukan dengan

prosedur Mini Preps (QIAGEN 2006).

Sebanyak 100 mL kultur bakteri hasil

perbanyakan LB cair dimasukkan ke tabung

Eppendorf dan disentrifus pada 12000 rpm

selama 1 menit (bagian ini diulangi lagi

dengan membuang supernatan dan

menambahkan lagi kultur ke dalam Ependorf

dan disentrifus). Tahap selanjutnya supernatan

dibuang dan dilarutkan dengan 100 µL larutan

I, di vortek selama 5 menit, kemudian

ditambahkan larutan II sebanyak 200 µL

(larutan II harus freshmade) dan digoyang

bolak-balik 10 kali, kemudian ditambahkan

larutan III sebanyak 150 µL, dan di bolak-

balik selam 10 kali. Lalu campuran disentrifus

dengan kecepatan tinggi (12.000 rpm) selama

10 menit, setelah itu supernatan dipindahkan

ke tabung Eppendorf yang baru dan ditambah

450 µL EtOH 95%, disentrifus dengan

kecepatan tinggi (12.000 rpm) selama 10

menit, supernatan dibuang dan ditambah

500µL ETOH 70% disentrifus lagi pada

kecepatan 12000 rpm selama 10 menit,

supernatan dibuang lagi. Tabung Eppendorf

diletakkan terbuka pada vakum hingga benar-

benar kering, lalu dilarutkan dengan 30 µL

buffer TE.

Pemotongan DNA Plasmid dengan

Enzim BamHI dan SalI (Invitrogen 2003)

Pemotongan DNA plasmid dengan enzim

restriksi sesuai dengan prosedur yang terdapat

pada Invitrogen (2003). Plasmid dipotong

dengan mencampurkan 20 µL DNA dengan

enzim restriksi BamHI sebanyak 1 µL, buffer

TE sebanyak 5 µL, dan BSA sebanyak 0,5 µL.

Setelah suspensi homogen, kemudian

diinkubasi pada suhu optimum selama 2 jam.

Setelah inkubasi enzim diinaktifasi dengan

dipanaskan pada suhu 700C selama 15 menit.

Kemudian dilanjukkan dengan pemotongan

menggunakan enzim SalI, yaitu dengan

menambahkan sebanyak 1 µL enzim SalI dan

diinkubasi lagi selama 2 jam, kemudian enzim

tersebut diinaktifasi dengan pemanasan.

Elektroforesis Gel Agarosa

(Sambrook dan Russel 2001)

Sampel DNA ditambah dengan bufer

loading dye kemudian dimasukkan ke dalam

sumur gel agarosa 1%. Elektroforesis dilakukan

pada tegangan 75 volt, arus 150 mA.

Kemudian gel di cuci dengan Ethidium

bromida dan air selama 10 menit. Kemudian

dilihat dibawah UV illuminator Chemidoc EQ

Biorad. Untuk pemurnian DNA dari gel

agarosa dilakukan dengan mengisolasi gel

yang mengandung DNA target yang diketahui

dengan membandingkannya dengan marker 1

kb.

Pemurnian DNA dari Gel Agarosa

(QIAGEN 2006)

Pemurnian DNA dari gel agarosa

dilakukan berdasarkan QIAGEN (2006), gel

agarosa dimasukkan ke dalam UV illuminator

Chemidoc EQ Biorad, dan diletakkan penanda

untuk mengetahui posisi DNA, lalu dilihat

dengan sinar ultraviolet. Setelah didapat posisi

DNA nya maka dilakukan pemotongan pada

agar yang terdapat DNA dan dimasukkan ke

dalam tabung Eppendorf yang terlebih dahulu

sudah ditimbang bobotnya, setelah

dimasukkan agar ke dalam Eppendorf dihitung

bobot agar dengan mengurangi bobot

Eppendorf kosong dengan Eppendorf yang

berisi agar. Kemudian ditambahkan 3x

volume buffer QG ke dalam tabung

Eppendorf, lalu tabung Eppendorf tersebut

dimasukkan ke oven bersuhu 650C selama 10

menit, lalu ditambahkan isopropanol 1 volume

dan dimasukkan ke dalam tabung QIAquick

dan di sentrifus selama 1 menit, supernatan

dibuang dan ditambahkan buffer PE 0,75 mL

dan disentrifus kembali selama 1 menit, buang

supernatannya. Lalu ke dalam tabung

QIAquick ditambahkan buffer EB 50 µL dan

disentrifus selama 1 menit, dan disimpan pada

suhu -200C.

Penyambungan (Ligasi) DNA

(Invitrogen 2003)

Proses ligasi berdasarkan prosedur dari

Invitrogen (2003). Ligasi dilakukan dengan

nisbah DNA sisipan (OsMADS18) dan vektor

3:1. Proses ligasi dilakukan dengan

memasukkan 2 x Ligation Buffer 5 µL

ditambah 1 µL vektor pCAMBIA1301 vektor

dan 3 µL OsMAD18 serta enzim T4 Ligase

sebanyak 1 µL. Semuanya dicampur dalam

tabung Eppendorf dan diletakkan pada suhu

11-160C selama 16 jam atau semalam.

Transformasi Agrobacterium tumefaciens

(Sambrook dan Russel 2001)

Introduksi plasmid dilakukan dengan

metode heat shock. Sebanyak 1 µL plasmid

dimasukkan ke dalam sel kompeten

Agrobacterium tumefaciens strain EHA105.

Kemudian diinkubasi di es selama 30 menit

setelah itu diletakkan di suhu 420C selama 50

7

detik lalu diinkubasi di dalam es selama 5

menit. Ditambahkan dengan 750 µL media LB

kemudian digoyang pada suhu ruang selama

60 menit. Kemudian disentrifus 6000 rpm

selama 2 menit. Setelah itu supernatan

sebagian dan kemudian disebar pada media

LB padat yang sudah ditambahkan dengan

rifampicin 50 mg/mL dan kanamycin 50

mg/mL. Penumbuhan Agrobacterium

tumefaciens pada media LB padat dilakukan

di dalam LAF. Hasil penumbuhan kemudian

diinkubasi pada suhu 280C selama 48 jam. Sel

Agrobacterium tumefaciens yang terinsersi

gen OsMADS18 akan tumbuh membentuk

koloni putih pada media LB.

Koloni tunggal pada media LB padat

kemudian ditumbuhkan pada 5 mL media LB

cair yang sudah ditambahkan dengan

rifampicin 50 mg/mL dan kanamycin 50

mg/mL. Penumbuhan koloni tunggal

Agrobacterium tumefaciens pada media LB

cair dilakukan di dalam LAF. Masing-masing

koloni tunggal diambil dengan menggunakan

tip setelah itu tip dimasukkan ke dalam media

LB cair yang sudah ditambahkan dengan

antibiotik. Hasil penumbuhan kemudian

digoyang pada suhu ruang selama 48 jam.

Sterilisasi Benih (Coombs dan Franco 2003)

Benih padi yang telah dikupas disterilisasi

dengan alkohol 70% selama 1 menit, lalu

dibilas 1x dengan aquades steril, setelah itu di

rendam dalam larutan bakterisida 10 menit

dan larutan fungisida 10 menit, lalu dicuci

dengan aquades 3 kali, kemudian di rendam

kembali dalam bayclean 20% 15 menit dan

bayclean 10% selama 5 menit dan dibilas

sebanyak 6x, kemudian ditanam ke media.

Transformasi kalus embriogenik dengan

Agrobacterium tumefaciens

(Sambrook dan Russel 2001)

Bakteri A.tumefaciens yang telah ditanam

pada media AB padat selama 3 hari dipanen

dengan menggunakan spatula steril sebayak 2-

3 petri (bakteri ditaman merata pada

permukaan petri dengan pengaduk kaca

segitiga), kemudian dimasukkan ke dalam 100

mL media AAM yang mengandung 100 µM

acetoyringone pada erlemeyer steril 250 mL

steril, kemudian digoyang perlahan agar

homogen, ODnya diukur sampai mencapai

OD600 bernilai 1. Kemudian 20 kalus

embriogenik yang telah disiapkan direndam

dengan suspensi bakteri selama 15 menit,

setelah itu kalus hasil infeksi ditiriskan pada

kertas steril dengan dirolling dari ujung ke

ujung agar kering dan diganti sampai 2-3 kali.

Kemudian bagian atas ditutup juga dengan

kertas saring steril dan ditekan sambil

digoyang perlahan. Setelah kalus kering

ditanam pada media ko-kultivasi (IK3+100

µM asetosiringon) selama 3 hari dengan

ditutup plastik hitam.

Seleksi dan Regenerasi

(Purnamaningsih 2006)

Kalus dari hasil ko-kultivasi di tanam pada

media seleksi I selama 14 hari kemudian kalus

yang resisten di subkultur pada media seleksi

II selama 14 hari. Kalus yang resisten ditanam

pada media regenerasi (R3B: media

IK3+0,5mg/L IAA, dan 0,3 mg/L BAP) dan

setelah tumbuh planlet, planlet dipindahkan ke

media MS sampai perakaran cukup kuat untuk

dipindahkan ke media aklimatisasi

Isolasi DNA Tanaman (Jaakola et. al. 2003)

Isolasi DNA dilakukan dengan metode

CTAB yang telah dimodifikasi dari Jaakola et

al. (2003): Daun muda berukuran sekitar 2 cm

atau kalus dimasukkan ke dalam Eppendorf

1,5 mL dan dibekukan dengan nitrogen cair.

Daun digerus sampai halus, kemudian

ditambahkan dengan 750 ul buffer isolasi

yang mengandung buffer lisis [0,2 M tris-HCL

pH 7.5, 0.05 M EDTA, 2 M NaCl, 2% (b/v))

CTAB (Hexadecyltrimethyl ammonium

bromide)], buffer ekstraksi [0.35 M sorbitol,

0.1 M tris HCl pH 7.5, 5 mM EDTA]. dan 5%

(b/v) sarkosil dengan perbandingan 2,5:2,5:1.

Selanjutnya campuran diinkubasi 1 jam pada

suhu 650C sambil dibolak-balik perlahan. Lalu

ditambahkan 750 uL kloroform:isoamil

alkohol (24:1). Kemudian sampel disentrifus

(12000 rpm, selama 5 menit pada suhu ruang).

Lapisan atas diambil dan dipindahkan ke

dalam tabung 1,5 mL baru dan ditambah 400

ul isopropanol lalu dibolak-balik hingga

gumpalan DNA terlihat. Selanjutnya cairan

disentrifus (12000 rpm, selama 6 menit pada

suhu ruang) dan cairan dibuang, endapan

dicuci dengan 500 ul 70% etanol dan

disentrifus lagi (12000 rpm selama 3 menit).

Cairan dibuang dan endapan dikeringkan.

DNA dilarutkan dalam 50 ul TE (10mM tris-

HCL pH 8.0, dan 1 mM EDTA). Sampel DNA

disimpan pada -200C

Uji Gus (Rueb dan Hensgen 1989)

Ekspresi enzim β-glucuronidase (GUS)

diuji terhadap daun tanaman, merujuk pada

metode Rueb dan Hensgen (1989). Daun

direndam dalam buffer fosfat (0.1 M NaPO4;

8

pH 6.8) yang mengandung 1% Triton X-100

pada suhu 370C selama 1 jam, kemudian

dicuci 2 kali dengan buffer fosfat segar, dan

divakum selama 5 menit. Setelah itu daun

direndam dalam larutan X-gluc dan divakum

selama 5 menit, kemudian diinkubasi semalam

pada suhu 370C. Buffer fosfat dibuang dan

ditambahkan alkohol 70%. Pengamatan

dilakukan dengan melihat perubahan warna

yang terbentuk pada daun, apabila daun

berubah menjadi warna biru maka gen β-

glucuronidase terekspresi.

Analisis PCR (Sambrook dan Russel 2001)

Analisis PCR digunakan untuk mendeteksi

integrasi gen OsMADS18 pada genom

tanaman padi. Komposisi bahan yang

digunakan adalah 1x reaksi PCR di dalam

volume akhir 15 ul adalah : 1 x buffer PCR

yang mengandung Mg2+

, 0.05 mM dNTP, 0.05

ul Taq Polymerase, 2.5 ng/ul primer OL13F,

2.5 ng/ul primer OL14R, 1 ul DNA hasil

isolasi dan ditambahkan dH2O hingga volume

mencapai 15 ul, dan dimasukkan dalam mesin

PCR dengan kondisi pra PCR pada susu 950C

5 menit, denaturasi pada 950C 1 menit,

annealing pada 550C 1 menit, sintesis DNA

pada 720C 1 menit dan ekstensi pada 72

0C

selama 10 menit dengan 40 siklus. Kemudian

hasil PCR di elektroforesis.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Plasmid rekombinan pembawa

Gen OsMADS18

Plasmid rekombinan pembawa gen

OsMADS18 berhasil dikonstruksi dengan

menyisipkan gen tersebut ke pCAMBIA 1301.

Tahap awal kegiatan ini adalah melakukan

isolasi plasmid pGEM-T Easy yang membawa

gen OsMADS18 dari kultur bakteri Eschericia

coli DH5α dan mengkultur bakteri E.coli ke

dalam media LB cair yang mengandung

antibiotik ampisilin 50 mg/l. Isolasi DNA

plasmid dilakukan dengan menggunakan

metode lisis alkali merujuk pada Sambrook

dan Russel (2001). Adapun prinsip dari

metode ini adalah merusak dinding sel dan

membran sel dari sel E.coli. Penggunaan

Etilen diamin tetra asetat (EDTA) bertujuan

untuk merusak dinding sel dengan

menghilangkan ion magnesium pada selubung

sel, sehingga sel bakteri pecah (Zhiwen et al.

2006). Sodium Deodosil Sulfat (SDS)

berfungsi untuk menghilangkan molekul lipid,

sehingga akan menyebabkan kerusakan pada

membran sel (Davis et al. 2004). Untuk

memisahkan RNA dari DNA ditambahkan

enzim RNAse yang akan mendegradasi

molekul RNA. Protein dihilangkan dengan

penambahan potasium asetat sehingga protein

akan mengendap dan dipisahkan melalui

sentrifus (Holzmann et al. 2008).

Tahap selanjutnya adalah melakukan

pemotongan terhadap vektor dan fragmen gen

OsMADS18 menggunakan enzim BamHI dan

SalI. Enzim ini mengenali gugus 6 basa

spesifik, yaitu G*GATCC (BamHI) dan

G*TCGAC (SalI) sehingga hasil pemotongan

berujung lenket (Bernard and Pasternak 2002).

Pemotongan vektor pCAMBIA 1301 dan gen

OsMADS18 dengan enzim yang sama

bertujuan agar proses ligasi dapat terjadi

karena kedua ujung vektor dan DNA sisipan

saling berkomplemen. Sedangkan penggunaan

dua enzim berbeda bertujuan untuk

memastikan arah orientasi gen OsMADS18

ketika terligasi dalam vektor pCAMBIA1301.

Hasil elektroforegram menunjukkan bahwa

plasmid pGEM-T Easy yang membawa gen

OsMADS18 berhasil diisolasi dari kultur

E.coli, dibuktikan dengan adanya pita DNA

pada ukuran 3757 bp (Gambar 1; lajur 1).

Selanjutnya plasmid dipotong dengan enzim

BamHI dan SalI. Pemotongan ini

menghasilkan 2 pita yaitu pGEM-T Easy

(3015 bp) dan OsMADS18 (742 bp) (Gambar

1; lajur 2 dan 3). Sedangkan pemurnian

fragmen gen OsMADS18 dari gel agarose

merujuk pada metode dari QIAGEN (2006).

Tujuan pemurnian adalah untuk mendapatkan

fragmen DNA yang diinginkan (OsMADS18)

dan menghilangkan pengotor-pengotor lain

berupa nukleotida, sisa-sisa garam, dan enzim

yang dapat mengganggu proses selanjutnya

(Dobhal et al. 2010). Hasil elektroforegram

terlihat bahwa pemurnian fragmen gen

OsMADS18 berhasil dilakukan, hal ini

ditunjukkan dengan adanya pita DNA

berukuran 742 bp (Gambar 1; lajur 4).

Gambar 1 Elektroforegram DNA pGEM-T

Easy-OsMADS18 (Lajur 1); DNA

yang dipotong dengan enzim

BamHI dan SalI (Lajur 2 dan 3);

Hasil pemurnian fragmen

OsMADS18 (Lajur 4)

3015 bp

742 bp

3757 bp

M 1 2 3 4

9

Konstruksi plasmid rekombinan dilakukan

dengan menyisipkan gen OsMADS18 di

bawah kontrol promotor CaMV35S di dalam

vektor pCAMBIA 1301 linear. Dari hasil

proses ligasi antara vektor pCAMBIA 1301

dengan fragmen gen OsMADS18 diperoleh

plasmid rekombinan pCAMBIA 1301-

OsMADS18 yang berukuran 12651 bp

(Gambar 2 ; lajur 1). Ukuran ini terdiri atas

ukuran vektor pCAMBIA1301 (11819 bp) dan

fragmen gen OsMADS18 (742 bp). Sedangkan

Gambar 3; lajur 2 adalah hasil restriksi vektor

pCAMBIA 1301 – OsMADS18. Pita dengan

ukuran 11819 bp adalah vektor pCAMBIA

1301, sedangkan pita berukuran 742 bp adalah

gen OsMADS18.

Gambar 2 Elektroforegram pemotongan vector

dengan enzim restriksi. lajur 1 ;

pCAMBIA 1301 - OsMADS18.

lajur 2 ; (11819 bp adalah

fragmen vector pCAMBIA 1301,

742 bp adalah fragmen gen

OsMADS18) M = λ HindIII

Agrobacterium tumefaciens Pembawa

vektor pCAMBIA 1301-OsMADS18

Tahapan selanjutnya adalah transformasi

plasmid rekombinan (vertor pCAMBIA 1301

– OsMADS18) ke Agrobaterium tumefacies

EHA105 dengan metode kejut panas.

Kemudian dilakukan seleksi Agrobacterium

tumefaciens EHA105 yang mengandung DNA

rekombinan berdasarkan pada marka seleksi

antibiotik ripamfisin 50 mg/l dan kanamisis 50

mg/l. Selain itu juga dilakukan seleksi koloni

biru-putih melalui pemberian IPTG dan X-gal

pada media seleksi.

Koloni yang tumbuh pada media seleksi

(Gambar 3) adalah koloni yang membawa

vector pCAMBIA 1301, hal ini terjadi karena

Agrobacterium tumefaciens yang membawa

vector ini akan memilik kemampuan resisten

terhadap antibiotik ripamfisin dan kanamisin.

Sedangkan seleksi koloni biru-putih pada A.

tumefaciens EHA105 bertujuan untuk

mendeteksi keberadaan gen OsMADS18

dalam vektor berdasarakan marka seleksi Lac-

Z. Koloni putih menunjukkan bahwa sel

Agrobacterium tumefaciens strain EHA105

membawa gen OsMADS18, sedangkan koloni

biru tidak membawa gen OsMADS18.

Gambar 3 terlihat bahwa semua koloni

yang terbentuk adalah koloni yang berwarna

putih. Terbentuknya koloni putih disebabkan

adanya penyisipan fragmen gen OsMADS18

pada lacZ di MCS yang mengakibatkan enzim

β-galaktosidase tidak terekspresi (Tsen et al.

2004). Hal ini membuktikan bahwa semua

koloni tersebut membawa plasmid pCAMBIA

1301 yang tersisipi gen OsMADS18.

Gambar 3 Koloni Agrobacterium tumefaciesn

EHA 105 hasil transformasi dengan

pCAMBIA 1301 (koloni putih)

Tranformasi dan Regenerasi Tanaman

Kemampuan Agrobacterium tumefaciens

sebagai mediasi transformasi sel tanaman

sudah banyak dimanfaatkan, hal ini karena

bakteri tersebut mampu membentuk tumor

yang akan mengintroduksikan gen asing ke

dalam genom tanaman dan gen tersebut akan

terintegrasi dan berfungsi dengan baik

(Uchimiya et al. 1989). Transformasi kalus

dilakukan melalui ko-kultivasi dengan

Agrobacterium tumefaciesn EHA105 yang

mengandung pCAMBIA 1301 pembawa gen

OsMADS18.

Beberapa faktor penting yang menentukan

keberhasilan transformasi tanaman padi

melalui A.tumefaciens adalah; tipe dan umur

jaringan, jenis vektor, genotipe, kondisi kultur

jaringan, waktu infeksi. Kalus embriogenik

merupakan salah satu faktor penting yang

menentukan efisiensi transformasi (Hiei et al.

1997). Secara morfologi, kalus embriogenik

mempunyai bentuk yang teratur, compact,

bewarna putih atau kekuningan, sedangkan

kalus non-embriogenik bersifat lembek, tidak

membentuk embrio, dan pertumbuhan

kalusnya lambat, tetapi dapat tumbuh besar

dalam waktu yang lama (Rueb et al. 1994).

M 1 2 12651 bp

11819 bp

742 bp

10

Hasil tranformasi diperoleh sejumlah kalus

yang membawa gen penyeleksi hpt sehingga

bisa hidup dalam media yang mengandung

antibiotik higromisin. Jumlah kalus yang

resisten terhadap higromisin pada media

seleksi adalah 18 kalus. Kalus yang resisten

higromisin akan berwarna putih kekuningan.

Sedangkan kalus yang tidak resisten akan

mengalami gejala nekrotik (warna hitam)

(Gambar 4b). Kemudian kalus tersebut

dipindahkan ke media regenerasi.

Kemampuan regenerasi kalus setelah proses

transformasi akan menentukan jumlah planlet

yang dihasilkan. Hal ini terkait dengan

kombinasi dan konsentrasi hormon yang

digunakan pada media regenerasi.

Pertumbuhan tunas pertama kali terjadi pada

hari ke-4, yaitu dengan menculnya green spot

pada kalus (Gambar 4c). Green spot ini akan

terus tumbuh hingga menjadi planlet padi

trangenik (Gambar 4d).

Gambar 4 Transformasi genetik padi Indica

menggunakan A. tumefaciens a)

Kalus yang telah diinfeksi

A.tumefaciens pada media ko-

kultivasi (kalus hitam mengalami

nekrotik = gagal). b) Seleksi kalus

resisten higromisin. c)

Pertumbuhan tunas awal pada

media regenerasi (wana hijau

adalah greenspot yang akan

menjadi planlet). d) Planlet padi

transgenik.

Tanaman Transgenik

Percobaan ini menghasilkan 18 tanaman

transgenik yang mengandung gen OsMADS18.

Hal ini dibuktikan dengan uji gus-A dan PCR

(Polymerase Chain Reaction). Uji gus-A bisa

dilakukan karena plasmid pCAMBIA 1301

mengandung gen gus-A dan gen hpt untuk

ketahanan terhadap atibiotik higromisin. Uji

histokimia β-glucuronidase dapat dilakukan

pada tahap awal segera setelah ko-kultivasi

maupun setelah gen diintroduksikan dan

terintegrasi dengan stabil dalam genom

tanaman. Pada penelitian ini digunakan daun

tanaman padi hasil transformasi.

Hasil pengujian terhadap semua tanaman

menunjukkan bahwa semua tanaman

mengandung gen gus-A. Hasil transformasi

positif ditunjukkan dengan adanya warna biru

yang muncul pada irisan daun (Gambar 5).

Warna biru tersebut disebabkan oleh reaksi

substrat X-gluc (5-bromo-4-chromo-3-indolys-

β-D-glucuronide) dengan enzim β-

glucuronidase menjadi senyawa intermediet

melalui reaksi dimerisasi oksidatif membentuk

senyawa dichloro-dibromoindigo (CIBr-

Indigo) yang berwarna biru.

Berdasarkan elektroforegram hasil PCR

terhadap 18 tanaman transgenik (Gambar 6),

semua tanaman membawa gen OsMADS18.

Hal ini ditunjukkan dengan adanya pita yang

berukuran 742 bp yang merupakan ukuran

dari gen tersebut.

Gambar 5 Hasil uji β-glucuronidase terhadap

daun tanaman padi. Hasil positif

ditunjukkan dengan terbentuknya

warna biru.

KESIMPULAN

Sejumlah 18 planlet Indica berhasil di

transformasikan dengan gen OsMADS18.

Keberhasilan uji gus-A di tunjukkan dengan

munculnya warna biru pada irisan jaringan

daun. Sedangkan analisis PCR terhadap 18

planlet transgenik menghasilkan pita

berukuran 742 bp, ini menunjukkan bahwa

gen OsMADS18 sudah terintegrasi ke dalam

genom tanaman padi.

a d

b

c

11

SARAN

Tanaman transgenik yang dihasilkan perlu

dianalisis lebih lanjut dengan Southern Blot

untuk mengetahui jumlah kopi. analisis

Western Blot untuk mengetahui ekspresi gen

yang diintroduksi. Uji segregasi terhadap

keturunan berikutnya untuk mendapatkan

tanaman transgenik yang mengandung gen

sasaran tetapi tidak mengandung gen

penyeleksi antibiotik.

DAFTAR PUSTAKA

Azhakanandam K, MS McCabe, JB POwer,

KC LOwe, EC Cocking, MR Davey. 2000.

T-DNA transfer, integration, expression

and inheritance in rice: Effects of plant

genotype and Agrobacterium tumefaciens

super-virulence. J Plant Physiol 157:429-

439

Belarmino MM. and Mii M. 2000.

Agrobacterium mediated genetic

transformation of a phalaenopsis orchid.

Plant Cell Report 19:435-442

Bernard JG, Pasternak JJ. 2002. Molecular

Biotechnology: Principles and

Applications of Recombinant DNA. 3rd

Edition. USA: American Society for

Microbiology

Casali N, Andrew P, Preston A. 2003. E coli

plasmid vectors: methods and applications.

Humana Press 12:19-25

Cheng M, Lowe BA ,Spencer M ,Ye X,

Armstrong CL. 2004. Factors influencing

Agrobacterium-mediated transformation

of monocotyledonous species. Dev

Biology-Plant 40: 31-45

Christou P. 1990. Inheritance and expression

of foreign genes in transgenic soybean

plants. Proc. Natl. Acad. Sci. 86:7500-

7504. In. Marc de Block. 1993. The cell

biology of plant transformation : current

state, problem, prospects and the

implication for the plant breeding. Kluwer

Aad Publisher. Netherlands.

Chuanfeng Z, Jiahe W, Chaozu H. 2010.

Induction of chromosomal inversion by

integration of T-DNA in the rice genome. J

Genet Genomics 37:1-9

Coombs JT, Franco CMM. 2003. Isolation and

identification of actinobacterial isolated

from surface-sterilized wheat roots.

Applied Environ Microbiol 69:5303-5308.

Datta SK, Peterhand A, Datta K and Potrykus

I. 1990. Genetically enginered fertile

Indica-rice recovered from protoplast.

Biotech 8:736-740

Datta SK, Datta K, Soltanifar N, Donn G and

Potrykus I. 1992. herbicide resistant

Indica-rice plants from IRRI breeding line

IR72 after PEG mediated transformation of

protoplast. Plant Mol Biol 20:619-629

Davis L et al. 1994. Basic Methods:

Molecular Biology. Jilid 2. Norwola :

Appletn & Lange

Dobhal S, P Dinesh, K Anil, A Sanjeev. 2010.

Studies on plant regeneration and

transformation efficiency of

Agrobacterium mediated transformation

using neomycin phosphotransferase II

(nptII) and glucuronidase (GUS) as a

reporter gene. Afr J of Biotech vol

9(41):6853-6859

742 bp

Gambar 6 Elektroforegram PCR terhadap gen OsMADS18, M = 1kb, kontrol negative (-) non

transgenik, lajur 1-18 tanaman transgenik positif terdapat gen OsMADS18 (ukuran pita

742 bp).

12

Dieffenbach CW, Dveksler GS. 2003. PCR

Primer, A Laboratory Manual. 2nd

Edition. USA: Spring Harbor Laboratory Pr.

Dworkin MM, Falkow W, Rosenberg E,

Schleifer K, Stackebrandt E. 2006. The

Prokaryotes. 3rd Edition. USA: Springer.

Enriquez-Obregon GA, Prieto-Samsonov DL,

de la Riva GA, Perez MI, Selman-

Housein G, Vazquz-Padron RI. 2000.

Agrobacterium-mediated Japonica rice

transformation a procedure assisted by an

antinecrotic treatment. Plant Cell Tiss.

Organ Cult. 59: 159-168l

Favaro R, Pinyopich A, Battaglia R, Kooiker

M, Borghi L, Ditta G, Yanofsky MF, Kater

MM, Colombo L. 2003. MADS box

protein complexes control carpel and ovule

development in Arabidopsis. Plant Cell

15:2603–2611

Ferrandiz C, Gu Q, Martienssen R, Yanofsky

MF. 2000. Redundant regulation of

meristem identity and plant architecture by

FRUITFUL, APETALA1 and

CAULIFLOWER. Development 127:725–

734

Fornara F, Parenicova L, Falasca G, Pelucchi

N, Masiero S, Ciannamea S, Lopez-Dee Z,

Altamura MM, Colombo L, Kater MM.

2004. Functional characterization of

OsMADS18, a member of the AP1/SQUA

subfamily of MADS box genes. Plant

Physiol 135:2207-2219

Frame B. H Zhang, S Cocciolone, L

Sidorenko, C Dictrich, S Pegg, S Zhen, P

Schnable, K Wang. 2000. Production of

transgenic maize from bombarded type II

callus: effect of gold particle size and

callus morphology on transformation

efficiency. In Vitro Cell Dev Plant 36:21-

29

Garris AJ. 2004. Genetic structure and

diversity in Oryza sativa L. Genetics

169:1631-1638

Gao Z, Xie X, Ling Y, Muthurrishnan S,

Liang HG. 2005. Agrobacterium

tumefaciens transformation using an

mannose selection system. J Plant Biotech

3:591-597

Ghasemi BK, SV Stepanovich, KG Illich.

2008. Design, construction and cloning of

pCAMBIA-MiAMP1 vector for enhancing

disease resistance in plants using

Agrobacterium-mediated transformation. J

App Bioscien vol 10(2):538-546

Herman M. 2002. Perakitan hasil rekayasa

genetik dan pengaturan keamanan hayati

Indonesia. Bul Agrobio vol 5(1).

Herman M 2010. Aplikasi teknik rekayasa

genetik dalam perbaikan sumber daya

genetik tanaman untuk ketahanan cekaman

biotik. Bul Plasma Nutfah Vol 16(1):172.

Heryati N. 2002. Konstruksi Plasmid

Rekombinan cryIB dan cryIAc di bawah

kontrol promotor terinduksi pelukaan

[SKRIPSI]. Derpartemen Kimia IPB.

Hiei Y, KOmari T, Kubo T. 1997. Efficient

transformation of rice (O.sativa L.)

mediated by Agrobacterium and sequence

analysis of the boundaries of the T-DNA.

The Plant J 6(0):001-011.

Holzmann J, P Frank, E Löffler, K Bennett, C.

Gerner, W Rossmanith .2008. RNase P

without RNA: Identification and functional

reconstitution of the human mitochondrial

tRNA processing enzyme. Cell 135 (3):

462–474

Jaakola L. AM Pirtilla, M Halonen, and A

Hohtola. 2001. Isolation of hight-quality

DNA from bilberry (Vaccinium myrtillus

L.) fruit. Mol Biotech 19:201-203

Jefferson RA. 1987. Assaying chimeric genes

in plant : the GUS gene fusion system.

Plant Mol Biol Rep 55:387-405

Joseph B, Jini D, Ajisha SU. 2011. Fight

global warming wiht genetically altered

trees. Asian J Biotech 1-8

Kibria K, Islam MM, and Begum SN. 2008.

Screening of aromatic rice lines by

phenotypic and molecular markers. J Bot

37(2):141-147

Klee H. 2000. A guide to Agrobacterium

binary Ti vectors. Trends in Plant Scie

5:446-451

Lal R and Lal S. 1993. Genetic Enginering of

Plants for Crop Improvement. New Delhi:

CRS Pr.

Le VQ, Belles-Isles J, Dusabenyagusani M,

tremblay FM. 2001. An improved

procedure for production of white pruce

(Picea glauca) transgenic plants using

Agrobacterium tumefaciens. J Exp Bot

52:2089-2095

13

Lestari AP, Aswidinnorr H, Suwarno. 2007.

Uji daya hasil pendahuluan dan mutu beras

21 padi hibrida harapan. Bul Agron

35(1):1-7

Listanto E, Sutrisno, Saptowo JP, Herman M.

2005. Penyisipan gen inhibitor α-amilase

pada plasmid biner pCAMBIA 1301. J

Agro Biogen 1(2):45-52

Lucca P, Ye X, Potrykus I. 2001. Effective

selection and regeneration of transgenic

rice plants with mannose as selective

agent. Mol Breed 7:43-49

Madigan MT, Martinko JM. 2006. Brock:

Biology of Microorganism. 12th edition, San Francisco Perason Education

International. p989-990

Masiero S, Imbriano C, Ravasio F, Favoro R,

Pelucchi N, Gorla MS, Mantovani R,

Colombo L, Kater MM. 2002. Ternary

complex formation between MADS-box

transcription factor and the histone fold

protein NF-YB. J Biol Chem Vol. 277

(29):26429-26435

Matthews PR. Ming-Bo W, Waterhouse PM,

Thornton S, Fieg SJ, Gubler F, Jacobsen

JV. 2001. Marker gene elimination from

transgenic barley, using co-transformation

with adjacent "twin T-DNAs" on a

standard Agrobacterium transformation

vector. Mol Breed 7:195-202

Mikkelsen SR, Corton E. 2004. Bioanalytical

Chemistry. New Jersey: John Wiley &

Sons.

Olhoft PM, Flaye, LE, Sowers DA. 2004. T-

DNA locus structure in a large population

of soyabean plant transform using the

Agrobacterium-mediated cotyledonany-

node methods. Plant Biotech. J. 2: 289-

300.

Opabode JT. 2006. Agrobacterium-mediated

transformation of plants: emergin factors

that influence efficiency. Biotech Mol Biol

Rev 1(1):12-20

Pelucchi N, Fornara F, Favalli C, Masiero S,

Lago C, Pe ` ME, Colombo L, Kater MM.

2002. Comparative analysis of rice MADS

box genes expressed during flower

development. Sex Plant Reprod 15:113–

122

Peng J, Kononowcz H and Hodges TK. 1992.

Transgenic indica rice plants. Theor Appl

Genet 83:855-863

Pray L. 2008. Recombinant DNA technology

and transgenic animal. Nature Education

1(1):125-133

Primrose SB, Twyman RM. 2006. Principles

of Gene Manipulation and Genomics. Ed.

Ke-7. Oxford: Blackwell Publishing

Purnamaningsih R. 2006. Induksi kalus dan

optimasi regenerasi empat varietas padi

melalui kultur In Vitro. J Agro Biogen

2(2):74-80

Rachmawati D, T Hosaka, E Inoue, H Anzai.

2004. Agrobacterium-mediated

transformation of javanica rice cv.

Rojolele. Biosci Biotech Bioch 68:1193-

1200

Rachmawati EE. 2010. Peningkatan Viabilitas

(Priming) Benih Juwawut (Setaria italica

(L.) P. Beauvois) dengan Polyethylene

Glycol (PEG) 6000 [SKRIPSI]. Biologi.

Fakultas Sains dan Teknologi. UIN

Malang.

Rajesh S, Krishnaveni S, Sudhakar D,

Raveendran M, Sivakumar P, Gnanam R,

Manickam A. 2008. Agrobacterium-

mediated transformation on indica rice

(Oryza sativa L.), IR64 with mungbean

LEA protein gene for water-stress

tolerance. Am J Plant Physiol 3(3):101-110

Rueb S and Hensgens LAM. 1989. Improved

histochemical staining for β-D-

glucuronidase activity in

monocotyledonous plant. Genet 6:168-

169.

Rueb S, Leneman M, Schilperoort RA,

Hensgens LAM. 1994. Efficient plant

regenartion through somatic

embryogenesis from callus induced on

mature rice embryos (Oryza sativa L.).

Plant Cell, Tissue And Organ Cult 36:259-

264.

Sarkar S, Chaudhuri S, Basu T. 2002.

Mechanism of arttificial transformation of

E.coli with plasmid DNA-clues from the

influence of ethanol. Current Science

83:1376-1380

Sambrook J, Russel DW. 2001. Molecular

Cloning : A Laboratory manual.3rd

Edition. New York: Cold Spring Harbor

Laboratory Pr, Cold Spring Harbor

Schroeder S, Hondred D, Seltzer J, Pierce D.

2000. Agrobacterium-mediated sorghum

transformation. Plant Mol Biol 44:789-798

14

Sha Y, Li S, Pei Z, Luo L, Tian Y, He C.

2004. Generation and flanking sequence

analysis of a rice T-DNA tagged

population. Theor Appl Genet 108:306-314

Stomp AM. 1992. Histochemical localization

of B-glucuronidase. IN : S.R. Gallagher

(ed) GUS Protocols : using the GUS gene

as reporter of gene expression. London :

Academic Press, Inc.

Sutrisno M, Herman S, J Pardal, E Listanto, A

Sisharmini, SG Budiarti, D Damayanti, TJ

Santoso, R. Wu. 2000. Regenerasi embrio

muda jagung Antasena dan Bisma yang

ditembak dengan Plasmid pTW-a dan

pRQ6. Dalam Moejopawiro S, T

Purwadaria, M Herman, A Rukyani,

Sutrisno, H Kasim, IN Orbani (eds.).

Prosiding Ekspose Hasil Penelitian

Bioteknologi Pertanian dalam rangka 25

Tahun Badan Penelitian dan

Pengembangan Pertanian. Balitbangtan,

Deptan.

Tsen Z et al. 2002. Natural plasmid

transformation in Escherichia coli. J

Biomel Scine 9:246-252.

Tzfira T, citovsky V. 2002. Partners-in-

infection: host proteins involved in the

transformation of plant cell by

Agrobacterium. Trends in Cell Biol

12:121-130

Tzfira T, Li JX, Lacroix B, Citovsky V. 2004.

Agrobacterium T-DNA integration:

molecules and models. Trends Genet

20:375-383.

Uchimiya H, Handa T, Brar DS. 1989.

Transgenic plant. J Biotech 12:1-20

Utomo SD. 2005. The effect of L-Cysteine on

the efficiency of Agrobacterium-mediated

transformation of maize (Zea mays). Bul

Agron 33(3):7-16

Walkerpeach C and Velten J. 1994.

Agrobacterium-mediated gene transfer to

plant cells : cointegrate and binary vector

systems. Plant Mol Biol Man B1:1-19

Wangxia W. 2003. Plant responses to drought,

salinity and extreme termperatures:

towards genetic engineering for stress

tolerance. PLANTA 218(1):1-14

Watson JD, Hopkins NH, Roberts J, Seitz JA,

Wainer AM. 2007. Molecular Biology of

the Gene. 6 Edition. California: The

Benyamin/Cumming Publishing Co Inc.

Widodo 2002. Pengaruh tegangan

elektroporasi terhadap efisiensi

transformasi plasmid pND968 bakteri

asam laktat ke E.coli HB101. J Teknol dan

Ind Pang Vol XIII(2):173-177

Xiao H, Wang Y, Liu D, Wang W, Li X, Zhao

X, Xu J, Zhai W, Zhu L. 2003. Functional

analysis of the rice AP3 homologue

OsMADS16 by RNA interference. Plant

Mol Biol 52:957–966

Yina K, Biran I, Davie RW. 2004.

Simultaneously monitoring gene

expression kinetics and genetic noise in

single cells by optical well array. Anal

Chem 76:6282-6286

Zhiwen Yuan, Jeanne M. VanBriesen. 2006.

The formation of intermediates in EDTA

and nta biodegradation. Environ Eng Sci

23:533-544.

Zhou HY, et al. 2003. Generating marker-free

transgenic tobacco by Agrobacterium-

mediated transformation with double T-

DNA binary vector. Acta Bot Sin 45:1103-

1108

Zohary D, Hopf M. 2000. Domestication of

Plants in The Old World. Oxford: Oxford

University Pr

Zupan J, Muth TR, Draper O, Zambryski P.

2000. The transfer of DNA from

Agrobacterium tumefaciens into plants: A

feast of fundamental insights. Plant J 23:

11-28

LAMPIRAN

16

Lampiran 1 Diagram alir penelitian

Isolasi Plasmid dari E.coli DH5α

Restriksi dengan enzim BamHI dan SalI

Transformasi ke Agrobacterium tumefaciens

Transformasi Kalus dengan A. tumefaciens

Uji gus-A

Kultur Jaringan

Padi Indica

Seleksi dan Regenerasi

Analisis PCR

Seleksi dan Sterilisasi

Benih Padi Indica

Purifikasi DNA dari Gel Agarose

Ligasi DNA ke Vektor pCAMBIA 1301

Isolasi DNA Tanaman

17

Lampiran 2 Proses umum isolasi plasmid (Sambrook & Russel 2001)

Koloni tunggal bakteri E.coli

ditumbuhkan ke media LB

diinkubasi selama 24 jam

pada suhu ruang

kultur bakteri dipanen dengan sentrifugasi

pada 10.000 rpm selama 1 menit

pemurnian DNA dengan larutan I, larutan II

dan larutan III

pemekatan DNA dengan etanol absolut

18

Lampiran 3 Peta Plasmid pCAMBIA 1301 (cambia.org)

Lampiran 4 Proses umum reaksi ligasi (Sambrook & Russel 2001)

pCAMBIA 1301

19

Lampiran 5 Proses purifikasi DNA dengan metode dari QiAgen (2006)

Hasil PCR

+ 3x volume buffer QG dan 1x volume isopropanol

+ Buffer PE 0,75 mL

+ Buffer EB 50 µL

Diperoleh DNA murni

Sentrifuse

Sentrifuse

Sentrifuse

20

Lampiran 6 Proses umum isolasi DNA tanaman (Sambrook & Russel 2001)

0,5 g bunga padi Indica, ditambah N2

lisis sel secara mekanik dengan penggerusan

sel dipanen dengan sentrifugasi

pada 12.000 rpm 10 menit

pemurnian DNA dengan kloroform/isoamil-

alkohol (1:1) dan disentrifugasi pada 12.000 rpm

selama 10 menit

pemekatan DNA dengan etanol absolut

pelet diresuspensi dengan etanol 70%

disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 2 menit

dan dikeringkan selama 5 menit

DNA kering dilarutkan dengan 50 µL bufer TE

21

Lampiran 7 Bahan-bahan pembuatan media

Media Komposisi

LB 5 g/l bacto yeast extract, 10 g/l bacto tripton, 5 g/l NaCl, dibuat

pH 7.5; untuk media padat + 15 g/l bacto agar

Makro

elemen

0.65 mg/l NH4NO3, 1.9 mg/l KNO3, 0.37 mg/l MgSO4.7H2O,

0.17 mg/l KH2PO4, 0.44 mg/l CaCL2.2H2O)

Mikro

elemen

0.8 mg/l KI, 6.2 mg/l H3BO3, 22.3 mg/l MnSO2.4H2O, 8.6 mg/l

ZnSO4.7H2O, 0.25 mg/l Na2MoO4.2H2O, 0.025 mg/l

CuSO4.5H2O, 0.025 mg/l CoCl2.6H2O

IK3 50 ml/l Makro elemen, 2 ml/l Mikro elemen, EDTA 36.7 mg/l,

Thiamin HCL 0.5 mg/l, 30 g/l sukrosa, 2.5 mg/l 2.4-D,

Myoinositol 0.1 g/l, Phytagel 3.75 g/l

Ko-kultivasi media IK3 + 100 uM acetosyringone, pH 5,2

Seleksi I IK3 + 250 mg/l cefotaxime, 50 mg/l higromisin, 60 mg/l

timentin, pH5,8

Seleksi II IK3 + 50 mg/l cefotaxime, 50 mg/l higromisin, 50 mg/l timentin,

pH 5,8

Regenerasi

R3B

IK3 + hormon 0.5 mg/l, IAA 0.3 mg/l BAP

MS 50 ml/l Makro elemen, 2 ml/l Mikro elemen, EDTA 36.7 mg/l,

Vitamin, AA (pyridoxine-HCl 0.5 mg/l, thiamin HCl 0.1 mg/l,

nicotinic acid 0.5 mg/l, glycine 3 mg/l), 30 g/l sukrosa, 0.1 g/l

myoinositol, 3.75 g/l phytagel

AAM pH

5,2

Makro elemen I AA, Makro elemen II AA, 2 ml/l Mikro elemen

LS, EDTA 36.7 mg/l, Asam amino (L-glutamine 877 mg/l, L-

asparagine 266 mg/l, l-arginin 228 mg/l, l-glycine 75 mg/l),

Pyridoxine-HCl 1 mg/l, Thiamin HCL 0.6 mg/l, Nicotinic acid

0.5 mg/l, Hormon 2.4-D 0.5 mg/l, 30 g.l sukrosa, 100 uM

acetosyringone