titrasi formal

Laporan Praktikum Biokimia

LAPORAN TETAP PRAKTIKUM BIOKIMIA

I. NOMOR PERCOBAAN : IV (EMPAT)

II. NAMA PERCOBAAN : TITRASI FORMAL ASAM AMINO

III. TUJUAN : Untuk Mempelajari cara kerja (aktivitas)

enzim pada asam amino melalui titrasi

formaldehid

IV. DASAR TEORI

Suatu reaksi kimia, khususnya antara senyawa organik, yang dilakukan dalam

laboratorium memerlukan kondisi yang ditentukan oleh beberapa faktor seperti suhu,

tekanan, waktu dan lain-lain. Apabila salah satu kondisi tidak sesuai dengan apa yang

seharusnya dibutuhkan maka reaksi tidak dapat berlangsung dengan baik. Tubuh kita

merupakan laboratorium yang sangat rumit, sebab didalamnya terjadi reaksi kimia

yang beraneka ragam. Reaksi atau proses kimia yang berlangsung dengan baik dalam

atubuh kita ini dimungkinkan karena adanya katalis, yang disebut dengan enzim.

Suatu enzim bekerja secara khas terhadap suatu subtrat tertentu. Kekhasan

inilah ciri suatu enzim. Ini sangat berbeda dengan katalis (bukan enzim) yang dapat

bekerja terhadap berbagai macam reaksi. Enzim urease hanya bekerja terhadap urea

sebagai subtratnya. Ada juga enzim yang bekerja terhadap lebih dari satu subtrat

namun enzim tersebut tetap mempunyai kekhasan tertentu.

Enzim-enzim memperlihatkan semua sifat-sifat Protein

Semua enzim murni yang telah diamati sampai saat ini adalah protein ; aktivitas

katalitiknya bergantung kepada integritas strukturnya sebagai protein. Sebagai

contoh, jika suatu enzim didihkan dengan asam kuat atau diinkunbasi dengan tripsin,

yaitu perlakuan yang memotong rantai polipeptida, aktivitas katalitiknya biasanya

akan hancur; hal ini memperlihatkan bahwa struktur kerangka primer protein enzim

dibutuhkan untuk aktivitasnya. Selanjutnya, jika kita mengubah berlipatnya rantai

protein yang khas dari suatu protein enzim utuh oleh panas, oleh perlakuan pH yang

jauh menyimpang dari keadaan normal, atau oleh perlakuan dengan senyawa perusak

lainnya, aktivitas enzim penting bagi aktivitas katalitiknya.

1Rusmala Dewi(06101410024)


Enzim, seperti protein lain, mempunyai berat molekul yang berkisar dari kira-

kira 12.000 sampai lebih dari 1 juta. Oleh karena itu, enzim berukuran amat besar

dibandingkan dengan subtrat atau gugus fungsional targetnya. Beberapa enzim hanya

terdiri dari polipeptida dan tidak mengandung gugus kimiawi selain residu asam

amino.

Fungsi dan Cara Kerja Enzim

Fungsi suatu enzim adalah sebagai katalis untuk proses biokimia yang terjadi

dalam sel maupun diluar sel. Suatu enzim dapat mempercepat reaksi 108 sampai 1011

kali lebih cepat daripada apabila reaksi tersebut dilakukan tanpa katalis. Jadi enzim

dapat berfungsi sebagai katalis yang sangat efisien, disamping itu mempunyai derajat

kekhasan yang tinggi. Seperti juga katalis lainnya, maka enzim dapat menurunkan

energi aktivasi suatu reaksi kimia. Reaksi kimia ada yang membutuhkan energi

(reaksi endergonik) dan ada pula yang menghasilkan energi atau mengeluarkan energi

(eksergonik).Cara kerja enzim dapat dimisalkan sebagai berikut :

Misalkan pembentukan ikatan antara senyawa A dengan senyawa B menjadi senyawa

AB akan mengeluarkan energi. Terjadinya senyawa AB dari A dan B membutuhkan

energi sebesar p, yaitu selisih energi antara A dan B dengan AB. Sebaliknya,

penguraian senyawa AB menjadi A dan B mengeluarkan energi sebesar p pula.

Enzim adalah katalisator sejati, molekul ini meningkatkan dengan nyata

kecepatan reaksi kimia spesifik yang tanpa enzim akan berlangsung amat lambat.

Enzim tidak dapat mengubah titik kesetimbangan reaksi yang dikatalisisnya: enzim

juga tidak akan habis dipakai atau diubah secara permanen oleh reaksi-reaksi ini.

Enzim meningkatkan kecepatan reaksi kimia dengan cara menurunkan energi

aktivasinya. Energi aktivasi tersebut adalah jumlah energi dalam kalori yang

diperlukan untuk membawa semua molekul pada 1 mol senyawa pada suhu tertentu

menuju tingkat transisi pada puncak batas energi. Kecepatan setiap reaksi kimia

sebanding dengan konsentrasi senyawa pada keadaan transisi.

Terdapat dua cara umum untuk meningkatkan kecepatan reaksi kimia, yaitu

dengan cara meningkatkan suhu, yang mempercepat gerak termal molekul, dan

karenanya meningkatkan bagian (fraksi) molekul yang memiliki energi dalam,



dengan jumlah yang cukup untuk memasuki keadaan transisi yaitu energi dimana

reaksi mencapai titik puncaknya. Cara kedua yaitu dengan menambahkan katalisator.

Katalisator ini akan mempercepat reaksi kimia dengan menurunkan batas penghalang

energi.

Faktor- Faktor yang Mempengaruhi Kerja Enzim

a.Konsentrasi Enzim

Seperti katalis lain, kecepatan suatu reaksi yang menggunakan enzim

tergantung pada konsentrasi enzim tersebut. Pada suatu konsentrasi subtrat tertentu,

kecepatan reaksi bertambah dengan bertambahnya konsentrasi enzim.

b.Konsentrasi Subtrat

Hasil eksperimen menunjukkan bahwa dengan konsentrasi enzim yang tetap,

maka pertambahan konsentrasi subtrat akan menaikkan kecepatan reaksi. Akan tetapi

pada batas konsentrasi tertentu, tidak terjadi kenaikan kecepatan reaksi walaupun

konsentrasi subtrat diperbesar. Keadaan ini diterangkan oleh Michaelis-Menten

dengan hipotesis mereka tentang terjadinya kompleks enzim subtrat yang dikenal

dengan Michaelis-Menten.

c.Suhu

Oleh karena reaksi kimia dapat dipengaruhi oleh suhu, maka reaksi yang

menggunakan katalis enzim yang dapat dipengaruhi oleh suhu. Pada suhu rendah

reaksi kimia berlangsung lambat, sedangkan pada suhu yang lebih tinggi reaksi akan

berlangsung lebih cepat.

Disamping itu, karena enzim itu adalah suatu protein, maka kenaikan suhu

dapat menyebabkan terjadinya proses denaturasi. Apabila terjadi proses denaturasi,

maka bagian aktif enzim akan terganggu dan dengan demikian konsentrasi efektif

enzim menjadi berkurang dan kecepatan reaksinya pun akan menurun.

Kenaikan suhu sebelum terjadinya proses denaturasi dapat menaikkan

kecepatan reaksi. Koefisien suhu suatu reaksi diartikan sebagai kenaikan kecepatan

reaksi sebagai akibat kenaikan suhu 10oC.

d.Pengaruh pH



Seperti protein pada umumnya, struktur ion enzim tergantung pada pH

lingkungannya. Enzim dapat berbentuk ion positif, ion negatif atau ion bermuatan

ganda (zwitter ion). Dengan demikian perubahan pH lingkungan akan berpengaruh

terhadap efektivitas bagian aktif enzim dalam membentuk kompleks enzim subtrat.

e.Pengaruh Inhibitor

Terdiri dari hambatan reversibel, hambatan tak reversibel, dan hambatan

Alosterik.

1. Hambatan Reversibel, dibagi menjadi dua, yaitu

a. Hambatan Bersaing, disebabkan karena adanya molekul yang nirip

dengan subtrat, yang dapat pula membentuk kompleks, yaitu kompleks

enzim inhibitor (EI).

b. Hambatan tak Bersaing, tidak dipengaruhi oleh besarnya konsentrasi

subtrat dan inhibitor yang melakukannya sebagai inhibitor tidak

bersaing.

2. Hambatan Tak Reversibel, terjadi karena inhibitor bereaksi tidak reversibel

dengan bagian tertentu pada enzim, sehingga mengakibatkan berubahnya

bentuk enzim.

3. Hambatan Alosterik

Hambatan alosterik ini menyebabkan hubungan kecepatan reaksi dengan

konsentrasi subtratnya membentuk grafik tidak berbentuk hiperbola

melainkan berbentuk sigmoida seperti yang diterangkan oleh persamaan

Michaelis-Menten.

Persamaan Michaelis – Menten

Pada tahun 1913, Leonor Michaelis dan Maude Menten mengajukan hipotesa

bahwa dalam reaksi enzim terjadi lebih dahulu kompleks enzim-subtrat yang

kemudian menghasilkan hasil reaksi dan enzim kembali. Michaelis – Menten

berkesimpulan bahwa kecepatan reaksi tergantung pada konsentrasi kompleks enzim-

subtrat (ES), maka penambahan konsentrasi subtrat akan menghasilkan pertambahan

kecepatan reaksi yang apabila digambarkan akan merupakan garis lurus dengan

persamaan umum, reaksi enzim dituliskan sebagai berikut :



E + S ES E + P

V. ALAT DAN BAHAN

1. ALAT

1. Pipet tetes

2. Gelas ukur

3. Beker gelas

4. Corong

5. Biuret

6. Statif

7. Klem

8. Erlenmeyer

9. pH meter

2. BAHAN:

1. Larutan NaOH 0,2M

2. Larutan NaOH 0,02M

3. Larutan HCl 0,1 M

4. Larutan gelatin 5%

5. Indikator PP

6. Larutan tripsin

7. Larutan formaldehid 40 %

dinetralkan dengan alkali

VI. PROSEDUR PERCOBAAN

Siapkan 100 ml larutan gelatin 5%. Atur temperatur 38oC. Tambahkan

kedalamnya 1 ml phenolpthalein dan 0,2 M NaOH tetes demi etets sampai warna

merah muda timbul. Tambahkan 0,1 M HCl tetes demi tetes sampai tepat warna

merah muda tadi hilang (pH = 8,0). Hati-hati jangan terlalu asam. Masukkan gelatin

yang telah dinetralisir tadi kedalam inkubator 38oC. Pada 25 ml larutan tripsin

tambahkan beberapa tetes phenolpthalein. Tambahkan tetes demi tetes 0,2 M NaOH

sampai warna merah muda. Kemudian teteskan 0,1 M HCl sampai warna tersebut

tepat hilang (pH = 8,0). Tepat pada jam “NOL” tambahkan larutan tripsin tersebut ke

dalam larutan gelatin. Aduk! Setelah tercampur rata, ambil 10 ml campuran,

masukkan ke dalam 100 ml beker gelas. Didihkan untuk merusak enzimnya. Catat

waktunya! Dinginkan. Tambahkan 15 ml formalin netral dan 3 tetes phenolpthalein.

Pada interval 15 menit lakukan hal yang sama seperti di atas (seperti kontrol). Semua

dilakukan duplo. Pada masing-masing hasil reaksi di atas pada interval 0, 15, 30, 60,



90, dan 120 menit dan dititrasi dengan NaOH 0,02 M hingga titik akhir berwarna

merah muda.

VII. HASIL PENGAMATAN

Prosedur percobaan Hasil Pengamatan

Gelatin

110 ml gelatin (kuning bening)

inkubasi (38o) + 1 ml indicator PP

(bening) + NaOH (bening) →

larutan merah muda + HCL

(bening) → larutan bening. pH =

7,8.

Setelah larutan gelatine diinkubasi,

gelatine ditambahkan dengan 1 ml

PP, kemudian dititrasi dengan 74

tetes NaOH → larutan menjadi

merah muda. Kemudian dititrasi

kembali dengan 21 tetes HCL →

Larutan bening. Diukur pH = 7,8.

10 ml gelatine (bening) dididihkan,

kemudian didinginkan. Setelah

dingin + 15ml formaldehid

(bening) + 3 tetes PP (bening) +

NaOH (bening).

Setelah gelatine dicampur dengan

formaldehid + 3 tetes indicator PP

→ larutan bening. Kemudian

dititrasi dengan 8,2 ml NaOH →

larutan merah muda.

Tripsin

35 ml tripsin (kuning bening) + 1

ml indicator PP + NaOH (bening)

→ larutan merah muda, + HCL

(bening). Cek pH = 7,74

Setelah tripsin dicampur dengan

indicator PP → larutan menjadi

kuning bening. Kemudian dititrasi

dengan 70 tetes NaOH → larutan

menjadi merah muda. Kemudian

dititrasi lagi dengan 34 tetes HCL

→ larutan bening. Diukur pH = 7,74

10 ml tripsin (kuning bening)

dididihkan, kemudian didinginkan.

Setelah tripsin dicampur dengan

formaldehid + 3 tetes indicator PP



Setelah dingin + 15ml formaldehid

(bening) + 3 tetes PP (bening) +

NaOH (bening).

→ larutan bening. Kemudian

dititrasi dengan 16,3 ml NaOH →

larutan merah muda.

Setelah itu 100 ml gelatin diinkubasi 38o, kemudian gelatin tersebut

dicampurkan dengan tripsin 25 ml. Larutan yang telah dicampurkan ini diambil

10 ml + dipanaskan hingga mendidih. Lalu didinginkan dan ditambahkan 15 ml

formaldehida, 3 tetes PP kemudian dititrasi dengan NaOH 0,02M hingga titik

akhir titrasi. Campuran gelatin+tripsin ini disebut dengan campuran t = 0 menit.

Lakukan hal yang sama hingga t = 120 menit

Sampel Waktu (t) dalam menit Volume NaOH (ml)

t0 (gelatin) 0 menit 8,2 ml

t0 (tripsin) 0 menit 16,3 ml

t0 0 menit 6,8 ml

t1 15 menit 7 ml

t2 30 menit 8 ml

t3 60 menit 8,8 ml

t4 90 menit 9,8 ml

t5 120 menit 10,2 ml

VIII. ANALISA DATA

a. Kurva titrasi antara volume alkali (ordinat) terhadap waktu (absis).

dimana :

Waktu = X

Volume NaOH = Y

X 0 15 30 60 90 120

Y 6,8 7 8 8,8 9,8 10,2



b. Hubungan antara waktu terhadap volume rata-rata dalam persamaan regresi

linier.

Nomor X Y XY X2

1 0 6,8 0 0

2 15 7 105 225

3 30 8 240 900

4 60 8,8 528 3600

5 90 9,8 882 8100

6 120 10,2 1224 14400

Jumlah ∑X = 315 ∑Y = 50,6 ∑XY = 2979 ∑X2 = 27225



Maka diperoleh persamaan regresi linier :

Y = AX+B

Sehingga Y = 0,030175X + 6,84912

X 1 2 3 4 5

Y 6,879295 6,90227 6,932445 6,96262 6,999995



c. Data untuk mencari persamaanregresi linier, jika 1 ml NaOH 0,1 N = 1,4 mg

nitrogen asam amino.

Nomor X Y XY X2

1 0 9,52 0 0

2 15 9,8 147 225

3 30 11,2 336 900

4 60 12,32 739,2 3600

5 90 13,72 1234,8 8100

6 120 14,28 1713,6 14400

Jumlah ∑X = 315 ∑Y = 70,84 ∑XY = 4170,6 ∑X2 = 27225



Maka diperoleh persamaan regresi linier :

Y = AX + B

Y = 0,04224X + 9,5887

X 0 15 30 60 90 120

Y 9,5887 10,2223 10,8559 12,1231 13,3903 14,65767

IX. REAKSI



X. PEMBAHASAN

Dalam percobaan kali ini dimana percobaan dimana percobaan mengenai

titrasi formal asam amino yang bertujuan untuk mengetahui serta memperlajari

aktivitas dari enzim dan apa saja yang dapat mempengaruhi aktivitas kerja enzim itu

sendiri. Percobaan ini menggunakan beberapa larutan yang terlebih dahulu

dipersiapkan dengan teliti oleh praktikan, dimana dalam percobaan ini digunakan

larutan gelatin sebagai salah satu larutan yang terlebih dahulu diberikan perlaku,

dimana sebelum melakukan percobaan larutan gelatine di reaksikan dengan larutan

NaOH dengan penambahan indikator beberapa tetes hingga menghasilkan warna

merah muda dan selanjutnya sebelum larutan gelatin ini di inkubasi larutan ini

ditambahkan terlebih dahulu dengan larutan HCl hingga warna merah muda

sebelumnya tadi menghilang.



Proses inkubasi ini terlebih dahulu diberikan pada larutan gelatin hingga

mencapai suhu 38oC. Perlu adanya perhatian khusus pada saat proses inkubasi larutan

gelatin ini dimana suhunya harus dijaga konstan jangan sampai naik, karena bila

suhunya mencapai lebih dari 50oC ptotein akan terdenaturasi. Sehingga akan merusak

struktur dari protein itu sendiri. Selanjutnya dalam percobaan ini yang bertindak

sebagai enzim adalah tripsin, yaitu enzim yang terdapat dalam tubuh kita yang dalam

hal ini digunakan air kencing. Perlakuan selanjutnya yang diberikan kepada larutan

gelatin yakni, gelatin ditambahkan dengan tripsin. Hal ini mengidentifikasikan bahwa

kita melakukan pemotongan pada rantai polipeptida pada protein. Sama halnya

seperti pada gelatin sebelumnya tadi, maka tripsin pun harus diinkubasi pada suhu

38oC, hal ini dimaksudkan agar enzim tripsin dapat bekerja secara optimum pada

suhu tersebut.

Larutan protein yang diinkubasi akan membutuhkan NaOH dengan jumlah

yang sama banyak baik dalam selang waktu yang berbeda jika dilakukan penitrasian.

Hal ini memberikan arti bahwa tidak ada hubungannya antara selang waktu dan

jumlah NaOH yang dibutuhkan pada saat proses titrasi. Pada kenyataannya setelah

dilakukan pengamatan melalui percobaan secara langsung ini, hasil pengamatan yang

didapat menjunjukkan semakin lama waktu yang digunakan maka jumlah larutan

NaOH yang dibutuhkan semakin banyak.Hal ini juga karena mengikuti prinsip

menten. Analisa kualitatif dalam percobaan akan sulit didapatkan dengan sempurna

apabila kurangnya ketelitian, ketelitian dalam pembuatan larutan, penitrasian,

pengadukan, pemanasan, serta penjagaan suhu agar tetap konstan pun harus sangat

diperhatikan sehingga akan didapatkannya hasil pengamatan yang benar-benar akurat.

Penitrasian dengan NaOH pada larutan protein yang ditambahkan dengan

tripsin dimaksudkan untuk melihat kecepatan reaksi yang terjadi berdasarkan volume

NaOH yang digunakan. Larutan protein bertindak sebagai subtratnya. Jadi, kecepatan

reaksi tergantung dengan konsentrasi gelatinnya. Namun bila enzim tripsin seolah-

olah “jenuh” dengan subtrat, artinya enzim tidak dapat lagi menampung gelatin.

Berdasarkan literatur, seharusnya kecepatan reaksi pada tripsin-gelatin,

tergantung pada konsentrasi tripsin-gelatin pula. Sebab apabila tergantung pada



konsentrasi gelatin saja, maka penambahan konsentrasi subtrat akan menghasilkan

pertambahan kecepatan reaksi yang apabila digambarkan akan merupakan garis lurus.

Oleh karena itu , reaksi kimia dipengaruhi oleh suhu, sebagian enzim akan

terdenaturasi pada suhu di atas 60oC, maka reaksi antara gelatin-tripsin juga

dipengaruhi oleh suhu pada waktu melakukan inkubasi. Kenaikan suhu sebelum

terjadinya proses denaturasi (atau pada saat suhu 38oC) maka akan dapat

menaikkan kecepatan reaksi.



IX. Kesimpulan

1. Lama waktu inkubasi atau kerja antara enzim dan substrat dalam percobaan

ini mempengaruhi jumlah asam amino yang dihasilkan sekama substrat

masih tersedia.

2. Penambahan NaOH dan HCl sekaligus untuk melihat titik ekuivalen dari

larutan yang digunakan dalam hal ini gelatin dan tripsin.

3. Pemanasan dalam inkubator 38 oC untuk menjaga agar enzim yang bekerja

dalam protein akan bekerja secara stabil.

4. Kecepatan reaksi gelatin-tripsin juga dipengaruhi oleh suhu. Kenaikan suhu

sebelum tripsin terdenaturasi maka akan menaikkan kecepatan reaksi

5. Titrasi formalin hanya tepat untuk menunjukkan atau menentukan suatu

proses terjadinya pemecahan protein tetapi kurang tepat untuk penemuan

protein

6. Gugus NH3+ adalah produk asam amino hasil reaksi antara tripsin dan

gelatin dimana reaksi enzimatik ini terjadi secara optimum pada suhu 38oC.

7. Penambahan formaldehid agar adanya reaksi dengan gugusan amino yang

tak bermuatan hingga memungkinkan gugusanm ammonium buffer

didaerah pH yang lebih rendah dan dapat dititrasi pada titik akhir dengan

indicator PP.

8. Suatu protein dapat ditentukan kadarnya secara kuantitatis melalui metoda

titrasi formal yang didasarkan pada reaksi asam basa antara penitrasi

(dalam hal ini NaOH)



XI. DAFTAR PUSTAKA

Arbianto, Purwo. 1993. Biokimia Konsep-Konsep Dasar. Bandung:ITB

Lehninger, Albert, 1992, Dasar-dasar Biokimia Jilid 1, Erlangga: Jakarta.

Fessenden dan Fessenden, 1999, Kimia Organik Edisi ketiga Jilid 2, Erlangga: Jakarta.

Pudjiadi, Anna. 1994. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta:Universitas Indonesia

Sukaryawan, Made. 2013. Petunjuk Praktikum Biokimia. Universitas Sriwijaya:Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan.

Wirahadikusumah, Muhammad, 1985, Biokimia, Penerbit ITB: Bandung.



XII. GAMBAR ALAT

1. pipet tetes

2. gelas ukur

3. beker gelas

5. Corong

6. Biuret

7. Statif dan klem

8. Erlenmeyer



X. Pertanyaan dan Jawaban

1. Buatlah kurva titrasi antara volum alkali (ordinat) terhadap waktu (absis)!

Jawaban:

Kurva terlampir....

2. Buat kurva antara mg nitrogen asam amino (ordinat) terhadap waktu (absis)!

Jawaban :

Kurva terlampir.....

3. Mengapa harus ditambahkan alkali pada formalin sampai merah muda dan

Phenolphtalein?

Jawaban:

Karena dengan ditambahkan alkali pada formalin maka akan terbentuk

dimethiol dan dengan terbentuknya dimethiol ini berarti gugus anionnya

sudah terikat, sehingga tidak akan mempengaruhi reaksi antara asam dengan

basa (NaOH) dan titik akhir titrasi dapat ditentukan dengan tepat.

Penambahan phenolphtalein berguna untuk melihat titik akhir titrasi tersebut,

yaitu dapat terlihatnya jika terjadi perubahan warna.

4. Apa tujuan melakukan titrasi formal ini ?

Jawaban :

Tujuan melakukan titrasi formal ini adalah untuk mempelajari aktivitas enzim

dan apa saja yang dapat mempengaruhi aktivitas dari enzim tersebut.


titrasi formal

Documents