BIDANG ILMU :

BIOTEKNOLOGI PERTANIAN DAN PERKEBUNAN

LAPORAN TAHUNAN

PENELITIAN HIBAH BERSAING

Menciptakan Kultivar Baru Anggrek

Vanda tricolor Lindl. var. suavis forma Bali yang Cepat Berbunga

melalui Rekayasa Genetika

Tahun ke 3 dari rencana 3 tahun

TIM PENGUSUL

Dr. Ir. Rindang Dwiyani, MSc. (NIDN : 0007056203)

Ir. Hestin Yuswanti, M.P. (NIDN: 0015035904)

Ida Ayu Putri Darmawati, S.P., M.Si.(NIDN: 0015097110 )

UNIVERSITAS UDAYANA

NOVEMBER 2015

2

3

RINGKASAN

Anggrek merupakan salah satu komodititas hortikultura unggulan yang ditetapkan

pemerintah Indonesia untuk dikembangkan sejak tahun 2007. Salah Satu anggrek alam

Indonesia yang berasal dari Bali adalah Vanda tricolor Lindl. var suavis forma Bali.

Permasalahan utama dalam budidaya anggrek, khususnya genus Vanda adalah masa vegetatif

yang panjang, sehingga membutuhkan waktu yang relatif lama untuk mencapai masa

berbunga. Tujuan dari penelitian ini adalah menciptakan kultivar baru tanaman anggrek V.

tricolor forma Bali yang memiliki kemampuan berbunga lebih cepat .

Penelitian ini dilaksanakan dalam 3 tahap. Dari tahun ke 2 penelitian sudah diperoleh

2 kandidat transgenik secara in vitro, namun secara in planta belum diperoleh kandidat

transgenik. Hal ini disebabkan karena buah anggrek hasil transformasi in planta baru bisa

dipanen dan ditabur bijinya pada umur 7 bulan setelah selfing (29 April 2015). Buah ini

merupakan hasil selfing dimana polen sudah direndam dengan Agrobacterium tumefaciens

yang membawa gen pembungaan PaFT. Transformasi in planta ini dilakukan secara faktorial

dengan dua faktor. Faktor pertama yaitu lama perendaman polen dengan suspensi

Agrobacterium (1 dan 2 jam). Faktor kedua yaitu pemberian Asetosyringone (AS), tanpa AS

dan dengan 25 ppm AS, diperoleh empat macam perlakuan dan diulang tiga kali, sehingga

dilakukan 12 kali selfing untuk mendapatkan 12 buah (kapsul) anggrek.

Pada tahun ketiga dilakukan pekerjaan sebagai berikut: penaburan biji hasil

transformasi in planta; seleksi awal untuk mendapatkan kandidat transgenik in planta; isolasi

DNA; dan PCR dengan primer spesifik kandidat transgenik (baik yang dihasilkan secara in

vitro maupun in planta) untuk mendapatkan tanaman transgenik V. tricolor yang membawa

gen PaFT.

Hasil penelitian tahun ketiga diperoleh bahwa lama perendaman polen selama 2 jam

dengan pemberian 25 ppm AS menghasilkan persentase kandidat tertinggi melalui seleksi

awal dengan 10 ppm higromisin. Dari 5 kandidat transforman yang di PCR dengan primer

Ubiquitin (forward: 5'-TTGTCGATGCTCACCCTG-3 ') dan TNos (reverse: 5'-

GATCTAGTAACATAGAT GACACCGCG-3'), 4 diantaranya mengamplifikasi 1.1kb (1100

bp) yang keseluruhannya adalah hasil transformasi in planta. Hasil ini menyimpulkan bahwa

metode in planta yang digunakan dalam penelitian ini dapat digunakan sebagai metode insersi

gen pada tanaman anggrek.

4

PRAKATA

Puji syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa kami panjatkan atas selesainya rangkaian

penelitian panjang yang kami kerjakan pada anggrek Vanda tricolor Lindl. Spesies anggrek

ini merupakan kekayaan plasma nutfah Indonesia yang layak mendapat perhatian dari kita

semua, termasuk para peneliti di perguruan tinggi.

Untuk itu kami haturkan terimakasih yang tak berhingga kepada Kementerian Riset

Teknologi dan Pendidikan Tinggi melalui Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi dan LPPM

Universitas Udayana yang telah berkenan membiayai penelitian kami.

Hasil penelitian tahap tiga ini memberikan harapan besar untuk kemajuan ilmu

pengetahuan untuk metode transformasi in planta yang dilakukan karena merupakan sesuatu

yang baru (inovatif). Di akhir tahun ketiga telah diperoleh tanaman transgenik anggrek

Vanda tricolor yang mengoverekspresikan gen pembungaan. Diharapkan tanaman ini mampu

berbunga lebih cepat.

Mudah-mudahan apa yang kami peroleh dapat bermanfaat khususnya untuk kemajuan

ilmu pengetahuan dan dapat diadopsi oleh para peneliti lain di Indonesia. Mudah-mudahan

Tuhan Yang Maha Esa senantiasa meridhoi pekerjaan kami.

Denpasar, 02-11- 2015

Tim Peneliti

5

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN SAMPUL 1

HALAMAN PENGESAHAN 2

RINGKASAN 3

PRAKATA 4

DAFTAR ISI 5

DAFTAR TABEL 6

DAFTAR GAMBAR 7

BAB 1. PENDAHULUAN 8

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA 9

BAB 3. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN 11

BAB 4. METODE PENELITIAN 11

BAB 5. HASIL YANG SUDAH DICAPAI 13

BAB 6. LUARAN YANG SUDAH DICAPAI 19

BAB 7. KESIMPULAN DAN SARAN 20

DAFTAR PUSTAKA 20

6

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1. Hasil Pengamatan Uji Higromisin 14

Tabel 2. Hasil Seleksi Awal Transforman dengan vektor yang membawa gen

PaFT dan gen hpt 15

Tabel 3. Hasil Seleksi Awal Transforman dengan vektor yang membawa hanya gen

hpt 15

7

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Buah hasil transformasi in planta pada tahap 2 yang ditanam tahap 3 13

Gambar 2. Biji anggrek hasil transformasi in planta setelah ditanam 14

Gambar 3. Hasil seleksi awal transforman PGA102 dengan 5ppm higromisin 16

Gambar 4. Hasil seleksi awal transforman PGA 102 dengan 15 ppm higromisin 17

Gambar 5. Hasil seleksi awal transforman PGA 3426 pada 15 ppm higromisin 18

Gambar 6. Hasil Elektroforesis 19

8

BAB 1. PENDAHULUAN

Anggrek merupakan salah satu komoditas hortikultura unggulan RI dan ditetapkan

sebagai komoditas yang memiliki prospek untuk dikembangkan (Departemen Pertanian RI,

2007). Di dunia terdapat lebih dari 30 000 spesies anggrek alam (Banks, 1999), 5000 spesies

di antaranya terdapat di Indonesia (Irawati, 2002).

Bali merupakan salah satu daerah di Indonesia dimana usaha tanaman hias

berkembang pesat. Pengembangan florikultura di Bali diperlukan tidak hanya untuk

menunjang Bali sebagai daerah tujuan wisata, namun hal ini juga akan berdampak terhadap

peningkatan ilmu pengetahuan dan income para petani, khususnya petani tanaman hias.

Vanda tricolor Lindl. var. suavis forma Bali adalah anggrek alam pulau Bali, salah

satu sumber kekayaan hayati pulau Bali yang perlu mendapat perhatian kita semua. Spesies

ini merupakan induk persilangan dari anggrek Vanda hibrida yang yang diperjualbelikan

secara komersial saat ini dan dengan harga yang relatif tinggi..

Dwiyani (2012) menndapatkan bahwa forma Bali memiliki karakter spesifik

dibandingkan forma Merapi dan forma Jawa Barat, yakni ukuran bunga dan buah yang lebih

besar serta totol-totol dan labelum yang berwarna ungu kemerahan, sementara forma Merapi

berwarna ungu dan forma Jawa Barat berwarna coklat. Lestari (2010) melaporkan bahwa

forma Bali memiliki tingkat keharuman bunga yang lebih tinggi dibanding forma Merapi.

Salah satu permasalahan dalam budidaya anggrek, khususnya genus Vanda, adalah

masa vegetatif yang panjang, sehingga saat (waktu) pembungaan (flowering) membutuhkan

waktu yang relatif lama. Vanda tricolor Lindl. var. suavis membutuhkan waktu kurang lebih

5 tahun setelah disemai untuk menghasilkan bunga pertama kali, padahal sebagai tanaman

hias, bunga merupakan organ tanaman penting yang dinikmati nilai estetikanya.

Perbaikan sifat-sifat (karakter) tanaman dapat dilakukan secara konvensional melalui

plant breeding maupun secara lebih modern dengan rekayasa genetika. Penelitian ini

menggunakan rekayasa genetika untuk memperbaiki karakter pembungaan dari anggrek V.

tricolor Lindl. var. suavis forma Bali. Pada penelitian ini dilakukan overekspresi gen

pembungaan yaitu gen PaFT dengan „strong promoter‟ Ubiquitin. Gen PaFT adalah gen

ortholog dari FLOWERING LOCUS T (FT) yang diisolasi dari tanaman Platanus acerifolia

(Pa) (Zhang et al. 2011). Mercuriani (Komunikasi pribadi 2013) sudah berhasil melakukan

transformasi gen PaFT melalui Agrobacterium tumefaciens pada anggrek Phalaenopsis

amabilis, namun belum ada yang melaporkan untuk tanaman anggrek genus Vanda yang

memiliki masa juvenil sangat panjang, lebih panjang dari anggrek P. amabilis. Sementara itu,

9

promoter Ubiquitin dilaporkan memiliki tingkat ekspresi gen yang tinggi pada tanaman

monokotil (Christensen & Quail 1996), sehingga diharapkan tanaman anggrek V. tricolor

yang sudah disisipi gen PaFT ini nantinya mampu berbunga lebih cepat. Kultivar baru

anggrek V. tricolor Lidl. forma Bali yang dihasilkan melalui penelitian ini dapat dijadikan

tanaman induk untuk menghasilkan hibrida-hibrida baru genus Vanda yang berbunga lebih

cepat. Rhodora & Thomas (1996) menyatakan bahwa gen asing yang ada pada tanaman

transforman yang dihasilkan melalui transformasi dengan Agrobacterium diturunkan pada

progeninya. Mengingat Vanda hibrid memiliki nilai tinggi secara ekonomis, maka hasil

penelitian ini akan sangat bermanfaat bagi pengembangan agribisnis anggrek khususnya di

Indonesia.

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA

Transformasi tanaman dengan perantara A. tumefaciens merupakan metode yang

paling banyak digunakan untuk induksi gen asing ke dalam sel tanaman untuk selanjutnya

dihasilkan tanaman transgenik (Alimohamdi dan Bagherieh-Najjar, 2009).

Secara alamiah, A. tumefaciens menginokulasi bagian yang luka dari tanaman dikotil

dan menyebabkan terbentuknya tumor. Strain virulen dari A. tumefaciens memiliki plasmid

yang besar (> 200kb) disebut Ti (Tumor inducing) plasmid yang berperan dalam induksi

tumor. Selama inokulasi, suatu segmen DNA yang bersifat mobile dari Ti plasmid (disebut T-

DNA) ditransfer ke inti sel tanaman dan terintegrasi ke dalam genom tanaman (Zupan dan

Zambryski, 1995) dan 95% dari sel-sel tumor tersebut tertransformasi (Deeken et al., 2006).

Sifat alamiah A. tumefaciens dalam menginduksi tumor pada tanaman seperti tersebut di atas

kemudian dimanfaatkan dalam rekayasa genetika tumbuhan. Tiga hal penting yang

mendasari proses transfer T-DNA ke sel tanaman adalah sebagai berikut.

1. Pembentukan tumor, merupakan suatu proses transformasi yang dihasilkan dari transfer

dan integrasi T-DNA ke sel tanaman dan ekspresi gen-gen pada T-DNA.

2. Gen-gen pada T-DNA ditranskripsi hanya dalam sel tanaman dan tidak berperan selama

proses transfer.

3. Suatu DNA asing yang disisipkan diantara T-DNA border dapat ditransfer ke sel-sel

tanaman (Opabode 2006).

Pada tanaman anggrek, transformasi genetik dengan perantara A. tumefaciens sudah

berhasi dilakukan untuk anggrek Dendrobium nobile (Men et al., 2003), Phalaenopsis hibrida

(Chai et al., 2002); Mishiba et al., 2005), anggrek Cymbidium (Chin et al., 2007),

10

Phalaenopsis amabilis (Semiarti et al., 2007), Vanda hibrida ‟Tokyo Blue‟ (Shresta et al.,

2007) dan Vanda tricolor Lindl. (Dwiyani dkk., 2011). Transformasi genetik tersebut pada

tanaman anggrek dilakukan pada target transformasi berupa protocorm like bodies / plb yang

berasal dari sel somatik (Men et al., 2003; Chin et al., 2007; Shresta et al., 2007) serta

protocorm yang berasal dari biji (Mishiba et al., 2005; Semiarti et al., 2007; Dwiyani dkk.,

2011).

Penelitian ini menggunakan anggrek Vanda tricolor Lindl. var. suavis forma Bali

seperti yang dilakukan oleh Dwiyani dkk. (2012), akan tetapi menggunakan target

transformasi yang lebih bervariasi yakni protocorm dan plb. Sedangkan Dwiyani (2012)

hanya menggunakan protocorm sebagai target transformasi. Meskipun relatif lebih sulit untuk

menghasilkan plb (dari sel somatik) dibandingkan menghasilkan protocorm (dari biji), namun

diharapkan dengan target berupa plb, terjadinya chimera dapat dihindarkan. Selain itu,

seleksi transforman dalam penelitian ini menggunakan higromisin, sedangkan Dwiyani dkk.

(2011) menggunakan kanamisin sebagai agen penyeleksi transforman. Hasil seleksi

menggunakan kanamisin bersifat sangat bias, sehingga banyak ditemukan adanya tanaman

non-transforman diantara kandidat transforman yang dihasilkan (Dwiyani, 2012), sedangkan

menggunakan antibiotik higromisin hasilnya lebih akurat, karena jaringan tanaman umunnya

bersifat sensitif terhadap antibiotik higromisin. Penelitian ini juga menggunakan metode

transformasi in planta yang sangat spesifik untuk tanaman anggrek dan belum pernah

dilaporkan sebelumnya.

Pada penelitian ini dilakukan overekspresi gen pembungaan yaitu gen PaFT dengan

„strong promoter‟ Ubiquitin. Gen PaFT adalah gen ortholog dari FLOWERING LOCUS T

(FT) yang diisolasi dari tanaman Platanus acerifolia (Pa) (Zhang et al. 2011). Mercuriani

(Komunikasi pribadi 2013) sudah berhasil melakukan transformasi gen PaFT melalui

Agrobacterium tumefaciens pada anggrek Phalaenopsis amabilis, namun belum ada yang

melaporkan untuk tanaman anggrek genus Vanda yang memiliki masa juvenil sangat panjang,

lebih panjang dari anggrek P. amabilis.

11

BAB 3. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk menghasilkan kultivar baru anggrek V. tricolor Lindl.

var. suavis forma Bali yang memiliki kemampuan mencapai masa berbunga lebih cepat

melalui rekayasa genetika.

Tujuan penelitian tahap 3 adalah mendapatkan kandidat transgenik dari transformasi

in planta serta mendeteksi keberadaan gen pembungaan pada genom tanaman melalui analisis

PCR dengan primer spesifik untuk gen PaFT. Selanjutnya kandidat transforman yang positif

mengandung gen PaFT disebut transforman.

Manfaat Penelitian

Hasil penelitian ini berguna secara aplikatif karena kultivar baru anggrek yang

dihasilkan dapat dikembangkan untuk kepentingan agribisnis florikultura di pulau Bali.

Kultivar baru anggrek V. tricolor Lidl. forma Bali yang dihasilkan melalui penelitian ini dapat

dijadikan tanaman induk untuk menghasilkan hibrida-hibrida baru genus Vanda yang

berbunga lebih cepat. Rhodora dan Thomas (1996) menyatakan bahwa gen asing yang ada

pada tanaman transgenik yang dihasilkan melalui transformasi dengan Agrobacterium

diturunkan pada progeninya melalui Hukum Mendel.

Metode transformasi yang juga dihasilkan dari penelitian ini dapat memperkaya hasil-

hasil penelitian Universitas Udayana di bidang bioteknologi dan biomolekuler, sehingga

diharapkan dapat bersaing secara nasional maupun internasional dalam pengembangan

IPTEK. Tanaman transgenik yang dihasilkan pada tahap 3 ini dapat didaftarkan sebagai paten

karena sejauh ini penelitian mengenai tanaman transgenik Vanda tricolor Lindl. yang cepat

berbunga belum pernah dilaporkan. Metode transformasi in planta yang dilakukan dalam

penelitian ini juga belum pernah dilaporkan sebelumnya, sehingga juga berpotensi paten.

BAB 4. METODE PENELITIAN

PENELITIAN TAHAP 3

Pekerjaan yang sudah dan akan dilakukan pada penelitian tahap 3 adalah sebabagi berikut:

Panen Buah (kapsul) anggrek Hasil Penelitian Transformasi In planta Tahap 2

Transformasi in planta tahap 2 menghasilkan 12 buah anggrek Vanda tricolor

(merupakan 4 kombinasi perlakuan, 3 ulangan) dan 2 buah anggrek tanpa perlakuan. Buah-

12

buah tersebut bijinya layak ditabur pada umur 7 bulan setelah semai yakni tanggal

29/04/2015, dengan demikian panen dilakukan pada tanggal tersebut.

Penanaman Biji Anggrek Hasil Transformasi in planta

Buah anggrek hasil selfing yang berumur 7 bulan dipanen, disterilisasi baru kemudian

ditabur pada media MS (dengan konsentrasi 50%) yang ditambah 100 gram per liter tomat.

Sterilisasi terhadap material tanam dilakukan dengan tahapan sebagai berikut. Pertama buah

anggrek (yang akan ditabur bijinya) dicuci pada kucuran air kran sambil disikat (dengan sikat

gigi bersih) menggunakan detergen. Selanjutnya buah anggrek yang sudah bersih ini

dicelupkan dalam spiritus dan dibakar di atas lampu bunsen. Hal ini dilakukan sebanyak tiga

kali, baru kemudian dimasukkan ke dalam laminar. Di dalam laminar, buah anggrek tersebut

dipegang dengan pinset, dibakar sekali lagi baru kemudian dibelah. Selanjutnya biji-biji

anggrek ditanam pada media yang sudah disiapkan.

Uji Higromisin

Uji higromisin terhadap protokorm anggrek V. tricolor dilakukan dengan konsentrasi

higromisin 0 ppm (kontrol), 5 ppm, 10 ppm, 15 ppm dan 20 ppm. Diamati persentase

protokorm mati setiap minggu.

Seleksi Protokorm

Seleksi awal terhadap keberadaan gen PaFT dilakukan dengan menanam protokorm

yang berumur 8 minggu pada media higromisin. Protokorm yang tetap hijau pada media yang

mengandung higromisin disebut sebagai kandidat transforman, mengindikasikan bahwa gen

tersebut diduga terinsersi pada genom tanaman.

Konfirmasi transgen dengan PCR

Selanjutnya protokorm hijau tersebut ditumbuhkan hingga menjadi plantlet yang

memiliki 2 daun. Plantlet ini kemudian dambil satu daunnya untuk diisolasi DNA genomnya.

Selanjutnya di PCR dengan primer dengan primer Ubiquitin (forward: 5'-

TTGTCGATGCTCACCCTG-3 ') dan TNos (reverse: 5'-GATCTAGTAACATAGAT

13

GACACCGCG-3'). Dengan menggunakan primer ini maka harus dihasilkan 1100bp untuk

konfirmasi bahwa transgen benar-benar terinsersi.

BAB 5. HASIL YANG SUDAH DICAPAI

Panen Buah (Kapsul) Anggrek Hasil Transformasi In planta

Buah hasil transformasi in planta yang berumur 7 bulan setelah selfing dapat dilihat

pada Gambar 1. Buah-buah tersebut dipanen selama 3 hari berturut-turut. Ulangan satu

dipanen pada hari pertama dan hari selanjutnya berturut turut untuk ulangan 2 dan 3.

Gambar 1. Buah hasil transformasi in planta pada tahap 2 yang dipanen pada tahap 3

Penanaman Biji Anggrek Hasil Transformasi in planta

Biji anggrek yang berasal dari buah yang dipanen tersebut ditabur secara in vitro pada

media ½ MS yang mengandung 100 gram ekstrak tomat (Gambar 2).

14

Gambar 2. Biji anggrek hasil transformasi in planta setelah ditanam

Uji Higromisin terhadap protokorm kontrol (Wildtype)

Pengamatan setelah tanaman kontrol ditanam selama 4 minggu pada media MS yang

ditambah higromisin dapat dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1. Hasil Pengamatan Uji Higromisin

Konsentrasi Higromisin

(ppm)

Persentase Prokorm hijau (%)

Ulangan 1 Ulangan 2

0 100 87

5 20 60

10 60 10

15 14 12,5

20 0 0

Berdasarkan uji higromisin ini, maka digunakan konsentrasi higromisin 15 ppm untuk seleksi.

Seleksi Transforman

Hasil seleksi terhadap protokorm anggrek hasil transformasi in planta dapat dilihat

pada Tabel 2 (PGA 102) dan Tabel 3 (PGA 3426). PGA 102 adalah vektor yang membawa

gen PaFT, sedangkan PGA 3426 adalah hanya vektor tanpa gen PaFT. Namun kedua

konstruksi ini mengandung gen ketahanan terhadap higromisin (gen hpt) sehingga seleksi

awal tanaman juga dapat dilakukan dengan antibiotik higromisin.

15

Tabel 2 memperlihatkan bahwa perlakuan perendaman selama 2 jam pada suspensi

Agrobacterium yang ditambah 25 ppm asetosiringon (AS) memberikan hasil terbaik. Hasil

penelitian juga menunjukkan bahwa lamanya perendaman polen dengan suspensi

Agrobacterium sangat penting. Hasil penelitian ini membuktikan bahwa lamanya

perendaman polen pada suspensi Agrobacterium memberikan peran lebih penting

dibandingkan asetosiringon.

Tabel 2. Hasil seleksi awal transforman dengan vektor yang membawa gen PaFT dan gen hpt

Perlakuan Jumlah Prokorm hijau

Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3 Rata-rata

PGA 102 perendaman

dengan 25 ppm AS selama

1 jam

3 dari 38 =

7.89%

1 dari 33 =

3.03%

0 dari 32 =

0% 3.61%

PGA 102 perendaman

dengan 25 ppm AS selama

2 jam

11 dari 35 =

31.42%

3 dari 14 =

28.57%

3 dari 17 =

17.6% 25.86%

PGA 102 perendaman 0

ppm (tanpa AS) selama 2

jam

3 dari 20=

15%

0 dari 17=

0%

3 dari 19=

15.8% 10.27%

Tabel 3. Hasil seleksi awal transforman dengan vektor yang membawa hanya gen hpt

Perlakuan Jumlah Prokorm hijau

Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3 Rata-rata

PGA 3426 perendaman 0

ppm (tanpa AS) selama 1

jam

0 dari 15 =

0%

0 dari 15 =

0%

0 dari 15 =

0% 0%

PGA 3426 perendaman 0

ppm (tanpa AS) selama 2

jam

3 dari 17 =

20%

3 dari 15=

17.65%

3 dari 9 =

33.33% 23.66%

Tabel 3 menunjukkan bahwa meskipun tanpa asetosiringon namun dengan lama

perendaman 2 jam,tetap dihasilkan kandidat transforman, sementara pada perlakuan lama

perendaman 1 jam tidak dihasilkan kandidat transforman. Poin ini juga membuktikan bahwa

peran dari lama perendaman sangat penting.

16

Hasil Tabel 2 dan 3 ini membuktikan bahwa asetosiringon tetap dibutuhkan untuk

transfer gen pada anggrek V. tricolor, lama perendaman meningkatkan proses transformasi

sehingga dihasilkan lebih banyak kandidat transforman.

Gambar 3 dan 4 memperlihatkan hasil seleksi transforman PGA 102 dengan antibiotik

higromisin, yakni 5 ppm (Gambar 3) dan 15 ppm (Gambar 4). Dihasilkan lebih banyak

kandidat transforman dengan 5 ppm higromisin. Gambar 5 memperlihatkan hasil seleksi

transforman PGA 3426 pada 15 ppm higromisin. Protokorm hijau atau kandidat

transforman hanya didapat pada perlakuan perendaman polen selama 2 jam.

Pembuktian bahwa gen tersebut terintegrasi pada genom tanaman dilakukan dengan

analisis PCR yang akan dilakukan jika tanaman sudah memiliki minimal 2 daun. Berdasarkan

pengalaman penelitian sebelumnya, daun V. tricolor akan terbentuk pada 4 bulan setelah

semai.

Gambar 3. Hasil seleksi awal transforman PGA 102 dengan 5 ppm higromisin

PGA 102 +25 ppm AS

(perendaman 2 jam)

PGA 102 +25 ppm AS

(perendaman 1 jam)

17

Hasil sementara penelitian ini mendapatkan bahwa lamanya perendaman serta

asetosiringon dibutuhkan untuk transformasi in planta dengan metode yang dijelaskan dalam

penelitian ini. Tanaman umumnya tidak memiliki gen ketahanan terhadap antibiotik

higromisisn, sehingga kandidat transforman hasil seleksi menggunakan higromisin lebih

memberikan gambaran yang tidak bias jika dilakukan analisis PCR.

Gambar 4. Hasil seleksi awal transforman PGA 102 dengan 15 ppm higromisin

Protokorm PGA 102 perendaman

dengan distilled water selama 2 jam Protokorm PGA 102 perendaman dengan 25

ppm asetosiringon selama 2 jam

Protokorm PGA 102 perendaman dengan 25

ppm asetosiringon selama 1 jam Protokorm Kontrol (Wild type)

18

Gambar 5. Hasil seleksi awal transforman PGA 3426 pada 15 ppm higromisin

Hasil Konfirmasi transgen dengan PCR

Hasil konfirmasi transgen dilakukan menggunakan primer Ubiquitin (forward: 5'-

TTGTCGATGCTCACCCTG-3 ') dan TNos (reverse: 5'-GATCTAGTAACATAGAT

GACACCGCG-3'). Yang dicoba sebanyak 5 kandidat, karena baru 5 kandidat transforman

yang bisa diambil sampel daunnya untuk isolasi DNA, artinya baru 5 tanaman yang memiliki

daun 2 buah dan berukuran agak besar yang bisa diambil sampel daunnya.

Daun tersebut diisolasi DNA-nya dan di PCR dengan primer tersebut di atas

menggunakan metode yang tercantum dalam “Bahan dan Metode”. Hasil elektroforesis

menunjukkan bahwa 4 dari 5 tanaman yang dicoba, mengamplifikasi pita sepanjang 1100bp

(Gambar 6), mengindikasikan bahwa gen PaFT yang dikonstruksi bersama promoter

ubiquitin dan transminator Tnos terinsersi ke genom tanaman Vanda tricolor.

PGA 3426 perendaman

selama 2 jam PGA 3426 perendaman

selama 1 jam

19

Gambar 6. Hasil Elektroforesis M=Marka; 1,2,3,4,5 = sampel kandidat transforman V. tricolor; K=V.tricolor kontrol

BAB 6. LUARAN YANG SUDAH DICAPAI

Beberapa luaran yang sudah dihasilkan dari Penelitian Hibah Bersaing Dikti hingga

memasuki tahun 3 ini adalah sebagai berikut:

1. Jurnal nasional tidak terakreditasi (Jurnal Agrotropika vol 18 no 2, Juli-Desember 2013,

FP Unila)

2. Jurnal internasional terindexed Scopus (Agrivita Vol 37 no 2 tahun 2015).

3. Disampaikan secara oral pada Seminar Nasional PERHORTI di Malang tahun 2014.

4. Disampaikan secara oral pada Seminar 5th

International Conference on Bioscience and

Biotechnology (ICBB) di Denpasar tahun 2014.

5. Disampaikan sebagai poster presenter pada Seminar 6th

International Conference on

Bioscience and Biotechnology (ICBB) di Denpasar tahun 2015.

6. Disampaikan secara oral pada Seminar Senastek UNUD 2015

7. Buku ber-ISBN

M 1 2 3 4 5 K

500 bp

100 bp

1100bp

20

BAB 7. KESIMPULAN DAN SARAN

Kesimpulan hasil penelitian ini adalah sebagai berikut:

1. Pada transformasi In planta dengan Agrobacterium, lama perendaman polen selama 2 jam

dan penambahan asetosiringon 25 ppm pada suspensi Agrobacterium memberikan persentase

kandidat transforman tertinggi.

2. Hasil konfirmasi transgen dengan primer Ubiquitin (forward: 5'-

TTGTCGATGCTCACCCTG-3 ') dan TNos (reverse: 5'-GATCTAGTAACATAGAT

GACACCGCG-3'), menunjukkan bahwa transgen telah terinsersi pada genom tanaman.

DAFTAR PUSTAKA

Alimohammadi, M & Bagherih-Najjar, MB 2009, „Agrobacterium-mediated transformation

of plants : Basic principles and influencing factors‟, African J. Biotechnol., vol. 8,

no. 20, pp. 5142-5148.

Banks,D.P. 1999. Tropical Orchids of Indonesia. Periplus Edition (HK) Ltd, Singapore. 64p.

Chai, ML, Xu, CJ, Senthil, KK, Kim, JY, & Kim, H 2002, „Stable transformation of

protocorm like bodies in Phalaenopsis orchid mediated by Agrobacterium

tumefaciens‟, Sci. Hort., vol. 96, pp.213-224.

Cheng, M, Fry, JE, Pang, SZ, Zhou, HP, Hironaka, CM, Duncan, DR, Conner, W & Wan,

YC 1997, „Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacterium

tumefaciens‟, Plant Physiol., vol. 115, pp. 971-980.

Chin, DP, Mishiba, K, & Mii, M 2007, „Agrobacterium-mediated transformation of

protocorm-like bodies in Cymbidium‟, Plant Cell Rep., vol. 26, pp. 735-743.

Christensen, AH & Quai, PH 1996, „Ubiquitin promoter based-vector for high level

expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous

plants‟, Transgenic Res., vo. 5, pp. 213-218

Deeken,R., Engelmann,J.C., Efetova,M., Czirjak,T., Muller,T., Kaiser,W.M., Tietz,

Krischke,M.O., Mueller,M.J., Palme,K., Dandekar,T., Hedricha, R. 2006. An

Integrated View of Gene Expression and Solute Profiles of Arabidopsis Tumors: A

Genome-Wide Approach. Plant Cell, 18:3617-3634.

Departemen Pertanian RI 2007, Prospek dan Arah Pengembangan Agribisnis: Rangkuman

Kebutuhan Investasi , Edisi Kedua, diunduh tanggal 17 Desember 2014

(http://www.google.com/.litbang.pertanian.go.id_bidangmasalah investasi)

Dwiyani, R 2012, „Mikropropagasi Tanaman Anggrek Vanda tricolor Lindl. var suavis forma

Bali yang membawa gen KNOTTED1-LIKE Arabidopsis thaliana (KNAT1)‟,

Disertasi, Program Studi Bioteknologi, Sekolah Pasca Sarjana, Universitas Gadjah

Mada, Yogyakarta.

Dwiyani, R, Purwantoro, A, Indrianto, A & Semiarti, E 2009, „Peningkatan kecepatan

pertumbuhan embrio anggrek Vanda tricolor Lindl. pada medium diperkaya dengan

ekstrak tomat‟, Prosiding Seminar Biologi Nasional XX, Universitas Islam Negeri

Malang , Hlm. 590 - 597.

21

Hiei, Y, Ohta, S, Komari, T & Kumashiro, T 1994, „Efficient transformation of rice (Oryza

sativa) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the

T-DNA‟, The Plant J., vol. 6, pp. 271-282.

Indrianto,A. 2003. Kultur Jaringan Tumbuhan (Bahan Ajar). Fakultas Biologi Universitas

Gadjahmada, Yogyakarta.

Irawati 2002, „Pelestarian jenis anggrek Indonesia‟, Buku panduan Seminar Anggrek

Indonesia, Yogyakarta, Hlm. 34-45.

Ishida, Y, Saito, H, Ohta, S, Hiei, Y, Komari, T & Kumashiro,T 1996, „High efficiency of

transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens‟,

Nat. Biotechnol., vol. 14, pp. 745-750.

Islam, MO, Ichihasi, S & Matsui, S 1998 „Control of growth and development of protokorm

like body derived from callus by carbon sources in Phalaenopsis‟, Plant Biotechnol.,

vol. 15, pp. 183-187.

Lestari, E.S. 2010. Karakterisasi Morfologis dan Molekuler Anggrek Vanda tricolor Lindl.

var. suavis Asal Merapi dan Bali. Skripsi. Fakultas Biologi Universitas Gadjah

Mada.

Men,S., Ming,X., Liu,R., Wei,C., Li,Y. 2003. Agrobacterium-mediated genetic

transformation of a Dendrobium orchid. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 75:

63-71.

Mishiba,K., Chin,DP., Mii,M. 2005. Agrobacterium-mediated transformation of Phalaenopsis

by targeting protocorms at an early stage after germination. Plant Cell Rep. 24:

297-303.

Nazim-Ud-Dowla, MAN, Ahmed, NU & Hasan, L 2008, „Optimization of Agrobacterium-

mediated Genetic Transformation in Indica Rice‟, Thai Journal of Agric.Sci., vol.

41, pp. 127-133

Opabode,J.T. 2006. Agrobacterium-mediated transformation of plants : emerging factors that

influence efficiency, Review. Biotechnol. and Mol. Biol. 1: 12-20.

Pandey, V, Misra, P, Chaturvedi, P, Misra, MK, Trivedi, PK & Tull, R. 2010.

Agrobacterium-mediated Transformation of Whithania somnifora (L.) Dunul: An

Important Medical Plant‟, Plant Cell Rep., vol. 29, pp. 133-141

Semiarti, E, Indrianto, A, Purwantoro, A, Isminingsih, S, Suseno, N, Ishikawa, NT, Yoshioka,

Y, Machida, Y & Machida, C 2007, „Agrobacterium-mediated transformation of

the wild orchid species Phalaenopsis amabilis‟, Plant Biotechnol., vol. 24, pp. 265-

272.

Shrestha, BR, Chin, DP, Tokuhara, K & Mii, M 2007, „Efficient production of transgenic

plants of Vanda through sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation

of protocorm-like bodies‟, Plant Biotechnol., vol. 24, pp. 429-434.

Yenchon, S & Te-Cato, S 2012, „Effect of bacteria density, innoculation and co-cultivation

period of Agrobacterium-mediated transformation of oil palm embryogenic callus‟,

J. Agric. Technol., vol. 8, no. 4, pp. 1485-1496

Zhang J1, Liu G, Guo C, He Y, Li Z, Ning G, Shi X, Bao M 2011, „The FLOWERING

LOCUS T orthologous gene of Platanus acerifolia is expressed as alternatively

spliced forms with distinct spatial and temporal patterns‟, Plant Biol., vol. 13, no. 5,

pp. 809-820.

Zhao, ZY, Gu, W, Chai, T, Tagliani, L, Miller, M, Wang, N, Pang, H, Rudert, M, Schroeder,

S, Hondred, D, Seltzer, J & Piercce, D 2000, „Agrobacterium-mediated shorgum

transformation‟, Plant Mol.Biol., vol. 44, pp. 789-798.

Zupan,J.R., Zambryski,P.C., 1995. Transfer of T-DNA from Agrobacterium to the plant cell.

Plant Physiol. 107: 1041-1047.

22

LAMPIRAN

Publikasi selama 3 tahun

1. Agrotropika vol 18 no 2 (Juli-Desember) 2013

23

2. Jurnal Agrivita vol 37 no2 2015 (Internasional terindex Scopus, Elsevier, Cross-Reff, Pro-

Quest, SJR)

24

3. Disampaikan sebagai pemakalah oral pada SEMINAR PERHIMPUNAN

HORTIKULTURA Di Malang (Nov. 2014)

25

4. Pemakalah oral dalam ICBB ke 5 Sept 2014

26

5. Poster Presenter ICBB 6 (Sept 2015)

27

6. Senastek UNUD 2015

Abstrak Senastek UNUD 2015

Transformasi In Planta melalui Agrobacterium tumefaciens pada Tanaman Anggrek

Vanda tricolor

R. Dwiyani1)

, H. Yuswanti1)

, I.A.P. Darmawati1)

,

I.S. Mercuriani2)

dan E. Semiarti3)

1) Fakultas Pertanian, Universitas Udayana, Denpasar, Bali 2) Fakultas Biologi Universitas Negeri Yogyakarta, Yogyakarta

3) Fakultas Biologi Univarsitas Gadjah Mada, Yogyakarta

Coresponding author: HP 0811386265; e-mail: rindangdwiyani@yahoo.co.id

ABSTRAK

Penelitian mengenai transformasi In planta melalui Agrobacterium tumefaciens pada

anggrek Vanda tricolor telah dilakukan dari bulan September 2014 hingga Juni 2015.

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh periode inokulasi serta pengaruh

asetosiringon terhadap persentase kandidat transforman yang dihasilkan pada

transformasi in planta melalui A. tumefaciens pada anggrek V. tricolor.. Penelitian ini

menggunaka T-DNA membawa gen pembungaan PaFT dengan „strong promoter‟

Ubiquitin dan gen hpt yaitu gen ketahanan higromisin sebagai „selectable marker‟

yang dikonstruksi pada vektor PGAS. . Penelitian transformasi in planta ini dilakukan

secara faktorial dengan dua faktor. Faktor pertama yaitu lama perendaman polen

dengan suspensi Agrobacterium (1 dan 2 jam). Faktor kedua yaitu pemberian

Asetosyringone (AS), tanpa AS dan dengan 25 ppm AS. Hasil penelitian

mendapatkan bahwa lama perendaman polen selama 2 jam dengan pemberian 25 ppm

AS menghasilkan persentase kandidat transforman tertinggi (yakni 25%) melalui

seleksi awal dengan 15 ppm higromisin.

Kata kunci: Transformasi in planta, Agrobacterium tumefaciens, Asetosiringon, gen

PaFT, periode inokulasi, Vanda tricolor

28

7. Buku ber ISBN