Nama/NIM: Rajini / K4307009

Teknologi DNA Rekombinan

Teknologi yang dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan, atau dengan istilah yang lebih populer

rekayasa genetika, ini melibatkan upaya perbanyakan gen tertentu di dalam suatu sel yang bukan sel

alaminya sehingga sering pula dikatakan sebagai kloning gen. Salah satu definisi teknologi DNA

rekombinan yang paling representatif adalah pembentukan kombinasi materi genetik yang baru

dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya untuk

terintegrasi dan mengalami perbanyakan di dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai

sel inang.

Teknologi DNA rekombinan merupakan tulang punggung dan pemicu lahirnya bioteknologi

molekuler. DNA rekombinan dikonstruksi dengan menggabungkan materi genetik dari dua atau

lebih sumber yang berbeda atau melakukan perubahan secara terarah pada suatu materi genetik

tertentu. Beberapa contoh rekombinasi dari dua sumber atau lebih antara lain:

Rekombinasi saat pindah silang dalam pembentukan gamet pada proses meiosis.

Saat sperma dan ovum melebur pada proses fertilisasi.

Saat bakteri melakukan transaksi bahan genetic melalui konjugasi transformasi atau transduksi.

Dari contoh-contoh rekombinasi tersebut dapat diketahui bahwa rekombinasi merupakan salah satu

cara untuk meningkatkan keanekaragaman hayati.

Teknologi DNA rekombinan mempunyai dua segi manfaat. Pertama, dengan mengisolasi dan

mempelajari masing-masing gen akan diperoleh pengetahuan tentang fungsi dan mekanisme

kontrolnya. Kedua, teknologi ini memungkinkan diperolehnya produk gen tertentu dalam waktu

lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi secara konvensional.

Teknologi DNA Rekombinan memiliki beberapa tahapan untuk mendapatkan produk-produk yang

diinginkan. Tahapan-tahapan tersebut yaitu mengisolasi DNA, memotong DNA, menyambung

DNA, memasukkan DNA ke sel hidup atau sel inang, transformasi sel inang menggunakan molekul

DNA rekombinan, reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang, dan analisis DNA

rekombinan.

1. Isolasi DNA

Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan

baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara

enzimatis seperti pemberian lisozim. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat diresuspensi di dalam

medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan

deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS).

Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang dengan cara sentrifugasi. Protein

yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk

kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. Jika remukan sel

masih tercampur dengan RNA maka perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari

RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan

amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl.

2. Pemotongan molekul DNA

Pemotongan molekul DNA, baik genomik maupun plasmid dilakukan dengan enzim restriksi. Ada

dua macam enzim restriksi yaieu enzim restriksi tipe I dan enzim restriksi tipe II. Enzim restriksi

tipe II mempunyai sifat-sifat umum yang penting sebagai berikut:

mengenali urutan tertentu sepanjang empat hingga tujuh pasang basa di dalam molekul

DNA

memotong kedua untai molekul DNA di tempat tertentu pada atau di dekat tempat

pengenalannya

menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan berbagai ukuran dan urutan basa.

Berdasarkan tempat hasil pemotongan, fragmen-fragmen DNA memiliki dua macam ujung yaitu:

Ujung lengket (sticky end) atau ujung kohesif, terjadi jika tempat pemotongan pada kedua

untai DNA terpisah sejauh beberapa pasang basa, sehingga menghasilkan fragmen-fragmen

dengan ujung 5’ yang runcing karena masing-masing untai tunggalnya menjadi tidak sama

panjang. Dua fragmen DNA dengan ujung yang runcing akan mudah disambungkan satu

sama lain.

Ujung tumpul (blunt end), terjadi jika tempat pemotongan DNA pada posisi yang sama.

Kedua fragmen hasil pemotongannya akan mempunyai ujung 5’ yang tumpul karena

masing-masing untai tunggalnya sama panjangnya. Penyatuan dua fragmen DNA ujung

tumpul sulit dilakukan sehingga memerlukan perlakuan tambahan, misalnya pemberian

molekul linker, molekul adaptor, atau penambahan enzim deoksinukleotidil transferase.

3. Penyambungan (ligasi) molekul DNA

Ada tiga cara yang dapat digunakan untuk meligasi fragmen-fragmen DNA secara in vitro. Pertama,

ligasi menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri. Kedua, ligasi menggunakan DNA ligase dari

sel-sel E. coli yang telah diinfeksi dengan bakteriofag T4 atau lazim disebut sebagai enzim T4 ligase.

Ketiga yaitu pemberian enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal

homopolimerik 3’.

Suhu optimum bagi aktivitas DNA ligase sebenarnya 37ºC. Akan tetapi, pada suhu ini ikatan

hidrogen yang secara alami terbentuk di antara ujung-ujung lengket akan menjadi tidak stabil dan

kerusakan akibat panas akan terjadi pada tempat ikatan tersebut.  Oleh karena itu, ligasi biasanya

dilakukan pada suhu antara 4 dan 15ºC dengan waktu inkubasi (reaksi) yang diperpanjang (sering

kali hingga semalam).

4. Transformasi Sel Inang

Setelah tahap ligasi, dilakukan analisis terhadap hasil pemotongan DNA genomik dan DNA vektor

serta analisis hasil ligasi molekul-molekul DNA tersebut. menggunakan teknik elektroforesis. Jika

hasil elektroforesis menunjukkan bahwa fragmen-fragmen DNA genomik telah terligasi dengan

baik pada DNA vektor sehingga terbentuk molekul DNA rekombinan, campuran reaksi ligasi

dimasukkan ke dalam sel inang agar dapat diperbanyak dengan cepat. Tahap memasukkan

campuran reaksi ligasi ke dalam sel inang dinamakan transformasi karena sel inang diharapkan

akan mengalami perubahan sifat tertentu setelah dimasuki molekul DNA rekombinan.

5. Seleksi Transforman dan Seleksi Rekombinan

Oleh karena DNA yang dimasukkan ke dalam sel inang bukan hanya DNA rekombinan, maka kita

harus melakukan seleksi untuk memilih sel inang transforman yang membawa DNA rekombinan.

Selanjutnya, di antara sel-sel transforman yang membawa DNA rekombinan masih harus dilakukan

seleksi untuk mendapatkan sel yang DNA rekombinannya membawa fragmen sisipan atau gen yang

diinginkan. Cara seleksi sel transforman akan diuraikan lebih rinci pada penjelasan tentang plasmid.

Pada dasarnya ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi setelah transformasi dilakukan, yaitu:

(1) sel inang tidak dimasuki DNA apa pun atau berarti transformasi gagal,

(2) sel inang dimasuki vektor religasi atau berarti ligasi gagal, dan

(3) sel inang dimasuki vektor rekombinan dengan/tanpa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan.

Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan mencari

fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe), yang pembuatannya dilakukan secara in

vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase chain reaction (PCR).

Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan melalui cara yang dinamakan

hibridisasi koloni.

Referensi:

Sajidan. 2008. Modul Pendidikan dan Pelatihan Profesi Guru (PLPG) Biologi. Surakarta: Panitia

Sertifikasi Guru Rayon 13

http://biologikubiologimu.blogspot.com/2008/09/teknologi-dna-rekombinan.html

http://biomol.wordpress.com/bahan-ajar/dasar-tek-dna-rek/

http://pustaka.ut.ac.id/puslata/online.php?menu=bmpshort_detail2&ID=209