tecnicas para determinacion de cromatina x

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  • 5/10/2018 Tecnicas Para Determinacion de Cromatina X

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    Revista de Ciencias U.N.M.S.M., Vol. 74, No.1, pp. 171-177,Mar. 1986

    UNA TECNICA SIMPLIFICADA PARA CROMATINA-X*JAIME DESCAILLEAUX * y MARGARITA VELASQUEZ'"

    Laboratorio de Genetica Hum ana, Faeultad de CienciasBiologicas, Institute de Investigacion de Cieneias Biolcgicas

    Antonio Raimondi, Universidad Naeional Mayor de San Marcos.C. P. 1101(),Lima - 14RESUMEN

    El anafisis estadistico realizado en una experiencia de coloracion paracromatina-X, en 4 mujeres normales, utilizando las tecnicas de Feulgen,Giemsa, Orceina y Fucsina, nos permiten afirmar que Ia coloracion de Giemsaresults la mas apropiada para ser ernpleada rutino.rinmentc en cl examen desexo nuclear (cromatina-X} por las siguientes razones: La frecueneia relativade celulas cromatino-positivas es identica entre Giemsa, Feulgen y Fucsina;la resoluci6n y nitidez de las preparaciones citologicas resulta cualitativamen-te superior en Giemsa que en Fucsina y Orceina, y iinalmente resulta Ia tee-nica mas simple y rapida.

    INTRODUCCIONEn los problemas de diferenckrcion sexual, una parte importante tie-

    ne como agente etiolocico una anomalla numerkxr del cromosoma X, ladeteccion precoz v/ el dicrqnostico diferencial pueelen verse muchas ve-ces auxiliados con la determinacion de la cromatina-X. Es bien conoci-do que 10 recrccion de Feulgen es la linica tecnica de coloracion especi-fica para e1ADN, constituyendo el metoda de mejor caBdad para lcr de-terminacion de 1a cromatina-X (1), sin embargo ella es un tanto lobo-riosa para 1apreporccion del recrctivo de Schiff y e1 tiempo de coloracionbast ante largo (90').

    Nuestro obiotivo 9st6:dirigido a Ia descripci6n de una tecnica quepermita un cmcltsis rapido, sin deterioro de 10 calidad de la preparacioncitolociccr, y que pueda ser realizada en labortorios de cualquier clfnica Trabajo financiado parcialmente por el Programa Latino-Americano de

    Investigaciones en la Reproducci6nHumana PLAMIRH 33-15B-1-77-R.Profesor Principal D. E..Jefe de Pract.icas 40 h.

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    1 7 2 J. DESCAILLEAUX Y M _ VELASQUEZu hospital que cuente con 1 0 0 infraestructura comun y carriente para ana-lisis clinlcos, Para este efecto hemos realizado una experienciu con 10 .finalidad de comporor los resultados obtanidos mediante 10 utilizrrcionde cuatro tecnicas difarentas para 10 coloraci6n de 10 cromatina-X, en c e -lukrs de mucosa oral en muleres normales.

    MATERIAL Y METODOSSe obtuvieron muestra de mucosa oral en 4 muieres de 27 aiios de

    edad y ciclos menstruales normcles, de coda una de eUas se prepara-ron 8 lCuninas (4 de cada lado), destin6:ndose 2 (l de coda lado) parocoda una de las 4 tecniC'CIS de coloracion emplecrdrrs.

    a) Coloracion con Fucsina Basica (I).b) Coloracion par 10 Reaction de Feulcen. (1).c) Coloraci6n con Orceina Acetica (I).d) Coloracion con Giemsa (2).Toma de 1amuestra: En cada caso se realiz6 un enjuaque de 10b0-

    ca antes de proceder 01 raspado con la espCrtulametcdicer,en sequidaun frotis sobre una 16m.inalimpio y ssccr.

    Fijacion: lnmediatamente se colocan en el fijador (alcohol etllico:Iteretillco 1:1) por un tiempa minima de 20' y maximo de 7 dias.

    Hidr6lisis: En HCl N, a 600 C por 10'.Coloracion:a) Con Pucsuia Bastca. Se colocan las laminas secas en el colo-

    rante Fucsina Bosicc durante 10', luego se lavon con aqua de caiio, ensequida sa decoloran durante 10" en alcohol a1 70% y sa lavon conagua de caiio.

    b) Coloracion con 10'Reaccion de Feulgen. Se colocan las lami-nas secas en el Reactivo de Schiff per 90', lueeo se lavan con agua sul-Iurcso en 2 baiios consecutivos de 2' coda uno y sa enjuagan con aguade caiio.c) Coloracion con Orceina Aceticu. Sa colocan las laminas secasen al colorante Orceina Acetica par 10', luego se lavon con aqua de ca-fio, en seguida se decoloran durante 10" en alcohol al 70% y sa lavancon agua de caiio.

    d) Coloracion con Glamsa. Sa colocan las lCuninasen al coloran-te Giemsa durante 10', lueco sa enjuaqan con crgua de cafio.

    Observaclon de las lCrminas: 1 enfoque inicial del an6:li.sisde las16minas sa reollzc con el obietivo de manor aumento (lOx) y 10identiHeaden de 10 cromattna-X con al de inmersion (lOOx).

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    TECNICA SIMPLlFlCADA PAllA caOMATINA x 1 7 3

    AncilfsisEstadist1co:Se recrliz6un cm.Cdisisde voriancia con las siquientes caractenstic::aa:Unidad de muestreo. Conjunto de 100 celulas de una de las meji

    lias de una persona, somelidas (I un tipo de colorants.Variable observada. Nu.mero de celulascon cromrrtincrsexual enlos coniuntos de 100 celulas descrltas.},AodelQ matem6tico.

    Xuk = p o + pi + U + tk + ZijkXijk variable observada en la persona I, en 10mejilla j y con

    eltrat~iento kJ . I . media verdadera de lcr poblccionpi persona I, 1 - 1, 2, 3, 4lj meiilkr I. 1 meifllo derecha2 mej illa izquierdatk tratamiento k. k 1, 2, : 3 , 4

    Zijk errorHip6tesis veriftcadas: De acuerdo con el modele, se verificaron las

    siguientes hlpbtesis:HOI: h b (no hay diferencia significativa entre loca:lizaciones).HO:t : PI P2 Cno hay diferencia significativa en-

    tre las personas).HOa~ tl -t2 ts 4 (no hay dilerencia significativa en-tre loa tratamientoe).

    I. De los valores obtenidos:En 10 Tabla No.1, presentamos el nUmero de celulas con cromatina

    sexual. en 100 celulas de una mejilla de una deteIminada persona: tom-bien sa onotan los totales observados y los valores de x para cada per-sona y por cada trcncrmlento.H. De las hJpOtesis vfitl'ifjc:acias:

    Los valoras de Y, obtenidos en -al anCilisis de variancia (ver TablaNo.2) nos llevaron a:

    1. Rechazar la Rea , puesto que el valor F para los tratamientos(13.002), es estadlsticamente significante al nivel de 0.01, por 10 que con-c1uimos que '~existe diferencta significativa cuanto a 10 frecuencia de I

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    174 J. DESCAILLEAUX Y M. VELASQUEZcelulas con cromatina sexual entre las celulcs sometidas a cada trata-mlento",

    2. No podsr rechazar HOi Y H~, puesto que los valores F para lasIocalimciones (0.010) Y las personas (0.383) no son estadfsticamentesignificativas, por 10 que concluimos "no existe diferencia significanteentre las dos localizaciones Y los cuotro personas".

    TABLA No. 1CELULAS CROMATINO-POSI'rIVAS POR COLORANTE Y

    POR MUJERES ESTUDIADAS

    Mujer I Mujer II Mujer III Mujer IV Total Total XuD I D I D I D I D I

    FuesinaBasica 21 2 3 2 4 2 0 2 1 2 5 2 4 2 2 90 9 0 1 8 0 2 2 . 5Re~cci6n deFeulgen 2 0 2 6 2 5 2 6 2 7 2 4 2 5 2 6 9 7 1 0 2 1 9 9 2 4 . 8OrcefnaAeetica 1 9 1 7 2 0 2 2 2 1 1 9 2 1 1 8 81 7 6 1 5 7 1 9 . 6Giemsa 2 7 2 5 2 3 2 6 2 3 2 2 2 3 2 5 96 9 8 1 9 4 2 4 . 2

    87 9 1 9 2 94 92 90 9 3 9 1 3 6 4 366 730Totales1 7 8 1 8 6 1 8 2 1 8 4 7 3 0

    x mujer 2 2 . 2 5 2 3 . 2 5 2 2 . 7 5 2 3 . 0 0

    TABLA No. 2ANALISIS DE VARIANCIA DE LA FRECUENCIA DE CROMATINA SEXUAL

    ENTRE LOS TRATAMIENTOS, LAS PERSONAS Y LAS LOCALIZACIONES

    Fuente de Grado:;; de Suma de Cuadradovariaeion libertad euadrados medio F Conclusion

    Tratamientos 3 1 3 2 . 6 2 5 4 4 . 2 0 8 3 1 3 . 0 0 2 Personas 3 4 . 3 7 5 1 . 4 5 8 3 0 . 3 8 3 no significanteLocalizaciones 1 0 . 1 2 5 0 . 0 4 1 6 0 . 0 1 0 no significanteError 2 4 9 1 . 7 5 3 . 8 2 2 9

    Total 3 1 2 2 8 . 8 7 5

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    TECNICA SrMPLlFICADA PAllACllOMATINA x i 7 5

    1I1. Olias irikrendas del an6Iisls:Intsrvelo de confianza de 95% para la media II - de cada tratamtento:Elestimador de p. es x .para ca:da tratamiento:En el tratamiento 1 (Fucsina B6:sica)En el tratamiento 2 (Reacc16n de Feulqen)En el tratamienio 3 (Orceino Acetica)En el trataIDiento 4 (Giemsa) .

    x 22.5 .x -24.8x - 19.6x 24.2

    El intervalo de confianza de 95% para 10 media I" de coda tretc-miento:

    Fucsina OOsica:Reaccion de Feulqen:Orceinaacetica:Giemsa:

    21.27 < p o < 23.7223.29 < p o < 26.3018.43 < p. < 20.7622.98 < p o < 25.41

    IV. Prueba t de igualdad de medias:..Puesto que el anCdisis de variancia nos muestra que existe diferen-

    cia Significativa, al nivel de 0.01 entre los cuatro tratamiantos. realiza..mOB 10 prueba t para detarminar en q u e tratamiantos exista ladiferencic:t.esableciendo pr&viamente nuestro nivel de significancia ena =0.05 10cual nos demostr6.

    Fucsina b6:sioo Reaccion de Feulqen'Fucslna b6sica o F Oreeina acetiooFucsina basica _ GiemsaReaccl6n de Feulqen '= F Oreeino aceticaReaccion de Feulqen .= GiemsaOrcefna 'Ocetica: = . GiemsaEn consecuencla, conc1uimosque el tratamiento conOrcefnn aceU"

    cadifiere siqnificattvamente de los tratamientos' con Fucsina b6stoo,'Reacci6n de Feulqen y Giemsa. pero no 'sa descubrl6 difarencia signifi-cativa entre Fucsina b6:sic:a, Reacci6n de FaUlqen y Giemsa al nivel pre-.viamen te eslablecido.

    DISCUSIONLos resultados obtenidos han mostrado que los valores de calulas

    cromatino-positivas. .aon eetodistlccmente identico8 eritre las ..2.mejillas >

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    176 J. DESCAILLEAUX Y M. VELASQUEZy entre las 4 muieres estudiodas, pero que las tecnieas de coloracionexhiben una diferencia estadlstieamente significativa al nivel del 0.01,verificandose que ella es consecuencia de una diferencia c rl nivel de sig-nificancio del 0.05de la coloracion con Orcefna acetica con respectoa lcr recrccion de Feulcen, Fucsina bcsicc y Giemsa sin ]ograr detectardiferencio alguna entre las 3 ultlmcs,

    Un cnrrllsls detalaldo de estos resultados, nos indican que el me-nor valor de i" fue registrado con 10 tecnicct de Ia Orceina oceticc(19.6%), mientros que 10 Fucsina besico, La reoccion de Feulcen y elGiemsa mostraron valores de x prccticnrnente identicos (22.5%; 24.8%;24.2%), sefialando de esta forma que la coloracion de Orcelna acetieaes la menos indicada para ser utilizada como sustituto del metodo deFeuIgen y que es entre Ia Fucsmo busker y el Giemsa que puede elegirse este sustituto.

    Pore alcanzar este objetivo es necesario referirse a las observacio-nes microscpicas de las colorociones, las mismas que permiten crpre-dar el aspecto cualitativo de los resultados, al respecto, basodos unicc-mente en la experiencia lograda durante varios ofios de trabajo citoge-netico,podemos afirmar que 10 coloracion con 10 Hecccion de Feulgencontinua siendo 10 tecniccr que permite apreclar las tinciones mas niti-des, de meior definicion, y sabre todo, la que elimina cualquier dudocuanto a la existencia de material cromos6mico,debido a la naturolezoespecifica de la coloraci6n, as vdlido eonduir que el material Feukren po-sitivo es de naturaleza cromos6mica.

    La utilizociondel HCIN pora hldrolizor las preparaciones citoloct-cas antes de la coloaci6n, resulta un paso importante para meioror elcrspecto cualitativo de 10 prepcrrcrcion, pues con ella se locrc eliminaruna serie de material extra-celular como residuos citoplasmCrticos0agen-tes bacterianos que son muyabundantes en la cavidad oral y suelencrcornpoficr las celulos obtenidas par descamaci6n.

    Finalmente, con rekrcion a Ia eleccion de una tecnica que reempla-ce al Feuleen en 10 coloracion de la cromctinc-X,es indudablemente queella debe ser elegida entre el Giemsa y 10 Fucsina OOsica. Del puntode vista cualitativo el Giemsa brinda una imagen muy nitido y con mrryor resoluci6n que la Fucsina basica, pero sin lIegar a aleanzar los nl-veles de Feulgen, y en cuanto a 10 simplicidad de la tecnica, igualmente el Giemsa presenta 10 ventaja de no necesitar un tratamiento paradeoolorocton que si requiere 10 Fucsina basica, pcdemos pues concluirque: el Giemsa resulta la tecnioc de coloracion a eleetr para: rsempkr-zar al Feulcen por las siquientes rezones:

    a) La x de celukrs cromctlno-positivcaes estadistieamente igualentre 10 Fucsina Bcrsiocr, la Recccion de Feulgen y Giemso,

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    TfcNICA SIMPLIFICADA PARACltOMATINA:X 1 7 7

    h) CuaUtativamenle, e1Giemsa brlnda coloraciones mas nitldas yde major resoluci6n que IcrFucsina:Basica, pero no as superior al Feulqen.

    c) La tecnica de coloracion mas simple y ropida es al Giemsa.AGRADECIMIENTO

    Los outores expresan su aqrodecimiento a 1a Profesora LeonorLo-guna del Departamento Academico de MatemCrticas de la UniversidadNacional Mayor de San Marcos por su colcborocion en el anaIisis estc-distico.

    ABSTRACTThe statistic analysis made in a Xohrcmcrtln research staining, infour normal women, by using Feulgen, Giemso, Orcein and Fuchsin

    techniques. allow us to affirm that the most convenient sex nuclearmethodology and in order to be use routinarlly is the Giemsa techniquefor the next reasons: The chromatin positive cells relative frequency isthe same among Giemsa, Feuleeri and Fuchsin. Giemsa gives superiorcytological resolution and sharper qualization than fuchsin and orceinones. Finally this technique is faster and simpler.

    KEFEBENCIASCULLING, c. F. 1966. Staining affinities and cytochemical propedi" of thesex chromattin. In K. L. MOORE. "The sex chromatin". Saunders, Phi~ladelphia.DUTRlLLAux. B.; COUTURIER, J. 1981. La Pratique de L';Analyse rnm.~.mosomiq1Je. Masson. Paris.