tecnicas moleculares para el dignostico bioquimico

Upload: julioce-waldo

Post on 18-Oct-2015

28 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

  • 7/14/2019 Tecnicas Moleculares Para El Dignostico Bioquimico

    1/34

    TECNICAS MOLECULARES PARA EL

    DIGNOSTICO BIOQUIMICO

    ALUMNO: JULIO CESAR WALDO SALDAA

    UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN

    MARTIN - T

  • 7/14/2019 Tecnicas Moleculares Para El Dignostico Bioquimico

    2/34

    Tcnica de PCR

    Desarrollada por el Dr. Kary Mullis en1983.

    Tcnica de Biologa Molecular quetiene por objetivo la amplificacin

    directa de un gen (o fragmento deDNA) o indirecta de un RNA,presente en mezclas de muydiversas fuentes.

  • 7/14/2019 Tecnicas Moleculares Para El Dignostico Bioquimico

    3/34

    Requerimientos de la prueba

    Agua libre de nucleasas.

    Catin divalente (MgCl2).

    Desoxinucletidos (dNTPs).

    Solucin amortiguadora y sales.

    Oligonucletidos (primers).

    Enzima (Taq polimerasa).

    5-GTTGACTTGATAGGCTA -3

    http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/5/56/GTP_chemical_structure.png
  • 7/14/2019 Tecnicas Moleculares Para El Dignostico Bioquimico

    4/34

    Agua libre de nucleasas

    Agua grado PCR libre de RNAsas y DNAsas.

    Provee el medio en el cual se llevaran a cabolas reacciones necesarias para la replicacin del

    ADN.

  • 7/14/2019 Tecnicas Moleculares Para El Dignostico Bioquimico

    5/34

    Catin divalente

    Los iones de magnesio estimulan a la

    enzima Taq polimerasa para queincorpore los dNTPs.

  • 7/14/2019 Tecnicas Moleculares Para El Dignostico Bioquimico

    6/34

    Desoxinucletidos

    Son 4 los dNTPs involucrados en

    un PCR tpico; dATP, dCTP, dGTP,

    dTTP.Provee de nucletidos (base +azcar + fosfato) a la reaccin

    para la sntesis de ADN.

    Se incorporan a un ADN molde

    de manera complementaria,para realizar una copia exacta

    de este.

  • 7/14/2019 Tecnicas Moleculares Para El Dignostico Bioquimico

    7/34

    Sol. Amortiguadora y sales para PCR.

    AmortiguadorMantiene el pHptimo para que la

    enzima acte.

    Sales

    Proporcionan lafuerza inica

    adecuada para unamxima actividad dela enzima.

    Influye en la Tm ehibridacin.

  • 7/14/2019 Tecnicas Moleculares Para El Dignostico Bioquimico

    8/34

    Oligonucletidos

    Secuencias cortas de ADN (18-25 bases), quesirven como punto de inicio de la replicacin del

    ADN.Molculas lineales con un grupo hidroxilo en elextremo 3.Secuencias complementarias al ADN blanco.Se unen al ADN molde deacuerdo a las reglas

    de complementariedad de bases.

  • 7/14/2019 Tecnicas Moleculares Para El Dignostico Bioquimico

    9/34

    Taq polimerasa

    Dirige la sntesis de ADN durantela replicacin.

    La Taq polimerasa fue aislada de

    la bacteria Thermus aquaticus en1976.

    Es termoestable y acta en lapresencia de iones de magnesio.

    La temperatura ptima de la

    enzima son 72C.

  • 7/14/2019 Tecnicas Moleculares Para El Dignostico Bioquimico

    10/34

    Pasos de la tcnica de PCR

    Las cadenas de ADN son separadas

    en dos hebras sencillas.

    Los primers se unen porcomplementariedad a las cadenas

    molde, deacuerdo a su Tm.

    La enzima Taq polimerasa, adiciona

    los nucletidos correspondientes en

    las nuevas cadenas sintetizadas porcomplementariedad de pares de

    bases.

  • 7/14/2019 Tecnicas Moleculares Para El Dignostico Bioquimico

    11/34

    Desnaturalizacin

    Es el primer paso en latcnica de PCR, en la cullas cadenascomplementarias de ADN

    son separadas porcalentamiento.

    Los puentes de hidrgenoentre las dos hebras de

    ADN son rotos y estas seseparan.

  • 7/14/2019 Tecnicas Moleculares Para El Dignostico Bioquimico

    12/34

    Alineacin

    3

    5

    5

    3

    Alineacin de los primers3

    5

    5

    33 535

    Proceso en el que dos secuencias de ADN (primers y cadena

    molde) forman puentes de hidrgeno.

    La alineacin se lleva a cabo por enfriamiento de la mezcla de

    reaccin, despus del paso de desnaturalizacin segn la Tm delos primers empleados.

  • 7/14/2019 Tecnicas Moleculares Para El Dignostico Bioquimico

    13/34

    Elongacin del ADN

    La Taq polimerasa se une al templado de ADN y comienza a adicionar los

    nucletidos que son complementarios a la cadena molde.

    La temperatura ptima de accin de la enzima Taq polimerasa son 72C.

  • 7/14/2019 Tecnicas Moleculares Para El Dignostico Bioquimico

    14/34

    Ciclo de replicacin

    Desnaturalizacin.Alineacin.

    Elongacin.

  • 7/14/2019 Tecnicas Moleculares Para El Dignostico Bioquimico

    15/34

    Anlisis del producto amplificadopor PCR convencional

    Despus de la amplificacin al obtener el ADN de inters, estepuede ser colocado en un gel de agarosa para realizar elcorrimiento electrofortico, teirlo y observarlo con luz ultravioleta(UV).

    La electroforesis es el movimiento de

    partculas cargadas en un campo elctrico.

    Los cidos nucleicos estn cargados de formanegativa debido a su esqueleto de grupos fosfato,

    por lo que migrarn hacia el polo positivo o

    nodo.

  • 7/14/2019 Tecnicas Moleculares Para El Dignostico Bioquimico

    16/34

    Gel de agarosa

    La agarosa es un polisacrido extrado de algas marinas que tienela propiedad de mantenerse en estado slido a temperaturaambiente pero que a altas temperaturas se torna lquida.Gelifica a temperaturas comprendidas entre 32 a 45C y funde atemperaturas entre 80 a 95C.

    La agarosa es un producto natural y no txico, por lo que puede sermanejado libremente y de forma cmoda en el trabajo.La concentracin de agarosa tpicamente utilizada paraelectroforesis est entre el 0.5 % y el 2%, dependiendo del tamaodel poro requerido para la corrida electrofortica y este a su vez deltamao del cido nucleico a analizar.la concentracin de agarosa define el tamao de los poros de lamatriz, a mayor concentracin, menor el tamao de los poros yviceversa.

  • 7/14/2019 Tecnicas Moleculares Para El Dignostico Bioquimico

    17/34

    Bromuro de etidio

    Es un colorante fluorescente que tiene la capacidad de intercalarseentre las bases nitrogenadas de ADN y ARN.

    Debido a esta propiedad, es un agente mutagnico y debemanejarse con cuidado, usando equipo de proteccin y las buenasprcticas de laboratorio establecidas.

    Bromuro de etidio

    Bases nitrogenadas Bases nitrogenadas

    http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/8/8c/DNA_intercalation2.jpg
  • 7/14/2019 Tecnicas Moleculares Para El Dignostico Bioquimico

    18/34

    Radiacin UV

    Los efectos biolgicos de esta radiacin se inician por unaabsorcin fotoqumica a nivel de molculas de importanciabiolgica, las ms importantes en este sentido son los cidosnucleicos, seguidos por las protenas.

    Es importante tomar las medidas necesarias para no exponerse aeste tipo de radiacin durante la revelacin de los productosamplificados en el gel de agarosa.

  • 7/14/2019 Tecnicas Moleculares Para El Dignostico Bioquimico

    19/34

    PCR en tiempo real

    En esta tcnica de laboratorio, los procesos de amplificacin ydeteccin se producen simultneamente en el mismo vial cerrado,sin necesidad de acciones posteriores.

    Los termocicladores para llevarla a cabo, incorporan un lector defluorescencia y estn diseados para poder medir en cualquiermomento de la amplificacin del material gentico, la fluorescenciaemitida en cada uno de los viales donde se realice esta.

    Los sistemas de deteccin para la PCR en tiempo real pueden serde 2 tipos: agentes intercalantes o sondas especficas marcadascon fluorocromos.

  • 7/14/2019 Tecnicas Moleculares Para El Dignostico Bioquimico

    20/34

    Agentes intercalantes

    Fluorocromos que aumentan notablemente la emisin defluorescencia cuando se unen a ADN de doble hlice.

    El ms empleado en PCR en tiempo real es el SYBR Green I.

    El incremento de ADN en cada ciclo, se refleja en un aumentoproporcional de fluorescencia emitida en cada vial donde se realiza

    la amplificacin.Uno de los inconvenientes de estos es su baja especificidad, que sepuede mejorar con el empleo de condiciones ptimas de reaccin ycon una seleccin cuidadosa de los primers o cebadores

  • 7/14/2019 Tecnicas Moleculares Para El Dignostico Bioquimico

    21/34

    Sondas de hibridacin especficas

    Sondas marcadas con dos tipos de fluorocromos, un donador y unaceptor.

    El proceso se basa en la transferencia de energa fluorescentemediante resonancia (FRET) entre las dos molculas.

    Las ms utilizadas son las sondas de hidrlisis, denominadastambin sondas TaqMan, las sondas molecular beacons y lassondas FRET.

    En todos estos sistemas, el incremento de ADN en cada ciclose corresponde con un aumento de hibridacin de las

    sondas, lo que conlleva un aumento en la misma proporcin

    de fluorescencia emitida.

  • 7/14/2019 Tecnicas Moleculares Para El Dignostico Bioquimico

    22/34

    Sondas de hidrlisisSon oligonucletidos marcados con unfluorocromo donador en el extremo 5que emite fluorescencia al ser excitadoy un aceptor en el extremo 3 queabsorbe la fluorescencia liberada por eldonador.Mientras la sonda este intacta, lafluorescencia emitida por el donador esabsorbida por el aceptor.Durante la sntesis de la nueva cadenapor la Taq polimerasa, que tieneactividad 5 exonucleasa, el extremo 5de la sonda es hidrolizado,producindose la liberacin delfluorocromo donador.Una vez que el donador y aceptor estnespacialmente alejados, la fluorescenciaemitida por el primero es captada por ellector.

  • 7/14/2019 Tecnicas Moleculares Para El Dignostico Bioquimico

    23/34

    Molecular beacons

    Parecidas a las sondas de hidrlisis.

    Tienen una molcula donadora en elextremo 5 y una molcula aceptora enel extremo 3, adems tienen unaestructura secundaria en forma de asa,

    que se pliega y mantiene unidas ambasmolculas.

    Al no estar hibridada con el ADN molde,la fluorescencia emitida por el donadores absorbida por el aceptor y no es

    captada por el lector del equipo.Al hibridarse con el ADN diana, la sondase abre, alejndose donador y aceptor,pudiendo detectarse la fluorescenciaemitida por el primero.

  • 7/14/2019 Tecnicas Moleculares Para El Dignostico Bioquimico

    24/34

    Sondas FRET

    El sistema se compone de 2 sondas que se unen a secuenciasadyacentes del ADN diana.

    Una de las sondas lleva un donador en el extremo 3 y la otra un

    aceptor en el extremo 5.

    Cuando las sondas estn hibridadas, los dos fluorocromos estnprximos. Al ser excitado, el donador transfiere su energa alaceptor que, a su vez, emite la fluorescencia que detecta el lectordel equipo.

    Lector

  • 7/14/2019 Tecnicas Moleculares Para El Dignostico Bioquimico

    25/34

    Equipo de amplificacin ydeteccin en PCR de tiempo real

    Cada tubo pasa frente lamisma fuente de luz

    excitatoria, la cual atraviesalas paredes laterales, y la

    fluorescencia emitida retornaal mismo sistema de

    deteccin, en este caso untubo fotomultiplicador.

    LEDS y filtros quedeterminan rangos

    de longitud deonda.

    Todos los tubos pasan por el detectorcada 150 milisegundos.

    La rotacingarantiza launiformidad

    de latemperatura

    del aire delsistema.

  • 7/14/2019 Tecnicas Moleculares Para El Dignostico Bioquimico

    26/34

    Curvas de amplificacin

    Constan de 3 partes diferentes:

    La fase inicial donde no sepuede medir la acumulacin delproducto de PCR pues haypocos cambios en la seal de

    fluorescencia, lo que define lalnea basal.

    La fase exponencial, donde lafluorescencia cambia a medidaque se forman ms productos.

    La fase de meseta, donde no sedistinguen cambios en lafluorescencia a pesar de que sesiguen acumulando productos.

    Lnea basal

    Fase exponencial Meseta

  • 7/14/2019 Tecnicas Moleculares Para El Dignostico Bioquimico

    27/34

    Comparacin de PCR tiempo real yPCR convencional

    PCR convencional

    Prueba de deteccin de puntofinal.

    Deteccin por empleo de geles

    de agarosa, aparte de lareaccin de PCR.

    Poder de resolucin limitado.

    Obtencin de resultados endos pasos (amplificacin y

    deteccin).Ms tiempo en obtencin deresultados.

    PCR tiempo real

    Prueba de deteccin de lacintica de la reaccin.

    Deteccin simultanea durante

    el proceso de amplificacin.Deteccin de cambiosmnimos en la secuencias ycon cantidades pequeas del

    ADN blanco.

    Prueba simultanea(amplificacin y deteccin) conmenor tiempo de espera.

  • 7/14/2019 Tecnicas Moleculares Para El Dignostico Bioquimico

    28/34

    Aplicaciones PCR

    Huella digital gentica.Test de paternidad.

    Deteccin de enfermedades hereditarias.Comparacin de la expresin gnica.Clonamiento de genes.

    Mutagnesis.Anlisis de DNA antiguo.Genotipificacion de polimorfismos

  • 7/14/2019 Tecnicas Moleculares Para El Dignostico Bioquimico

    29/34

    FISH o hibridacin fluorescente in

    situ:

    Es una tcnicacitogentica de marcajede cromosomas

    mediante la cual estosson hibridados consondas que emitenfluorescencia y permitenla visualizacin,distincin y estudio delos cromosomas.

  • 7/14/2019 Tecnicas Moleculares Para El Dignostico Bioquimico

    30/34

    FISH

    Hibridizacin in situ fluorescente

    Sndromes por Micro-deleciones

    Retinoblastoma(RB) del13q14

    Prader Willi-Angelman del15q12

    Di George/VCFacial del22q11

    Beckwith Wiedwmann del11p15

    Hibridar sondas marcadas

    sobre un cromosoma (metafase)

    o sobre un fragmento de ADN

    (interfase)

    http://images.google.com.ar/imgres?imgurl=http://www.consorziogenimed.it/cosa/citogenetica/3fish.jpg&imgrefurl=http://www.consorziogenimed.it/cosa/citogenetica/metodi.htm&h=225&w=300&sz=16&hl=es&start=3&tbnid=InULKFeHbh0TxM:&tbnh=87&tbnw=116&prev=/images%3Fq%3Dcitogen%25C3%25A9tica%2Bfish%26svnum%3D10%26hl%3Des%26lr%3Dhttp://images.google.com.ar/imgres?imgurl=http://www.consorziogenimed.it/cosa/citogenetica/110tuple.jpg&imgrefurl=http://www.consorziogenimed.it/cosa/citogenetica/metodi.htm&h=197&w=224&sz=13&hl=es&start=6&tbnid=Y64ZJ55ARXKiuM:&tbnh=95&tbnw=108&prev=/images%3Fq%3Dcitogen%25C3%25A9tica%2Bfish%26svnum%3D10%26hl%3Des%26lr%3D
  • 7/14/2019 Tecnicas Moleculares Para El Dignostico Bioquimico

    31/34

    Ligamiento

    Tendencia de los alelos

    cercanos en un mismoCromosoma a sertransmitido juntos, comouna unidad intacta en lameiosis.

    Anlisis de Ligamiento

    Es un mtodo de mapeode genes que utiliza el

    estudio de familias paradeterminar los dosgenes estn ligados

  • 7/14/2019 Tecnicas Moleculares Para El Dignostico Bioquimico

    32/34

    Es un mtodo de biologa molecular que permite detectar la

    presencia de una secuencia de ADN en una mezcla compleja de

    este cido nucleico. Para ello, emplea la tcnica de electroforesisen gel de agarosa con el fin de separar en base a la longitud de los

    fragmentos de ADN y, despus, una transferencia a una membrana

    en la cual se efecta la hibridacin de la sonda.

    -Inmunodeficiencias,

    -Hipoplasia adrenal congnita

    -Distrofia miotnica severa

    -Deficiencia de glicerol-quinasa-Distrofia muscular de Duchenne

    -Anlisis de mutaciones de genes en clulas B de leucemia

    -linfoblstica crnica, entre otras enfermedades

    Aplicaciones

    SOUTHERN BLOT

  • 7/14/2019 Tecnicas Moleculares Para El Dignostico Bioquimico

    33/34

    LA SECUENCIACIN DEL ADN

    La secuenciacin del ADN es un conjunto demtodos y tcnicas bioqumicas cuya finalidades la determinacin del orden de los nucletidos

    (A, C, G y T) en un oligonucletido de ADN.

  • 7/14/2019 Tecnicas Moleculares Para El Dignostico Bioquimico

    34/34

    Gracias..