4. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Kadar Air Mangrove Sonneratia alba

Kadar air dari mangrove Sonneratia alba adalah daun (74,72%), batang

(47,12%), akar (68,96%) dan buah (72,71%). Menurut (Ahmadi & Estiasih,2009),

Kadar air menutupi hampir 71% permukaan bahan. Kadar air diperlukan untuk

kelangsungan proses biokimiawi organisme hidup, sehingga sangat esensial

dalam menentukan kandungan kadar air pada bahan. Mikroorganisme menurut

Winarno dan Fardiaz (1973), dapat tumbuh pada kisaran kadar air tertentu.

Sebagian besar bakteri membutuhkan kadar air 75%-100% untuk tumbuh.

Dengan nilai kadar air sebesar itu akan membatasi pertumbuhan

mikroorganisme. Menurut Piggot dan Tucker (1990) , mikroorganisme yang

masih mungkin tumbuh adalah bakteri Leucocostoc, Leuconostoc

mesenteroides, Pseudomonas, Acetobacter, Flavobacterium, dan Zymomonas.

4.2 Isolasi Bakteri Penghasil Enzim L-Asparaginase

Isolasi bakteri L-asparaginase yang diperoleh dari penelitian ini berasal

dari sampel endofit mangrove Sonneratia alba yang diambil dari pantai Bajul Mati

Malang Jawa Timur. Sampel endofit mangrove adalah dari bagian daun, batang,

akar dan buah untuk diambil sebanyak 1 gram.

Hasil penginokulasian berdasarkan metode pengenceran bertingkat,

pengenceran 10-2, 10-3, 10-4 dan 10-5 merupakan isolat yang cukup untuk

mewakili semua koloni bakteri yang tumbuh. Dari sampel tersebut didapatkan

isolat bakteri sebanyak 8 isolat yang tumbuh dari 16 isolat pada media agar LBA

dapat dilihat pada Tabel 3 sebagai berikut :

37

Tabel 1. Kode Isolat

Kode isolat Keterangan

DSA2 isolat daun dari pengenceran 10-2

DSA3 isolat daun dari pengenceran 10-3

DSA4 isolat daun dari pengenceran 10-4

DSA5 isolat daun dari pengenceran 10-5

BSA2 isolat Buah dari pengenceran 10-2

BSA3 isolat Buah dari pengenceran 10-3

BSA4 isolat Buah dari pengenceran 10-4

BSA5 isolat Buah dari pengenceran 10-5

Isolasi bakteri menurut Dewi (2008), adalah pengambilan atau

memindahkan mikroba dari lingkungannya di alam dan menumbuhkannya

sebagai biakan murni dalam medium buatan. Isolasi dilakukan untuk

mendapatkan koloni tunggal. Hasil isolasi dapat dilihat pada Tabel 4.

Tabel 2. Hasil Pengamatan Morfologi Bakteri

Kode isolat Morfologi koloni

Bentuk koloni

Permukaan koloni

Tepi koloni

Warna koloni

DSA2 Tidak teratur Timbul datar Bergerigi Krem

DSA3 Bulat Rata Utuh Krem

DSA4 Bulat Rata Utuh Krem

DSA5 Tidak teratur Timbul datar Berombak Krem

BSA2 Tidak teratur Timbul datar Berombak Krem

BSA3 Tidak teratur Timbul datar Utuh Krem

BSA4 Bulat Timbul datar Utuh Putih

BSA5 Bulat Timbul datar Utuh Krem

Tabel 4 menunjukkan bahwa diperoleh 8 isolat bakteri yang berhasil

diisolasi dari endofit mangrove Sonneratia alba dari Pantai Bajul Mati, Malang

Jawa Timur dengan ciri-ciri makroskopis yang berbeda. Hasil morfologi koloni

menunjukkan bahwa isolat DSA2, DSA3, BSA4, dan BSA5 memiliki bentuk bulat,

DSA2, DSA3, BSA4 dan BSA5 memiliki bentuk tidak teratur. DSA2 dan DSA3

memiliki permukaan koloni rata sedangkan DSA2, DSA3, BSA4, BSA5, BSA4,

dan BSA6 memiliki permukaan koloni timbul datar. Tipe koloni DSA3, DSA4,

BSA3, BSA4 dan BSA5 adalah utuh, sedangkan DSA2, DSA5, BSA2 memiliki

tipe koloni berombak a

BSA2, BSA3, dan BSA5

putih. morfologi koloni 8 isolat bakter

Pantai Bajul Mati, Malang

berikut.

(DSA3)

(BSA3)

Jumlah bakteri endofit tumbuhan

pada bagian daun daripada batang, akar dan buah. Jumlah bakteri endofit juga

lebih banyak terdapat pada bagian daun daripada b

(Lecava et al., 2004). Berbeda dengan Zinniel

biasanya populasi bakteri lebih banyak diakar dan sedikit di daun dan batang.

Kusumawati (2004) juga mendapatkan jumlah bakteri endofit paling banyak dari

batang miana. Helander

bakteri endofit tergantung dari jenis tanaman, struktur tanah, umur tanah,

sebaran geografis dan waktu pengambilan sampel. Jalur masuk bakteri endofit

biasanya melalui akar, namun bagian tanaman yang terpapar udara langsung

seperti daun (melalui stomata)

38

tipe koloni berombak atau bergerigi. Warna koloni DSA2, DSA3, DSA4, DSA5,

BSA2, BSA3, dan BSA5 memiliki warna isolat krem, sedangkan BSA4

. morfologi koloni 8 isolat bakteri dari endofit mangrove Sonneratia alba

, Malang Jawa Timur dapat dilihat pada Gambar 13 sebagai

(DSA4) (DSA5)

(BSA4) (BSA5)

Gambar 1. Hasil Koloni Bakteri Endofit

Jumlah bakteri endofit tumbuhan Sonneratia alba lebih banyak terdapat

pada bagian daun daripada batang, akar dan buah. Jumlah bakteri endofit juga

lebih banyak terdapat pada bagian daun daripada batang pada tumbuhan jeruk

2004). Berbeda dengan Zinniel et al., (2002), yang menyatakan

biasanya populasi bakteri lebih banyak diakar dan sedikit di daun dan batang.

Kusumawati (2004) juga mendapatkan jumlah bakteri endofit paling banyak dari

batang miana. Helander et al., (2007), menyatakan bahwa adanya variasi jumla

bakteri endofit tergantung dari jenis tanaman, struktur tanah, umur tanah,

sebaran geografis dan waktu pengambilan sampel. Jalur masuk bakteri endofit

biasanya melalui akar, namun bagian tanaman yang terpapar udara langsung

seperti daun (melalui stomata), bunga, batang dan kotiledon dapat juga sebagai

tau bergerigi. Warna koloni DSA2, DSA3, DSA4, DSA5,

arna isolat krem, sedangkan BSA4 adalah

Sonneratia alba dari

dapat dilihat pada Gambar 13 sebagai

(DSA6)

(BSA6)

lebih banyak terdapat

pada bagian daun daripada batang, akar dan buah. Jumlah bakteri endofit juga

atang pada tumbuhan jeruk

(2002), yang menyatakan

biasanya populasi bakteri lebih banyak diakar dan sedikit di daun dan batang.

Kusumawati (2004) juga mendapatkan jumlah bakteri endofit paling banyak dari

(2007), menyatakan bahwa adanya variasi jumlah

bakteri endofit tergantung dari jenis tanaman, struktur tanah, umur tanah,

sebaran geografis dan waktu pengambilan sampel. Jalur masuk bakteri endofit

biasanya melalui akar, namun bagian tanaman yang terpapar udara langsung

, bunga, batang dan kotiledon dapat juga sebagai

39

jalur masuk bakteri endofit. Studi terakhir diperoleh bakteri endofit pada akar dan

buah. Hal ini membuktikan bahwa bakteri endofit dapat diisolasi dari berbagai

jaringan tanaman seperti akar, daun, batang dan buah (Simarmata et al., 2007).

Kemudian dilakukan pemurnian isolat dengan goresan zig-zag atau

goresan T pada media LBA. Goresan zig-zag bertujuan untuk memurnikan

kembali isolat yang telah lama disimpan, selain itu untuk menghindari terjadinya

kontaminasi oleh mikroba yang tidak diinginkan. Lay (1994), menyatakan bahwa

biakan murni merupakan biakan yang hanya mengandung satu jenis bakteri dari

tiap koloni tersebut diambil dan lakukan pemurnian. Gambar streak zig-zag dapat

dilihat pada Gambar 14 sebagai berikut.

(DSA2) (DSA3) (DSA5)

(DSA5) (BSA2) (BSA3)

(BSA4) (BSA5)

40

Keterangan : Koloni yang diambil

Gambar 2. Streak zig-zag

Isolat bakteri kemudian dipindah pada media agar miring untuk dilakukan

peremajaan. Peremajaan isolat bakteri bertujuan untuk mencegah indukan

terhindar dari kontaminasi, menjaga ketersediaan cadangan bakteri serta

mengoptimalkan pertumbuhan. Pemindahan dan pemeliharaan kultur dilakukan 4

minggu sekali ke dalam media agar miring yang baru dapat dilihat pada Gambar

15.

Gambar 3. Isolat Pada Agar Miring

4.3 Skrining bakteri penghasil L-Asparaginase

Hasil dari penapisan bertujuan untuk memperoleh isolat bakteri penghasil

enzim L-asparaginase. Penapisan enzim L-asparaginase dilakukan dengan

metode plate dan media selektif M-9 yang telah diberi indikator BTB dan L-

asparagin sebagai sumber karbon dan nitrogen tunggal dalam media untuk

menapis mangrove yang mampu menghasilkan enzim L-asparaginase.

Penapisan dilakukan sebanyak 2 kali ulangan untuk mendapatkan enzim L-

asparaginase paling baik.

Enzim L-asparaginase yang dihasilkan oleh isolat akan memecah asam

amino L-asparagin menjadi asam aspartat dan amoniak, pelepasan amoniak

41

tersebut mengubah pH medium yang semula netral (pH 7.0) menjadi basa.

Perubahan pH ditandai dengan perubahan warna medium disekitar koloni

mikroba. Hal tersebut ditunjukkan dengan perubahan warna awal dari media BTB

adalah kuning dengan kondisi pH asam. Deteksi positif enzim L-asparaginase

ditandai dengan adanya perubahan formasi dari amonia, menyebabkan pH dari

kultur berubah menjadi basa dan perubahan warnanya menjadi biru yang

dihasilkan oleh bakteri tersebut. Semakin pekat warna biru yang dihasilkan maka

semakin besar aktivitas enzim L-asparaginase (Mahajan et al., 2013).

Keuntungan dari penggunaaan BTB dibandingkan dengan phenol red

adalah sebagai indikator warna BTB memberikan warna kontras yang tajam (biru

tua dan kuning cerah) diantara yang terhidrolisis dan tidak terhidrolisis

asparagine. Selain itu, penggunaan BTB meningkatkan kejernihan zona

hidrolisis, prosesnya mudah dilakukan serta cepat dan efektif untuk indikator

warna pada medium pertumbuhan mikroorganisme yang menghasilkan

L_asparaginase (Gulati et al., 1997). Hasil penapisan bakteri penghasil enzim L-

asparaginase dapat dilihat pada Gambar 16.

(a) (b)

42

(c) (d)

Keterangan : (a) dan (b) Ulangan 1 dan (c) dan (d) Ulangan 2

Gambar 4. Hasil Skrining Bakteri Penghasil Enzim L-Asparaginase

Dari Gambar 16, setelah dilakukan dua kali percobaan pada isolat daun

kode DSA4 menghasilkan warna biru paling pekat, terang dan menyebar penuh

melebihi batas garis. Sedangkan untuk sampel buah hanya satu isolat yaitu

BSA4 yang menghasilkan warna biru namun tidak seterang pada isolat DSA4.

Sedangkan pada kode isolat lain tidak menghasilkan aktivitas enzim L-

asparaginase tetapi hanya tumbuh koloni saja. Garis hitam pada cawan

digunakan untuk mempermudah melihat pertumbuhan bakteri penghasil L-

asparaginase yang diindikasikan dengan perubahan warna pada koloni. Warna

biru yang paling pekat, terang dan menyebar pada cawan merupakan bakteri

yang dapat menghasilkan enzim L-asparaginase paling baik. Pada saat

pengamatan, diberikan tanda positif (+) sesuai dengan perubahan warna pada

cawan. Apabila hidrolisisnya rendah diberikan tanda (+) satu kali, hidrolisis

sedang positif (++) dua kali dan bila hidrolisis tinggi maka positif (+++) tiga kali.

Sedangkan apabila tidak menghasilkan maka diberi tanda negatif (-).

Hasil penapisan menunjukkan bahwa isolat bakteri yang menghasilkan

enzim L-asparaginase adalah dari endofit mangrove dapat dilihat pada Tabel 5.

43

Tabel 3. Hasil Penapisan Bakteri Endofit Mangrove

No Isolat Aktivitas enzim L-asparaginase

Ulangan1 Ulangan 2

1 DSA3 ++ ++

2 DSA4 - -

3 DSA5 +++ +++

4 DSA6 ++ +

5 BSA3 - -

6 BSA4 - -

7 BSA5 ++ +

8 BSA6 - -

Keterangan = - = Tidak ada aktivitas + = Aktivitas hidrolisis rendah ++ = Aktivitas hidrolisis sedang +++ = Aktivitas hidrolisis tinggi

Dari tabel diatas, dapat disimpulkan bahwa dari 8 isolat bakteri endofit

yang berhasil diisolasi mampu menghasilkan enzim L-asparaginase dengan baik

adalah isolat DSA4 yang mempunyai hasil postif (+++) tiga kali. Dari hasil diatas

dapat diketahui bahwa, pada isolat DSA4 adalah isolat bakteri yang mampu

menghidrolisis dengan baik pada medium L-asparginase, karena setelah

dilakukan dua kali percobaan isolat tersebut yang paling baik menghasilkan

aktivitas enzim L-asparaginase, sehingga dapat digunakan untuk uji identifikasi

dengan Microbact untuk mengetahui jenis spesies bakterinya.

4.4 Hasil Uji Identifikasi Bakteri

Identifikasi yang dilakukan meliputi pengamatan visual, pewarnaan Gram

dan uji Biokimia. Pengamatan visual dilakukan dengan mengamati bentuk dan

warna koloni yang akan diidentifikasi. Pewarnaan Gram digunakan untuk

mengetahui morfologi sel bakteri serta untuk membedakan bakteri Gram positif

dan Gram negatif. Jika dilihat dibawah mikroskop, bakteri Gram positif akan

berwarna ungu dikarenakan dinding sel dapat menahan kompleks pewarna

primer (CGV-Lugol), sedangkan bakteri Gram negatif berwarna merah karena

44

pada pewarna primer (CGV-Lugol) hilang akibat pembilasan dengan alkohol dan

terwarnai oleh pewarna lugol. Identifikasi dengan microbact identification

dilakukan menggunakan microbact 24E karena hasil oksidasinya positif..

Pengamatan morfologi pada isolat bakteri DSA5 penghasil enzim L-

asparaginase pertama-tama dilakukan dengan pengamatan visual. Bakteri

tersebut memiliki spora, berwarna krem dan bentuk koloni bulat. Sel bakteri ini

berbentuk basil, diameter koloni 3,82 mm, tepi koloni tidak rata, elevansi koloni

datar, konsistensi basah dan tergolong Gram positif. Hasil menunjukkan

kesamaan dengan buku Bergey’s (1986) bahwa bakteri Bacillus megaterium

termasuk dalam golongan bakteri Gram positif, memiliki warna krem atau kuning,

bentuk koloni bulat dan diameter koloni >1 µm. Berikut adalah gambar dari koloni

dan hasil pewarnaan Gram (1000Χ) dapat dilihat pada Gambar 17.

Gambar 5. A. Foto Koloni dan B. Foto Sel Bacillus megaterium Pada Perbesaran 1000X

Microbact identification yang digunakan adalah 24E yaitu kombinasi dari

12A, 12B dan 12E atau disebut juga uji biokimia. Ciri-ciri utama suatu bakteri

yang perlu diketahui dalam mengkarakterisasi bakteri adalah melalui beberapa

uji morfologi dan uji biokimia (Sudarsono, 2008). Hasil perbandingan dari hasil

Uji Microbact Identification isolat bakteri dengan pustaka (Bergey’s Manual of

Determinative Bacteriology dapat dilihat pada Tabel 6 sebagai berikut.

B A

45

Tabel 4. Hasil Uji Microbact Identification

No. Uji biokimia isolat Buku Bergey’s bakteri Bacillus

megaterium

Keterangan

1 Spora + + Cocok 2 Katalase - + Tidak cocok 3 Oksidase + + Cocok 4 Nitrat + + Cocok 5 Lysin - - Cocok 6 V-P - - Cocok 7 H2S - - Cocok 8 Indol - - Cocok 9 Motilitas - + Tidak Cocok 10 Ornithin - - Cocok 11 Arginin - - Cocok 12 Urease - Td

13 Sitrat - + Tidak Cocok

14 Koagulase + Td 15 ONPG + Td 16 TDA - Td

17

Uji Gula-gula = - Glukosa - Arabinosa - Xylosa - Manitol - Adonitol - Inositol - Lactosa - Rafinosa - Ramnosa - Salicin - Sukrosa

+ - - - - - + - - - -

+ - + +

Td Td Td Td Td Td Td

Cocok Cocok

Tidak Cocok Tidak Cocok

18

Hidrolysis = - Gelatine - Starch - Casein

- + +

+ + +

Tidak Cocok Cocok Cocok

19 Malonate - Td 20 hemolisa Beta Beta Cocok

21 Uji sensitive Novobiosin

TDK TDK cocok

Keterangan: td : Tidak ada dalam pustaka

Berdasarkan Tabel 6 hasil uji biokimia pada isolat DSA4 mempunyai ciri-

ciri sebagai berikut : memiliki spora, katalase negatif, oksidase positif, nitrat

positif, lysine negatif, VP negatif, H2S negatif, indol negatif, motilitas negatif,

46

ornithin negatif, arginin negatif, urease negatif, urease negatif, sitrat negatif, sitrat

negatif, koagulase positif, ONPG positif, TDA negatif, glukosa positif, arabinose

negatif, xylosa negatif, manitol negatif, adonitol negatif, inositol negatif, loctosa

positif, rafinosa negatif, ramnosa negatif, salicin negatif, sukrosa negatif, gelatin

negatif, starch positif, casein positif, malonate negatif, hemolisa beta dan tidak

sensitif novobiosin. Dari hasil uji microbact mengacu dengan Bergey’s Manual of

Determinative Bacteriology bahwa spesies bakteri Bacillus megaterium memiliki

persamaan sifat biokimia. Hal ini sesuai dengan Fithriyah (2015), bahwa isolat

bakteri Bacillus megaterium memiliki ciri yaitu selnya berbentuk batang (basil),

mempunyai spora, mampu memfermentasi gula – gula (glukosa, manitol sukrosa,

arabinosa, dan xylosa), aktif pada suhu 20ºC sampai 45ºC, positif membentuk β-

helolisa, tidak resisten terhadap Novobiocin, mengkatalase dan

menghidroksidase hydrogen untuk menghasilkan oksigen

Klasifikasi dari Bacillus megaterium menurut Brook (2001), adalah

sebagai berikut :

Kingdom : Prokaryota Divisio : Protophyta Class : Schizomycetes Ordo : Eubacteriales Family : Bacillaceae Genus : Bacillus Spesies : Bacillus megaterium

Bacillus megaterium adalah bakteri gram positif, berbentuk batang

pembentuk endospora. Bakteri ini termasuk dalam bakteri aerobik, tetapi bakteri

ini juga mampu tumbuh di bawah kondisi anaerobik bila diperlukan (Reddy et al.,

2010). Bakteri tumbuh pada suhu 15ºC - 45ºC, reaksi gula-gula positif pada

glukosa xylosa, manitol, sukrosa, maltose dan arabinosa dan negatif pada

laktosa, media tumbuh positif pada Nutrient Broth (NB) dan negatif pada media

MCA, citrate, indol, MR, VP, motalitas positif, tidak menghidrolisis pati, sensitif

47

terhadap penisilin, reaksi dengan β hemolisa, katalase positif, oksidase positif,

tidak mereduksi nitrat dan methylen blue ( Brenner et al., 2005).

Beberapa golongan Bacillus sp. Seperti megaterium merupakan bakteri

aerob, gram positif, berbentuk batang dengan ukuran diameter 1,2 – 1,5 µm dan

panjang 2,0 – 2,4 µm, bentuk sel-sel silindris sampai oval dan bentuk pear, dan

motil endospora. Selain itu bakteri ini juga ditemukan dari beberapa perairan dan

mangrove Avicennia marina, Rhizophora apiculata, Avicennia alba dan

Sonneratia alba (Yahya et al., 2014).

Bacillus megaterium merupakan bakteri non-patogen dan biasanya

ditemukan pada tanah dan sumber air panas. Spesies ini menjadi menarik

karena mampu memproduksi enzim yang menjanjikan dalam bidang

bioteknologi, produksi rekombinan protein, dan produksi rekombinan fragmen

antibodi. Disisi lain bakteri ini tidak mampu untuk memproduksi protease (Malle

et al., 2012).

Hasil identifikasi pada penelitian ini dengan buku panduan manual

Bergey’s (1986) mengenai karakteristik Bacillus megaterium menunjukkan

beberapa perbedaan hasil meliputi uji motilitas, manitol, xylitol, sitrat, gelatin dan

katalase. Pada penelitian ini uji motilitas, manitol, xylitol, sitrat, gelatin dan

katalase menadapatkan hasil (-) sedangkan pada buku Bergey’s (1986), uji

motilitas, manitol, xylitol, sitrat, gelatin dan katalase menunjukkan hasil positif (+).

Perbedaan hasil tersebut dapat terjadi karena bakteri merupakan makhluk hidup

yang dapat berubah karena dipengaruhi oleh faktor lingkungan sehingga hasil

yang didapatkan tidak selalu sama persis. Selain faktor lingkungan juga

dipengaruhi saat melakukan tahap isolasi dan identifikasi bakteri tersebut.

Berdasarkan pengamatan identifikasi, morfologi, pewarnaan Gram dan uji

biokimia dan dibandingkan dengan buku panduan manual bergey’s (1986) dapat

48

disimpulkan bahwa bakteri penghasil enzim L-asparaginase pada endofit

mangrove berasal dari genus Bacillus, dengan spesies Bacillus megaterium.