sintesis turunan arilamida-3 dan uji aktivitas in...

SINTESIS TURUNAN ARILAMIDA-3 DAN UJI AKTIVITAS IN VITRO

TERHADAP ENZIM MATRIX METALLOPROTEINASE-9 (MMP-9)

SEBAGAI KANDIDAT ANTI-KANKER PAYUDARA

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Diajukan oleh :

Kevin Cahaya Putra

NIM : 158114111

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2019

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i

SINTESIS TURUNAN ARILAMIDA-3 DAN UJI AKTIVITAS IN VITRO

TERHADAP ENZIM MATRIX METALLOPROTEINASE-9 (MMP-9)

SEBAGAI KANDIDAT ANTI-KANKER PAYUDARA

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Diajukan oleh :

Kevin Cahaya Putra

NIM : 158114111

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2019


ii


iii


iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

“Segala perkara dapat kutanggung di dalam Dia yang

memberi kekuatan kepadaku”

(Filipi 4:13)

“Diberkatilah orang yang mengandalkan Tuhan, yang

menaruh harapannya pada Tuhan!”

(Yeremia 17:7)


v


vi


vii

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa karena

berkat anugerah-Nya penulis dapat melewati tiga setengah tahun untuk

menjalankan studi di almamaternya dan sampai pada skripsi yang berjudul “Sintesis

Turunan Arilamida-3 dan Uji Aktivitas In Vitro Terhadap Enzim Matrix

Metalloproteinase-9 (MMP-9) Sebagai Kandidat Anti-Kanker Payudara”.

Penelitian ini merupakan bagian dari penelitian Maywan Hariono, Ph.D., Apt. yang

didanai oleh Indonesia Toray Science Foundation periode 2017/2018 dengan judul

“Synthesis, Enzymatic Assay, and Molecular Modelling of Purin Derivatives

Targeting Hemopexin Domain of Matrix Metalloproteinase-9 (PEX-9) in the

Discovery of Novel Anti-Breast Cancer”. Perjalanan studi yang penulis tempuh

penuh suka dan duka, namun skripsi ini dapat ditempuh dengan baik dan tepat

waktu. Skripsi ini disusun sebagai syarat untuk memperoleh gelar sarjana Farmasi

(S.Farm.) di Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Banyak pihak yang turut serta membantu, mendukung, dan membimbing

penulis dalam penyusunan naskah skripsi ini. Tanpa bantuan mereka, penulis tidak

mungkin sampai pada tahap penyelesaian skripsi ini. Oleh karena itu, penulis

hendak mengucapkan terima kasih yang sedalam-dalamnya kepada:

1. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Bapak Maywan Hariono, Ph.D., Apt. selaku dosen pembimbing skripsi

yang dengan sabar dan tulus membimbing tim penelitian sampai detik ini

serta selalu memberikan dukungan, kritik dan saran kepada penulis dari

awal penyusunan skripsi hingga selesai.

3. Ibu Phebe Hendra, M.Si., Ph.D., Apt. dan ibu Dr. Erna Tri Wulandari, M.Si.,

Apt., selaku dosen penguji skripsi yang menyemangati dan memberi

masukan dalam menyelesaikan penelitian ini.

4. Almarhumah mama yang sampai detik terakhir menghembuskan nafas

terakhir selalu mendukung dan menyemangati penulis dalam studinya

sehingga penulis termotivasi lebih untuk membahagiakan mama disana

dengan penyelesaian skripsi ini.


viii

5. Papa yang selalu setia, memotivasi, mendukung, dan membantu penulis

dalam mengerjakan skripsi sampai pada tahap akhir hingga selesainya

skripsi ini.

6. Adik-adik yang selalu mengerti dan menyemangati penulis ketika

mengerjakan skripsi dan semoga adik-adik segera menyusul penulis dalam

mengerjakan skripsi mereka kelak.

7. Mak yang selalu sabar dan mendukung penulis dalam mengerjakan skripsi,

penulis berharap agar mak sehat selalu.

8. Ndut yang selalu mengerti, mendukung, dan membantu penulis dari awal

hingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini dan bersama-sama

merasakan suka-duka selama dua tahun ini.

9. “Skripsi Analog” yang terdiri dari teman-teman penelitian Ervan, Krisna,

Sangga, Wisnu, dan Aldo yang selalu bekerja bersama-sama hingga larut

malam dan merasakan suka-duka bersama selama mengerjakan penelitian

ini terutama saat mengerjakan “kurva baku” bersama.

10. Sahabat-sahabat yang tidak sengaja ditemukan di Farmasi “Pethodon”

Sangga, Ricky, Ervan, Aris, Willy, dan Kemara yang selalu mengerti satu

sama lain dan menempuh suka-duka bersama selama tiga setengah tahun

ini.

11. Sahabat-sahabat pejuang nonton bioskop “Survivor” Sangga, Cicik, Ricky,

Yansen, Gumi, Momon, dan Vivi yang telah berjuang bersama dalam satu

kelas selama tiga setengah tahun ini.

12. Sahabat-sahabat penikmat sus coklat “Sus Coklat” Sangga, Ricky, Felis,

Glenys, dan Trisna yang selalu berbagi dan menikmati sus coklat bersama.

13. Sahabat-sahabat yang satu dalam iman dan tidak pernah melupakan salah

satu sahabatnya “Cross” yang ada untuk menyemangati penulis.

14. Sahabat-sahabat yang tidak pernah pudar “Crossworshipper” selalu

memberikan semangat dan dukungan satu sama lain serta tidak pernah lupa

dengan sahabat-sahabatnya.


ix


x

ABSTRAK

Pada kanker payudara, diketahui bahwa enzim matrix metalloproteinase

(MMP) dan khususnya MMP-9 diekspresikan dalam jumlah yang tinggi sehingga

banyak penelitian tentang penemuan MMP inhibitor (MMPI). Kebanyakan MMPI

diketahui gagal pada uji klinis karena menimbulkan efek samping yang merugikan

seperti inflamasi dan sindroma muskuloskeletal. Penelitian ini bertujuan untuk

mensintesis senyawa arilamida-3 yang dirancang aktif menghambat MMP-9 pada

hemopexin domain (PEX-9) dengan mereaksikan 3,4,5-trimetoksianilin dan 3-

bromopropionil klorida dengan katalisator piridin pada suhu kamar. Produk hasil

sintesis berupa serbuk berwarna putih dan larut dalam kloroform dengan titik lebur

115,7-120,1°C. Uji DAB-HCl menunjukkan hasil negatif yang berarti gugus amina

primer telah tersubstitusi. Uji KLT menunjukkan senyawa hasil sintesis berbeda

dengan bahan baku dan murni secara KLT. Hasil elusidasi struktur menunjukkan

proton etilen terletak pada geseran kimia 2-4 ppm berdasarkan 1H-NMR dan 15-55

ppm pada 13C-NMR, C=O dan -NH- amida pada 1658,78 dan 3448,72 cm-1

berdasarkan FTIR, serta m/z 317 berdasarkan GC-MS. Senyawa hasil sintesis diuji

aktivitasnya dalam menghambat enzim MMP-9 in vitro dengan fluorogenic assay.

Hasil uji in vitro menunjukkan persen penghambatan senyawa arilamida-3 sebesar

5% pada konsentrasi 200 µg/mL mengindikasikan bahwa senyawa tersebut

mempunyai aktivitas rendah dalam menghambat MMP-9.

Kata kunci: hemopexin, in vitro, kanker payudara, matrix metalloproteinase-9

(MMP-9), senyawa arilamida-3


xi

ABSTRACT

In breast cancer, it is known that Matrix Metalloproteinase-9 enzyme

(MMP-9) and especially MMP-9 are highly expressed by the cancer cells so that

many studies have been done to discover MMP inhibitor. Most of these inhibitors

fail in clinical trials due to the adverse side effects such an inflammation and

musculoskeletal syndrome. This study aims to synthesize arylamide derivative-3

which is selectively targeting hemopexin domain (PEX-9) by reacting 3,4,5-

trimethoxyaniline and 3-bromopropionyl chloride with pyridine as catalysator at

room temperature. The product was determined its physical appearance as a white

powder which is soluble in chloroform with 115,7-120,1°C melting point. DAB-

HCl test showed negative result which is confirming substitution of primary amine

group at 3,4,5-trimethoxyaniline. Arylamide-3 is pure by KLT and has different Rf

with 3,4,5-trimethoxyaniline. Structure elucidation showed ethylene proton appears

at 2-4 ppm using 1H-NMR and its carbon appears at 15-55 ppm using 13C-NMR,

carbonyl group and secondary amine appears at 1658,78 and 3448,72 cm-1 using

FTIR, and m/z 317 using GC-MS. Arylamide derivative-3 was then tested for its

activity in inhibiting MMP-9 in vitro with fluorogenic assay. The results showed a

percent inhibition of arylamide-3 of 5% at 200 µg/mL associated with its low

activity to inhibit MMP-9.

Keyword: arylamide-3 compound, breast cancer, hemopexin, in vitro, matrix

metalloproteinase-9 (MMP-9)


xii

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN SAMPUL……………………………………………… i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING…………………….. ii

HALAMAN PENGESAHAN………………………………………. iii

HALAMAN PERSEMBAHAN…………………………………….. iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA…………………………….. v

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI……….. vi

PRAKATA…………………………………………………………... vii

ABSTRAK…………………………………………………………... x

ABSTRACT…………………………………………………………... xi

DAFTAR ISI………………………………………………………… xii

DAFTAR TABEL…………………………………………………… xiii

DAFTAR GAMBAR………………………………………………... xiv

DAFTAR LAMPIRAN……………………………………………… xv

PENDAHULUAN…………………………………………………… 1

METODE PENELITIAN……………………………………………. 4

HASIL DAN PEMBAHASAN……………………………………… 7

KESIMPULAN……………………………………………………… 16

SARAN……………………………………………………………… 16

UCAPAN TERIMA KASIH………………………………………… 17

DAFTAR PUSTAKA……………………………………………….. 18

LAMPIRAN…………………………………………………………. 20

BIOGRAFI PENULIS………………………………………………. 27


xiii

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1. Perhitungan persen penghambatan senyawa arilamida-3

terhadap MMP-9……………………………………….

16


xiv

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Struktur Senyawa 2 dengan gugus fungsi yang diduga

farmakofor (Dufour et al., 2011)……………………….

1

Gambar 2. Struktur arilamida-3 dengan gugus fungsi yang mirip

dengan Senyawa 2……………………………………...

3

Gambar 3. (a) Struktur senyawa milik Adhipandito, (b) Struktur

senyawa milik Ludji……………………………………

4

Gambar 4. Spektrum 1H-NMR senyawa arilamida-3 dengan

ditandakannya masing-masing sinyal A, B, C, D, dan E

beserta karakteristik masing-masing sinyal……………..

11

Gambar 5. Spektrum 13C-NMR senyawa arilamida-3 dengan

ditandakannya masing-masing sinyal A, B, C, D, E, F,

G, I, dan J beserta karakteristik masing-masing sinyal….

12

Gambar 6. Spektrum inframerah senyawa arilamida-3……………. 13

Gambar 7. Kromatogram GC arilamida-3 dengan ditandakannya

masing-masing puncak A, B, C, D, dan E………………

14

Gambar 8. Spektrum MS senyawa arilamida-3……………………. 14

Gambar 9. Struktur 3D kristalografi sinar X senyawa arilamida-

3…………………………………………………………

15


xv

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Representasi tata letak 96-microwell plate dengan B:

bufer, Sp: sampel senyawa arilamida-3, E: enzim

MMP-9, dan Sb: substrat disertai dengan volume

dalam µL…………………………………………….

20

Lampiran 2. Mekanisme reaksi SNA antara 3,4,5-trimetoksianilin

dan 3-bromopropionil klorida……………………….

20

Lampiran 3 (a) Sintesis senyawa arilamida-3 pada awal

pengadukan, (b) Crude product setelah dibilas dengan

aquadest dan dibiarkan mengering………….

21

Lampiran 4. (a) Serbuk 3,4,5-trimetoksianilin yang berwarna

sedikit kekuningan (b) Serbuk arilamida-3 yang

berwarna putih……………………………………….

21

Lampiran 5. Hasil Uji Kelarutan Senyawa Arilamida-3………….. 22

Lampiran 6. Mekanisme reaksi antara DAB-HCl dan 3,4,5-

trimetoksianilin……………………………………...

22

Lampiran 7. Hasil uji pendahuluan DAB-HCl antara bahan baku

dan arilamida-3……………………………………...

23

Lampiran 8. Profil KLT arilamida-3 (Rf = 0,55) dibandingkan

dengan bahan baku (Rf = 0,38).……………………...

23

Lampiran 9. Perhitungan bahan sintesis dan hasil rendemen

senyawa arilamida-3………………………………...

24

Lampiran 10. Perbesaran spektrum 1H-NMR pada geseran 2,6-4,1

ppm………………………………………………….

25

Lampiran 11. Perbesaran spektrum 1H-NMR pada geseran 6,1-7,9

ppm…………………………………………………..

25

Lampiran 12. Spektrum inframerah senyawa 3,4,5-

trimetoksianilin………………………………………

26


1

PENDAHULUAN

Pada tahun 2011, Dufour et al., menemukan suatu obat yang secara selektif

menghambat enzim matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) pada kanker payudara.

Pada penelitian tersebut dilakukan penapisan virtual dan uji in vitro terhadap 5

senyawa yang diduga aktif menghambat aktivitas MMP-9. Senyawa yang paling

aktif adalah senyawa dari database ZINC dengan kode 135415473 (~{N}-[4-

(difluoromethoxy)phenyl]-2-[(6-oxo-4-propyl-1~{H}-pyrimidin-2-yl)sulfanyl]

acetamide) yang kemudian disebut Senyawa 2 dengan struktur seperti pada Gambar

1. Senyawa 2 ditemukan aktif in silico dan in vitro diduga karena memiliki cincin

planar dan gugus aril amida yang berinteraksi secara selektif dengan kantung aktif

MMP-9 pada domain non-katalitik (Dufour et al., 2011).

Gambar 1. Struktur Senyawa 2 dengan gugus fungsi yang diduga farmakofor (Dufour et

al., 2011)

Pada awal tahun 1990-an, MMP mulai diketahui memiliki peranan besar

dalam perkembangan kanker. Oleh karena itu, banyak ditemukan MMP inhibitor

(MMPI) sebagai strategi untuk terapi kanker dengan mentarget domain katalitik

dari MMP. Namun, beberapa dari obat-obat tersebut gagal dalam berbagai fase uji

klinis karena tidak selektifnya domain katalitik pada semua MMP terhadap MMPI.

Semua MMP (MMP-1 sampai MMP-26) akan dihambat padahal MMP lain juga

diperlukan tubuh untuk metabolisme normal yang salah satunya untuk

penyembuhan luka. Salah satu MMPI yaitu marimastat dapat menyebabkan efek

samping sindroma muskuloskeletal dan inflamasi. Selain itu, senyawa ini diketahui

secara statistik tidak meningkatkan kualitas hidup pasien secara signifikan pada uji

klinis. Ketidakselektifan MMPI tersebut disebabkan domain katalitik memiliki

Cincin planar

Rantai

alkil

Gugus aril amida


2

kemiripan sekuens asam amino sejumlah 43-65% dengan semua MMP (Dufour et

al., 2011, Cathcart et al., 2015).

Semua kelompok MMP memiliki bagian struktur yang terdiri dari signal

peptide, propeptide domain, domain katalitik, dan hemopexin domain (PEX)

(Bauvois, 2012). Uniknya, hemopexin MMP-9 (PEX-9) hanya mempunyai

kemiripan kurang lebih 25-35% dengan PEX domain pada MMP lain (Dufour et

al., 2011, Ugarte-Berzal et al., 2016). Hal ini menjadikan PEX-9 lebih selektif

ditargetkan dalam penemuan obat kanker melalui mekanisme penghambatan MMP

(Dufour et al., 2011).

Pada tahun 2018, kanker memiliki jumlah kasus baru sebanyak 18,1 juta

dan jumlah kematian sebanyak 9,6 juta. Kanker payudara merupakan jenis kanker

dengan penyebab kematian terbanyak kelima di dunia dengan angka 6,6%. Pada

wanita, kanker payudara merupakan kanker yang sangat umum terdiagnosis

diantara kanker yang lain dengan angka kejadian kasus sebanyak 24,2% (IARC,

2018). Kanker payudara paling banyak dialami oleh wanita di Indonesia setelah

kanker serviks (Wahidin et al., 2012). Kasus kanker payudara di Indonesia terdapat

sebanyak 0,5% dan DI Yogyakarta merupakan provinsi dengan kasus kanker

payudara terbanyak yaitu sebanyak 2,4% (Kemenkes, 2015).

Kebanyakan penyebab kematian pada penderita kanker bukan karena tumor

primer, melainkan karena metastasis yang biasanya dialami oleh penderita kanker

stadium akhir. Metastasis merupakan proses menyebarnya sel tumor ke organ lain

melalui pembuluh darah, dan 90% penderita kanker yang telah mencapai tahap

metastasis mengalami kematian (Welch et al., 2000, Chaffer and Weinberg, 2011).

Sel tumor yang mengalami metastasis akan melewati extracellular matrix

(ECM) yang mengontrol sel untuk bermigrasi dari satu organ ke organ yang lain

melalui pembuluh darah. Hal ini karena sel tumor memproduksi MMP yang

merupakan enzim untuk mendegradasi ECM (Gialeli et al., 2011). Pada kanker

payudara, ditemukan ekspresi MMP-9 yang tinggi dibandingkan dengan payudara

normal dan ini merupakan ciri khas dari kanker payudara jenis triple-negative dan

human epidermal growth factor receptor 2-positive (HER2-positive) yang belum


3

ada obatnya. Studi menunjukan adanya hubungan ekspresi berlebihan MMP-9

dengan tingginya insiden metastasis (Yousef et al., 2014).

Pada penelitian ini telah disintesis turunan dari Senyawa 2 yang akan diberi

nama arilamida-3 yang strukturnya disajikan pada Gambar 2. Senyawa ini

merupakan turunan arilamida yang disintesis dari 3,4,5-trimetoksianilin dan 3-

bromopropionil klorida. Pada bagian meta dan para dari cincin arilamida terdapat

gugus metoksi.

Gambar 2. Struktur arilamida-3 dengan gugus fungsi yang mirip dengan Senyawa 2

Senyawa yang akan disintesis oleh peneliti tidak mengadaptasi seluruh

farmakofor dari penelitian Dufour, melainkan hanya mengadaptasi gugus arilamida

dan rantai alkil. Adhipandito (2017) dan Ludji (2017) telah mensintesis 2 senyawa

yang merupakan fragmen dari Senyawa 2 milik Dufour dan telah di uji aktivitasnya

terhadap enzim MMP-9 in vitro. Tahap sintesis dalam penelitian mereka telah

dipublikasikan, namun tahap uji in vitro belum sampai pada tahap publikasi.

Senyawa Adhipandito dan Ludji disajikan pada Gambar 3. Persen penghambatan

terhadap enzim MMP-9 senyawa Adhipandito sebesar 11% dan Ludji sebesar 69%.

Pada senyawa Dufour, tidak dijelaskan fungsi gugus fungsional -OCHF2 yang

berkarakter Electron Withdrawing Group (EWG) dan Electron Donating Group

(EDG). Maka dari itu tujuan Ludji memodifikasi bagian tersebut dengan

memasukkan gugus nitro yang bersifat EWG dan ternyata meningkatkan aktivitas

penghambatan MMP-9 dibandingkan milik Adhipandito yang tidak mengalami

modifikasi. Oleh karena itu, menarik untuk dilakukan modifikasi dengan EDG pada

posisi 3, 4, dan 5 dari cincin arilamida dengan harapan meningkatkan aktivitas

penghambatan terhadap MMP-9.

Rantai

alkil

Gugus aril amida


4

Gambar 3. (a) Struktur senyawa milik Adhipandito, (b) Struktur senyawa milik Ludji

Keuntungan yang lain adalah metode sintesis senyawa arilamida-3 hanya

melalui satu tahap dibandingkan dengan Senyawa 2 yang harus melalui dua sampai

tiga tahap reaksi kimia. Hal ini menyebabkan senyawa arilamida-3 lebih efisien dari

segi biaya dan waktu. Senyawa arilamida-3 dilihat kebenaran strukturnya dengan

spektroskopi resonansi magnetik inti, inframerah, massa, dan kristalografi x-ray.

Kemudian senyawa arilamida-3 di uji aktivitas penghambatannya terhadap enzim

MMP-9 in vitro dengan metode fluorogenic assay.

METODE PENELITIAN

Bahan

Kecuali dinyatakan lain, semua bahan kimia yang dipakai bermutu analisis

yang disuplai oleh Sigma Aldrich dan Merck. Bahan utama yang digunakan untuk

sintesis adalah: 3,4,5-trimetoksianilin, 3-bromopropionil klorida, piridin, plat silika

gel GF254, etil asetat, n-heksana, kloroform, dan 4-dimetilamino benzaldehida HCl

(DAB-HCl). Bahan yang digunakan untuk elusidasi struktur adalah: pellet kalium

bromida (KBr) dan kloroform-D (CDCl3). Bahan yang digunakan untuk uji in vitro

adalah: kit enzim MMP-9 yang terdiri dari enzim MMP-9 dari manusia yang

terliofilisasi, substrat peptida, buffer, peptida NNGH, gliserol, dan

dimetilsulfoksida (DMSO).

Alat

Alat yang digunakan untuk sintesis adalah: Labu alas bulat (Pyrex), alat-alat

gelas pada umumnya, timbangan analitik (Mettler Toledo®), melting point system

(Mettler Toledo®), pompa vakum (GAST model DOA-P504-BN), oven (Memmert

GmbH + Co.KG), dan lampu UV254. Alat yang digunakan untuk elusidasi struktur

adalah: spektrofotometer inframerah (Shimadzu), spektrometer Nuclear Magnetic


5

Resonance (Bruker 176 dan 700 MHz), dan spektrometer massa (Waters® Xevo®).

Pengujian dengan spektrometer inframerah dan massa dilakukan di Fakultas MIPA

Kimia UGM, sedangkan pengujian dengan spektrometer NMR dilakukan di Institut

Farmasetikal dan Nutrasetikal Malaysia. Alat yang digunakan untuk uji in vitro

adalah: pipet mikro (Eppendorf), micro well plate 96, pipet tips, inkubator, vortex,

Tecan Microplate Reader (Infinite 200Pro).

Tata Cara Penelitian

Sintesis Senyawa Turunan Arilamida-3 (Diadaptasi dari metode Arifiyanto,

2001)

3,4,5-trimetoksianilin sebanyak 3,59 mmol (0,66 g) dimasukkan ke dalam

labu alas bulat dan ditambahkan piridin sebagai katalis sebanyak 3,59 mmol (0,28

g; 0,29 mL). 3-bromopropionil klorida kemudian ditambahkan tetes demi tetes

sebanyak 4,00 mmol (0,69 g; 0,40 mL) sambil diaduk hingga terbentuk padatan

(reaksi dimonitor dengan KLT dalam fase gerak n-heksana:etil asetat 2:2 dan fase

diam silika gel GF254). Padatan disaring dan dicuci dengan aquadest untuk

menghilangkan sisa piridin dan HCl sebagai produk samping reaksi (dicuci hingga

pH netral). Kemudian dilakukan rekristalisasi dengan menggunakan pelarut

kloroform. Produk diuji organoleptis, titik lebur, kelarutan, KLT dan elusidasi

struktur dengan 1H-NMR, 13C-NMR, FTIR, GC-MS, dan kristalografi x-ray.

Uji Organoleptis

Bentuk dan warna dari produk hasil sintesis diamati dan diidentifikasi.

Uji Kelarutan

Senyawa hasil sintesis ditimbang sebanyak 5 mg dan dilarutkan dalam

sejumlah pelarut dari polar hingga non-polar tetes demi tetes hingga tepat larut.

Pelarut yang di uji adalah air, etanol, DMSO, aseton, kloroform, etil asetat, dan n-

heksana. Kategori kelarutan senyawa hasil sintesis ditentukan berdasarkan

Farmakope Indonesia V.

Uji DAB-HCl

3,4,5-trimetoksianilin dan senyawa hasil sintesis masing-masing ditimbang

sebanyak 1 mg kemudian dimasukkan ke dalam drupple plate. Masing-masing

diteteskan DAB-HCl dan diamati perubahan warna yang terjadi.


6

Uji KLT

3,4,5-trimetoksianilin dan senyawa hasil sintesis masing-masing ditimbang

sebanyak 1 mg kemudian dilarutkan dalam kloroform. Masing-masing senyawa

ditotolkan pada plat silika gel GF254 yang telah diaktifkan pada suhu 100°C. Totolan

berjarak 1 cm dari bawah. Plat yang disiapkan sejumlah dengan 3 sistem fase gerak

yang telah disiapkan dan dijenuhkan dengan kertas saring yaitu fase gerak n-

heksana:etil asetat dengan perbandingan 1:3, 2:2, dan 3:1 (Adhipandito, 2017).

Kemudian plat dimasukkan ke dalam gelas beker yang berisi fase gerak dan dieluasi

hingga 1 cm dari atas. Kemudian plat dikeluarkan, dikeringkan, dan dilihat

bercaknya di bawah lampu UV 254 nm serta dihitung nilai Rf.

Uji Titik Lebur

Senyawa hasil sintesis ditimbang sebanyak 1 mg dan dihaluskan. Kemudian

senyawa dimasukkan ke dalam pipa kapiler untuk dimasukkan ke dalam melting

point system. Suhu diatur dalam rentang 100-200°C dan didapatkan hasil berupa

jarak lebur.

Uji Aktivitas In Vitro

Enzim MMP-9 yang terliofilisasi direkonsitusi dengan 110 µL gliserol 30%

dalam air deionisasi. Enzim yang telah terekonstitusi dilarutkan dalam 550 µL bufer

dan siap digunakan. Sampel (200 µg/mL) sebanyak 1 µL dipipet dan dimasukkan

ke setiap sumuran 96-microwell plate dan ditambahkan 5 µL enzim MMP-9 dan 44

µL bufer. Kemudian kontrol positif dibuat dalam sumuran yang lain dengan

mencampurkan 2 µL inhibitor NNGH (Asparagin-Asparagin-Glisin-Histidin)

(2mM), 5 µL enzim MMP-9, dan 43 µL bufer. Kemudian kontrol negatif dibuat

dalam sumuran yang lain dengan mencampurkan 5 µL enzim MMP-9 dan 45 µL

bufer sebagai kontrol negatif. Bufer dipipet sebanyak 100 µL dan dimasukkan ke

dalam sumuran yang lain sebagai blanko. Kemudian diinkubasi pada suhu 37°C

selama 30 menit. Setelah inkubasi selesai, masing-masing sumuran ditambahkan 50

µL larutan substrat kemudian diinkubasi kembali pada suhu 37°C selama 60 menit.

Tata letak 96-microwell plate disajikan pada Lampiran 1.

Fluorosensi kemudian dibaca menggunakan Tecan Microplate Reader pada

panjang gelombang eksitasi 325 nm dan emisi 393 nm. Hasil fluorosensi senyawa


7

sampel, kontrol negatif, dan kontrol positif dikurangkan blanko kemudian

didapatkan persen aktivitas enzim dengan rumus:

𝑓𝑙𝑢𝑜𝑟𝑜𝑠𝑒𝑛𝑠𝑖 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙

𝑓𝑙𝑢𝑜𝑟𝑜𝑠𝑒𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑓 𝑥 100%. Persen penghambatan MMP-9 didapatkan

dengan rumus: 100% - persen aktivitas enzim (%).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Sintesis Senyawa

Substitusi Nukleofilik Asil (SNA) merupakan reaksi yang terjadi pada

pembentukan arilamida-3 antara 3,4,5-trimetoksianilin dan 3-bromopropionil

klorida dengan piridin sebagai katalisator. Reaksi substitusi merupakan reaksi

kimia yang melibatkan penggantian gugus pergi dari suatu senyawa dengan gugus

fungsi yang lain (Smith and March 2007). Pada reaksi SNA ini, yang berperan

sebagai gugus pergi adalah gugus klorida (-Cl) dari 3-bromopropionil klorida,

sedangkan gugus pengganti adalah NH dari 3,4,5-trimetoksianilin (Koltunov et al.,

2016). Gugus klorida (-Cl) pada 3-bromopropionil klorida merupakan gugus pergi

yang baik tetapi Cl yang berkarakter elektronegatif relatif masih terikat kuat dengan

-CO- karbonil apabila tidak dipercepat dengan katalisator (Zhang et al., 2009).

Nukleofil yang akan menyerang 3-bromopropionil klorida adalah 3,4,5-

trimetoksianilin yang merupakan suatu nukleofil yang baik karena memiliki amina

primer yang pada atom N memiliki pasangan elektron bebas dan dapat bereaksi

dengan turunan asam karboksilat untuk membentuk suatu amida (Kahl et al., 2012).

Mekanisme reaksi disajikan pada Lampiran 2.

Produk awal hasil reaksi (crude product) berupa serbuk berwarna putih,

kemudian produk dibilas dengan aquadest dan dibiarkan mengering seperti terlihat

pada Lampiran 3. Pencucian dengan aquadest bertujuan untuk menghilangkan sisa

piridin dan HCl yang terbentuk sebagai produk sampingan karena dikhawatirkan

HCl akan menghidrolisis produk yang berupa amida.

Uji pendahuluan hasil sintesis arilamida-3 ditegakkan dengan uji

organoleptis, kelarutan, DAB-HCl, KLT, dan titik lebur. Pada uji organoleptis

terlihat senyawa hasil sintesis berupa serbuk berwarna putih. Warna senyawa hasil

sintesis berbeda dengan senyawa awal yang memiliki warna sedikit kekuningan


8

seperti terlihat pada Lampiran 4. Perbedaan warna antara senyawa awal dan

senyawa hasil sintesis menunjukkan bahwa senyawa hasil sintesis berbeda dengan

senyawa awal. Pada uji kelarutan, senyawa arilamida-3 larut dalam kloroform,

aseton, etil asetat, dan DMSO sehingga arilamida-3 bersifat semi polar. Hasil uji

kelarutan disajikan pada Lampiran 5.

Pada uji DAB-HCl, senyawa yang memiliki gugus amina primer akan

bereaksi dengan DAB-HCl dan membentuk basa Schiff yang berwarna jingga,

sedangkan senyawa yang tidak memiliki amina primer tidak akan bereaksi dengan

DAB-HCl dan tidak menghasilkan warna jingga (Adegoke, 2011). Arilamida-3

tidak bereaksi dengan DAB-HCl dan tidak membentuk warna jingga karena pada

arilamida-3 gugus amina primer sudah mengalami substitusi dengan 3-

bromopropionil klorida. Mekanisme reaksi DAB-HCl dengan 3,4,5-

trimetoksianilin disajikan pada Lampiran 6, sedangkan hasil uji pendahuluan yang

membedakan antara bahan baku dengan hasil sintesis disajikan pada Lampiran 7.

Pada uji KLT, sistem fase gerak yang dipilih adalah n-heksana:etil asetat 2:2 karena

perbedaan Rf antara bahan baku dan arilamida-3 lebih besar dibandingkan dengan

n-heksana:etil asetat 1:3 dan 3:1. Pada fase gerak n-heksana:etil asetat 2:2,

arilamida-3 memiliki faktor retensi (Rf) sebesar 0,55 dan bahan baku (3,4,5-

trimetoksianilin) sebesar 0,38. Perbedaan Rf ini menunjukkan bahwa produk hasil

sintesis merupakan senyawa yang berbeda dengan bahan baku atau dengan kata lain

telah berhasil disintesis. Profil KLT arilamida-3 dibandingkan dengan bahan baku

disajikan pada Lampiran 8.

Produk hasil sintesis dinyatakan murni secara KLT sehingga tidak

diperlukan pemurnian dengan kromatografi kolom. Uji yang dilakukan selanjutnya

yaitu uji titik lebur untuk mengetahui perbedaan jarak lebur antara senyawa hasil

sintesis dengan bahan baku. Apabila terjadi perbedaan yang signifikan antara bahan

baku dengan senyawa hasil sintesis maka prediksi bahwa arilamida-3 sudah

terbentuk semakin kuat. Selain itu, jarak lebur mengindikasikan kemurnian suatu

senyawa yang apabila berjarak kurang dari ≤1,5°C maka dinyatakan murni secara

titik lebur. Hasil percobaan menunjukkan bahwa senyawa hasil sintesis memiliki

titik lebur 115,7-120,1°C yang berbeda dengan bahan baku yaitu 3,4,5-


9

trimetoksianilin yang memiliki jarak lebur 111-114°C (Oakwood Products, 2018).

Jarak lebur yang lebih dari 1,5°C berarti mengindikasikan senyawa belum murni

100% karena jarak lebur yang lebar menunjukkan masih terdapat pelarut atau

reagen yang masih belum terbilas atau teruapkan. Pemurnian senyawa dapat

dilakukan dengan rekristalisasi atau kromatografi kolom agar mendapatkan jarak

lebur yang sesuai dengan syarat kemurnian.

Rendemen produk yang didapatkan sebanyak 23,5%. Rendemen ini masih

jauh dari kriteria ideal (100%) sehingga masih memerlukan optimasi terkait mol

bahan, suhu, katalisator, atau lama pengadukan pada prosedur sintesis dan

pemurniannya. Perhitungan rendemen disajikan pada Lampiran 9.

Elusidasi Struktur

Kerangka hidrokarbon senyawa hasil sintesis ditentukan dengan

spektroskopi NMR yang terdiri dari proton-1 (1H) dan karbon-13 (13C). Spektrum

1H-NMR disajikan pada Gambar 4 yang menunjukkan sinyal-sinyal sebagai

berikut: sinyal pada pergeseran 2,809 ppm dan 2,935 ppm adalah proton etilen (B)

sedangkan sinyal pada pergeseran 3,716 ppm dan 3,890 ppm adalah proton etilen

(A). Kedua set proton ini menegaskan bahwa senyawa hasil sintesis sudah

terbentuk. Pola splitting sinyal kedua set tersebut adalah triplet. Hal ini karena

kedua set proton saling bertetangga dengan jumlah proton tetangga yang tidak

ekivalen sebanyak 2. Normalnya kedua set proton ini muncul sebagai 2 sinyal

triplet, namun hasil percobaan menunjukkan munculnya 4 sinyal triplet pada jarak

yang saling berdekatan. Hal ini mungkin disebabkan 2 proton pada C yang sama

bisa merasakan 2 kali lingkungan magnetik dari proton tetangganya. Hal ini

ditegaskan dengan jumlah integrasi sebanyak 2 untuk 2 sinyal triplet yang saling

berdekatan. J-coupling constant untuk kedua sinyal triplet = 7 Hz yang

mengindikasikan bahwa kedua set proton bertetangga secara langsung. Proton

etilen (A) berada pada geseran kimia yang lebih deshielded dibandingkan dengan

proton etilen (B) karena proton (A) terikat langsung dengan atom Br yang memiliki

elektronegatifitas tinggi (Fessenden, 1986, Pavia et al., 2015).

Proton selanjutnya adalah metoksi yang muncul pada geseran 3,853 ppm

dan 3,817 ppm. Sinyal pada geseran 3,853 ppm adalah metoksi (D) sedangkan


10

sinyal pada geseran 3,817 ppm adalah metoksi (E). Hal ini karena metoksi (D) lebih

dekat dengan gugus amida yang merupakan Electron Withdrawing Group (EWG)

sehingga kurang terlindungi dibandingkan dengan metoksi (E) yang berada pada

posisi para (Pavia et al., 2015). Selain itu, berdasarkan integrasinya proton (D)

dihitung sejumlah 6 sedangkan proton (E) dihitung sejumlah 3 sehingga sesuai

dengan prediksi strukturnya. Penegasan selanjutnya kedua sinyal bentuknya singlet.

Hal ini juga sesuai karena ketiga proton tidak mempunya tetangga yang tidak

ekivalen. Perbesaran spektrum 1H-NMR pada geseran 2,6-4,1 ppm disajikan pada

Lampiran 10.

Proton selanjutnya adalah proton pada benzena (C) yang muncul pada

geseran 6,841 ppm. Integrasi proton (C) dihitung sejumlah 2. Hal ini sesuai dengan

prediksi karena proton pada benzena (C) berada pada lingkungan yang sama atau

ekivalen sehingga muncul sebagai singlet dengan integrasi 2. Perbesaran spektrum

1H-NMR pada geseran 6,1-7,9 ppm disajikan pada Lampiran 11.


11

Proton Geseran

(ppm)

Splitting Integrasi J-coupling

constant (Hz)

A 3,716 dan

3,890

Triplet of

triplet

2 7

B 2,809 dan

2,935

Triplet of

triplet

2 7

C 6,841 Singlet 2

D 3,853 Singlet 6

E 3,817 singlet 3

Gambar 4. Spektrum 1H-NMR senyawa arilamida-3 dengan ditandakannya masing-

masing sinyal A, B, C, D, dan E beserta karakteristik masing-masing sinyal

Pada spektrum 13C-NMR, terdapat 9 sinyal yang diindikasi sebagai karbon

pada senyawa hasil sintesis. Karbon etilen (A) dan (B) muncul pada geseran 39,81

ppm dan 26,96 ppm. Karbon metoksi (I) dan (J) muncul pada geseran 60,98 ppm

dan 56,14 ppm. Karbon pada benzena (G), (F), (E), dan (D) muncul pada geseran

97,65 ppm, 133,54 ppm, 134,94 ppm, dan 153,37 ppm. Karbon karbonil (C) muncul

pada geseran 167,83 ppm. Hal ini sesuai dengan prediksi geseran kimia 13C-NMR

yang disajikan pada Gambar 5. Sebagai catatan bahwa 13C-NMR hanya dapat


12

diindikasi lewat geseran kimia dengan mengabaikan pola splitting, integrasi, serta

J-coupling constant. Hal ini karena 13C mempunyai momen magnetik yang rendah

sebesar 67,28 radians/Tesla dibandingkan dengan 1H yang mempunyai momen

magnetik sebesar 267,53 radians/Tesla. Selain itu, kelimpahan 13C di alam kecil

yaitu 1,08% yang menyebabkan tidak spesifiknya pola splitting serta integrasi

(Pavia et al., 2015).

Proton Geseran (ppm)

A 39,81

B 26,96

C 167,83

D 153,37

E 134,94

F 133,54

G 97,65

I 60,98

J 56,14

Gambar 5. Spektrum 13C-NMR senyawa arilamida-3 dengan ditandakannya masing-

masing sinyal A, B, C, D, E, F, G, I, dan J beserta karakteristik masing-masing sinyal


13

Metode elusidasi selanjutnya adalah FTIR yang bertujuan untuk mengetahui

gugus fungsional yang terdapat pada arilamida-3. Suatu molekul akan menyerap

radiasi inframerah yang menyebabkan molekul tersebut berada dalam keadaan

vibrasi tereksitasi kemudian energi yang terserap akan dibuang dalam bentuk panas

apabila molekul kembali ke keadaan dasar. Energi yang terserap akan menyebabkan

ikatan bervibrasi ulur (stretching vibration) atau tekuk (bending vibration).

Molekul yang dapat menyerap radiasi inframerah secara baik adalah molekul yang

memiliki momen dipol yang tinggi (Fessenden, 1986, Pavia et al., 2015).

Berdasarkan spektrum inframerah, terdapat pita pada daerah sekitar

bilangan gelombang (ῡ) 1658,78 cm-1 yang menunjukkan adanya gugus C karbonil

(C=O) dan pita yang melebar pada daerah sekitar bilangan gelombang 3448,72 cm-

1 yang menunjukkan adanya gugus NH (-NH-). Adanya gugus C karbonil dan NH

ini menandakan pada arilamida-3 terdapat gugus amida (-CONH-). Pada daerah

500-1500 cm-1 atau daerah sidik jari dapat dilihat pita-pita yang berbeda polanya

dengan senyawa awal. Spektrum inframerah senyawa awal disajikan pada

Lampiran 12 (Pubchem, 2019). Spektrium inframerah arilamida-3 disajikan pada

Gambar 6.

Gambar 6. Spektrum inframerah senyawa arilamida-3

Metode elusidasi selanjutnya adalah dengan GC-MS yang bertujuan untuk

mengetahui bobot molekul dari arilamida-3. Senyawa dipisahkan terlebih dahulu

dari impurities dengan menggunakan GC dan senyawa dianalisis bobot


14

molekulnya. Puncak F merupakan puncak tertinggi yang menunjukkan puncak

tersebut adalah senyawa arilamida-3 karena terdapat dalam konsentrasi yang paling

tinggi. Kromatogram GC arilamida-3 disajikan pada Gambar 7.

Gambar 7. Kromatogram GC arilamida-3 dengan ditandakannya masing-masing puncak

A, B, C, D, dan E

Puncak tertinggi pada kromatogram memiliki m/z sebesar 317 yang terbaca

pada spektrum MS. Hal ini mendukung kebenaran hasil sintesis arilamida-3 yang

memiliki bobot molekul sebesar 317,03 g/mol. Selain itu, senyawa arilamida-3

memiliki atom brom (Br) yang pada spektra MS memiliki ciri khas bentuk spektra

kembar dengan nilai m/z M+2 (ion molekul plus 2 satuan massa) dan intensitas

kedua peak sama. Hal ini dikarenakan Br yang terdapat pada alam terdiri dari

campuran 50,5% 79Br dan 49,5% 81Br (Zhai and Zhang, 2009, Pavia et al., 2015).

Pada spektrum MS senyawa arilamida-3 yang disajikan pada Gambar 8, terdapat

peak kembar pada 317 m/z yang menunjukkan adanya atom Br pada senyawa

arilamida-3.

Gambar 8. Spektrum MS senyawa arilamida-3

Kristalografi x-ray merupakan metode penentuan struktur yang paling sahih

dan tidak meragukan. Suatu kristal tunggal yang terkena sinar X akan


15

merefleksikan inti dari struktur senyawa tersebut seperti yang disajikan pada

Gambar 9. Secara keseluruhan, struktur arilamida-3 dipastikan kebenarannya mulai

dari 1H-NMR, 13C-NMR, FTIR, MS, dan kristalografi sinar X sehingga

disimpulkan bahwa senyawa hasil sintesis terbentuk sesuai dengan hipotesisnya.

Gambar 9. Struktur 3D kristalografi sinar X senyawa arilamida-3

Uji Aktivitas In Vitro

Senyawa arilamida-3 kemudian dilakukan uji aktivitas penghambatan

enzim MMP-9 in vitro. MMP-9 yang merupakan enzim protease dan memiliki

aktivitas proteolitik akan memotong ikatan peptida pada substratnya. Substrat

dalam pengujian ini mengikat gugus fluorofor sehingga ketika terpotong oleh

MMP-9, gugus fluorofor terlepas dan terbaca fluoresensinya oleh

spektrofluorometri pada panjang gelombang (λ) eksitasi 325 nm dan emisi 393 nm.

Fluoresensi yang tinggi menunjukkan aktivitas enzim sebanyak 100%, sedangkan

fluoresensi yang rendah menunjukkan adanya penghambatan pada aktivitas enzim.

Senyawa arilamida-3 memiliki persen penghambatan sebesar 5% pada konsentrasi

200 µg/mL yang disajikan pada Tabel 1. Perhitungan IC50 tidak dapat dilakukan

karena persen penghambatan yang didapat dibawah 50%. Berdasarkan persen

penghambatan, senyawa arilamida-3 termasuk dalam kategori low active

(Aderogba, 2013). Penambahan gugus metoksi sebagai EDG pada bagian para dan

meta gugus arilamida pada senyawa arilamida-3 ternyata menurunkan nilai persen

penghambatan dibandingkan dengan senyawa milik Adhipandito dan Ludji yang

memiliki penambahan gugus EWG. Sehingga dapat disimpulkan bahwa


16

penambahan gugus EWG dalam senyawa penghambat aktivitas enzim MMP-9

lebih baik dibandingkan dengan gugus EDG.

Tabel 1. Perhitungan persen penghambatan senyawa arilamida-3 terhadap MMP-9

Fluoresens Rata-

rata

Aktivitas

inhibitor

(%)

Penghambatan

enzim

(%) ± SD

R1 R2 R3

Blanko

(bufer)

9683 9349 9217 9416 - -

Kontrol

negatif

(tanpa

inhibitor)

32989 33687 30321 32332 100 0

Kontrol

positif

(inhibitor

NNGH)

5946 5946 7898 6597 0 100 ± 4,92

Senyawa

arilamida-3

29954 31102 32431 31162 95 5 ± 5,41

Aktivitas inhibitor = rata-rata/32332 x 100%; Penghambatan enzim = 100% - aktivitas inhibitor

KESIMPULAN

Hasil penelitian menunjukkan bahwa senyawa arilamida-3 dapat disintesis

dari 3,4,5-trimetoksianilin dan 3-bromopropionil klorida dengan katalisator piridin

melalui mekanisme reaksi SNA dengan produk hasil sintesis berupa serbuk

berwarna putih yang larut dalam kloroform dan memiliki titik lebur 115,7-120,1°C.

Senyawa arilamida-3 dapat menghambat aktivitas MMP-9 sebesar 5% pada

konsentrasi 200 µg/mL yang berasosiasi pada aktivitas yang rendah.

SARAN

Berdasarkan nilai persen penghambatan senyawa arilamida-3 terhadap

aktivitas enzim MMP-9 in vitro yang didapatkan sebesar 5% pada konsentrasi 200

µg/mL, penelitian ini dapat menjadi informasi tambahan bahwa dengan adanya


17

gugus EDG akan mengurangi nilai persen penghambatan aktivitas enzim MMP-9

sehingga disarankan untuk penelitian selanjutnya tidak mempertimbangkan gugus

EDG dalam modifikasi struktur suatu senyawa yang bertujuan untuk menghambat

enzim MMP-9.

UCAPAN TERIMA KASIH

Penulis berterima kasih kepada Indonesia Toray Science Foundation

periode 2017/2018 dan Divisi Penelitian dan Pengembangan BEM Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma yang memberikan hibah untuk penelitian ini.


18

DAFTAR PUSTAKA

Adegoke, O.A., 2011. Analytical, biochemical and synthetic applications of para-

dimethylaminobenzaldehyde. International Journal of Pharmaceutical

Sciences Review and Research, 11 (2), 17–29.

Aderogba, M.A., 2013. Antimicrobial and Selected In Vitro Enzyme Inhibitory

Effects of Leaf Extracts, Flavonols and Indole Alkaloids Isolated from Croton

menyharthii. Molecule, 18, 12633-12644.

Adhipandito, C.F., 2017. Sintesis Analog Purin (FFUSD-001) dan Studi In Silico

Terhadap Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-() Hemopexin Domain sebagai

Kandidat Anti-Kanker Payudara. Skripsi. Universitas Sanata Dharma.

Arifiyanto, A., 2001. Pengaruh Penambahan Basa Natrium Hidroksida dan Piridin

dalam Sintesis Benzoilanilida.

Bauvois, B., 2012. New facets of matrix metalloproteinases MMP-2 and MMP-9

as cell surface transducers: Outside-in signaling and relationship to tumor

progression. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer, 1825 (1),

29–36.

Cathcart, J., Pulkoski-Gross, A., and Cao, J., 2015. Targeting matrix

metalloproteinases in cancer: Bringing new life to old ideas. Genes and

Diseases, 2 (1), 26–34.

Chaffer, C.L. and Weinberg, R.A., 2011. A perspective on cancer cell metastasis.

Science (New York, N.Y.), 331 (6024), 1559–1564.

Dufour, A., Sampson, N.S., Li, J., Kuscu, C., Rizzo, R.C., DeLeon, J.L., Zhi, J.,

Jaber, N., Liu, E., Zucker, S., and Cao, J., 2011. Small-molecule anticancer

compounds selectively target the hemopexin domain of matrix

metalloproteinase-9. Cancer Research, 71 (14), 4977–4988.

Fessenden, R.J., Fessenden, J.S., 1986. Kimia Organik Edisi Ketiga. Jakarta:

Penerbit Erlangga.

Gialeli, C., Theocharis, A.D., and Karamanos, N.K., 2011. Roles of matrix

metalloproteinases in cancer progression and their pharmacological targeting.

FEBS Journal, 278 (1), 16–27.

IARC, 2018. Latest Global Cancer Data [Press Release]. Available from:

https://www.iarc.fr/wp-content/uploads/2018/09/pr263_E.pdf (Accessed: 5

November 2018).

Kahl, T., Schroder, K.-W., Lawrence, F.R., Marshall, W.J., Hoke, H., and Jackh,

R., 2012. Aniline. Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 2, 108–

137.

Kemenkes, 2015. InfoDATIN Pusat Data dan Informasi Kementerian Kesehatan

RI. Jakarta: Kementerian Kesehatan RI.


19

Koltunov, K.Y., Sobolev, V.I., and Bondareva, V.M., 2016. Oxidation, oxidative

esterification and ammoxidation of acrolein over metal oxides: Do these

reactions include nucleophilic acyl substitution? Catalysis Today, 1–5.

Ludji, D.P.K.S., 2017. Sintesis Analog Purin (FUSD-002) dan Studi In Silico

Terhadap Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) Hemopexin Domain sebagai

Kandidat Anti-Kanker Payudara. Skripsi. Universitas Sanata Dharma.

Oakwood Products, 2018. Safety Data Sheet: 3,4,5-Trimethoxyaniline [online].

Available from: https://ehslegacy.unr.edu/msdsfiles/31329.pdf (Accessed: 19

Januari 2019).

Pavia, D.L., Lampman, G.M., Kriz, G.S., and Vyvyan, J.R., 2015. Introduction to

Spectroscopy Fifth Edition. Cengange Learning.

Pubchem, 2019. 3,4,5-Trimethoxyaniline | C9H13NO3 - PubChem [online].

Available from: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/3_4_5-

trimethoxyaniline#section=Infrared-Spectra (Accessed: 24 Januari 2019).

Smith, M.B. and March, J., 2007. March’s Advanced Organic Chemistry. New

Jersey: John Wiley & Sons, Inc.

Ugarte-Berzal, E., Vandooren, J., Bailón, E., Opdenakker, G., and García-Pardo,

A., 2016. Inhibition of MMP-9-dependent degradation of gelatin, but not other

MMP-9 substrates, by the MMP-9 hemopexin domain blades 1 and 4. Journal

of Biological Chemistry, 291 (22), 1–13.

Wahidin, M., Noviani, R., Hermawan, S., Andriani, V., Ardian, A., and Djarir, H.,

2012. Population-Based Cancer Registration in Indonesia. Asian Pacific

Journal of Cancer Prevention, 13 (4), 1709–1710.

Welch, D.R., Steeg, P.S., and Rinker-schaeffer, C.W., 2000. Molecular biology of

breast cancer metastasis Genetic regulation of human breast carcinoma

metastasis. Breast Cancer Research, 2 (6), 1–6.

Yousef, E.M., Tahir, M.R., St-Pierre, Y., and Gaboury, L.A., 2014. MMP-9

expression varies according to molecular subtypes of breast cancer. BMC

Cancer, 14, 1–12.

Zhai, H. and Zhang, X., 2009. A new method for differentiating adducts of common

drinking water DBPs from higher molecular weight DBPs in electrospray

ionization-mass spectrometry analysis. Water Research, 43 (8), 2093–2100.

Zhang, L., Wang, X. jun, Wang, J., Grinberg, N., Krishnamurthy, D.K., and

Senanayake, C.H., 2009. An improved method of amide synthesis using acyl

chlorides. Tetrahedron Letters, 50 (24), 2964–2966.


20

LAMPIRAN

Lampiran 1. Representasi tata letak 96-microwell plate dengan B: buffer, Sp:

sampel senyawa arilamida-3, E: enzim MMP-9, dan Sb: substrat disertai dengan

volume dalam µL.

Lampiran 2. Mekanisme reaksi SNA antara 3,4,5-trimetoksianilin dan 3-

bromopropionil klorida.


21

Lampiran 3. (a) Sintesis senyawa arilamida-3 pada awal pengadukan, (b) Crude

product setelah dibilas dengan aquadest dan dibiarkan mengering.

Lampiran 4. (a) Serbuk 3,4,5-trimetoksianilin yang berwarna sedikit kekuningan

(b) Serbuk arilamida-3 yang berwarna putih

(a) (b)


22

Lampiran 5. Hasil Uji Kelarutan Senyawa Arilamida-3

Pelarut Kelarutan Perbandingan

Kloroform Larut 1:20

Air Tidak larut 1:1000

Aseton Larut 1:30

Etil asetat Larut 1:20

n-heksana Tidak larut 1:1000

DMSO Larut 1:30

Etanol Agak sukar larut 1:80

Lampiran 6. Mekanisme reaksi antara DAB-HCl dan 3,4,5-trimetoksianilin.


23

Lampiran 7. Hasil uji pendahuluan DAB-HCl antara bahan baku dan arilamida-3.

Lampiran 8. Profil KLT arilamida-3 (Rf = 0,55) dibandingkan dengan bahan baku

(Rf = 0,38).

1

2 1 = Bahan baku (Rf 0,38)

2 = Arilamida-3 (Rf 0,55)


24

Lampiran 9. Perhitungan bahan sintesis dan hasil rendemen senyawa arilamida-3.

Perhitungan bahan:

1. 3,4,5-trimetoksianilin (BM: 183,2 g/mol) sebanyak 3,59 mmol

3,59 mmol x 183,2 g/mol = 657,69 mg = 0,66 g

2. Piridin (BM: 79,1 g/mol, massa jenis: 0,98 g/mL) sebanyak 3,59 mmol

3,59 mmol x 79,1 g/mol = 283,97 mg = 0,28 g

0,28 g / 0,98 g/mL = 0,290 mL = 290 µL

3. 3-bromopropionil klorida (BM: 171,4 g/mol, massa jenis: 1,7 g/mL)

sebanyak 4,00 mmol

4,00 mmol x 171,4 g/mol = 686 mg = 0,69 g

0,69 g / 1,7 g/mL = 0,40 mL = 400 µL

Stokiometri reaksi:

3,4,5-

trimetoksianilin

+ 3-bromopropionil

klorida

→ Arilamida-3 + HCl

3,59 mmol 4,00 mmol

3,59 mmol 3,59 mmol 3,59 mmol 3,59 mmol

0,41 mmol 3,59 mmol 3,59 mmol

Hasil rendemen:

Massa arilamida-3 teoritis (BM: 317 g/mol)= 3,59 mmol x 317 g/mol = 1138,03 mg

Massa arilamida-3 yang didapat = 268 mg

Rendemen intermediet =

𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑑𝑎𝑝𝑎𝑡

𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑡𝑖𝑠 𝑥 100% =

268 𝑚𝑔

1138,03 𝑚𝑔 𝑥 100% = 23,5%


25

Lampiran 10. Perbesaran spektrum 1H-NMR pada geseran 2,6-4,1 ppm.

Lampiran 11. Perbesaran spektrum 1H-NMR pada geseran 6,1-7,9 ppm.


26

Lampiran 12. Spektrum inframerah senyawa 3,4,5-trimetoksianilin


27

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi berjudul “Sintesis Turunan

Arilamida-3 dan Uji Aktivitas In Vitro Terhadap

Enzim Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9)

Sebagai Kandidat Anti-Kanker Payudara” memiliki

nama lengkap Kevin Cahaya Putra. Penulis lahir di

Yogyakarta pada tanggal 6 Maret 1997 sebagai anak

pertama dari tiga bersaudara dari pasangan Iwan

Binanto dan Alm. Carla Santoso. Pendidikan formal

yang pernah ditempuh penulis diselesaikan di TK

Mutiara Persada (2001-2003), SD Tarakanita (2003-2009), SMP Stella Duce 1

(2009-2012), dan SMA Negeri 2 Yogyakarta (2012-2015). Penulis kemudian

melanjutkan Pendidikan Sarjana 1 di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

pada tahun 2015. Selama menempuh kuliah, penulis pernah mendapatkan prestasi

berupa Juara II pada lomba Pharmaceutical Industry Case Study (PICS) 2017 di

ITB dan terlibat sebagai anggota tim dalam Program Kreativitas Mahasiswa

Pengabdian Masyarakat (PKM-M) yang didanai oleh Direktorat Jendral Pendidikan

Tinggi (Dikti). Selain itu, penulis pernah menjadi Ketua dari grup penelitian Drug

Discovery Research Group (DDRG) (2018), Ketua I inisiasi fakultas TITRASI

(2017), Koordinator Divisi Perlengkapan dan Table Pharmacy Performance (2016)

dan Lomba Cerdas Cermat Kimia (2016), anggota Divisi Perlengkapan inisiasi

fakultas TITRASI (2016), anggota Divisi Perlengkapan Pharmacy Performance

(2015) dan Road to School (2015). Penulis juga berperan aktif sebagai asisten

praktikum Kimia Dasar (2018) dan Kimia Organik (2016-2018).


sintesis turunan arilamida-3 dan uji aktivitas in...

Documents