Umum dan Endokrinologi Perbandingan xxx(2014) xxx-xxxekspresi gen globalselama diferensiasi awal Xenopus (Silurana) tropicalis jaringan gonadJonathan T. Haselman*,Allen W. Olmstead 1, Sigmund J. DegitzUS Environmental Protection Agency, Kantor Penelitian dan Pembangunan, Kesehatan Nasional dan Dampak Lingkungan Laboratorium Penelitian, Mid-Continent Divisi Ekologi, 6201 Congdon Blvd., Duluth, MN 55804, USAarticleinfoPasal sejarah: Tersedia online xxxxKeywords: Xenopus tropicalis Amfibi microarray Gonad diferensiasi Perkembangan reproduksi ekspresi genabstrakkatak bercakar Afrika Xenopus sp. digunakan secara luas untuk biologi perkembangan dan penelitian toksikologi. Di tengah kekhawatiran polusi lingkungan mengganggu sistem endokrin dan menyebabkan perkembangan reproduksi berubah satwa liar, penelitian eko-toksikologi telah menyebabkan fokus pada menghubungkan kejadian awal molekul efek tingkat populasi. Dengan demikian, upaya untuk lebih memahami perkembangan reproduksi pada tingkat molekul dalam spesies Model ini dijamin. Untuk itu, transcriptomes dicirikan dalam membedakan Xenopus tropicalis jaringan gonad di Nieuwkoop dan Faber (NF) tahap 58 (phosis pro-metamor-), NF66 (penyelesaian metamorfosis), 1 minggu pasca-metamorfosis (1WPM), dan pasca 2 minggu - metamorfosis (2WPM). Analisis ekspresi perbedaan antara jenis jaringan pada setiap tahap perkembangan mengungkapkan perbedaan besar transcriptomes ovarium dan testis mulai antara NF58 dan NF66; transcriptomes terus menyimpang melalui 2WPM. Umumnya, transkrip testis diperkaya diungkapkan pada tingkat yang relatif konstan, sedangkan transkrip ovarium diperkaya naik-diatur dalam periode perkembangan ini. Analisis fungsional dari transkrip yang diekspresikan secara berbeda memungkinkan hubungan yang akan dibuat antara orthologues manusia diduga mereka dan proses seluler spesifik yang terkait dengan jaringan-beda gonad ferentiating. Dalam jaringan ovarium, program genetik sel germinal langsung melalui meiosis ke tahap lotene dip- ketika mRNA ibu ditranskripsi dan diperdagangkan ke oosit untuk terjemahan berikut pembuahan. Dalam testis, ekspresi gen konsisten dengan pengembangan jaringan ikat, tubulus mewarnai pembentukan, dan dukungan sel germinal (Leydig dan sel Sertoli). Dataset ini dipamerkan konsistensi yang luar biasa dengan profil transkrip dijelaskan sebelumnya dalam jaringan gonad seluruh spesies, dan menekankan pentingnya sal universal transkrip tertentu untuk pengembangan sel germinal dan persiapan jaringan tersebut untuk reproduksi.Diterbitkan oleh Elsevier Inc1. PengantarAfrika mencakar katak Xenopus sp. telah digunakan secara luas untuk biologi perkembangan dan penelitian toksikologi. Dengan memuncaknya kekhawatiran tentang paparan satwa liar untuk polusi lingkungan dan potensi endokrin mengganggu senyawa (ditinjau oleh Kloas, 2002), upaya untuk lebih memahami mekanisme yang xenobiotik menyebabkan kerusakan reproduksi dijamin. Banyak penelitian telah menunjukkan kerentanan amfibi untuk perkembangan gonad diubah karena xenobiotik atau eksogen paparan hormonal Depdiknas mengakibatkan sex reversal atau rasio jenis kelamin diubah (Bogi et al, 2002;. Olmstead et al, 2009a;.. Ohtani et al, 2000 ; Petterssonet al, 2006;.. Reeder et al, 1998; Villalpando dan Merchant-Larios, 1990). Proses molekul penentuan seks di ans amphibi- tergantung pada spesies, tapi banyak dari proses-proses molekuler hilir mengemudi diferensiasi (misalnya, hormon steroid) yang serupa bahkan di taksa (ditinjau oleh Hayes, 1998; ditinjau oleh Ogielska 2009a, b, c; ditinjau oleh Nakamura, 2010). Penelitian terbaru dari ekspresi gen yang terkait dengan diferensiasi gonad di Xenopus sp. fokus pada subset kecil dari gen dalam kompleks gonad-mesonefrik dan kekurangan anchoring untuk seks genotip (Duarte-Guterman dan Trudeau, 2011; Banjir dan Langlois, 2014; Navarro-Martn et al, 2012.). Kita sekarang dapat mengidentifikasi jenis kelamin genotipe dalam individu larva Xenopus (Olmstead et al, 2010;.. Yoshimoto et al, 2008) dan memiliki kemampuan untuk mengeluarkan jaringan gonad murni sedini Nieuw- koop dan Faber ([NF] 1994) Tahap 58. Kemajuan ini memungkinkan jelas *penulis korespondensi. Fax: +1 218 529 5003.perbandingan profil ekspresi gen pada jaringan ovarium dan testisalamat E-mail:. Haselman.jon@epa.gov (JT Haselman), allen.olmstead@bayeruntuk identifikasi jaringan molekul yang bias gender tertentu untuk com (AW Olmstead), degitz.sigmund@epa.gov (SJ Degitz).masing-masing jaringan. Dengan kemajuan teknologi terbaru dalam gen dunia 1 Hadir alamat:. Toksikologi Lingkungan dan Penilaian Risiko, Pengembangan Amerika Utara, Bayer CropScience LP, Research Triangle Park, NC 27709, USAanalisis ekspresi, sekarang mungkin untuk mengkarakterisasihttp genetik:// dx.doi.org/10.1016/j.ygcen.2014.06.009 0016-6480 / Diterbitkan oleh Elsevier IncSilakan mengutip artikel ini di media sebagai: Haselman, JT, et al. Ekspresi gen global pada diferensiasi awal Xenopus (Silurana) jaringan tropicalis gonad. Jenderal Comp. Endocrinol. (2014), http://dx.doi.org/10.1016/j.ygcen.2014.06.009daftar Isi tersedia diScienceDirectUmum dan Perbandinganhomepage jurnalEndokrinologi:www.elsevier.com/locate/ygcen

2 JT Haselman et al. / Umum dan Endokrinologi Perbandingan xxx (2014)xxx-xxxprogrambertanggung jawab untuk diferensiasi gonad aktif. Informasi nasional yayasan ini kemudian dapat digunakan dalam penelitian toksikologi berikutnya untuk lebih memahami bagaimana molekul gangguan pada jaringan gonad menyebabkan fenotipe normalvertebrata.Tiga peristiwa berurutan adalah operasi dalam menentukan jenis kelamin yang paling Sekering dari gamet pada saat pembuahan (misalnya, XX / XY atau ZZ / ZW kromosom seks), penentuan jenis kelamin dengan saklar molekuler selama perkembangan embrio atau larva, dan akhirnya, cas- cading pola ekspresi molekul diprakarsai oleh seks penentu beralih bangsa. Sebelum penentuan seks di anurans, yang dibeda-bedakan, gonad bipotential terdiri dari korteks dan medula (Merchant-Larios dan Villalpando, 1981). Di Xenopus tropicalis, tanda-tanda pertama dari diferensiasi testis pada tingkat histologis terjadi sekitar NF tahap 48, sedangkan bukti pertama dari ovarium diferensiasi terjadi sekitar NF tahap 51 berdasarkan perbedaan laminin lokal-isasi pola (El Jamil et al., 2008). Sel-sel germinal primordial (PGC) berada di korteks gonad bipotential dan terus tetap di korteks gonad betina sedangkan medula surut ke lapisan epitel dalam membentuk lumen (Ogielska, 2009a). Dalam testis, yang PGCs bermigrasi dari korteks ke medula; korteks akhirnya menghilang sebagai pengganti epitel peritoneal. Proses ini dimulai dan diatur oleh kontrol genetik, tetapi mekanisme yang tepat belum dijelaskan dalam anuran spesies (Hayes, 1998; Ogielska 2009a, b, c, Nakamura, 2010). Oleh NF58, gonad adalah histologis sepenuhnya dibedakan baik sebagai ovarium atau testis didasarkan pada ada tidaknya korteks dan medula (Gbr. 1). Setelah NF58, banyak perubahan yang nyata terjadi histo- logis yang menunjukkan substansial up-regulasi proses diferensiasi. Dalam ovarium, oogonium utama secara aktif membagi mitot- turun tajam dan membentuk sarang sel germinal dari oogonium sekunder (Ogielska, 2009b). Sarang sel germinal ini dikelilingi oleh sel-sel pra-ular follic- somatik yang pada akhirnya akan mendukung pengembangan oosit diplotene. Pembuluh darah dan sel-sel mesenkim bermigrasi ke korteks melalui ruang tipis antara korteks dan apa yang sebelumnya medula. Pembuluh darah ini pada akhirnya akan memberikan sors kuning precur- ke oosit dari hati di mana mereka disintesis. Detik- oogonium ondary menjadi oosit primer dan dilanjutkan melalui meiosis ke tahap diplotene, ketika sel-sel folikel berkembang biak dan menyelimuti setiap oosit untuk membentuk folikel. Dalam setiap folikel, oosit mulai menonjol mikrovili yang jalin dengan sel folikel rovilli mac, dan gap junction terbentuk antara oosit dan follic-LGambar. 1. bagian histologis ovarium (O) dan testis (T) jaringan di NF58, NF66, dan 2 minggu pasca-metamorfosis (2WPM). Diwarnai dengan H & E. C: korteks; M: medulla; L:. LumenSilakan mengutip artikel ini di media sebagai: Haselman, JT, et al. Ekspresi gen global pada diferensiasi awal Xenopus (Silurana) jaringan tropicalis gonad. Jenderal Comp. Endocrinol. (2014), http://dx.doi.org/10.1016/j.ygcen.2014.06.009O-NF58CT-NF58MO-NF66 O-2WPMT-NF66ular vili sel yang memungkinkan luas permukaan lebih untuk bagian hormon dan molekul sinyal antara sel-sel untuk mengarahkan oosit meiosis dan pematangan. Mikrovili oosit mulai cabang di ujungnya, berjalan sejajar dengan permukaan oosit menciptakan amplop (zona pelusida) di mana glikoprotein terlokalisasi untuk menengahi reaksi akrosom dan menolak polispermia. Jaringan luas komponen sitoskeletal dirakit dalam oosit diplotene molekul lalu lintas dan mempersiapkan dimulainya kembali meiosis ketika trig- punah oleh progesteron lama kemudian dalam pembangunan. Dengan 2 minggu yang asalnya bank penyelesaian metamorfosis, ovarium mengandung sel-sel germinal meiosis pra dan meiocytes mewakili setiap tahap meio- sis sampai ke tahap diplotene ditangkap.Keunggulan histologis diferensiasi testis selama periode ini perkembangan yang organisasi seluler terutama dan proliferasi, karena spermatogenesis tidak dimulai sampai tubulus niferous semi sepenuhnya dikembangkan lebih dekat dengan kematangan seksual. Namun, kegiatan penting termasuk invasi pembuluh darah dan sel-sel mesenkim ke testis antara korteks dan medula (seperti dalam ovarium), spermatosit primer menjadi dikemas oleh sel-sel somatik dan mengatur ke dalam kabel seminiferus primordial yang akhirnya menjadi tubulus, dan sel-sel mesenkim berdiferensiasi menjadi Sel-sel Leydig yang akan menghasilkan hormon steroid (Ogielska, 2009c). Secara keseluruhan, ovarium mengalami lebih banyak aktivitas dalam pengembangan sel germinal sedangkan pengalaman testis gerakan yang lebih seluler dan organisasi untuk pembentukan saluran.Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengkarakterisasi gen diekspresikan pola sion terkait dengan X. tropicalis gonad awal diferensiasi tion dan mengidentifikasi gen kandidat yang memiliki asosiasi yang kuat dengan pematangan gonad selama periode pembangunan. Tujuan ondary detik- adalah untuk memperluas pemahaman makna fungsional dalam konteks lintas-spesies dengan membandingkan profil ekspresi gen kandidat pengetahuan yang ada ekspresi gen orthologous pada spesies lain selama perkembangan gonad. Untuk itu, sementara profil ekspresi global yang diukur dalam empat tahapan yang berbeda dari membedakan X. tropicalis ovarium dan testis tis- menggugat dengan microarray. Profil ekspresi yang dihasilkan dibandingkan antara jaringan pada setiap tahap perkembangan dan set gen diperkaya dianalisis lebih lanjut untuk asosiasi fungsional. Sebagai bagian dari proses analisis, orthologues manusia diidentifikasi untuk sebanyak transkrip gen mungkin sehingga luas mamaliaT-2WPM

JT Haselman et al. / Umum dan Endokrinologi Perbandingan xxx (2014) xxx-xxx 3Silakan mengutip artikel ini di media sebagai: Haselman, JT, et al. Ekspresi gen global pada diferensiasi awal Xenopus (Silurana) jaringan tropicalis gonad. Jenderal Comp. Endocrinol. (2014), http://dx.doi.org/10.1016/j.ygcen.2014.06.009 database interaksi molekul dapat digunakan untuk anal- fungsionalsetiap kolam sesuai dengan instruksi RNeasy kit (Qiagen Inc., Valen- yses dan diskusi cross-spesies perbandingan.cia, CA, USA). Konsentrasi RNA diukur pada NanoDrop ND-1000 Spektrofotometer (NanoDrop Technologies, Inc,2. Bahan dan metodehttp://www.nanodrop.com) dan kualitas diperiksa menggunakan 2.100 Bioanalyzer dengan RNA 6000 pico assay (Agilent, Santa2.1. perawatan hewan dan budayaClara, CA, USA). Sampel kemudian dibekukan pada A80 C dan dikirim pada es kering ke AS EPA Genomics Penelitian Core Penelitian Triin-house peternak X. tropicalis digunakan untuk menghasilkan hewan untuk penelitian ini adalah dari '' ketegangan emas '' dan perempuan itu dikuatkan memiliki W-linked polimorfisme diidentifikasi oleh Olmstead et al. (2010). Ini penanda sex-linked dan penanda referensi yang digunakan untuk menentukan jenis kelamin genetik keturunan individu berikut sampling (dijelaskan kemudian). Kondisi perawatan hewan dan budaya yang sama seperti yang dijelaskan oleh Olmstead et al. (2009b) dan adalah sebagai berikut. Pasangan pemuliaan dewasa dipertahankan pada 0:12 cahaya: penyinaran gelap pada 25 C pada 7 L kaca akuarium dengan kondisi aliran-melalui 50 ml / menit dan diberi makan 3/3200premiumsudutPark, NC, di mana setiap kolam RNA diamplifikasi dan diberi label dengan menggunakan 30 IVT Ekspres kit (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) sesuai dengan instruksi kit. Hibridisasi berikutnya, mencuci, pewarnaan, dan pemindaian dari 38 Affymetrix GeneChip X. tropicalis Genome Array (http://www.affymetrix.com/) dilakukan sesuai dengan instruksi Analisis Ekspresi yang disediakan dengan chip. Hasil penyelidikan file (.CEL) mengandung fitur Intensifikasi hubungan yang dihasilkan dengan menggunakan software Affymetrix GeneChip Command Con- sole. File-file data dapat ditemukan di Gene Expression Omnibus repositori (GEO: GSE58612)USA)..tenggelam pelet katak makanan (Xenopus Express, Plant City, FL, Air adalah dari dekat Danau Superior (Duluth, MN, USA) dan2,4. Analisisdataozon dirawat dan disaring sebelum digunakan. Perkawinan pasangan pemuliaan diinduksi oleh suntikan hCG (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA). Suntikan awal 20 IU hCG diikuti oleh suntikan kedua 100 IU hCG 5 jam kemudian diberikan kepada laki-laki dan perempuan peternak. Setelah kawin, peternak dewasa dipindahkan ke tangki lain dan embrio diizinkan untuk menetas dalam kondisi aliran-melalui. Sebuah bibit tunggal dibubarkan dengan kepadatan 40 / tangki (12:12 penyinaran, 25 C, tangki 7 L, 25 ml / menit aliran) dan diberi diet yang terdiri dari homogen dimasak wortel dan bayam, Sera Micron (Sera Amerika Utara , Toronto, Kanada), dan udang air garam tiga kali sehari sampai dihapus karena sampling.2.4.1. Data summarizationFile .CEL diimpor ke GeneSpring GX 12.6 (Agilent) perangkat lunak di mana mereka diringkas menggunakan rithm yang PLIER16 Algoritma termasuk penyesuaian dasar median dari semua sam prinsip keuangan. Algoritma PLIER16 mengasumsikan beberapa analisis-array, menggunakan normalisasi quantile dan pendekatan tertimbang untuk kembali-koreksi tanah menggunakan cocok dan penyelidikan pasangan mismatch (Hubbell, 2004, 2005). Quality control dilakukan pada semua array menggunakan analisis komponen utama dan parisons com- kontrol hibridisasi. Rangkaian hibridisasi tingkat kontrol berlabel biotin untuk satu sampel mereplikasi (NF58 testis) yang menunjukkan rusak2.2. Desain eksperimentalhibridisasi (Supplemental Gambar. 1). Sampel ini bertekad untuk dikompromikan berdasarkan kontrol hibridisasi ini danEmpat perkembangan waktu-poin yang dipertimbangkan untuk analisis ekspresi global: NF58 (pro-metamorfosis), NF66 (penyelesaian metamorfosis), 1 minggu pasca-metamorfosis (1WPM), dan 2 minggu pasca-metamorfosis (2WPM). Jaringan gonad yang cocok waktu-dan tahap-cocok, sehingga koleksi terjadi pada satu hari untuk setiap perkembangan titik waktu dan semua hewan yang digunakan berasal dari bibit yang sama. Untuk 1WPM dan 2WPM waktu-poin, semua hewan mencapai NF66 pada hari yang sama dan dipisahkan dari sisa bibit sampai pengumpulan sampel 1 dan 2 minggu kemudian masing-masing. Pada hari pengumpulan jaringan, binatang pengembangantelah dihapus dari analisis selanjutnya. Sebagai hasilnya, NF58 tes- tis set sampel terdiri dari tiga ulangan sementara ada empat ulangan NF58 sampel ovarium. The NF58 sampel testis tunggal adalah satu-satunya contoh yang menunjukkan hibridisasi rusak; semua tions hybridiza- lainnya berhasil berdasarkan tingkat kontrol hibridisasi berlabel biotin dan koefisien korelasi Pearson. Plot korelasi termasuk semua chip dibandingkan satu sama lain juga disediakan secara sebagai bukti hibridisasi rusak ini sampel, tetapi menekankan kualitas ulangan biologi yang tersisa (Support tambahan dimasukkan Gambar. 2).Mental dipentaskan (Nieuwkoop dan Faber, 1994) dan eutanasia oleh perendaman dalam konsentrasi mematikan tricaine methanesulfonate ([MS-222], Argent Chemical Laboratories, Redmond, WA, USA) buf- fered dengan natrium bikarbonat. Jaringan gonad kemudian dipotong secara independen dari setiap jaringan lain (yaitu '' murni '' jaringan gonad) dan dipindahkan ke botol terpisah untuk setiap individu, dihomogenisasi dalam buffer lisis dari kit mikro RNeasy (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA) , dan segera dibekukan dalam es kering sampai sampel dapat dipindahkan ke A80 C penyimpanan. Ekor atau jaringan kaki juga dikumpulkan dari masing-masing individu untuk penentuan seks genetik menggunakan metode dideskripsikan oleh Olmstead et al. (2010). Setelah seks genetik adalah2.4.2. Analisis ekspresi diferensial dan pengelompokanT-tes dengan asumsi varians yang tidak sama (Welch) dilakukan untuk membandingkan testis dibandingkan jaringan ovarium pada setiap tahap tal developmen- (Tabel 1). P-nilai dihitung asimtotik dan Benjamini-Hochberg FDR koreksi beberapa pengujian diterapkan (dikoreksi p-value cutoff = 0,01). Analisis ini menghasilkan daftar gen untuk setiap tahap perkembangan yang dipamerkan P2-kali lipat, P5-kali lipat, dan P10-kali lipat ekspresi perbedaan antara jaringan. The 2WPM, daftar gen P5-kali lipat dipilih untuk analisis fungsional karena 2WPM jaringan gonad yang paling berbeda danditentukan untuk masing-masing individu, testis dan ovarium secara acak ditugaskan untuk kolam dari empat orang (delapan gonad per kolam renang)Tabel1 make a Sebanyak lima kolam jaringan testis dan lima kolam tis- ovariumBilangantranskrip yang diekspresikan secara berbeda antara jaringan pada setiap sue pengembangan pada setiap perkembangan titik waktu, dengan pengecualian NF58 yang memiliki empat kolam jaringan testis dan empat kolam ovariumjaringanTahap jiwa(t-test Welch, Benjamini-Hochberg FDR dikoreksi p