RESUME

Potensi Sistem Pelepasan Obat Target pada Tumor yang Terdiri dari Fragmen Peptida Spesifik MMP-2 dengan Karakteristik Self-assemblingObat sitotoksik seperti paclitaxel harus bekerja spesifik pada sel tumor agar tidak merusak sel normal disekitarnya. MMP (matriks metalloproteinase) adalah target potensial untuk terapi kanker, ada banyak hal menarik dalam mengembangkan inhibitor MMP sintetik, terutama untuk MMP-2 dan MMP-9. MMP-2 (gelatinase A, 72 kDa) dan MMP-9 (gelatinase B, 92 kDa) memainkan peran penting dalam perkembangan tumor, angiogenesis, dan metastasis. Enzim ini membantu sel-sel tumor untuk bertahan hidup dan tumbuh dengan merusak matriks ekstraselular, melepaskan faktor pertumbuhan untuk merangsang proliferasi sel dan faktor angiogenesis untuk mempromosikan pembentukan pembuluh darah. Matriks metalloproteinases (MMPs), yang mampu mendegradasi matriks ekstraselular dan membran sel pada sel tumor, yang menyebabkan metastasis di tempat yang jauh dari tumor primer.MMP ini dapat dihambat oleh bahan antiangiogenik seperti senyawa golongan reaktif zinc-chelating (tiol atau hydroxamate) dan beberapa inhibitor MMP, tetapi tidak ada inhibitor spesifik untuk MMP. Sistem drug targeting pada MMP dirancang dalam bentuk prodrug dimana obat akan terikat secara kovalen pada MMP. Adanya peptida MMP-spesifik memungkinkan pelepasan obat pada MMP-2. Pengembangan klinik peptide MMP-spesifik dan konjugat obat sitotoksik oleh stabilitas obat yang sangat rendah. Sehingga penelitian ini merancang peptida self-assembling untuk meningkatkan stabilitas. Peptida MMP-spesifik adalah fitur self-assembling melalui integrasi urutan aktif untuk pemotongan MMP. Peptida yang dimodifikasi mampu membentuk supramolekul mengandung obat antikanker dengan cara self-assembling. Peptida self-assembling ini dapat memproduksi supramolekul berrongga di mana molekul obat dapat dimuat di dalamnya. Fitur self-assembling ini jika dikombinasi dengan bahan target MMP-2 mungkin menghasilkan sistem pelepasan obat yang baru yang memiliki spesifikasi yang baik dan stabilitas berkepanjangan. sehingga rancangan ini terdapat dua fungsi sebagai carrier pelepasan obat, yaitu, pembentukan kompleks dapat meningkatkan stabilitas obat dan protein MMP-2 bisa mengaktifkan untuk pelepasan obat dengan proteolisis spesifik. Supramolekul dibentuk oleh substrat peptide self-assembling MMP dan paclitaxel yang telah stabil kemudian obat bisa dilepas pada pemotongan spesifik oleh MMP-2. Heptapeptide digunakan sebagai fragmen peptide substrat spesifik MMP-2. Setelah memodifakasi fragmen ini dengan fitur self-assembling, paclitaxel diisikan untuk bentuk dari supramolekul yang mengandung obat. SAMTA7 (sebutan calon obat pada penelitian ini) merupakan carrier pelepasan obat terkontrol dan sustained. SAMTA7 memberikan aktivitas antiproliferatif pada sel tumor HT1080 yang mengekspresikan MMP-2. Dengan rancangan ini bioavailabilitas obat dalam darah juga diperpanjang.Metode1. Kultur sel HT1080 dan HEp2

2. Analisis paclitaxel dan campuran peptide substrat MMP self-assembled Menggunakan HPLC

3. Pengujian proteolisis MMP-2

Pengujian proteolisis digunakan untuk menentukan kompleks menggunakan modifikasi peptida dan paclitaxel melalui pemotongan menggunakan enzim MMP-2. Berbagai macam kompleks peptida dan paclitaxel dengan perbandingan molar 1:10 diinkubasi dengan dan tanpa MMP-2 (5 g) dalam buffer fosfat saline (pH 7,0) yang mengandung 100 M ZnSO4. HPLC-MS digunakan untuk memonitoring jumlah paclitaxel bebas yang terlepas dari campuran.4. Pengukuran HPLC-MS untuk memonitoring jumlah paclitaxel bebas yang terlepas dari campuran.5. Pengujian MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide), untuk mengetahui toksisitas dari paclitaxel bebas dan juga kompleks SAMTA7-paclitaxel.6. Pengujian Scratch untuk mengetahui kecepatan inhibisi metastasis yang dihitung menggunakan rumus :

Kecepatan inhibisi = (jarak kelompok uji setelah inhibisi jarak kelompok control setelah inhibisi jarak terbesar utk inhibisi)/jarak terbesar utk pemulihan x 100

7. Pengobatan tikus yang membawa xenograft tumor manusia yang telah diinokulasi dengan impaltasi sel tumor HT1080, HEp2, atau U-87MG. tumor dibiarkan tumbuh sekitar 100 mm3 pada punggung tikus yang mirip dengan kondisi klinis dimana pengobatan dimulai setelah tumor telah tumbuh. Hewan uji diobati dengan paclitaxel bebas ataupun kompleks SAMTA7-paclitaxel via intravena dengan dosis (3 mg/kg/BB) tiap 5 hari. Control hanya menggunakan SAMTA7 saja. Waktu bertahan hidup dicatat mulai hari setelah pengijeksian tumor, dan berat dan ukuran tumor dimonitoring 3 x dalam seminggu selama periode uji 30 hari.Ukuran tumor dihitung dengan rumus volume elips berdasarkan rumus:Ukuran = lebar2 x panjang x /68. Simulasi dinamika molecular untuk analisis pembentukan supramolekular dari kompleks SAMTA7-paclitaxel

RESULT

Modifikasi dari 7 macam peptida yang telah disintesi dan divalidasi yang mana yang sesuai dengan pemotongan urutan basa PVGLIG yang merupakan fragment substrat spesifik MMP-2 termasuk penambahan fragmen EAK, RADA, dan modifikasi amfipatic.

Peptida yang sudah dirancang sedemikian rupa di inkubasi dengan paklitasel bebas. Lalu dilanjutkan dengan studi HPLC untuk mengindentifikasi peptida mana yang mampu membentuk supramolekul dengan obat paclitaxel. Hasilnya adalah sebagai berikut (Gambar 1):

Hasil tersebut menyatakan bahwa 1a dan 1b menunjukkan spectrum SAMTA7 dan paklitasel bebas tidk dapat berikatan dengan rasio molar 1:1. Gambar 1c (rasio molar 1:1) juga sama kondisinya dengan gambar 1a dan 1b. Gambar 1d dengan rasio molar 1:5 menunjukkan adanya ikatan kompleks antara SAMTA7-paklitasel yang terdeteksi pada waktu retensi puncak 13,5 menit, serta puncak yang menyatakan paklitasel bebas kadarnya berkurang di waktu 30 menit. Gambar 1e dengan rasio 1:6 menunjukkan puncak paklitasel bebas menghilang da nada puncak di menit 13,5 yang menunjukkan kompleks antara SAMTA7 dengan paklitasel bebas.

Formasi supramolekul SAMTA7-paclitaxel perlu untuk diketahui apakah formasi supramolekul tersebut mampu melepas paclitaxel dengan adanya enzim MMP-2 dengan studi MS dalam waktu 24 jam. Hasilnya terlihat pada Gambar 2 (gambar berikut ini).

Supramolekul yang terbentuk oleh SAMTA7 mulai melepaskan obat setelah di inkubasi dengan MMP-2 selama 2 jam. Paclitaxel terlihat terlepas secara sempurna dari formasi supramolekul dalam waktu 24 jam. Hal tersebut menyatakan bahwa peptida SAMTA7 membungkus secara sempurna paclitaxel dibandingkan peptida lainnya.

Dilakukan juga tes MTT dan tes awal sel untuk menilai aktivitas antitumor dari formasi supramolekul yang terbentuk dari SAMTA7-paclitaxel. Uji ini melihat aktivitas antiproliferasi dari SAMTA7-paclitaxel secara spesifik terhadap MMP-2.

Pada line sel HT1080 dengan MMP-2 menghasilkan respon cepat kematian sel. Pengobatan denagn supramolekul SAMTA7-paclitaxel mengakibatkan kerugian pada sel tumor tersebut bila dibandingkan dengan sel HEp2 yang tidak mengekspresikan MMP-2. Dari hasil MTT terlihat bahwasupramolekul SAMTA7-paclitaxel memiliki kemampuan menghambat lini sel yang mengekspresikan MMP-2 seperti pada HT1080. Selain itu pada uji MTT ditemukan bahwa ada Kristal paclitaxel disekitas sel HT1080 saja Hal itu dianggap bahwa pelepasan kompleks paclitaxel secara spesifik dengan adanya MMP-2 paclitaxel telah jenuh dan kemudian mengkristal. Temuan ini memberikan penjelasan lain bahwa kompleks SAMTA7-paclitaxel dapat melepaskan paclitaxel di MMP-2 dengan proses degradasi tertentu.MMP-2 memainkan peran penting dalam perkembangan sel tumor, proses angiogenesis tumor, dan proses metastasis. Kemampuan dari supramolekul SAMTA7-paclitaxel dalam mengahambat proses metastasis sel tumor dievaluasi dengan uji awal sel (cellular scratch assay). Hasilnya dapat terlihat pada Gambar.3

Hasil tersebut menunjukkan bahwa supramolekul SAMTA7-paclitaxel secara signifikan menghambat sel HT1080 dibandingkan dengan sel HEp2 dengan peningkatan 5,3 kali lipat dalam aktivitasnya sebagai antimigratory dimana sel HT1080 memiliki protein MMP-2 yang akan mempengaruhi secara spesifik pelepasan paclitaxel pada peptida (SAMTA7) spesifik self-assembling. Dilakukan pengujian pada tikus yang mempunyai sel HT1080 dan HEp2, atau xenograft U-87MG untuk melihat efek dari supramolekul SAMTA7-paclitaxel dibandingkan dengan paclitaxel bebas saja. Akan dipantau volume tumor setelah pengobatan. Hasilnya adalah sebagai berikut (Gambar 4) :

Dari hasil tersebut gambar 4a (sel tumor Ht1080) menunjukkan bahwa ukuran tumor itu sangat berkurang dengan penggunaan supramolekul SAMTA7-paclitaxel dibandingkan dengan paclitaxel bebas. Namun, supramolecule memiliki aktivitas antitumor yang buruk pada tikus dengan sel tumor HEp2 dan U-87MG , seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4B dan C. Tikus dengan sel tumor HT1080 diberi phosphate-buffered saline (control), paclitaxel bebas, dan kompleks SAMTA 7-paclitaxel. Gambar 4D menunjukkan bahwa SAMTA 7-paclitaxel dapat meningkatkan tingkat kelangsungan hidup pada tikus tersebut.

Gambar di atas (Gambar. 5) menunjukkan gambar 5A merupakan SAMTA7 tunggal dengan konformasi hairpin-seperti interaksi dengan fragmen RADA. Konformasi ini dieksplorasi untuk mengenal peptida MMP-2. Fragmen PVGLIG rentan terhadap proteolysis MMP-2. Gambar 5B menunjukkan SAMTA7 dengan sifat self-assembling dan mampu membungkus paclitaxel di dalamnya menjadi formasi supramolekul , namun formasi itu tidak mempengaruhi efek terapi.

MMP-2 ditargetkan untuk system pelepasan obat secara spesifik terhadap substrat MMP-2 dari PVGLIG. Pada hexapeptida, PVLGLIG, akan membungkus obat dengan sifat self-assembling melalui modifikasi struktur untuk mendapatkan struktur SAMTA7 yang memiliki dua sifat, yaitu self-assembling dan kemudian membungkus obat dalam rongga supramolekul. Formasi tersebut dianggap akan meningkatkan indeks terapi karena aktivitasnya spesifik terhadap target tersebut ditingkatkan.

CONCLUTIONDari hasil modifikasi obat tersebut yang memiliki sifat pelepasan obat secara spesifik terhadap peptida MMP-2 akan meningkatkan waktu paruh dalam darah dikarenakan obat terbungkus dalam formasi supramolekul dan akan terlepas jika bertemu dengan peptida MMP-2 dan menurunkan toksisitas.