1 Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2015

REGENERASI RUMPUT LAUT HASIL INTRODUKSI GEN KARAGINAN PADA RUMPUT LAUT Kappaphycus alvarezii MENGGUNAKAN MEDIA KULTUR YANG BERBEDA DENGAN KONDISI OPTIMAL

Emma Suryati*), Andi Tenriulo*), A. Rajamuddin**), dan Utut Widyastuti**).*) Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air Payau

Jl. Makmur Dg. Sitakka No. 129, Maros 90512, Sulawei Selatan**) Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi, IBP dan Departemen Biologi, FMIPA-Institut Pertanian Bogor

E-mail: emmasuryati@yahoo.com

ABSTRAKTransformasi gen karaginan pada rumput laut Kappaphycus alvarezii telah berhasil dilakukan melalui beberapa tahapan antara lain konstruksi gen karaginan pada plasmid pHSH sebagai vektor menjadi menjadi pMSHkar (PPSHB-IPB), kemudian insersi konstruksi Gen K-karagenase (pMSH-kar) pada Agrobacterium, serta transformasi gen K-raginase pada rumput laut K.alvarezii maka penelitian diarahkan pada regenerasi serta perbanyakan rumput laut hasil transformasi gen karaginan pada rumput laut K.alvarezii menggunakan media kultur yang diperkaya dengan pupuk yang berbeda serta kondisi lingkungan yang optimal antara lain salinitas, pH, penetrasi cahaya, ratio gelap dan terang, serta komposisi zat perangsang tumbuh yang berbeda. Hasil penelitian memperlihatkan kelangsungan hidup yang paling baik pada media PES, dengan salinitas 30 ppt, pH = 6, penetrasi cahaya 1500 lux, ratio gelap terang =16:8, dan komposisi ZPT adalah campuran IAA dan BAP dengan perbandingan 2:1.

KATA KUNCI: regenerasi, gen K-karaginan, rumput laut Kappaphycus alvarezii, transformasi gen

PENDAHULUAN

Rumput laut jenis Kappaphycus alvarezii atau sering dikenal dengan Eucheuma cotonii merupakangolongan alga merah (Rhodophyta) yang mengandung karaginan dan banyak dibudidayakan olehmasyarakat pesisir (Collen et al., 1995).Rumput laut K. alvarezii adalah komoditas unggulan penghasil karaginan yang banyak dimanfaatkan dalam industri kertas, tekstil, fotografi, pasta, dan pengalengan ikan. Pada aspek budidaya ia mampu menjadi kunci pemberdayaan masyarakat pesisir, peningkatan usaha budidaya ditingkat petani memacu peningkatan sediaan benih unggulan baik kualitas maupun kuantitasnya.Selain itu permintaan pasar dunia masih sangat tinggi (FAO, 2010)

Mengingat permintaan rumput laut sangat tinggi, baik didalam maupun diluar negeri, maka perlu dilakukan kegiatan usaha budidaya untuk rumput laut K. alvarezii yang diproduksi dengan jalan penyetekan (pemotongan thalus) yang akan dijadikan bibit untuk dikembang biakkan secara produktif, sekalipun demikian perbanyakan ini belum dapat mengimbangi permintaan bibit yang makin meningkat. Penggunaan bibit yang berasal dari sisa tanam sering kali mengakibatkan penurunan produksi antara lain tumbuhan menjadi kerdil, kualitas karaginan yang semakin menurun dan sangat rentan terhadap serangan penyakit (Largo et al., 1997) .

Untuk meningkatkan dan mempertahankan produksi rumput laut nasional perlu dilakukan upayaupaya dalam mengatasi permasalahan dalam budidaya, seperti menurunnya mutu genetik rumput laut akibat permasalahan penyakit dan lingkungan (Largo et al., 1997; Vairappan, 2006) melalui beberapa pendekatan teknologi, antara lain rekayasa genetik melalui transformasi gen potensial yang dapat meningkatkan ketahanan serta memperbaiki gen dari rumput laut (Cheney et al., 2000).

Sejalan dengan perkembangan ilmu dan teknologi, perbaikan mutu genetik rumput laut dilakukan melalui teknik biologi molekuler dan rekayasa genetika. Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air Payau bekerjasama dengan PAU-IPB merintis untuk melakukan perbaikan mutu genetik rumput laut.

Page 1 of 37

Page 1 of 7

Regenerasi rumput laut hasil introduksi gen karaginan pada rumput laut ... (Emma Suryati) 2 Hasil penelitian yang telah dilakukan antara lain introduksi gen GFP dibawah beberapa promoter sehingga menghasilkan transgenik rumput laut sampai tahap filamen (Rajamuddin et al., 2010), dan didukung dengan keberhasilan melakukan regenerasi dari filamen non transgenik menjadi thalus rumput laut (Suryati et al., 2011) memberikan harapan besar untuk melakukan perbaikan genetic rumput laut melalui rekayasa genetik. Kegiatan untuk memproduksi karagenan yang lebih baik telah dilakukan dengan mengklon gen penyandi en selanjutnya introduksi gen, PaCs, Mamt, MaSOD dan lizosym, ke dalam thalus Kappaphycus alvarezii, telah berhasil dilakukan (Daud et al., 2014, Suryati etal., 2014, Fajriah et al., 2014, Handayani et al., 2013, Rajamuddin et al., 2014).Transformasi gen karaginan pada rumput laut K.alvarezii telah berhasil dilakukan melalui mediasi menggunakan bakteri Agrobacterium tumefaciens serta dapat terintegrasi pada plantet dan anakan rumput laut (Rajamuddin et al., 2014). Beberapa peneliti telah menggunakan A. tumeficiencens sebagai perantara transformasi, seperti yang dilakukan oleh Cheng et al. (2011) pad mikroalga Schizochytrium. Pengembangan teknologi kultur jaringan merupakan rumput laut Kappaphycus alvarezii telah dikembangkan oleh Suryati & Mulyaningum (2009). Masalah yang dihadapi pada regenerasi rumput laut hasil transfer gen karaginan antara lain sering terjadi kematian pada aklimatisasi dalam kultur chamber dan perbanyakan di bak resirkulasi, sehingga diperlukan media kdapat kultur yang tepat serta kondisi optimal pada pemeliharaan rumput laut hasil transgenik, sehingga rumput laut dapat bertahan dan berkembang dengan baik Penelitian ini bertujuan untuk melakukan regenerasi rumput laut hasil transformasi gen karaginan pada rumput laut K.alvarezii pada media kultur yang diperkaya dengan pupuk dan komposis ZPT yang berbeda.

METODE PENELITIANRegenerasi Rumput Laut Hasil Introduksi Gen Karaginan pada Rumput Laut Kappaphycus alvarezii

Eksplan hasil transformasi dan eksplan tanpa transformasi (kontrol), selanjutnya ditumbuhkansampai terdiferensiasi dan berkembang menjadi tanaman muda (planlet), mengacu pada metodeSulistiani et al. (2011) dan Reddy et al. (2003). Eksplan dikultur pada dua tahapan regenerasi (keduanya dilakukan secara aseptik dan in vitro), yaitu: 1). Kultur cair pada botol kultur volume 200 mL yang diletakkan pada shaker digoyang selama pemeliharaan, menggunakan media kultur PES, setiap botol diisi 3-5 eksplan, dan selama pemeliharaan dilakukan pergantian media setiap 1 minggu. Kemudian dilanjutkan dengan aklimatisasi pada botol dengan volume 1,5-2 liter yang diletakkan pada ‘culture chamber’ dan diberi aerasi. Seiring berkembangnya eksplan menjadi rumput laut muda, selanjutnya dipindahkan ke tempat kultur yang lebih besar, dengan sistem pergerakan air media yang lebih kuat untuk merangsang pertumbuhan talus yang lebih cepat. Setiap botol diisi 5-10 planlet, dengan masa pemeliharaan sampai rumpun mencapai bobot sekitar 30 gram. Media kultur dan pergantian media yang sama pada kultur sebelumnya.Optimasi media pemeliharaan dilakukan melalui seleksi pupuk antara lain pupuk PES, Grund,Conwy dan SSW sebagai kontrol, dengan salinitas 20, 25, 30, 35, dan 40 ppt. Selanjutnya kisaran pH yang digunakan yaitu 4, 5, 6, 7, dan 8. Intensitas cahaya berkisar antara 500-2000 lux denganphotopheriod terang dan gelap 8:16; 12:12; dan 16:8. Untuk merangsang pertumbuhan eksplandilakukan pemeliharaan dengan penambahan hormon tumbuh IAA dan BAP dengan beberapaperbandingan 1:1, 1:2, dan 2:1. Pengamatan dilakukan dengan interval 1 minggu. Antara lain sintasan serta laju pertumbuhan

HASIL DAN BAHASAN

Pada regenerasi rumput laut hasil introduksi gen karaginan pada rumput laut memperlihatkanoptimasi media pemeliharaan antara lain pupuk yang paling optimal untuk pemeliharaan yaitumenggunakan pupuk PES (Gambar 1)

3 Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2015 Kelangsungan hidup eksplan hasil introduksi gen karaginan pada rumput laut K.alvarezii pada media kultur yang diperkaya dengan pupuk PES, memperlihatkan kelangsungan hidup yan paling baik walaupun tidak berbeda nyata dengan media yang diperkaya dengan Grund (Gambar 1). Hal ini disebabkan kebutuhan nutrien pada rumput laut dapat dipenuhi oleh nutrien yang berada pada media yang diperkaya dengan PES

Page 2 of 37

Page 2 of 7

dan grund, selain itu eksplan yang digunakan memang diadaptasi pada media dengan pupuk yang sama sehingga tidak perlu menyesuaikan diri dengan lingkungannya sendiri. Salinitas merupakan faktor pembatas pada kelangsungan hidup rumput laut pada umumnya, khususnya pada eksplan rumput laut hasil transformasi, toleransi kemampuan hidup rumput laut K.alvarezii berkisar pada salinitas 20-40 ppt, namun kelangsungan hidup eksplan yang tertinggi yaitu pada salinitas 30 ppt, berbeda nyata dengan salinitas 20 dan 40 ppt, namun tidak berbeda nyata dengan 25 dan 35 ppt. (Gambar 2) Hal ini sangat erat dengan fisiologi penyerapan dan sirkulasinutrien pada rumput laut sehingga pada salinitas yang lebih rendah maupun tinggi akanmengakibatkan kematian pada rumput laut.

Gambar 1. Sintasan eksplan hasil introduksi gen karaginan pada rumput laut Kappaphycus alvarezii dengan penambahan pupuk yang berbeda

Gambar 2. Sintasan eksplan hasil introduksi gen karaginan pada rumputLaut Kappaphycus alvarezii dengan salinitas yang berbeda

Regenerasi rumput laut hasil introduksi gen karaginan pada rumput laut..(EmmaSuryati) 4 Pada rumput laut K.alvarezii yang hidup di laut kisaran pH yang dapat diterima bisa mencapai pH 9, namun pada kondisi pemeliharaan di laboratorium memperlihatkan tingkat kemasaman yang lebih rendah yaitu berkisar 6-7 (Gambar 3). Hal ini kemungkinan disebabkan karena proses adaptasi pada kondisi media kultur selama pemeliharaan di laboratorium yang memiliki

Page 3 of 37

Page 3 of 7

kisaran pH yang lebih rendah. Penetrasi cahaya pada kondisi di laboratorium memperlihatkan kelangsungan hidup yang paling baik yaitu pada 1500 lux berbeda nyata dengan 2000 lux, namun tidak berbeda nyata dengan 500 dan 1000 lux (Gambar 4) pada 2000 lux seringkali terjadi kematian yang disebabkan karena peningkatan temperatur terutama pada chamber pemeliharaan. Sangat berbeda dengan kondisi budidaya di laut penetrasi cahaya bias mencapai 3000 lux namun peningkatan suhu di laut kemungkinan lebih konstan serta ada penetrasi dari lingkungan sekitar sehingga masih dapat bertahan hidup

Gambar 3. Sintasan eksplan hasil introduksi gen karaginan pada rumputlaut Kappaphycus alvarezii dengan pH yang berbeda

Gambar 4. Sintasan eksplan hasil introduksi gen karaginan pada rumputlaut Kappaphycus alvarezii dengan penetrasi cahaya yang berbeda

5 Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2015

Page 4 of 37

Page 4 of 7

Gambar 5. Sintasan eksplan hasil introduksi gen karaginan pada rumput laut Kappaphycus alvarezii dengan perbandingan terang dan gelap yang berbeda

Gambar 6. Sintasan eksplan hasil introduksi gen karaginan pada rumput laut Kappaphycus alvarezii dengan penambahan ZPT dengan komposisi yang berbeda

Gambar 7. Perkembangan eksplan hasil tranformasi gen karaginan pada rumput laut Kappaphycus alvarezii (A) 0 hari; (B) 2 Minggu; (c) 4 Minggu ; (D) 8 minggu

Regenerasi rumput laut hasil introduksi gen karaginan pada rumput laut (EmmaSuryat)6

Page 5 of 37

Page 5 of 7

Proses fotosintesa pada rumput laut, selain tergantung pada intensitas cahaya juga tergantungpada lamanya pemaparan serta ratio terang dan gelap cahaya yang digunakan. Kelangsungan hidup eksplan rumput laut hasil transformasi gen karaginan yang paling tinggi pada ratio terang gelap 16:8, disini terlihat kebutuhan cahaya untuk mempertahankan kelangsungan hidup lebih banyak walaupun tidak berbeda nyata dengan perbandingan 12:12 (Gambar 5)Untuk memacu pertumbuhan tunas pada rumput laut transgenik dilakukan pada media PES yang diperkaya dengan penambahan ZPT antara lain dari golongan auksin dan sitokinin yaitu kombinasi IAA dan BAP dengan perbandingan 1:1, 1:2, dan 2:1. Dapat meningkatkan kemampuan untuk bertumbuh dan beregenerasi (Suryati et al., 2009). Hasil analisis memperlihatkan pertumbuhan tunas yang paling baik yaitu pada media PES yang diperkaya dengan IAA dan BAP dengan perbandingan 1:2, berbeda nyata dengan kontrol, namun tidak berbeda dengan perbandingan 1:1, dan 2:1, demikian juga kontrol tidak berbeda nyata dengan perbandingan 1:1 dan 2:1.(Gambar 6)

KESIMPULAN

Media kultur yang paling baik yaitu media PES dengan salinitas 30 ppt, pH = 6, penetrasi cahaya 1500 lux, ratio gelap terang =16:8, dan komposisi ZPT adalah campuran IAA dan BAP dengan perbandingan 2:1. Hasil analisis integrasi gen K.karaginan menunjukkan adanya fragmen pada posisi 20000 bp

DAFTAR ACUAN

Cheney, D.P. (2000). Agrobacterium-mediated genetic transformation of multicellular marine algae, resultant strains and their products. international classes. Northeastern University (Huntington Avenue Boston) US. http://ip.com/patfam/en/22440221. Diakses 20 September 2012.Cheng, R., Ruijuan, M.A., Li, K., Hui, R., Xiangzhi, L., Zhaokai, W., Shanjun, Y., & Yong, M. (2011). Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of marine microalgae Schizochytrium. Micres, 25421,1-8.Collen, J.U. (1995). Farming and physiology of the red algae Eucheuma growing commercial importance in East Africa. Ambio, 24, 7-8Daud, R.F., Widyastuti, U., Suharsono, Suryati, E., & Parenrengi, A. (2013). Introduksi gen sitrat sintase ke dalam rumput laut Kappaphycus alvarezii menggunakan bakteri Agrobacterium tumefaciens. Jurnal Riset Akuakultur, 8(2), 201-208.Fajriah U, Suryati, E., Parenrengi, A., Suharsono & Widyastu, U. (2014). Introduksi gen Metallothionin tipe II ke dalam rumput laut Kappaphycus alvarezii menggunakan Agrobacterium tumefaciens. Jurnal Riset Akuakultur, 8(3), 201-208Food and Agriculture Organization of The United Nations Rome. (2010). The state of worldfisheries and aquaculture sales and marketing group ofûce of knowledge exchange, Research and Extension Food and Agriculture Organization of the United Nations Viale delle Terme di Caracalla 00153 Rome, Italy, p. 218.Handayani, T. (2013). Konstruksi vektor biner dan transformasi gen lisozim pada rumput lautKappaphycus alvarezii menggunakan perantara Agrobacterium tumefaciens. Seminar Hasil Sekolah Pasca Sarjana. Bogor(ID).Institut Pertanian Bogor Largo, D.B., Faukami, K., Adachi, M., & Nhisijima, T. (1997). Direct enumeration of total bacteria frommacroalgae by epifluoresecence microscopy asapllied to the flashy red algae Kappaphycus alvarezii and Glacilaria Spp (Rhodophyta). J. Phycol., 33, 554-557.Rajamuddin, M.A., Jaya, A.A., Ridwan, & Suryati, E. (2010). Kajian induksi kalus rumput lautKappaphycus alvarezii untuk produksi embrio somatik. Jurnal Riset Akuakultur, 5(2), 211-219.Rajamuddin, M.A., Widyastuti, U., & Alimuddin. (2014). Introduction and expression analysis of cappa carageenase gene in seaweed Kappaphycus alvarezii (Doty). Prosiding Seminar Nasional Bioteknologi UGM 2014, 10 hlm.Reddy, C.R.K., Kumar, G.R.K., Siddhanta, A.K., & Tewari, A. (2003). In Vitro somatic embriogenesis and regeneration of somatic embryos from pigmented callus of Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty (Rhodophyta, Gigartinales). J. Phycol., 39, 610-616.

Page 6 of 37

Page 6 of 7

7 Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2015

Sulistiani, E, Soelistyowati, D., Alimuddin, & Yani, S.A. (2012). Introduction and filaments regeneration from callus of cottonii seaweed (Kappaphycus alvarezii (Doty) collection from Natuna Island, Riau. Islands Province. Biotropia, 19(2), 103-114 Suryati, E., & Mulyaningum, S.R.H. (2009). Regenerasi rumput laut Kappaphycus alvarezii (Doty) melaluiinduksi kalus dan embrio dengan penambahan hormon perangsang tumbuh secara In vitro. J. Ris. Akuakultur, 4(1), 39-45.Suryati, E., Fadilah, S., & Tenriulo, A. (2011). Perkembangan kristal filamen serta pembentukan mikropropagule rumput laut Kappaphycus alvarezii melalui induksi kalus pada media PES 1/20. Makalah disajikan pada Seminar Forum Inovasi Teknologi Akuakultur di Inna Grand Bali Beach Denpasar tanggal 19-21 Juli 2011.Suryati, Daud, E,R.F., Widyastuti, U., Tenriulo, A., & Parenrengi, A. (2014). Regenerasi rumput laut Kappaphycus alvarezii hasil transformasi gen sitrat sintase menggunakan Agrobacterium tumefacien secara in vitro. J. Ris. Akuakultur, 9(2), 169-178.Vairappan, C.S. (2006). Seasonal occurancences of epiphytic algae on the comercially cultivated red algae Kappaphycus alvarezii (Soliriciae, Gigartinales, Rhodophyta). J. Applied Phycol., 18, 611-617.

Page 7 of 37

Page 7 of 7