KARAKTERISASI ENZIM EKSTRASELULER

DAN PRODUK BIOSOLUBILISASI BATUBARA HASIL IRADIASI

GAMMA OLEH KAPANG Penicillium sp. DAN Trichoderma sp.

YELVI ERIDA

PROGRAM STUDI BIOLOGI

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARI HIDAYATULLAH

JAKARTA

2010 M / 1431 H

KARAKTERISASI ENZIM EKSTRASELULER

DAN PRODUK BIOSOLUBILISASI BATUBARA HASIL IRADIASI

GAMMA OLEH KAPANG Penicillium sp. DAN Trichoderma sp.

SKRIPSI

Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Sarjana Sains

Pada Program Studi Biologi Fakultas Sains dan Teknologi

Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta

YELVI ERIDA

106095003217

PROGRAM STUDI BIOLOGI

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARI HIDAYATULLAH

JAKARTA

2010 M / 1431 H

Bismillaahirrahmaanirrahiim

“Sesungguhnya pada pertukaran malam dan siang itu dan pada apa

yang diciptakan Allah di langit dan di bumi, benar-benar terdapat tanda-

tanda (kekuasaan-Nya) bagi orang-orang yang bertakwa” (QS. Yunus: 6)

Pengetahuan diperlikan karena ia adalah akar, tempat bertaut cabang.

Setiap sayap tak akan mampu terbang melintasi kekuasaan samudra.

Hanya ilmu yang terlimpah lansung dari Allah dapat mengantarkan

seseorang dari haribaan-Nya (Anonim)

Skripsi ini dipersembahkan

Teruntuk kedua orang tua dan keluarga tercinta

PERNYATAAN

DENGAN INI SAYA MENYATAKAN BAHWA SKRIPSI INI BENAR-BENAR HASIL KARYA SENDIRI YANG BELUM PERNAH DIAJUKAN SEBAGAI SKRIPSI ATAU KARYA ILMIAH PADA PERGURUAN TINGGI ATAU LEMBAGA MANAPUN.

Jakarta, Desember 2010

Yelvi Erida 106095003217

YELVI ERIDA Karakterisasi Enzim Ekstraseluler dan Produk Biosolubilisasi Batubara Hasil Iradiasi Gamma

oleh Kapang Penicillium sp. dan Trichoderma sp.

JAKARTA 2010 M / 1431 H

ABSTRAK Karakterisasi Enzim Ekstraseluler dan Produk Biosolubilisasi Batubara Hasil Iradiasi Gamma oleh Kapang Penicillium sp. dan Trichoderma sp. Biosolubilisasi adalah teknologi yang memiliki potensi untuk mengubah padatan batubara menjadi bahan bakar cair atau kimia. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengkarakterisasi enzim ekstraseluler dan mengetahui produk biosolubilisasi batubara hasil iradiasi gamma oleh kapang Penicillium sp. dan Trichoderma sp. Dosis iradiasi gamma yang digunakan pada batubara adalah 5 kGy dan batubara yang tidak diiradiasi. Parameter yang diukur adalah uji kualitatif enzim ekstraseluler kapang (fenoloksidase, lignin peroksidase, dan Mn-peroksidase), pH medium, nilai absorbansi hasil biosolubilisasi batubara (λ250 nm and λ450 nm), pengukuran hidrolisis FDA, pengukuran kadar protein ekstraseluler kapang dengan metode Lowry, analisis senyawa hasil biosolubilisasi batubara dengan GC-MS dan karakteristik enzim ekstraseluler dengan SDS-PAGE. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kedua kapang memiliki ketiga jenis enzim dan iradiasi gamma pada batubara (5 kGy) tidak mempengaruhi pH medium, biosolubilisasi, hidrolisis FDA dan kadar protein ekstraseluler kecuali pada karakteristik enzim ekstraseluler kapang Trichoderma sp. Enzim yang terdeteksi pada kapang Penicillium sp. adalah mangan peroksidase (BM=48 KDa) dan lakase (BM=56 KDa) baik pada batubara yang tidak diiradiasi (0 kGy) dan batubara yang diiradiasi (5 kGy), sedangkan pada kapang Trichoderma sp. terdeteksi hanya lakase (BM=56 KDa) pada batubara yang diiradiasi (5 kGy) dan mangan peroksidase (BM=48 KDa) dan lakase (BM=56 KDa) pada batubara yang tidak diiradiasi (0 kGy). Produk solubilisasi menunjukkan kecenderungan setara bensin pada perlakuan batubara yang diiradiasi dan tidak diiradiasi untuk Trichoderma sp., sedangkan Penicillium sp. hanya pada batubara yang tidak diiradiasi. Kata kunci: batubara, biosolubilisasi, enzim ekstraseluler, iradiasi gamma,

Penicillium sp. dan Trichoderma sp.

ABSTRACT

Characterization of Extracellular Enzyme And Biosolubillization Product of Gamma Irradiation Coal By Penicillium sp. and Trichoderma sp. Biosolubilization is a technology that has a potential for converting solid coal into liquid fuel or chemical. The objectives of this research were to characterize extracellular enzyme and to know biosolubillization products of gamma irradiation coal by Penicillium sp. and Trichoderma sp. The dosages which has been used for gamma irradiation were 5 kGy and unirradiated coal. The parameters were the qualitative test of extracellular enzyme enzyme (phenoloxidase, peroxidase, and Mn-peroxidase), pH of medium, absorbance of the coal biosulubilization (λ250 nm and λ450 nm), hydrolysis of FDA, protein concentration by Lowry method, analysis of coal biosolubilization product by GC-MS, and characteristics of the extracellular enzyme by SDS-PAGE. The result showed both of fungi were positive for all enzymes test and the gamma irradiated did not effect on the pH medium, biosolubilization, FDA hydrolysis and extracellular protein concentration but effected on the characteristic of extracellular enzyme from Trichoderma sp. The enzymes detected from Penicillium sp. were manganese-peroxidase (MW = 48 KDa) and laccase (MW = 56 KDa) in both irradiated coal (5 kGy) and unirradiated coal (0 kGy), whereas on Trichoderma sp. was detected only laccase (MW = 56 KDa) in irradiated coal (5 kGy), and manganese-peroxidase (MW = 48 KDa) and laccase (MW = 56 KDa) in unirradiated coal (0 kGy). The biosolubilization product showed the similarity with gasoline in irradiated and unirradiated coal for Trichoderma sp., but for Penicillium sp. only occurred on unirradiated coal . Keywords: biosolubilzation, coal, extracellular enzyme, gamma iradiation,

Penicillium sp., and Trichoderma sp.

KATA PENGANTAR

Puji syukur yang dalam penulis sampaikan kehadiran Allah Yang Maha

Pemurah, karena berkat kemurahan-Nya skripsi ini dapat penulis selesaikan sesuai

dengan yang diharapkan, dalam skripsi ini penulis mengambil judul tentang

”Karakterisasi Enzim Ekstraseluler dan Produk Biosolubilisasi Batubara

Hasil Iradiasi Gamma oleh Kapang Penicillium sp. dan Trichoderma sp.”

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Program

Studi Biologi Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

Shalawat dan salam senantiasa tercurahkan kepada junjungan Nabi

Muhammad SAW beserta para sahabat, keluarga, dan pengikut-pengikut beliau

hingga hari akhir.

Pada kesempatan ini penulis tidak lupa mengucapkan terima kasih yang

sebesar-besarnya atas bimbingan dan saran-saran serta pentunjuk kepada :

1. `Dr. Sopiansyah Jaya Putra, M.Sis, selaku Dekan Fakultas Sains dan

Teknologi Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

2. Dr. Lily Surraya Eka Putri, M.Env.Stud selaku Ketua Program Studi

Biologi Fakultas sains dan Teknologi.

3. Irawan Sugoro, M.Si dan Megga Ratnasari Pikoli, M.Si selaku

Pembimbing I dan Pembimbing II, yang dengan sabar memberikan

petunjuk serta bimbingan, sehingga penulis dapat menyelesaikan

penelitian dan penyusunan skripsi ini.

4. Dra. Nani Radiastuti, M.Si dan La Ode Sumarlin, M.Si, selaku Penguji I

dan II pada seminar proposal dan seminar hasil yang telah memberikan

pengarahan dalam penyusunan skripsi ini.

5. Dr. Lily Surraya Eka Putri, M.Env.Stud dan Dasumiati, M.Si, selaku

Penguji I dan II pada sidang Munagosyah yang telah memberikan

pengarahan dalam penyusunan skripsi ini.

6. Kedua orang tua tercinta, Mama dan Papa yang selalu hidup di hati penulis

sampai kapanpun, yang telah memberikan kasih sayang, do’a, dan

pengorbanan yang tak terkira demi kehidupan dan masa depan penulis.

i

7. Bang Ary dan Adek-adekku (Ade, Syahrul, Ilham dan Putra) yang telah

memberi perhatian, semangat dan keceriaan pada penulis sehingga segala

kepenatan dapat terobati dalam penulisan skripsi ini (Love You All).

8. Keluarga besar penulis ( Nenek, Kakek, Mak wo, Nte nana, Mama ii, Nte

titi, Nte ja, Ni on, Om yos, Om pen, ka pup dan Uncu) yang selalu

memberi motivasi, kasih sayang, doa maupun materi pada penulis.

9. Keluarga di Citayam (Nte fifi, Om rid, Om al dan Nte adek) yang selalu

memberikan motivasi, doa, perhatian dan kasih sayang kepada penulis.

10. Mitha, Riska, Dede, Astri dan Rian yang menemani penulis dalam

melaksanakan Penelitian di Batan (makasih atas kerjasamanya plend).

11. Biologi Angkatan 2006 khususnya ayang-ayangan (Rinae, Ise, Noe yang

selalu menemeni penulis) dan teman-teman seperjuanganku, Nene, Anggi,

Lidi, Mpit, Nungky, Nita, Zian, Hera, Eko, Ipin, Muhe, Deden, Malik,

Iqbal, Adeng, dan Geleng) tetap kompak sampai kapanpun.

12. Teman masa kecil penulis ( Ami, Yelin dan Ci) atas doa dan perhatiannya.

13. Pihak-pihak lain yang tidak bisa saya sebutkan satu persatu, tapi saya

ucapkan sekali lagi banyak terima kasih karena dengan bantuan semuanya

segala masalah dapat terselesaikan dengan lebih mudah dan mendapatkan

hasil yang baik.

Harapan penulis semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi penulis

khususnya serta para pembaca umumnya dalam melengkapi ilmu pengetahuan

yang berhubungan dengan ”Karakterisasi Enzim Ekstraseluler dan Produk

Biosolubilisasi Batubara Hasil Iradiasi Gamma oleh Kapang Penicillium sp.

dan Trichoderma sp.” Akhir kata hanya kepada Allah SWT dipanjatkan do’a

untuk membalas segala budi baik untuk semua pihak yang terkait.

Jakarta, 14 November 2010

Yelvi Erida

ii

DAFTAR ISI

Halaman

KATA PENGANTAR ................................................................................ i

DAFTAR ISI ............................................................................................... iii

DAFTAR GAMBAR .................................................................................. vi

DAFTAR TABEL .................................................................................... vii

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................ viii

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang ............................................................... 1

1.2 Perumusan Masalah ........................................................ 3

1.3 Hipotesis.......................................................................... 4

1.4 Tujuan Penelitian ............................................................ 4

1.5 Manfaat Penelitian .......................................................... 5

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Batubara .......................................................................... 6

2.1.1 Penyusun Batubara.............................................. 6

2.1.2 Klasifikasi Batubara ........................................... 7

2.2 Biosolubilisasi Batubara ................................................. 9

2.3 Kapang Pengsolubilisasi Batubara.................................. 10

2.3.1 Kapang Trichoderma sp. .................................... 12

2.3.2 Kapang Penicillium sp. .... ................................. 14

2.4 Enzim .............................................................................. 15

2.5 Kromatografi Gas Spektroskopi Massa (GCMS) ........... 20

2.6 Elektroforesis .................................................................. 21

2.7 Iradiasi Gamma .............................................................. 23

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ....................................... 24

iii

3.2 Alat dan Bahan .............................................................. 24

3.3 Cara Kerja ..................................................................... 25

3.3.1 Persiapan Serbuk Batubara ................................ 25

3.3.2 Pembuatan Medium .... ...................................... 25

3.3.2.1 Medium Potato Dextrose Agar (PDA) .... 25

3.3.2.2 Medium Minimal Salt (MMS) .... .......... 26

3.3.2.3 Medium Potato Dextrose Agar Minimal Salt (PDAM) .... ..................................... 26

3.3.2.4 Medium Minimal Salt + Sukrosa (MMSS) ............................................................................ 26

3.3.3 Peremajaan Kultur Kapang ................................ 27

3.3.4 Kultur Inokulum Spora .... ................................. 27

3.3.5 Uji Enzim Ekstraseluler .... ................................ 27

3.3.5.1 Fenoloksidase .... .................................... 27

3.3.5.2 Peroksidase ............................................ 27

3.3.5.3 Mangan Peroksidase .... ......................... 28

3.3.6 Pengukuran pH Medium .................................... 28

3.3.7 Pengujian Biosolubilisasi Batubara .................... 28

3.3.7.1 Pengukuran Biosolubilisasi Batubara .... 29

3.3.8 Pengukuran Hidrolisis FDA .... .......................... 30

3.3.9 Pengukuran Kadar Protein Ekstraseluler dengan Metode Lowry ....................................... 30

3.3.10 Analisis Hasil Biosolubilisasi Batubara oleh Kapang Penicilium sp. dan Trichoderma sp. Dengan Menggunakan GC-MS ................................................................ 31

3.3.11 Karakteristik Enzim Ekstraseluler dengan Elektroforesis ..................................................... 31

3.4 Analisis Data ................................................................. 33

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Analisis Kualitatif Enzim Ekstraseluler Kapang ... 34

4.2 Hasil Pengukuran pH Medium Kapang .......................... 35

4.3 Hasil Biosolubilisasi Batubara ........................................ 38

iv

4.4 Hasil Hidrolisis FDA ...................................................... 44

4.5 Hasil Kadar Protein Ekstraseluler Kapang...................... 46

4.6 Analisis Senyawa Hasil Biosolubilisasi Batubara Menggunakan GC-MS .................................................... 49

4.7 Karakteristik Enzim Ekstraseluler Kapang Penicillium sp. dan Trichoderma sp. ..................................................... 53

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan ..................................................................... 56

5.2 Saran................................................................................ 56

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................. 57

LAMPIRAN................................................................................................... 61

.

v

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Klasifikasi Batubara ...................................................................... 8

Gambar 2. Kapang Trichoderma sp. ............................................................. 12

Gambar 3. Kapang Penicillium sp. . .............................................................. 15

Gambar 4. Uji kualitatif adanya enzim ekstraseluler kapang Penicillium sp. dan Trichoderma sp. ..................................................................... 34

Gambar 5. Nilai pH medium kapang Penicillium sp. dan Trichoderma sp. ... 37

Gambar 6. Nilai absorbansi supernatan pada panjang gelombang 250 nm hasil biosolubilisasi kapang Penicillium sp. (A) dan Trichoderma sp. (B) ...................................................................... 39

Gambar 7.Nilai absorbansi supernatan pada panjang gelombang 450 nm hasil biosolubilisasi kapang Penicillium sp. (A) dan Trichoderma sp (B).. ..................................................................... 41

Gambar 8. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 490 nm hasil aktivitas enzim kapang Penicillium sp. (A) dan Trichoderma sp. (B).. . ... 45

Gambar 9. Nilai kadar protein ekstraseluler kapang Penicillium sp.(A) dan Trichoderma sp. (B). ..................................................................... 47

Gambar 10.Karakteristik enzim ekstraseluler kapang Penicillium sp. dan Trichoderma sp. pada medium yang mengandung batubara yang tidak diiradiasi (0 kGy) dan batubara yang diiradiasi (5 kGy)...... 54

vi

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1. Enzim ekstraseluler pendegradasi lignin dari kapang pelapuk putih (White Rot Fungi) ..................................................... 18

Tabel 2. Komposisi medium perlakuan ......................................................... 25

Tabel 3. Data perlakuan kultur kapang .......................................................... 29

Tabel 4. Senyawa hasil biosolubilisasi batubara menggunakan GC-MS........ 51

vii

viii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Kerangka berpikir.................................................................... 61

Lampiran 2. Bagan kerja ............................................................................ 62

Lampiran 3. Komposisi medium ................................................................ 63

Lampiran 4. Komposisi reagen Lowry ....................................................... 63

Lampiran 5. Komposi larutan elektroforesis .............................................. 64

Lampiran 6. Hasil pengujian pH medium kapang....................................... 65

Lampiran 7. Hasil pengujian biosolubilisasi batubara................................. 65

Lampiran 8. Hasil pengujian hidrolisis FDA.............................................. 65

Lampiran 9. Hasil pengujian kadar protein ekstraseluler kapang................ 66

Lampiran 10. Kurva standar protein BSA ..................................................... 66

Lampiran 11. Kurva standar marker.............................................................. 67

Lampiran 12. Uji statistik analisis varians..................................................... 68

Lampiran 13. Kromatogram hasil GC-MS kontrol ....................................... 70

Lampiran 14. Kromatogram hasil GC-MS biolubilisasi batubara oleh kapang Penicillium sp. ........................................................... 71

Lampiran 15. Kromatogram hasil GC-MS biosolubilisasi batubara oleh kapang Trichoderma sp. ........................................................ 72

Lampiran 16. Foto-foto hasil biosolubilisasi batubara. . ............................. 73

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Kebutuhan bahan bakar minyak mengalami peningkatan dari tahun ke tahun,

sedangkan cadangan minyak mentah diperkirakan akan habis dalam kurun waktu

20 tahun. Sumber energi yang akan memegang peranan yang penting adalah

batubara. Indonesia memiliki cadangan batubara sekitar 36,3 juta ton dan 49 %

dari cadangan tersebut masih dalam bentuk batubara peringkat rendah.

Penggunaan batubara terutama untuk kebutuhan energi listrik, tetapi Indonesia

tidak mungkin membakar habis batubara dalam bentuk PLTU karena akan

mengotori lingkungan dengan dihasilkannya polutan seperti sulfur oksida (SOx),

nitrogen oksida (NOx), karbondioksida (CO2) dan logam berat. Salah satu solusi

untuk mengatasi masalah kelangkaan bahan bakar minyak adalah dengan

mengolah batubara sehingga menjadi energi bersih seperti melalui proses

pencairan batubara (Novia et al., 2009).

Biosolubilisasi batubara adalah suatu upaya untuk mencairkan batubara

yang nantinya dapat digunakan sebagai bahan bakar pengganti minyak bumi. Pada

umumnya metode yang digunakan dalam proses pencairan batubara adalah

dengan metode kimia dan fisika. Kelemahan metode kimia dan fisika yaitu

membutuhkan biaya operasional yang cukup tinggi karena prosesnya dilakukan

dalam temperatur dan tekanan yang tinggi, memerlukan instalasi yang cukup

rumit dan menghasilkan CO2 dua kali lipat dari bahan bakar minyak biasa.

1

2

Alternatif lainnya dengan metode biologi yaitu dengan bantuan mikroorganisme.

Pencairan batubara dengan metode biologi relatif dapat menekan biaya

operasional karena tidak dilakukan dalam tekanan dan temperatur yang tinggi

serta lebih ramah lingkungan karena tidak menghasilkan produk sampingan yang

berbahaya (Scott et al., 1991). Hasil biosolubilisasi batubara akan menghasilkan

senyawa yang setara dengan autput minyak bumi (Cohen et al., 1990).

Mikrooganisme dapat diterapkan dalam proses biosolubilisasi batubara

(Laborda et al., 1999). Menurut Cohen dan Gabriele (1982) mikroorganisme

menggunakan material batubara sebagai sumber energi untuk pertumbuhan dan

kemampuannya dalam mensolubilisasi batubara. Mikroorganisme yang digunakan

dalam penelitian ini adalah kapang Penicillium sp. dan Trichoderma sp. Penelitian

Sugoro et al. (2009) membuktikan bahwa kapang Penicillium sp. dan

Trichoderma sp. memiliki nilai absorbansi tertinggi, artinya kapang tersebut telah

melakukan pendegradasian batubara tertinggi dan mampu tumbuh menggunakan

medium batubara. Pembuktian ini diperkuat oleh penelitian Laborda et al. (1999)

membuktikan bahwa kapang Penicillium sp. dan Trichoderma sp. terlibat dalam

proses biosolubilisasi batubara. Biosolubilisasi batubara oleh kapang Penicillium

sp. dan Trichoderma sp. tumbuh dengan adanya batubara.

Biosolubilisasi batubara melibatkan enzim. Enzim-enzim ekstraseluler yang

berperan dalam biosolubilisasi batubara adalah peroksidase, esterase,

fenoloksidase, mangan peroksidase, lignin peroksidase dan lakase (Laborda et al.,

1999; Fakuosa dan Hofrichter, 1999). Enzim peroksidase terdiri dari lignin

peroksidase dan mangan peroksidase. Lignin peroksidase, mangan peroksidase

3

dan lakase, masing-masing mempunyai berat molekul 38-47 KDa, 38-50 KDa,

dan 53-110 KDa (Fakuosa dan Hofrichter, 1999).

Biosolubilisasi dapat ditingkatkan dengan cara praperlakuan terhadap

batubara. Batubara diiradiasi dengan iradiasi gamma. Pemakaian dosis dalam

iradiasi gamma mempengaruhi proses biosolubilisasi batubara karena pada

iradiasi terjadi proses oksidasi yang dapat menghasilkan senyawa asam. Penelitian

ini menggunakan batubara yang tidak diiradiasi (0 kGy) dan batubara yang

diiradiasi (5 kGy) (Selvi, 2009). Pemakaian dosis iradiasi gamma bertujuan untuk

mengubah senyawa kompleks pada batubara menjadi senyawa sederhana sehingga

hasil biosolubilisasi batubara menjadi lebih sempurna. Selain itu, iradiasi gamma

dapat meningkatkan site adsorpsi pada batubara sehingga enzim atau sel dapat

bekerja maksimum (Sugoro, 2009).

Berdasarkan uraian di atas, tujuan dari penelitian ini adalah untuk

mengetahui pengaruh batubara hasil iradiasi gamma terhadap karakteristik enzim

ekstraseluler dari kultur kapang Penicillium sp. dan Trichoderma sp. Hasil

penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang enzim ekstraseluler

yang mampu mensolubilisasi batubara.

1.2. Perumusan Masalah

1. Apakah ada pengaruh iradiasi gamma pada batubara terhadap kadar

protein ekstraseluler kultur kapang Penicillium sp. dan Trichoderma sp.?

4

2. Apakah ada perbedaan karakteristik enzim ekstraseluler kultur kapang

Penicillium sp. dan Trichoderma sp. dalam medium yang mengandung

batubara hasil iradiasi gamma?

3. Apakah ada perbedaan produk biosolubilisasi batubara oleh Penicillium

sp. dan Trichoderma sp. dalam medium yang mengandung batubara hasil

iradiasi gamma?

1.3. Hipotesis

1. Iradiasi gamma pada batubara berpengaruh terhadap kadar protein

ekstraseluler kapang Penicillium sp. dan Trichoderma sp.

2. Karakteristik enzim ekstraseluler kultur kapang Penicillium sp. dan

Trichoderma sp. dalam medium yang mengandung batubara hasil iradiasi

gamma berbeda.

3. Produk biosolubilisasi batubara oleh Penicillium sp. dan Trichoderma sp.

dalam medium yang mengandung batubara hasil iradiasi gamma berbeda.

1.4. Tujuan Penelitian

1. Mengetahui pengaruh iradiasi gamma pada batubara terhadap kadar

protein ekstraseluler kultur kapang Penicillium sp. dan Trichoderma sp.

2. Mengetahui karakteristik enzim ekstraseluler kultur kapang Penicillium

sp. dan Trichoderma sp. dalam medium yang mengandung batubara hasil

iradiasi gamma.

5

3. Mengetahui perbedaan produk biosolubilisasi batubara oleh Penicillium

sp. dan Trichoderma sp. dalam medium yang mengandung batubara hasil

iradiasi gamma.

1.5. Manfaat Penelitian

Karakteristik enzim ekstraseluler kultur kapang Penicillium sp. dan

Trichoderma sp. diharapkan dapat memberikan informasi tentang enzim-enzim

yang mampu mensolubilisasi batubara.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Batubara

Batubara adalah mineral organik yang dapat terbakar, terbentuk dari sisa

tumbuhan purba yang mengendap yang selanjutnya berubah bentuk akibat proses

fisika dan kimia yang berlangsung jutaan tahun. Oleh karena itu, batubara

termasuk dalam kategori bahan bakar fosil, proses yang mengubah tumbuhan

menjadi batubara tadi disebut dengan pembatubaraan. Batubara adalah batuan

yang mudah terbakar yang lebih dari 50%-70% berat volumenya merupakan

bahan organik. Bahan organik utamanya yaitu tumbuhan yang dapat berupa kulit

pohon, daun, akar, spora, polen, dan lain-lain. Selanjutnya bahan organik tersebut

mengalami berbagai tingkat pembusukan (dekomposisi) sehingga menyebabkan

perubahan sifat-sifat fisik maupun kimia baik sebelum ataupun sesudah tertutup

oleh endapan lainnya (Speight, 1994).

2.1.1. Penyusun Batubara

Menurut Speight (1994) batubara berasal dari sisa tumbuhan diperkuat

dengan ditemukannya fosil tumbuhan di dalam lapisan batubara. Dalam

penyusunannya batubara diperkaya dengan berbagai macam polimer organik yang

berasal dari antara lain karbohidrat, lignin, dan protein.

Lignin merupakan suatu unsur yang memegang peranan penting dalam

mengubah susunan sisa tumbuhan menjadi batubara. Sementara ini susunan

6

7

molekul umum dari lignin belum diketahui dengan pasti, namun susunannya dapat

diketahui dari lignin yang terdapat pada berbagai macam jenis tanaman. Sebagai

contoh lignin yang terdapat pada rumput (Hatakka, 2001).

Karbohidrat terdiri dari disakarida, trisakarida, ataupun polisakarida. Jenis

polisakarida inilah yang umumnya menyusun batubara, karena dalam tumbuhan

jenis inilah yang paling banyak mengandung polisakarida (khususnya selulosa)

yang kemudian terurai dan membentuk batubara (Speight, 1994)

Protein merupakan bahan organik yang mengandung nitrogen yang selalu

hadir sebagai protoplasma dalam sel mahluk hidup. Struktur dari protein pada

umumnya adalah rantai asam amino yang dihubungkan oleh rantai amida. Protein

pada tumbuhan umunya muncul sebagai steroid (Laborda et al.,1999).

2.1.2. Klasifikasi Batubara

Batubara diklasifikasikan berdasarkan tingkat pembatubaraan dan tujuan

pemanfaatannya. Misalnya, batubara bituminus banyak digunakan untuk bahan

bakar pembangkit listrik, pada industri baja atau genteng serta industri semen.

Tipe batubara berdasarkan tingkat pembatubaraan ini dapat dikelompokkan yaitu

lignit, subbituminus, bituminus, dan antrasit (American Coal Foundation, 2007).

8

A. B.

C. D.

Gambar 1. Klasifikasi batubara (American Coal Foundation, 2007) (A. lignit; B. subbituminus; C. bituminus; dan C. antrasit)

Lignit merupakan batubara muda dengan kualitas terendah. Lignit adalah

batubara yang sangat lunak dan mengandung air 70% dari beratnya. Batubara ini

berwarna hitam, sangat rapuh, nilai kalor rendah dengan kandungan karbon yang

sangat sedikit, kandungan abu dan sulfur yang banyak (Gambar 1 A). Batubara

jenis ini dijual secara eksklusif sebagai bahan bakar untuk pembangkit listrik

tenaga uap (PLTU).

Subbituminus merupakan batubara yang berada di antara batubara lignit

dan bituminus, terutama digunakan sebagai bahan bakar untuk PLTU. Batubara

9

subbituminus mengandung sedikit karbon dan banyak air, oleh karena itu menjadi

sumber panas yang tidak efisien (Gambar 1 B).

Bituminus adalah batubara yang tebal, biasanya berwarna hitam

mengkilat, terkadang coklat tua (Gambar 1 C). Batubara bituminus mengandung

86% karbon dari beratnya dengan kandungan abu dan sulfur yang sedikit.

Umumnya dipakai untuk PLTU, tapi dalam jumlah besar juga dipakai untuk

pemanas dan aplikasi sumber tenaga dalam industri.

Antrasit adalah batubara peringkat teratas, biasanya dipakai untuk bahan

pemanas ruangan di rumah dan perkantoran. Batubara antrasit berbentuk padat,

keras dengan warna hitam mengkilat dan mengandung antara 86% – 98% karbon

dari beratnya, terbakar lambat, dengan nyala api berwarna biru dengan sedikit

sekali asap (Gambar 1 D).

2.2. Biosolubilisasi Batubara

Biosolubilisasi adalah proses pelarutan dalam suatu medium dengan bantuan

mikroorganisme. Biosolubilisasi dapat berupa upaya untuk mencairkan batubara

yang nantinya dapat digunakan sebagai bahan bakar pengganti minyak bumi. Di

samping untuk mencairkan batubara, biosolubilisasi dapat pula digunakan untuk

mengurangi kandungan sulfur atau logam toksik pada batubara (Faison et al.,

1989).

Batubara cair yang dihasilkan dari proses biosolubilisasi adalah berupa

campuran senyawa yang larut dalam air, senyawa-senyawa polar dengan berat

molekul relatif lebih tinggi. Teknologi ini memiliki potensi besar, tetapi masih ada

sejumlah masalah yang harus dipecahkan tanpa adanya air atau pelarut yang

10

cocok, produk yang dihasilkan tetap padat. Produk terlarut ini memiliki

kandungan energi tinggi dan memungkinkan digunakan sebagai bahan bakar,

tetapi belum dapat digunakan sebagi bahan bakar sarana transportasi. Selain itu,

kebanyakan mikroorganisme membutuhkan gula dan media pertumbuhan lebih

dari dua minggu. Media murah dan mampu mempercepat pertumbuhan

mikroorganisme untuk aplikasi komersial. Produksi batubara cair dapat dilakukan

dengan memanfaatkan enzim hasil isolasi mikroorganisme (Liu et at., 1989).

2.3. Kapang Pengsolubilisasi Batubara

Kapang (mould/filamentous fungi) merupakan mikroorganisme anggota

Kingdom Fungi yang membentuk hifa (Carlile dan Watkinson 1994). Kapang

bukan merupakan kelompok taksonomi yang resmi, sehingga anggota-anggota

dari kapang tersebar ke dalam filum Glomeromycota, Ascomycota, dan

Basidiomycota (Hibbett et al., 2007).

Sifat-sifat fisiologi kapang dipengaruhi oleh kebutuhan air, suhu

pertumbuhan, kebutuhan oksigen dan pH, makanan, dan komponen penghambat.

Pada umumnya kebanyakan kapang membutuhkan aw minimal untuk

pertumbuhan lebih rendah. Kapang bersifat mesofilik, yaitu tumbuh baik pada

suhu kamar. Suhu optimum pertumbuhan kapang adalah sekitar 25-30°C, tetapi

ada beberapa dapat tumbuh pada suhu 35-37°C atau lebih tinggi, misalnya

Aspergillus. Semua kapang bersifat aerofilik, yaitu membutuhkan oksigen untuk

pertumbuhannya. Kebanyakan kapang dapat tumbuh pada kisaran pH yang luas,

yaitu pH 2-8,5 tetapi biasanya pertumbuhannya akan lebih baik pada kondisi asam

11

atau pH rendah. Kapang dapat menggunakan berbagai komponen makanan dari

yang sederhana sampai kompleks. Kapang memproduksi enzim hidrolitik,

misalnya amilase, pektinase, proteinase, dan lipase. Kapang mengeluarkan

komponen yang dapat menghambat organisme lainnya. Komponen ini disebut

antibiotik. Pertumbuhan kapang biasanya berjalan lambat bila dibandingkan

pertumbuhan bakteri dan khamir (Fardiaz, 1989).

Habitat kapang sangat beragam, namun pada umumnya kapang dapat

tumbuh pada substrat yang mengandung sumber karbon organik (Carlile dan

Watkinson 1994). Kapang yang tumbuh dan mengkolonisasi bagian-bagian di

dalam ruangan telah banyak diteliti. Kapang tersebut mudah dijumpai pada

bagian-bagian ruangan yang lembab, seperti langit-langit bekas bocor, dinding

yang dirembesi air, atau pada perabotan lembab yang jarang terkena sinar

matahari. Genus kapang yang sering dijumpai tumbuh di dalam ruangan adalah

Cladosporium, Penicillium, Alternaria, dan Aspergillus (Mazur et al., 2006).

Kapang melakukan reproduksi dan penyebaran menggunakan spora. Spora

kapang terdiri dari dua jenis, yaitu spora seksual dan spora aseksual (Carlile dan

Watkinson 1994). Menurut Champe et al. (1981) dan Carlile dan Watkinson

(1994), spora aseksual dihasilkan lebih cepat dan dalam jumlah yang lebih banyak

dibandingkan spora seksual. Spora aseksual memiliki ukuran yang kecil (diameter

1-10 μm) dan ringan, sehingga penyebarannya umumnya secara pasif

menggunakan aliran udara.

Sejumlah strain jamur dan bakteri berfilamen diketahui berinteraksi

dengan batubara kualitas rendah, melalui proses ekstraselular untuk menghasilkan

12

medium yang lebih gelap selama proses kultur atau cairan gelap pada permukaan

batubara ketika ditumbuhkan pada permukaan kultur agar. Diketahui bahwa

tedapat beberapa jenis mikroorganisme dari jenis bakteri maupun fungi yang

dapat mengubah batubara padat menjadi produk cair, dengan minimalisasi

hilangnya kandungan energi total awal (Faison et al., 1989).

2.3.1. Kapang Trichoderma sp.

Ciri-ciri spesifik kapang Trichoderma sp. adalah mempunyai konidia,

sterigmata, konidiofora, miselium berseptat (Gambar 2). Koloni kapang

Trichoderma sp. tersebut berumur 7 hari, penampakan koloninya dilihat

menggunakan mikroskop pada perbesaran 400 X (Kuraesin, 2009). Kapang

Trichoderma sp. mempunyai konidiofora bercabang banyak, ujung

percabangannya merupakan sterigma, membentuk konidia bulat atau oval,

berwarna hijau terang, dan berbentuk bola-bola berlendir ( Fardiaz, 1989).

A. Konidia

B. Sterigma

C. Konidiofora

Gambar 2. Kapang Trichoderma sp.( Kuraesin, 2009)

13

Kapang Trichoderma sp. diklasifikasikan menurut sistem nama binomial

yaitu: Kingdom Fungi; Filum Eumycota; Sub Filum Deuteromycota; Kelas

Hyphomycetes; Ordo Hyphomycetales; Famili Moniliaceae; Genus Trichoderma

dan Spesies Trichoderma sp. Koloni dari kapang Trichoderma sp. berwarna putih,

kuning, hijau muda, dan hijau tua. Susunan sel kapang Trichoderma sp. bersel

banyak berderet membentuk benang halus yang disebut dengan hifa. Hifa pada

jamur ini berbentuk pipih, bersekat, dan bercabang-cabang membentuk anyaman

yang disebut miselium. Miseliumnya dapat tumbuh dengan cepat dan dapat

memproduksi berjuta-juta spora, karena sifatnya inilah Trichoderma sp. dikatakan

memiliki daya kompetitif yang tinggi. Dalam pertumbuhannya, bagian permukaan

akan terlihat putih bersih, dan bermiselium kusam. Setelah dewasa, miselium

memiliki warna hijau kekuningan (Carlile dan Watkinson, 1994).

Trichoderma sp. adalah salah satu jamur tanah yang tersebar luas

(kosmopolitan), yang hampir dapat ditemui di lahan-lahan pertanian dan

perkebunan. Trichoderma sp. bersifat saprofit pada tanah, kayu, dan beberapa

jenis bersifat parasit pada jamur lain. Pada spesies saprofit, kapang tumbuh pada

kisaran suhu optimal 22-30°C. Suhu optimal untuk pertumbuhan kapang ini

adalah 32-35°C dan pH optimal sekitar 4.0. Trichoderma sp. berkembangbiak

secara aseksual dengan membentuk spora di ujung fialida atau cabang dari hifa

(Mazur et al., 2006).

Miselium Trichoderma sp. dapat menghasilkan suatu enzim yang

bermacam-macam, termasuk enzim selulase (pendegradasi selulosa) dan kitinase

(pendegradsi kitin). Oleh karena adanya enzim selulase, Trichoderma sp. dapat

14

tumbuh secara langsung di atas kayu yang terdiri atas selulosa sebagai polimer

dari glukosa. Oleh karena adanya kitinase, Trichoderma sp. dapat bersifat sebagai

parasit bagi jamur yang lainnya. Secara alami seseorang dapat sering menemukan

Trichoderma sp. yang menjadi parasit pada badan buah dan miselia dari jamur

yang lain (Carlile dan Watkinson, 1994).

Penelitian sebelumnya Sugoro et al. (2009) membuktikan bahwa kapang

Trichoderma sp. memiliki nilai absorbansi tertinggi, artinya berarti telah

melakukan pendegradasian batubara tertinggi pada hari ke-2 inkubasi yaitu 1,936.

Kapang Trichoderma sp. mampu tumbuh menggunakan medium batubara dan

memiliki nilai pH medium yang berfluktuasi, artinya telah terjadi proses degradasi

selama proses inkubasi.

2.3.2. Kapang Penicillium sp.

Ciri-ciri spesifik Penicillium sp. (Gambar 3) adalah mempunyai hifa

berseptat, konidia, sterigma , konidiospora (Kuraesin, 2009). Kapang Penicillium

sp. mempunyai hifa berseptat, miselium bercabang, konidiospora septat dan

muncul di atas permukaan, kepala yang membawa spora berbentuk seperti sapu

dengan sterigma muncul dalam berkelompok, dan konidia membentuk rantai

(Fardiaz, 1989).

15

A. Konidia

B. Sterigma

C. Konidiofora

Gambar 3. Kapang Penicillium sp. (Kuraesin, 2009)

Kapang Penicillium sp. diklasifikasikan menurut sistem nama binomial

yaitu: Kingdom Fungi; Filum Ascomycota; Kelas Eurotiomycetes; Ordo

Eurotiales; Famili Trichocomaceae; Genus Penicillium dan Spesies Penicillium

sp. Kapang Penicillium sp. banyak tersebar di alam. Penicillium juga digunakan

dalam industri untuk memproduksi antibiotik, misalnya penisilin yang diproduksi

oleh Penicillium notatum dan Penicillium chrysogenum (Fardiaz, 1989).

Pada hasil penelitian Sugoro et al. (2009) membuktikan bahwa kapang

Penicillium sp. memiliki nilai absorbansi tertinggi, artinya berarti telah melakukan

pendegradasian batubara tertinggi, mampu tumbuh menggunakan medium

batubara dan memiliki nilai pH medium yang berfluktuasi, artinya telah terjadi

proses degradasi selama proses inkubasi.

2.4. Enzim

Enzim adalah biokatalis atau substansi yang dapat mempercepat atau

membantu suatu reaksi kimia tanpa harus ikut terlibat di dalam reaksi itu sendiri.

Enzim ditemukan dalam setiap sel hidup, mulai dari organisme bersel tunggal

16

sederhana sampai organisme multiseluler yang kompleks, termasuk manusia.

Enzim termasuk molekul protein. Reaksi biokimia yang paling sering saat

mengaplikasian enzim secara industri adalah peruraian hidrolitik komponen bahan

pangan yang memiliki berat molekul (BM) tinggi seperti pati, protein, selulosa,

dan sebagainya (Poedjiadi dan Supriyanti, 2006). Setiap jenis enzim memiliki

kisaran pH tertentu yang sangat menentukan enzim beraktivitas secara optimal.

Enzim bersifat spesifik artinya hanya mengkatalisis suatu reaksi yang dirancang

khusus untuk enzim tertentu, misalnya pektinase hannya dapat mendegradasi

pektin, bukan pati atau selulosa. Sekitar 80% dari enzim industrial adalah enzim

hidrolitik, yang digunakan untuk depolimerisasi (pemecahan molekul-molekul

yang kompleks menjadi yang lebih sedarhana) bahan-bahan alami (Hidayat et al.,

2006).

Mikroba merupakan sumber penting dari beberapa jenis enzim. Sebagai

sumber enzim, mikroba memiliki beberapa kelebihan jika dibandingkan dengan

hewan maupun tanaman, yaitu : produksi enzim pada mikroba lebih murah,

kandungan enzim dapat diprediksi dan dikontrol, pasokan bahan baku terjamin,

dengan komposisi konstan dan mudah dikelola (Hidayat et al., 2006). Ada 3

keuntungan yang berkaitan dengan enzim ekstra sel : pertama, tidak memerlukan

proses penghancuran sel saat memanen enzim (proses penghancuran sel tidak

selalu mudah dilakukan dalam skala besar). Kedua, enzim protein yang

disekresikan keluar sel umumnya terbatas jenisnya. Ini berarti enzim ekstrim sel

terhindar dari kontaminasi berbagai jenis protein. Ketiga, secara alami enzim

disekresikan keluar sel umumnya lebih tahan terhadap proses denaturasi.

17

Ada tiga golongan utama sumber enzim yaitu tanaman, hewan, dan mikroba.

Enzim tanaman pada dasarnya diperoleh dari tanaman. Di antara kelompok ini

yang sudah dikenal luas yaitu papain, bromelin, ficin, dan enzim amilolitik dari

sereal, lipoksigenase dari kedelai dan specialized enzymes dari buah jeruk.

Sebagian besar enzim tanaman tersedia dalam bentuk unpurified powder extracts,

meski demikian ada juga yang tersedia dalam bentuk lain seperti papain dalam

bentuk stabilized dan purified liquid. Enzim dari hewan umumnya di peroleh dari

glandula. Sedangkan enzim mikrobial adalah diperoleh dari mikroba misalnya

yang bersumber dari fungi, bakteria maupun khamir seperti amilase, diastase,

lipase, dan sebagainya. Enzim yang berasal dari fungi menempati urutan teratas,

disusul dari bakteri dan khamir (Hidayat et al., 2006).

Penggolongan enzim berdasarkan tempat bekerjanya adalah endoenzim

dan eksoenzim. Endoenzim disebut juga enzim intraseluler, yaitu enzim yang

bekerjanya di dalam sel. Umumnya merupakan enzim yang digunakan untuk

proses sintesis di dalam sel dan untuk pembentukan energi (ATP) yang berguna

untuk proses kehidupan sel, misalnya dalam proses respirasi. Eksoenzim disebut

juga enzim ekstraseluler, yaitu enzim yang bekerjanya di luar sel. Umumnya

berfungsi untuk “mencernakan” substrat secara hidrolisis untuk dijadikan molekul

yang lebih sederhana dengan BM lebih rendah sehingga dapat masuk melalui

membran sel. Energi yang dibebaskan pada reaksi pemecahan substrat di luar sel

tidak digunakan selama proses kehidupan sel (Lehninger, 1982).

Kapang mendegradasi batubara menggunakan enzim ekstraseluler, hal

tersebut diperkuat dengan penelitian bahwa proses solubilisasi pada batubara

18

dikatalis melalui aktifitas enzim ekstratseluler (Ward, 1990). Enzim ekstraseluler

adalah enzim yang diekskresikan oleh kapang ke luar tubuhnya untuk

mendegradasi substrat. Enzim ekstraseluler tersebut akan menghasilkan medium

yang lebih gelap selama proses kultur cair atau cairan gelap pada permukaan

batubara ketika ditumbuhkan pada permukaan kultur agar (Faison et al., 1989).

Tabel 1. Enzim ekstraseluler pedegradasi lignin dari kapang pelapuk putih (white rot fungi) (Akhtar et al., 1997).

Enzim Tipe enzim Peran dalam degradasi

Kerja bersama dengan

Berat Molekul (KDa)

pH optimum

LiP (Lignin peroksidase)

Peroksidase Degradasi unit non–fenolik H2O2

38-47

2,5-3,0

MnP (Mangan peroksidase)

Peroksidase

Degradasi unit fenolik dan non-fenolik dengan lipid

H2O2, lipid

38-50

4,0-4,5

Lakase Fenol oksidase

Oksidasi unit fenolik dan non fenolik dengan mediator

O2, mediator : 3-hidroksibenzotriazol

53-110

3,5-7

Enzim pendegradasi lignin secara umum terdiri dari dua kelompok utama

yaitu lakase dan peroksidase yang terdiri dari lignin peroksidase dan mangan

peroksidase. Ketiga enzim tersebut bertanggung jawab terhadap pemecahan awal

polimer lignin dan menghasilkan produk dengan berat molekul rendah, larut

dalam air dan CO2 (Akhtar et al., 1997). Mangan peroksidase (MnP), lignin

peroksidase (LiP) atau lakase mampu mendegradasi komponen aromatik di

batubara dan mendepolimerisasinya menjadi komponen yang kaya oksigen dan

dapat melarut ke dalam air (Holker et al., 2002).

19

Lignin peroksidase (LiP) merupakan enzim utama dalam proses degradasi

lignin karena mampu mengoksidasi unit non fenolik lignin. Unit non fenolik

merupakan penyusun sekitar 90 persen struktur lignin. Oksidasi substruktur lignin

yang dikatalis oleh LiP dimulai dengan pemisahan satu elektron cincin aromatik

substrat donor dan menghasilkan radikal aril. LiP memotong ikatan Cα-Cβ

molekul lignin, pemotongan tersebut merupakan jalur utama perombakan lignin

oleh berbagai kapang pelapuk putih (Hammel, 1996).

Mangan peroksidase (MnP) berperan dalam oksidasi unit fenolik, sehingga

LiP dan MnP dapat bekerja secara sinergis. Siklus katalitik MnP dimulai dengan

pengikatan H2O2 atau peroksida organik dengan enzim ferric alami dan

pembentukan kompleks peroksida besi. Pemecahan ikatan oksigen peroksida

membutuhkan Fe okso-porpirin-radikal kompleks dalam pembentukan MnP-

komponen I, kemudian ikatan dioksigen dipecah dan dikeluarkan satu molekul air.

Reaksi berlangsung sampai terbentuk MnP-komponen II, ion Mn2+ bekerja

sebagai donor 1-elektron untuk senyawa antara porfirin dan dioksidasi menjadi

Mn3+. Mn3+ merupakan oksidasi kuat yang dapat mengoksidasi senyawa fenolik

tetapi tidak dapat menyerang unit non fenolik lignin (Perez et al., 2002).

Lakase ditemukan pada kapang, khamir, dan bakteri. Enzim ini tidak

membutuhkan H2O2 tetapi menggunakan molekul oksigen. Lakase mereduksi

oksigen menjadi H2O dalam substrat fenolik melalui reaksi satu elektron

membentuk radikal bebas yang dapat disamakan dengan radikal kation yang

terbentuk pada reaksi MnP (Kersten et al., 1990).

20

2.5. Kromatografi Gas Spektroskopi Massa (GC-MS)

Kromatografi Gas-Spektroskopi Massa atau sering disebut GCMS (Gas

Chromatography Mass Spectrometry) adalah teknik analisis yang

menggabungkan dua metode analisis yaitu Kromatografi Gas dan Spektroskopi

Massa. Kromatografi gas adalah metode analisis, dimana sampel terpisahkan

secara fisik menjadi bentuk molekul-molekul yang lebih kecil (hasil pemisahan

dapat dilihat berupa kromatogram). Sedangkan spektroskopi massa adalah metode

analisis, dimana sampel yang dianalisis akan diubah menjadi ion-ion gasnya, dan

massa dari ion-ion tersebut dapat diukur berdasarkan hasil deteksi berupa

spektrum massa (Hermanto, 2008).

Pada GC hanya terjadi pemisahan untuk mendapatkan komponen yang

diinginkan, sedangkan bila dilengkapi dengan MS (berfungsi sebagai detektor)

akan dapat mengidentifikasi komponen tersebut, karena bisa membaca spektrum

bobot molekul pada suatu komponen, juga terdapat reference pada software

(Hermanto, 2008).

Pemisahan komponen senyawa dalam GCMS terjadi di dalam kolom

(kapiler) GC dengan melibatkan dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Fase

diam adalah zat yang ada di dalam kolom, sedangkan fase gerak adalah gas

pembawa (Helium maupun Hidrogen dengan kemurnian tinggi, yaitu ± 99,995%).

Proses pemisahan dapat terjadi karena terdapat perbedaan kecepatan alir dari tiap

molekul di dalam kolom. Perbedaan tersebut dapat disebabkan oleh perbedaan

afinitas antar molekul dengan fase diam yang ada di dalam kolom. Selanjutnya

komponen-komponen yang telah dipisahkan tersebut masuk ke dalam ruang MS

21

yang berfungsi sebagai detektor secara instrumentasi, MS adalah detektor bagi GC

(Hermanto, 2008).

2.6. Elektroforesis

Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu

medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada muatan listrik tergantung

pada muatan, bentuk dan ukuran (Lehninger, 1982). Dengan demikian

elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan

asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan

pewarnaan.

Menurut Yuwono (2005), elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan

molekul seluler berdasarkan atas ukurannya, dengan menggunakan medan listrik

yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan

dipisahkan. Kecepatan gerak molekul tergantung pada nisbah (rasio) muatan

terhadap massanya, serta tergantung pula pada bentuk molekulnya.

Kegunaan elektroforesis adalah menentukan berat molekul (estimasi).

Penetapan BM secara lebih teliti dapat dilakukan dengan ultrasentrifuge,

meskipun dengan elektroforesis cukup memenuhi syarat, dapat mendeteksi

terjadinya pemalsuan bahan, dapat mendeteksi terjadinya kerusakan bahan seperti

protein dalam pengolahan dan penyimpanan, untuk memisahkan spesies molekul

yang berbeda secara kualitatif, yang selanjutnya masing-masing spesies dapat

dianalisis dan menetapakan titik isoelektrik protein (Lehninger, 1982).

22

Salah satu jenis elektroforesis adalah elektroforesis SDS-PAGE. Sodium

Sodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) terutama

dilakukan untuk mengetahui apakah suatu protein monometrik ataukah

oligometrik, selain itu untuk menetapkan berat molekul dan jumlah rantai

polipeptida sebagai subunit atau monomer.

Pada mekanisme SDS-PAGE, protein bereaksi dengan SDS yang merupakan

deterjen anionic membentuk kompleks yang bermuatan negatif. Protein akan

terdenaturasi dan terlarut membentuk kompleks berikatan dengan SDS, berbentuk

elips atau batang, dan berukuran sebanding dengan berat molekul protein. Protein

dalam bentuk kompleks yang bermuatan negatif ini dipisahkan berdasarkan

muatan negatif ini dipisahkan berdasarkan muatan dan ukurannya secara

elektroforesis di dalam matriks gel poliakrilamid. Berat molekul protein dapat

diukur dengan menggunakan protein standar yang telah diketahui berat

molekulnya (Ummubalqis, 2000).

SDS-PAGE dilakukan pada pH normal. Pada metoda ini digunakan

anionic deterjent yang bersama dengan beta-merkaptoetanol dan pemanasan

menyebabkan rusaknya struktur tiga dimensi protein menjadi konfigurasi random

coil. Hal ini menyebabkan oleh terpecahnya ikatan disulfida yang selanjutnya

tereduksi menjadi gugus-gugus sulfihidril. SDS akan membentuk kompleks

dengan protein dan komleks ini bermuatan negatif karena gugus-gugus anion dari

SDS. Pada pH 7, SDS 1% dan merkaptoetanol 0,1 M sebagian besar rantai protein

mengikat sekitar 1,4 gr SDS per gram protein, dengan demikian jumlah SDS

yang terikat oleh protein adalah tetap. Oleh karena itu protein dapat dipisahkan

23

hanya berdasarkan ukurannya (BM) di dalam kompleks SDS protein yang lebih

besar mempunyai mobilitas yang lebih kecil dibandingkan dengan kompleks yang

lebih kecil (Hames, 1998).

2.7. Iradiasi Gamma

Iradiasi merupakan pemancaran suatu energi elektromagnetik atau partikel-

partikel dengan kecepatan tinggi. Iradiasi dapat dibedakan menjadi dua macam,

yaitu iradiasi panas dan iradiasi pengion. Iradiasi panas menggunakan frekuensi

rendah atau dengan panjang gelombang tinggi, misalnya infra merah. Iradiasi

pengion menggunakan frekuensi tinggi, misalnya sinar alfa (α), sinar beta (β), dan

sinar gamma (Akhadi, 1997). Aplikasi sumber iradiasi pengion telah meluas

dalam berbagai bidang. Pemanfaatan sumber iradiasi misalnya bidang kedokteran,

bidang industri dan bidang pertanian. Efek kerusakan yang ditimbulkan

bergantung pada jenis dan kualitas iradiasi karena mempunyai daya tembus yang

rendah dan bermuatan positif, bentuk sinar alfa (α) merupakan partikel inti He

yang bergerak cepat. Partikel beta (β) memiliki daya tembus lebih besar

dibandingkan sinar alfa (α) dan bermuatan negatif (Darussalam, 1996).

Sinar gamma merupakan jenis iradiasi yang bisa digunakan dalam berbagai

bidang karena muatan netral, panjang gelombang pendek dan daya tembus paling

tinggi sehingga energi sinar gamma yang dipancarkan sumber terhadap target

dapat menimbulkan perubahan pada komposisinya. Perubahan dapat terjadi secara

acak dan tiba-tiba. Besar kecilnya efek iradiasi gamma tergantung dari energi dan

jarak sumber radioaktif (Lehninger, 1994).

24

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Tempat dan Waktu Penelitian.

Penelitian ini dilakukan pada bulan April sampai dengan bulan Juli tahun

2010 dan bertempat di Badan Tenaga Nuklir Nasional, Pasar Jum’at Jakarta.

3.2. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah timbangan analitik,

mikropipet, refrigerator, sentrifuse, pH meter, spektrofotometer Uv-vis, autoklaf,

pipet tetes, Gas Chromatograph Mass Spectrometer (GC-MS) Shimadzu dan Mini

Protein-Gel Elektroforesis “Atto”.

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah batubara subbituminus,

kertas whatman No.1, alkohol 70 %, NaCl 0,85 %, isolat kapang Penicillium sp.

dan Trichoderma sp. koleksi dari BATAN (Irawan Sugoro), aseton, akuades,

medium Potato Dextrose Agar (PDA), Medium Minimal Salt (MMS), agar bakto,

sukrosa 1 %, Lowry I ( 2% Na2CO3 dalam NaOH 0,1 N ; 2,7% K.Na tartat; 2%

CuSO4), Lowry II (Folin dan akuades (1:1) ), Larutan Standar BSA, buffer

sampel, Separating Gel (10%) dan Stacking Gel (45%), tanin, methylene blue,

manganese chloride, dan fluorescien diacetate.

25

3.3. Cara Kerja

3.3.1. Persiapan Serbuk Batubara

Batubara dihaluskan menggunakan mortar secara aseptik, kemudian

disaring menggunakan saringan berukuran 0,2 mm (70 mesh). Serbuk batubara

yang telah siap ditimbang sebanyak 5 gr dan dimasukkan ke dalam plastik

polyetilen. Serbuk batubara ditutup rapat dan diiradiasi gamma (5 kGy) dan tidak

diiradiasi (0 kGy).

3.3.2. Pembuatan Medium

Tabel 2. Komposisi medium perlakuan

No. Nama Medium PDA (ml)

Agar bakto (gr)

MMS (ml) Sukrosa Serbuk

Batubara Keterangan

1. Potato Dextrose Agar Minimal Salt (PDAM)

75 0,75 75 - - Untuk peremajaan kapang

2. Medium Minimal Salt + Sukrosa (MMSS

- - 600 1 % 2 % Untuk proses biosolubilisasi.

3.3.2.1. Medium Potato Dextrose Agar

Sebanyak 39 gr PDA dilarutkan dalam 1 liter akuades, kemudian

ditambahkan agar bakto sebanyak 10 gr. Medium PDA dipanaskan dengan

menggunakan hot plate dan magnetic stirer agar terlarut. Medium PDA tersebut

disterilisasi menggunakan autoklaf dengan suhu 121°C selama 15 menit.

26

3.3.2.2. Medium Minimal Salt (MMS)

Sebanyak 0,52 gr MgSO4.7H2O; 0,003 gr ZnSO4.7H2O pH 5,5 ; 5 gr

K2HPO4; 0,005 gr FeSO4, dan 1 gr NH4(SO4) dilarutkan dalam 1 liter akuades,

kemudian dilarutkan sampai homogen. Medium MMS tersebut disterilisasi

menggunakan autoklaf dengan suhu 121°C selama 15 menit (Silva et al., 2007).

3.2.2.3. Medium Potato Dextrose Agar Minimal Salt (PDAM)

Medium PDAM dibuat dengan mencampurkan medium PDA dan MMS

dengan perbandingan 1:1 atau 75 ml : 75 ml. Medium PDA ditambahkan 1 %

agar bakto atau 0,75 gr. Medium PDA dan MMS disterilisasi dulu menggunakan

autoklaf dengan suhu 121°C dengan waktu 15 menit sebelum dicampurkan.

Medium PDAM dihomogenkan dengan cara pengadukan. Sebanyak 5 ml

dimasukkan tabung reaksi untuk peremajaan kapang pada tabung reaksi (agar

miring).

3.2.2.4. Medium Minimal Salt + Sukrosa (MMSS)

Sebanyak 600 ml MMS ditambahkan sukrosa sebanyak 1% (6 gr sukrosa)

lalu dihomogenkan, kemudian 100 ml MMSS dimasukkan ke dalam erlenmeyer.

MMSS disterilisasi menggunakan autoklaf dengan suhu 121°C dengan waktu 15

menit.

27

3.3.3. Peremajaan Kultur Kapang

Sebanyak 5 ml medium PDAM di masukkan ke dalam tabung reaksi (untuk

agar miring). Kultur stok/isolat kapang diinokulasikan pada medium PDAM

tersebut menggunakan ose. Kultur kapang tersebut diinkubasi pada suhu ruang

sampai kapang menghasilkan spora, selama 5-7 hari pada suhu ruang.

3.3.4. Kultur Inokulum Spora

Kultur spora yang sudah diremajakan pada medium PDAM, kemudian

diambil sporanya menggunakan ose. Kultur spora pada medium ditambahkan 5 ml

NaCl steril 0,85 % sambil dilepaskan sporanya menggunakan ose, kemudian

dimasukkan ke dalam yellow tube steril.

3.3.5. Uji Enzim Ekstraseluler

3.3.5.1. Fenoloksidase

Pengujian berdasarkan reaksi kimia warna Bavendamm. Kapang

ditumbuhkan pada medium PDA yang mengandung tanin 4 mM/L. Lingkaran

warna coklat yang terbentuk menunjukkan adanya ekskresi fenoloksidase kapang

(Tao et al., 2009).

3.3.5.2. Peroksidase

Metode penambahan warna medium untuk pengujian enzim peroksidase.

methylene blue sebanyak 0,1 gr/L ditambahkan kedalam medium PDA dan

kapang ditumbuhkan diatasnya. Pudarnya warna medium memperlihatkan

kehadiran enzim peroksidase (Tao et al., 2009).

28

3.3.5.3. Mangan Peroksidase

Sebanyak 1 gr/L Manganese cloride ditambahkan dalam medium PDA

dan kapang diinokulasikan lalu diinkubasi selama 2 minggu. Selama masa

inkubasi dilakukan pengamatan terhadap titik-titik hitam-coklat yang terbentuk.

MnP mengkatalis terjadinya oksidasi MnCl2 menjadi MnO2 yang dihasilkan

warna hitam-coklat (Tao et al., 2009).

3.3.6. Pengukuran pH medium

Medium diukur nilai pHnya dengan menggunakan pH meter. Selanjutnya

dibuat grafik perubahannya.

3.3.7. Pengujian Biosolubilisasi Batubara

Kultur inokulum spora sebanyak 10 % v/v diinokulasikan ke dalam

erlenmeyer yang sudah berisi 100 ml MMSS. Kemudian, ditambahkan sebanyak

2% serbuk batubara (2 gr) dengan masing-masing yang tidak diiradiasi (0 kGy)

dan diiradiasi (5 kGy). Kultur kapang diinkubasi pada suhu ruang. Kultur ini

dinamakan kultur diam tanpa adanya mengocokan selama pertumbuhan kapang

(Gadjar et al., 2006). Pencuplikan sampel kultur kapang dilakukan pada hari ke 0,

7, 14, 21, 28 dan 35 untuk pengukuran biosolubilisasi terhadap batubara (Scott

and Lewis, 1990).

29

Tabel 3. Data perlakuan kultur kapang

Kapang Dosis Iradiasi Serbuk Batubara

Medium MMS+ 1 %

Sukrosa

% Inokulum spora kapang

tanpa batubara 100 ml 10 % v/v

tidak diiradiasi

(0 kGy)

100 ml 10 % v/v

Penicillium sp.

diiradiasi

(5 kGy)

100 ml 10 % v/v

tanpa batubara 100 ml 10 % v/v

tidak diiradiasi

(0 kGy)

100 ml 10 % v/v

Trichoderma sp.

diiradiasi

(5 kGy)

100 ml 10 % v/v

3.3.7.1. Pengukuran Biosolubilisasi Batubara

Sampel pada kultur diam diambil sebanyak 10 ml menggunakan

mikropipet, kemudian dimasukkan ke dalam yellow tube steril. Sampel

disentrifugasi dengan kecepatan 5400 rpm selama 15 menit. Supernatan hasil

sentrifugasi diambil menggunakan pipet tetes kemudian dimasukkan dalam yellow

tube steril, kemudian diukur nilai absorbansinya menggunakan Spektrofotometer

UV-Vis pada panjang gelombang 250 nm dan 450 nm untuk mengetahui tingkat

solubilisasi batubara (Selvi, 2007). Nilai absorbansi yang tinggi berbanding lurus

dengan tingkat solubilisasi batubara yang tinggi pula.

30

3.3.8. Pengukuran Hidrolisis FDA

Supernatan dimasukkan 1 ml ke dalam tabung reaksi, kemudian

ditambahkan 4 ml KH2PO4 buffer (pH 7,6) 60 mM. Reaksi dimulai dengan

menambahkan 40 µg FDA (Fluorescien diacetate) dalam 4 ml aseton, kemudian

diinkubasi dalam pengocokan selama 20 menit. Setelah penginkubasian segera

ditambahkan aseton sebanyak 4 ml untuk menghentikan reaksi. Suspensi disaring

dengan kertas Whatman No. 1, filtrat dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditutup

dengan kertas parafilm dan disimpan dalam es batu untuk menguapkan aseton.

Nilai OD ditera dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang

490 nm (Breeuwer, 1996).

3.3.9. Pengukuran Kadar Protein Eketraseluler dengan Metode Lowry

Sebanyak 0,5 ml sampel ditambahkan 2,5 ml larutan Lowry I dan

diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit. Kemudian ditambahkan 0,25 ml

larutan Lowry II, divortek dan diinkubasi pada suhu ruang selam 30 menit.

Setelah itu absorbansi dibaca dengan Spektrofotometer UV-Vis pada panjang

gelombang 750 nm dan dibandingkan dengan standar Bovine Serum Albumin

(BSA) (Apriyanto et al., 1989). Pengukuran kadar protein ekstraseluler bertujuan

untuk mengetahui seberapa besar enzim ekstraseluler diekresikan oleh kapang.

31

3.3.10. Analisis Hasil Biosolubilisasi Batubara oleh Kapang Penicilium sp. dan Trichoderma sp. Dengan Menggunakan GC-MS

Supernatan dan pelarut dicampurkan dengan perbandingan 1:1. Pelarut

yang digunakan adalah benzena : heksana : dietil eter dengan perbandingan 3:1:1.

Campuran tersebut dimasukkan ke dalam corong Buchner lalu diaduk sampai

bercampur kemudian didiamkan beberapa saat sampai terbentuk fase atas dan

bawah. Fase atas dipakai untuk identifikasi jenis senyawa produk hasil

biosolubilisasi batubara dan menentukan kadarnya dengan menggunakan GC-MS

Shimadzu. Kolom yang digunakan adalah Dimethyl polysiloxana dengan kondisi

suhu kolom oven 50 0C, suhu injeksi 280 0C, laju alir 1,54 ml/menit, dan fase

gerak gas helium. Kontrol yang digunakan adalah medium MMSS yang

ditambahkan serbuk batubara yang diiradiasi dan tidak diiradiasi (Silva et al.,

2007).

3.3.11. Karakteristik Enzim Ekstraseluler dengan Elektroforesis

Karakterisasi enzim ekstraseluler dilakukan melalui elektroforesis dengan

menggunakan SDS-PAGE. Adapun tahapan kerja yang dilakukan antara lain:

1. Preparasi sampel

Sebanyak 30 µl supernatan ditambahkan 50 µl buffer sampel lalu

dipanaskan pada suhu 95 °C selama 10 menit. Kemudian sampel disentrifus

dengan 6000 rpm selama 10 menit.

32

2. Preparasi gel elektroforesis

a. Separating gel (10%)

Sebanyak 6 ml Acrylamid 30 % dicampurkan dengan separating

gel buffer (1,5 Tris-HCl, pH 8,8) sebanyak 4,5 ml kemudian akuabides

7,5 ml, SDS 50 µl, amonium persulfate (APS) 0,08 ml dan TEMED

0,01 ml.

b. Stacking gel (45%)

Sebanyak 0,9 ml Acrylamid 30 % dicampurkan dengan separating

gel buffer (1,5 Tris-HCl, pH 8,8) sebanyak 1,5 ml kemudian akuabides

3,6 ml, SDS 25 µl, amonium persulfate (APS) 0,02 ml dan TEMED

0,01 ml.

3. Proses Elektroforesis

Setelah separating gel dibuat, kemudian dimasukkan sedikit demi

sedikit ke dalam alat elektroforesis dengan mikropipet, lalu ditambahkan

akuades untuk meratakan separating gel tersebut. Setelah separating gel

membeku, akuades dibuang dan dimasukkan stacking gel sedikit demi sedikit,

lalu dipasang sisir pembentuk kolom dan dibiarkan hingga stacking gel

membeku kemudian sisir diangkat.

Sebanyak 600 ml larutan running buffer dimasukkan dalam tangki

elektroforesis. Kemudian sampel sebanyak 10 µl dimasukkan ke dalam kolom

gel yang sudah terbentuk lalu dielekroforesis dengan kecepatan 200 Volt dan

kuat arus 40 mA selama lebih kurang 1 sampai 2 jam atau hingga warna biru

sebagai penanda pada sampel mencapai batas bawah gel.

33

Gel diangkat lalu diwarnai dengan staining solution coomassie blue R-

250 kurang lebih selama 24 jam.Gel dicuci dengan larutan destaining yang

terdiri atas methanol 40 %, asam asetat 7,5 % dan akuades kurang lebih

selama 24 jam. Protein yang telah didestaining kemudian discan dan dianalisa

dengan Lab.Image untuk menentukan nilai RF (Retensi Faktor) sebagai

representasi dari profil protein yang dihasilkan dan berat molekulnya.

3.4. Analisa Data

Data penelitian ini dianalisis dengan menggunakan Rancangan Acak

lengkap (RAL) yang dianalisis dengan Analisis Varian (ANOVA) satu arah untuk

mengetahui apakah ada perbedaan atau pengaruh yang signifikan pada tiap

perlakuan. Uji Anaisis Varian ini (ANOVA) dibantu dengan bantuan program

SPSS 16.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Analisis Kualitatif Enzim Ekstraseluler Kapang

Pengujian enzim ekstraseluler kapang sangatlah penting dilakukan sebelum

proses biosolubilisasi batubara. Pengujian ini bertujuan mengetahui ada atau

tidaknya enzim ekstraseluler kapang yang berperan dalam proses biosolubilisasi

batubara. Uji enzim ini menggunakan substrat atau pereaksi (tanin, methylene blue

dan manganese chloride) yang berbeda untuk setiap enzim.

A.1 A.2 A.3

Fenoloksidase (+) Peroksidase (+) Mangan Peroksidase (+)

B.1 B.2 B.3

Fenoloksidase (+) Peroksidase (+) Mangan Peroksidase (+) Gambar 4. Uji kualitatif adanya enzim ekstraseluler kapang Penicillium sp. (A)

dan Trichoderma sp. (B)

34

35

Hasil pengujian kualitatif enzim ekstraseluler kapang Penicillium sp. dan

Trichoderma sp. menunjukkan hasil yang positif untuk terdapatnya enzim

fenoloksidase, peroksidase, dan mangan peroksidase (MnP) (Gambar 4). Enzim-

enzim ekstraseluler yang terlibat dalam proses biosolubilisasi batubara adalah

peroksidase, esterase, fenoloksidase atau lakase, MnP dan lignin peroksidase.

Enzim-enzim ini berperan untuk memecah senyawa kompleks menjadi senyawa

yang lebih sederhana, kemudian digunakan sebagai sumber energi untuk

pertumbuhan kapang (Laborda et al., 1999; Fakuosa dan Hofrichter, 1999).

Tao et al. (2009) mengindikasikan perubahan medium untuk mengamati

terjadinya lingkaran coklat oleh fenoloksidase yang dihasilkan oleh kapang

(Gambar 4 A.1 dan B.1). Pada (Gambar 4 A.2 dan B.2) positif terdapatnya enzim

peroksidase karena pudarnya warna medium pada bagian medium yang ditumbuhi

oleh kapang. (Gambar 4 A.3 dan B.3) adanya titik-titik coklat yang terbentuk

sehingga positif terdapatnya enzim MnP. Hal itu terjadi karena MnP mengkatalis

terjadinya oksidasi MnCl2 menjadi MnO2 hingga dihasilkan warna coklat.

4.2. Hasil Pengukuran pH Medium Kapang

Pola perubahan pH medium, baik kapang Penicillium sp. dan Trichoderma

sp. cenderung sama (Gambar 5). Nilai pH medium setelah 7 hari inkubasi

mengalami penurunan dan setelah itu mengalami kenaikan sampai hari ke-35

inkubasi. Penurunan pH medium yang mengandung batubara yang tidak diiradiasi

(0 kGy) dan diiradiasi (5 kGy) yang terjadi pada hari ke-7 inkubasi tidak terlalu

besar. Penurunan pH medium disebabkan terbentuknya asam-asam organik hasil

36

biosolubilisasi batubara seperti asam karboksil dan asam fulvat yang merupakan

senyawa humat yang terdapat dalam batubara (Cerniglia,1992).

Menurut penelitian Mustikasari (2009), nilai pH cenderung mengalami

kenaikan seiring dengan bertambahnya masa inkubasi. Kondisi peningkatan pH

medium dapat disebabkan oleh dua kemungkinan. Kemungkinan pertama karena

hasil degradasi lignin menghasilkan berbagai macam senyawa fenolik yang

memiliki gugus –OH. Keberadaan gugus tersebut dapat meningkatkan nilai pH

pada masa akhir inkubasi dan kemungkinan kedua adalah terjadinya peningkatan

jumlah sel yang lisis. Menurut Judoamidjojo et al. (1992) sel yang lisis tersebut

terdeaminasi dan menyebabkan peningkatan pH.

Nilai pH medium kapang Penicillium sp. dan Trichoderma sp. selama proses

inkubasi berkisar antara 2,69 - 4,9 pada kontrol (tanpa batubara), pada medium

yang mengandung batubara yang tidak diradiasi (0 kGy) dan yang diradiasi (5

kGy). Nilai pH medium kapang Penicillium sp. berkisar antara 2,71- 4,62

(Gambar 5 A), sedangkan pada medium kapang Trichoderma sp. adalah 2,69- 4,9

(Gambar 5 B). Enzim-enzim ekstraseluler pendegradasi lignin bekerja pada pH

yang optimum. Kondisi pH medium mendukung kerja enzim fenoloksidase atau

lakase yang bekerja optimum pada pH 3,5-7. Lignin peroksidase bekerja optimum

pada pH 2,5-3,0 dan mangan peroksidase bekerja optimum pada pH 4,0-4,5

(Akhtar, 1997). pH medium kultur kapang Penicillium sp. dan Trichoderma sp.

masih pada kisaran pH yang optimum untuk bekerjanya enzim fenoloksidase atau

lakase, lignin peroksidase dan mangan peroksidase.

37

A.

00.5

11.5

22.5

33.5

44.5

0 7 14 21 28 35

waktu (hari)

pH m

ediu

m kontrol

0 kGy

5 kGy

B.

0

1

2

3

4

5

6

0 7 14 21 28

waktu (hari)

pH m

ediu

m

35

kontrol

0 kGy

5 kGy

Gambar 5. Nilai pH medium kapang Penicillium sp. (A) dan Trichoderma sp. (B).

( kontrol = tanpa batubara; 0 kGy = batubara tidak diiradiasi dan 5 kGy = batubara diiradiasi 5 kGy)

Hasil pengujian statistik menunjukkan nilai pH medium kapang Penicillium

sp. menunjukkan perbedaan yang signifikan (probabilitas ≤ 0,05) (Lampiran 12).

Selama proses inkubasi, medium yang mengandung batubara yang diiradiasi (5

kGy) nilai pH cenderung lebih tinggi daripada medium yang mengandung

batubara yang tidak diiradiasi (0 kGy). Nilai pH medium yang mengandung

batubara lebih asam daripada medium yang tidak mengandung batubara (kontrol).

Diduga iradiasi menyebabkan terlepasnya senyawa-senyawa fenolik yang

memiliki gugus –OH sehingga pH medium cenderung meningkat. Berbeda dari

38

kapang Penicillium sp., hasil pengujian statistik pada penggunaan kapang

Trichoderma sp. tiap perlakuan menunjukkan tidak adanya perbedaan yang

signifikan pada seluruh perlakuan (probabilitas ≥ 0,05) (Lampiran 12)

Perubahan pH merupakan hal yang menjadi salah satu faktor pengukuran

dalam proses biosolubilisasi batubara. Nilai pH medium kapang Penicillium sp.

dan Trichoderma sp. cenderung asam, yaitu 2,69- 4,9 dan memiliki pola yang

sama setelah 35 hari inkubasi. Kisaran pH tersebut memungkinkan untuk

pertumbuhan kapang Penicillium sp. dan Trichoderma sp. karena kapang tersebut

dapat tumbuh pada kisaran pH yang luas yaitu pH 2 - 8,5 dan pertumbuhan

kapang akan lebih baik pada kondisi asam atau pH rendah (Fardiaz, 1989).

Dengan pertumbuhan kapang yang lebih baik itu dapat mempengaruhi kadar dan

aktivitas enzim yang dihasilkan oleh kapang selama proses biosolubilisasi

batubara. Nilai pH medium sangat mempengaruhi hasil biosolubilisasi batubara

oleh kapang Penicillium sp. dan Trichoderma sp. sehingga hasilnya dapat dilihat

pada biosolubilisasi batubara pada panjang gelombang 250 nm dan 450 nm.

4.3. Hasil Biosolubilisasi Batubara

Pengukuran nilai absorbansi supernatan pada panjang gelombang 250 nm

bertujuan untuk mendeteksi adanya gugus fenolik produk hasil biosolubilisasi

batubara oleh kapang Penicillium sp. dan Trichoderma sp. Gugus fenolik

terbentuk oleh proses solubilisasi senyawa lignin yang merupakan komponen

penyusun batubara. Penguraian senyawa lignin ini dibantu oleh enzim lignin

peroksidase yang mampu mengoksidasi unit non fenolik lignin (Hammel, 1996).

39

Semakin tinggi nilai absorbansi maka semakin baik pula hasil biosolubilisasi

batubara (Selvi dan Banerjee, 2007).

A.

00.5

11.5

22.5

3

0 7 14 21 28 35

waktu (hari)

Abs

orba

nsi

0 kGy

5 kGy

B.

0

1

2

3

0 7 14 21 28

waktu (hari)

Abs

orba

nsi

35

0 kGy

5 kGy

Gambar 6. Nilai absorbansi supernatan pada panjang gelombang 250 nm hasil

biosolubilisasi kapang Penicillium sp. (A) dan Trichoderma sp. (B)

Hasil pengukuran supernatan kultur medium kapang Penicillium sp. dan

Trichoderma sp. pada panjang gelombang 250 nm dan 450 nm memiliki pola

yang sama, baik pada batubara yang tidak diiradiasi (0 kGy) maupun batubara

yang diiradiasi (5 kGy) (Gambar 6 dan 7). Hasil pengujian statistik juga

menunjukkan tidak adanya perbedaan yang signifikan pada seluruh perlakuan

(probabilitas ≥ 0,05) (Lampiran 12). Pada (Gambar 6) terlihat bahwa nilai

absorbansi supernatan pada medium yang mengandung batubara yang tidak

40

diiradiasi (0 kGy) dan batubara yang diiradiasi (5 kGy) mengalami peningkatan

pada hari ke-7 inkubasi dan setelah itu mengalami penurunan pada panjang

gelombang 250 nm. Pada medium kapang Penicillium sp. yang mengandung

batubara yang diiradiasi (5 kGy) tidak mempengaruhi biosolubilisasi batubara.

Tanpa radiasi gamma, nilai absorbansi kapang Penicillium sp. memililki nilai

absorbansi yang tinggi.

Nilai absorbansi supernatan meningkat dan menurun seiring dengan

bertambahnya masa inkubasi. Nilai absorbansi yang meningkat pada hari ke-7

inkubasi disebabkan karena proses biosolubilisasi batubara padat diurai menjadi

batubara terlarut dan selain itu dihasilkan pula gas CO2. Nilai absorbansi yang

menurun pada hari ke-14 dan sampai akhir inkubasi disebabkan karena proses

degradasi atau biosolubilisasi batubara yang sudah melarut kemudian diurai

kembali menjadi komponen-komponen yang lebih sederhana dan dihasilkan pula

gas CO2 (Ward, 1990). Unit fenolik hasil degradasi lignin dioksidasi oleh enzim

lakase yang berperan dalam oksidasi unit fenolik (Perez et al.,2002).

Tiap kapang memiliki waktu yang berbeda dalam hal memiliki nilai

absorbansi tertinggi pada panjang gelombang 250 nm. Kapang Penicillium sp.

nilai absorbansi tertinggi terjadi pada inkubasi hari ke-7 dalam medium yang

mengandung batubara yang tidak diiradiasi (0 kGy) dan diirasiasi (5 kGy).

Kapang Trichoderma sp. nilai absorbansi tertinggi pada inkubasi hari ke-35 dalam

medium yang mengandung batubara yang tidak diiradiasi (0 kGy) dan diirasiasi (5

kGy).

41

Tingkat biosolubilisasi juga diamati melalui nilai absorbansi pada panjang

gelombang 450 nm. Pengukuran nilai absorbansi pada panjang gelombang

tersebut bertujuan untuk mendeteksi produk hasil biosolubilisasi berupa gugus

karboksil dan hidroksil oleh kapang Penicillium sp. dan Trichoderma sp. karena

karakter lain dari produk biosolubilisasi kaya akan gugus karbonil (C=O) dan

hidroksil (O-H) (Scott dan Lewis, 1990).

A.

00.010.020.030.040.050.060.07

0 7 14 21 28 35

waktu (hari)

Abs

orba

nsi

0 kGy

5 kGy

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0 7 14 21 28 35

waktu (hari)

Abs

orba

nsi

0 kGy

5 kGy

B.

Gambar 7. Nilai absorbansi supernatan pada panjang gelombang 450 nm hasil

biosolubilisasi kapang Penicillium sp. (A) dan Trichoderma sp. (B) (0 kGy = batubara tidak diiradiasi dan 5 kGy = batubara diiradiasi 5 kGy).

42

Pada (Gambar 7A) terlihat bahwa nilai absorbansi pada masa inkubasi hari ke-

7 dan 28 pada medium yang mengandung batubara yang tidak diiradiasi (0 kGy)

mengalami penurunan. Nilai absorbansi terus meningkat pada masa inkubasi hari

ke-14 dan 21, kemudian nilai absorbansi meningkat lagi pada hari ke-35.

Peningkatan nilai absorbansi tertinggi pada masa inkubasi hari ke-35 yaitu,

sebesar 0,063 pada medium yang mengandung batubara yang tidak diiradiasi (0

kGy). Nilai absorbansi pada medium yang mengandung batubara yang diiradiasi

(5 kGy) pada masa inkubasi dari hari ke-0, 7 dan 14 terus mengalami peningkatan,

kemudian nilai absorbansi menurun lagi pada hari ke-28 dan 35. Peningkatan nilai

absorbansi tertinggi pada masa inkubasi hari ke-35 yaitu, sebesar 0,053 pada dosis

batubara yang diiradiasi (5 kGy). Iradiasi gamma 5 kGy pada batubara tidak

mempengaruhi biosolubilisasi. Hasil pengujian statistik kapang Penicillium sp

menunjukkan tidak adanya perbedaan yang signifikan pada seluruh perlakuan

(probabilitas ≥ 0,05) (Lampiran 12).

(Gambar 7 B) terlihat bahwa nilai absorbansi pada medium yang mengandung

batubara yang tidak diiradiasi (0 kGy) dari ke-0, 7, 14, 21 dan 35 terus mengalami

peningkatan, kemudian nilai absorbansi menurun pada hari ke-28 inkubasi.

Peningkatan absorbansi tertinggi pada masa inkubasi hari ke-35 yaitu, 0,220. Nilai

absorbansi pada dosis batubara yang diiradiasi (5 kGy) menurun pada hari ke-7

dan 28. Kemudian meningkat pada hari ke-14 dan ke-21. Nilai absorbansi

meningkat lagi pada hari ke-35 yaitu, sebesar 0,178. Peningkatan nilai absorbansi

tertinggi pada masa inkubasi ke-35. Hasil pengujian statistik kapang Trichoderma

43

sp. menunjukkan tidak adanya perbedaan yang signifikan pada seluruh perlakuan

(probabilitas ≥ 0,05) (Lampiran 12)

Jika dibandingkan dengan nilai pH medium (Gambar 5) maka dapat dilihat

adanya hubungan yang berbanding terbalik antara pH medium dengan absorbansi

supernatan. Ketika nilai pH medium meningkat maka nilai absorbansi supernatan

mengalami penurunan sedangkan jika nilai pH menurun maka nilai absorbansi

supernatan menigkat. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian yang dilakukan oleh

Selvi dan Banerje (2007), yang menghasilkan biosolubilisasi yang tertinggi pada

pH yang rendah.

Kapang Trichoderma sp. memiliki nilai absorbansi lebih tinggi daripada

kapang Penicillium sp. pada medium yang mengandung batubara yang tidak

diiradiasi (0 kGy) selama proses inkubasi. Hal ini sesuai dengan penelitian Sugoro

et al. (2009) kapang Trichoderma sp. memiliki nilai absorbansi tertinggi atau

memiliki kemampuan tertinggi dalam mendegradasi batubara subbituminus

Sumatera Selatan dibandingkan isolat kapang Penicillium sp., Mucor sp.,

Aspergillus sp. dan isolat lainnya (belum teridentifikasi). Menurut Ward (1990)

perbedaan absorbansi menunjukkan adanya perbedaan pada tingkat biosolubilisasi

batubara oleh kapang melalui aktivitas enzim ekstraseluler menjadi produk yang

dapat larut dan mencair, sehingga dalam penelitian ini perlu dilakukan analisis

hidrolisis FDA.

44

4.4. Hasil Hidrolisis FDA

Nilai absorbansi diukur bertujuan untuk melihat aktivitas dari enzim

intraseluler dan enzim ektraseluler dalam kegiatannya menghidrolisis FDA

(Fluorescien diacetate). FDA dalam pengujian ini merupakan substrat sebagai

pengganti batubara. Jumlah FDA yang terhidrolisis menunjukkan jumlah enzim

intraseluler dan ekstraseluler. Selain ketiga enzim seperti lakase, lignin

peroksidase dan mangan peroksidase ternyata masih ada enzim ektraseluler lain

seperti lipase, protease dan terutama esterase. Aktivitas dari enzim akan

menghasilkan senyawa yang berpendar berwarna kuning (Lampiran 16.5

)(Breeuwer, 1996).

Hasil pengujian statistik kapang Penicillium sp. menunjukkan tidak adanya

perbedaan yang signifikan pada seluruh perlakuan (probabilitas ≥ 0,05) (Lampiran

12).(Gambar 8 A) terlihat bahwa nilai absorbansi pada kontrol (tanpa batubara),

batubara yang tidak diiradiasi (0 kGy) dan batubara yang diiradiasi (5 kGy)

mengalami peningkatan pada inkubasi hari ke-7. Pada kontrol (tanpa batubara),

nilai absorbansi menurun pada hari ke-14, dan terus meningkat pada hari ke-21,

28 dan 35, sedangkan pada batubara yang tidak diiradiasi (0 kGy) dan batubara

yang diiradiasi (5 kGy) terus meningkat pada hari ke-14 dan nilai absorbansi

menurun pada hari ke-21, 28, dan 35. Nilai absorbansi tertinggi pada batubara

yang tidak diiradiasi (0 kGy) dan batubara yang diiradiasi (5 kGy) yaitu, pada hari

ke-14 yaitu sebesar 0, 85, sedangkan pada kontrol (tanpa batubara) nilai aborbansi

tertinggi pada masa inkubasi hari ke-35. Meningkat dan menurunnya hidrolisis

45

FDA karena dipengaruh oleh pH medium, disaat hidrolisis FDA terus meningkat

maka nilai pH medium juga meningkat (Gambar 5).

A.

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

0 7 14 21 28 35

waktu (hari)

Abso

rban

si Kontrol0 KGy5 KGy

B.

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0 7 14 21 28

waktu (hari)

Abs

orba

nsi

35

Kontrol0 KGy5 KGy

Gambar 8. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 490 nm hasil hidrolisis

FDA kapang Penicillium sp. (A) dan Trichoderma sp. (B). ( kontrol = tanpa batubara; 0 kGy = batubara tidak diiradiasi dan 5 kGy = batubara diiradiasi 5 kGy).

(Gambar 8 B) terlihat bahwa nilai absorbansi batubara yang tidak diiradiasi (0

kGy) dan batubara yang diiradiasi (5 kGy) mengalami peningkatan pada hari ke-7

sampai hari ke-14, 21 dan 28. Nilai absorbansi hidrolisis FDA menurun pada hari-

35. Pada kontrol nilai absorbansi menurun pada hari ke-7 dan meningkat pada hari

ke-35. Nilai absorbansi tertinggi pada batubara yang tidak diiradiasi (0 kGy) dan

46

batubara yang diiradiasi (5 kGy) yaitu pada masa inkubasi hari ke-28, sedangkan

pada kontrol (tanpa batubara) nilai absorbansi tertinggi pada hari ke-21. Hasil

pengujian statistik kapang Trichoderma sp. menunjukkan perbedaan yang

signifikan (probabilitas ≤ 0,05) (Lampiran 12)

Peningkatan nilai absorbansi hidrolisis FDA tiap masa inkubasi karena jumlah

kapang yang terus meningkat sehingga aktivitas enzim juga tinggi, dan menurut

penelitian Indahwati (2009), hasil degradasi batubara yang kompleks menjadi

senyawa yang terlarut dalam medium menyebabkan peningkatan kekeruhan

medium sehingga nilai absorbansi juga meningkat. Menurut Fengel dan Weneger

(1995), enzim-enzim pendegradasi lignin harus bekerja secara aktif untuk

mendegradasi zat-zat makromolekul batubara, untuk itu perlu dilakukan analisis

kadar protein ekstraseluler kapang. Kadar protein ekstraseluler berhubungan

dengan enzim-enzim yang dihasilkan oleh kapang, sehingga bisa dihubungkan

dengan biosolubilisasi.

4.5. Hasil Kadar Protein Ekstraseluler Kapang

Pengukuran kadar protein ekstraseluler kapang Penicillium sp. dan

Trichoderma sp. bertujuan untuk mengetahui seberapa besar enzim ekstraseluler

diekresikan oleh kapang. Hasil uji menunjukkan bahwa kadar protein ektraseluler

yang tinggi menyebabkan warna supernatan akan lebih gelap setelah proses uji

(Lampiran 16.4), karena menurut Faison et al. (1989), biosolubilisasi batubara

oleh kapang melalui proses ektraseluler akan menghasilkan medium yang lebih

gelap selama proses kultur.

47

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 7 14 21 28 35

waktu (hari)

mg/

ml kontrol

0 kGy

5 kGy

A.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 7 14 21

waktu (hari)

mg/

ml

28 35

kontrol

0 kGy

5 kGy

B. Gambar 9. Nilai kadar protein ekstraseluler kapang Penicillium sp.(A) dan

Trichoderma sp. (B) (kontrol = tanpa batubara; 0 kGy = batubara tidak diiradiasi dan 5 kGy = batubara diiradiasi 5 kGy).

(Gambar 9 A), pada kapang Penicillium sp. terlihat bahwa kadar protein

ekstraseluler pada kontrol (tanpa batubara) dan medium yang mengandung

batubara yang tidak diiradiasi (0 kGy) menurun pada hari ke-7 inkubasi dan

meningkat pada hari ke-14 inkubasi. Pada kontrol (tanpa batubara) kadar protein

ekstraseluler tertinggi yaitu pada hari ke-35 inkubasi, sedangkan pada medium

yang mengandung batubara yang tidak diiradiasi (0 kGy) tertinggi pada hari ke-21

inkubasi.

48

Pada medium yang mengandung batubara yang diiradiasi (5 kGy) kadar

protein ekstraseluler menurun pada hari ke-28 inkubasi dan kadar protein

ekstraseluler tertinggi pada hari ke-21 inkubasi yaitu, 0,57 mg/ml. Hasil pengujian

statistik kapang Penicillium sp. menunjukkan tidak adanya perbedaan yang

signifikan pada seluruh perlakuan (probabilitas ≥ 0,05) (Lampiran 12). Radiasi

gamma tidak mempengaruhi kadar proein ekstraseluler kapang. Pada hari ke-21

dan ke-28 inkubasi terjadi peningkatan kadar protein ekstraseluler karena kapang

mengekresikan enzim ekstraseluler (Gandjar et al., 2006) dan terjadi juga

degradasi batubara oleh kapang (Sugoro et al., 2009).

(Gambar 9 B), pada kapang Trichoderma sp. kadar protein ekstraseluler pada

kontrol (tanpa batubara), batubara yang tidak diiradiasi (0 kGy ) dan batubara

yang diiradiasi (5 kGy) meningkat pada hari ke-7 inkubasi. Pada kontrol (tanpa

batubara) kadar protein ekstraseluler menurun pada hari ke-28 inkubasi dan kadar

protein ekstraseluler tertinggi pada hari ke-21 inkubasi yaitu, 0,93 mg/ml. Pada

medium yang mengandung batubara yang tidak diiradiasi (0 kGy) kadar protein

ekstraseluler turun pada hari ke-21 inkubasi dan kadar protein ekstraseluler

tertinggi pada hari ke-14 inkubasi yaitu, 0,55 mg/ml. Pada batubara yang

mengandung batubara yang diiradiasi (5 kGy) kadar protein ekstraseluler menurun

pada hari ke-14 inkubasi dan Trichoderma sp. tertinggi pada hari ke-7 yaitu, 0,62

mg/ml. Hasil pengujian statistik kapang Trichoderma sp. menunjukkan perbedaan

yang signifikan (probabilitas ≤ 0,05) (Lampiran 12). Kadar protein tertinggi pada

media yang berisi batubara yang diiradiasi (5 kGy) masa inkubasi ke-21 yaitu,

0,58 mg/ml (Gambar 9 A). Kadar protein pada media yang mengandung batubara

49

yang tidak diiradiasi (0 kGy) pada masa inkubasi ke-21. Jika dibandingkan

dengan kontrol (tanpa batubara) kadar protein tertinggi yaitu pada masa inkubasi

hari ke-35.

4.6. Analisis Senyawa Hasil Biosolubilisasi Batubara oleh Kapang Penicillium

sp. dan Trichoderma sp. Menggunakan GC-MS.

Hasil analisis biosolubilisasi menggunakan GC-MS pada pada kontrol

(MMSS+ batubara tanpa kapang) dan perlakuan pada batubara yang tidak

diiradiasi (0 kGy) dan diiradiasi (5 kGy) oleh kapang Penicillium sp. dan

Trichoderma sp. dinyatakan dalam persen area. Hasil analisis biosolubilisasi

tersebut menunjukkan hasil biosolubilisasi batubara yang tidak diiradiasi (0 kGy)

dan diiradiasi (5 kGy) oleh kapang Penicillium sp. dan Trichoderma sp.

menghasilkan senyawa-senyawa hidrokarbon yang terkandung dalam minyak

bumi. Senyawa hidrokarbon adalah senyawa-senyawa organik yang setiap

molekulnya hanya mempunyai unsur karbon dan hidrogen saja (Hardjono, 2001).

Sampel yang digunakan dalam analisis GC-MS adalah berdasarkan nilai

biosolubilisasi yang tinggi yaitu, kapang Penicillium sp. yang mendegradasi

batubara yang tidak diiradiasi (0 kGy dan) dan diiradiasi (5 kGy) pada hari ke-7

inkubasi, sedangkan kapang Trichoderma sp. pada hari ke-14 inkubasi.

Puncak-puncak yang muncul pada kromatogram dari kontrol (MMSS+

batubara tanpa kapang) dibandingkan dengan perlakuan. Ada senyawa-senyawa

yang mengalami peningkatan, pengurangan persen area dan pembentukan

senyawa baru karena proses degradasi batubara (Sugoro et al., 2009). Senyawa

50

hidrokarbon yang terbentuk selama proses biosolubilisasi adalah delapan sampai

dua puluh satu atom karbon (C8-C21). Menurut penelitian Indahwati (2009),

senyawa hidrokarbon yang terbentuk selama proses biosolubilisasi batubara

adalah tujuh sampai lima puluh empat atom karbon (C7-C54).

Hasil analisis GC-MS pada kontrol (MMSS+ batubata yang tidak diradiasi (0

kGy) terdeteksi 8 senyawa, sedangkan batubara yang diiradiasi (5 kGy) terdeteksi

12 senyawa. Kapang Penicillium sp. yang mengandung batubara yang tidak

diiradiasi (0 kGy) pada hari ke-7 inkubasi terdapat 4 puncak senyawa

hidrokarbon, sedangkan batubara yang diiradiasi (5 kGy) terdeteksi hanya 2

senyawa. Kapang Trichoderma sp. yang mendegradasi batubara yang tidak

diiradiasi (0 kGy) pada hari ke-14 inkubasi terdeteksi 2 senyawa hidrokarbon,

sedangkan batubara yang diiradiasi (5 kGy) terdeteksi 4 senyawa hidrokarbon

(Tabel 4).

Hasil analisis GC-MS kapang Penicillium sp. yang mendegradasi batubara

yang tidak diiradiasi (0 kGy) pada hari ke-7 inkubasi memiliki 9-21 atom karbon

(C9-C21). Terjadi pengurangan persen area pada senyawa 2,4-dimetilheptana

(C9H20) dari 19,43 % menjadi 13,24 % dan n-tetradekana (C14H30) dari 18,03 %

menjadi 15,02 %. Senyawa baru yang terbentuk adalah 3,7-dimetildekana

(C12H26) sebanyak 14,97 % dan senyawa 2,6,10,14-tetrametilheptadekana

(C21H32) terdeteksi paling tinggi sebanyak 56,77 %. Kapang Penicillium sp. yang

mendegradasi batubara yang diiradiasi (5 kGy) pada hari ke-7 inkubasi memiliki

13-14 atom karbon (C13-C14). Senyawa baru yang terbentuk berbeda dengan

batubara yang tidak diiradiasi yaitu 3,7-dimetilundekana (C13H28), senyawa

51

tersebut terdeteksi paling banyak, yaitu 65,61 %. Selain itu, terjadi penambahan

persen area pada senyawa n-tetradekana (C14H30) dari 18,03 % menjadi 34,39 %

(Tabel 4).

Tabel 4. Senyawa hasil biosolubilisasi batubara menggunakan GC-MS

%area/5 µl Perlakuan

Kontrol Penicillium sp. Trichoderma sp.

No Nama Senyawa 0 kGy H-0

5 kGy H-0

0 kGy H-7

5 kGy H-7

0 kGy H-14

5 kGy H-14

1 n-oktana (C8H18) 11,07 6,26 - - - - 2 3,3-dimetilheksana (C8H18) - 23,37 - - - - 3 2,3,3-trimetilpentana (C8H18) - 3,33 - - - - 4 2,4-dimetil-1-heptena (C9H18) - 4,99 - - - - 5 2,4-dimetilheptana (C9H20) 19,43 17,73 13,24 - 67,19 24,41 6 4-metiloktana (C9H20) 4,50 4,93 - - - - 7 2,3,4-trimetilheksana (C9H20) - 9,53 - - - - 8 n-nonena (C9H20) - 2,12 - - - - 9 1-iododekana (C10H21) - 4,52 - - - -

10 6-etil-2-metiloktana (C11H24) - 5,23 - - - - 11 dodekana,1,1-difloro (C12H24) 5,49 - - - - - 12 dodekana (C12H26) 29,22 - - - - - 13 2,4-dimetildekana (C12H26) 6,73 - - - - - 14 3,7-dimetildekana (C12H26) - - 14,97 - - -

15 4,7-dimetilundekana (C13H28) - 16,07 - - - - 16 3,7-dimetilundekana (C13H28) - - 16,61 32,81 22,96 17 n-tetradekana (C14H30) 18,03 - 15,02 34,39 - 20,59 18 n-pentadekana (C15H32) 5,53 1,92 - - - 19 n- heksadekana (C16H34) - - - - - 32,04

20 2,6,10,14-tetrametilheptadekana (C21H32) - - 56,77 - - -

Total % area 100 100 100 100 100 100 Total senyawa 8 12 4 2 2 4

Keterangan: Kontrol : MMSS + serbuk batubara tanpa kapang Perlakuan : MMSS + serbuk batubara + kapang

Hasil analisis senyawa hidrokarbon pada kapang Trichoderma sp. yang

mendegradasi batubara yang tidak diiradiasi (0 kGy) hari ke-14 inkubasi memiliki

9-13 atom karbon (C9-C13). Senyawa baru yang terbentuk adalah 3,7-

dimetilundekana (C13H28) sebanyak 32,81 % dan terjadi juga penambahan persen

52

area senyawa 2,4-dimetilheptana (C9H20) dari 19,43 % menjadi 67,19 %. Kapang

Trichoderma sp. yang mendegradasi batubara yang diiradiasi (5 kGy) hari ke-14

inkubasi memiliki atom karbon dari 9-16 (C9-C16). Senyawa baru yang terbentuk

adalah 3,7-dimetilundekana (C13H28) dan n-heksadekana (C16H34) terdeteksi

paling tinggi sebanyak 32,04 %. Senyawa yang mengalami penambahan persen

area adalah 2,4-dimetilheptana (C9H20) dari 19,43 % menjadi 24,41 % dan

senyawa n-tetradekana (C14H30) dari 18,03 % menjadi 20,59 % (Tabel 4).

Formulasi kimia yang masuk ke dalam fraksi bensin memiliki jumlah atom

karbon sebanyak 4-12 (American Petroleum Institute, 2001), sedangkan pada hasil

penelitian Sugoro et al. (2009), degradasi batubara oleh kapang Penicillium sp.

dan Trichoderma sp. berpotensi sebagai energi alternatif pengganti bahan bakar

minyak yang setara dengan bensin karena kedua kapang tersebut mampu

mendegradasi batubara yang kompleks menjadi senyawa dengan rantai karbon

sebanyak 6-12 dengan persentase yang cukup tinggi, yaitu 33,67 % dan 33,33 %.

Pada penelitian ini senyawa dengan rantai karbon 9-12 berpotensi sebagai energi

alternatif pengganti bahan bakar minyak yang setara dengan bensin , yaitu kapang

Trichoderma sp. yang mendegradasi batubara yang tidak diiradiasi (0 kGy)

memiliki persentasi yang lebih tinggi sebanyak 67,19 %. dan batubara yang

diiradiasi (5 kGy) lebih kecil 24,41 %. Kapang Penicillium sp. yang mendegradasi

batubara yang tidak diiradiasi (0 kGy) sebanyak 28,21 %.

Proses biosolubilisasi tidak lepas dari peran enzim. Untuk mengetahui jenis

enzim, maka akan dilakukan karakterisasi enzim ekstraseluler dengan

eloktroforesis SDS-PAGE. Sampel yang akan digunakan adalah supernatan yang

53

mempunyai tingkat solubilisasi yang tinggi nilai absorbansinya pada panjang

gelombang 250 nm dan 450 nm, nilai absorbansi yang tinggi berbanding lurus

dengan tingkat solubilisasi yang tinggi pula (Selvi dan Banerjee, 2007).

Berdasarkan nilai solubilisasi yang tinggi, maka sampel yang akan dianalisis

karakterisasi protein dengan eloktroforesis SDS-PAGE adalah kapang

Penicillium sp. yang mendegradasi batubara yang tidak diiradiasi (0 kGy) dan

batubara yang diiradiasi (5 kGy) pada hari ke-7 inkubasi, sedangkan kapang

Trichoderma sp. pada hari ke-14 inkubasi.

4.7. Karakteristik Enzim Ekstraseluler Kapang Penicillium sp. dan Trichoderma sp.

Hasil elektroforesis SDS-PAGE memperlihatkan gambaran karakteristik

enzim kapang Penicillium sp. dan Trichoderma sp. Dengan elektroforesis dapat

diketahui berat molekul (BM) enzim ekstraseluler. Karakteristik enzim kapang

Penicillium sp. dan Trichoderma sp. berbeda (Gambar 10).

Pada hari ke-7 inkubasi karakteristik enzim kapang Penicillium sp. pada

batubara yang tidak diiradiasi (0 kGy) dan batubara yang diiradiasi (5 kGy)

tampak sama. Karakteristik enzim kapang Penicillium sp. terdiri atas mangan

peroksidase (BM= 48 KDa) dan lakase (BM= 56 KDa), kedua enzim tersebut juga

terdapat pada uji kualitatif enzim ekstraseluler (Gambar 4). Iradiasi gamma pada

batubara 5 kGy yang disolubilisasi oleh kapang Penicillium sp. tidak

mempengaruhi karakteristik enzim kapang tersebut karena karakteristik enzimnya

sama dengan yang tidak diradiasi (0 kGy).

54

M 1 2 3 4

97,4 KDa

66,2 KDa

45 KDa

31,5 KDa

5 6 KDa

200 KDa

4 8 KDa

2 3 KDa 21,5 KDa

Gambar 10. Karakteristik enzim ekstraseluler kapang Penicillium sp. dan

Trichoderma sp. pada medium yang mengandung batubara yang

tidak diiradiasi (0 kGy) dan batubara yang diiradiasi (5 kGy). M

(marker), 1 (Pe,0 kGy,7 hari,) 2 (Pe,5 kGy,7 hari), 3 (Tr,0 kGy,14

hari), dan 4 ( Tr, 5 kGy, 14 hari).

Pada hari ke-14 inkubasi, karakteristik enzim kapang Trichoderma sp.

batubara yang tidak diiradiasi (0 kGy) dan batubara yang diiradiasi (5 kGy)

menunjukkan karakteristik enzim yang berbeda (Gambar 10). Pada batubara yang

tidak diradiasi (0 kGy) karakteristik enzim kapang Trichoderma sp. terdiri atas

mangan peroksidase (BM= 48 KDa), lakase (BM= 56 KDa) dan belum diketahui

karakteristiknya (23 kDa), sedangkan batubara yang diiradiasi 5 kGy karakteristik

55

enzim kapang Trichoderma sp. terdiri atas lakase (BM= 56 KDa) dan belum

diketahui karakteristiknya (23 kDa). Enzim-enzim ekstraseluler yang terlibat

dalam proses biosolubilisasi batubara adalah peroksidase, esterase, fenoloksidase

atau lakase, mangan peroksidase dan lignin peroksidase (Laborda et al., 1999;

Fakuosa dan Hofrichter, 1999).

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan

1. Iradiasi gamma pada batubara (5 kGy) tidak mempengaruhi kadar protein

ekstraseluler kapang Penicillium sp. dan Trichoderma sp.

2. Iradiasi gamma pada batubara (5 kGy) mempengaruhi karakteristik enzim

ekstraseluler kapang Trichoderma sp., tetapi pada kapang Penicillium sp.

sebaliknya. Enzim yang terdeteksi pada kapang Penicillium sp adalah

mangan peroksidase (BM=48 KDa) dan lakase (BM=56 KDa) baik pada

batubara yang tidak diiradiasi (0 kGy) dan batubara yang diiradiasi (5

kGy), sedangkan pada kapang Trichoderma sp. terdeteksi hanya lakase

(BM=56 KDa) pada batubara yang diiradiasi (5 kGy) dan mangan

peroksidase (BM=48 KDa) dan lakase (BM=56 KDa) pada batubara yang

tidak diiradiasi (0 kGy).

3. Produk solubilisasi menunjukkan kecenderungan setara bensin pada

perlakuan batubara yang diiradiasi dan tidak diiradiasi untuk Trichoderma

sp., sedangkan Penicillium sp. hanya pada batubara yang tidak diiradiasi.

5.2. Saran

Perlu dilakukan peningkatan pada dosis batubara hasil iradiasi gamma agar

ditingkatkan biosolubilisasinya dibandingkan dengan yang tidak diiradiasi.

Disamping itu perlu dilakukan optimasi kandungan batubara dan purifikasi enzim

ekstraseluler yang berperan dalam biosolubilisasi batubara.

56

57

DAFTAR PUSTAKA

Akhadi, M. 2007. Pengantar Teknologi Nuklir. PT Reneka Cipta. Jakarta. Akhtar, M., R.A. Blanchette and T.K. Kirk. 1997. Fungal Delignification and

Biomechanical Pulping of Wood. Advances in Biochemical Enginering Biotechnology 57:138-144.

American Coal Foundation. 2007. Coal’s Journey. http://www.coaljourney.htm,

(akses 16 Februari 2010) Apriyanto, A., D. Fardiaz, N.L. Puspitasari, Sedarnawati, S. Budiyanto. 1989.

Analisis Pangan. Penelaah: D. Muchtadi. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi Institut Pertanian Bogor. Bogor.

Breeuwer, P. 1996. Assesment of Viability of Microorganism Employing

Fluorescene Techniques. Wageningen. Carlile, M.J. dan S.C. Watkinson. 1994. The Fungi. Academic Press. London. Cerniglia. 1992. Biodegradation of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons.

Biodegradation Journal. 3: 227-361 Champe, S.P., M.B. Kurtz, L.N. Yager, N.J. Butnick & D.E. Axelrod. 1981. Spore

formation in Aspergillus nidulans: Competence and other developmental processes. Dalam: Turian,G. & H.R. Hohl. (eds). 1981. The Fungal Spore: Morphogenetics Controls. Academic Press. London: 255 – 276.

Cohen S.M dan P.D Gabriele. 1982. Dedradation of Coal by the Fungi Poliporus

versicolor and Poria monticule. Appl. Environ. Mikrobiol. 44: 23-27. Darussalam, M. 1996. Radiasi dan Radioisotop: Prinsip Penggunaan dalam

Biologi, Kedokteran, dan Pertanian. Tarsito. Bandung. Faison, B.D., C.D. Scott and B.H. Davidson. 1989. Biosolubilization of Coal in

aqueous and non-aqueous media. Biotechnol. Bioeng. Symp. Ser. 743-752 Fakuosa, R.M dan M. Hofrichter. 1999. Biotechnology and Microbiology of Coal

Degradation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 52: 25-40. Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan. PT Gramedia Pustaka Umum. Jakarta.

58

Fardiaz, S. 1989. Mikrobiologi Pangan. Penelaah: F.G. Winarno. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi Institut Pertanian Bogor. Bogor.

Fengel, D dan G. Weneger. 1995. Kayu: Kimia, Ultrastruktur, Reaksi-reaksi.

Gajah Mada University Press. Yogyakarta. Gandjar, I., W. Sjamsuridzal, A. Oetari. 2006. Mikologi: Dasar dan Terapan.

Yayasan Obor Indonesia. Jakarta. Hames,B. D. 1998. Gel Electrophoresis of Protein. Oxford University Press. New

York Tokyo Hammel, K.E. 1996. Extracelluler Free Radical Biochemistry of Ligninolytic

Fungi. New J. Chem. 20:195-198. Hardjono, A. 2001. Teknologi Minyak Bumi. Gadjah Mada University Press.

Yogyakarta. Hatakka, A. 2001. Biodegradation of lignin. In: Steinbuchel, A. (editor).

Biopolymers. (1): 129-180. Hibbet, D.S., et al. 2007. A Higher-level Phylogenetic Classification of the

Fungi.. Mycological Research. 48: 261-266 Hidayat, N., M.C. Padaga dan S. Suhartini. 2006. Mikrobiologi Industri. Penerbit

Andi. Yogyakarta. Holker, U., H. Schmiers, S. Grobe, M. Winkelhofer, M. Polsakiewicz, S. Ludwig,

J. Dohse and M. Hofer. 2002. Solubilization of Low-rank Coal by Trichoderma atroviride Evidence for the Involvement of Hydrolytic and Oxidative Enzymes by Using 14C-labelled Lignite. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 28: 207-212.

Indahwati, E. 2009. Degradasi Batubara Subbituminus Asal Kalimantan Timur

Menggunakan Fungi Aspergillus sp. dan Penicillium sp. Skripsi. Jurusan MIPA Biologi. Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah. Jakarta.

Judoamidjojo, M., A.A. Darwis dan E.G. Said. 1992. Teknologi Fermentasi.

Rajawali Press. Jakarta. Kersten, P.J., B. Kalyanaraman, K.E. Hammel, B. Reinhamar and T.K. Kirk.

1990. Comparation of Lignin Peroxidase, Horseradish Peroxidase and Laccase in the Oxidation of Methoxybenzenes. Biochem. J. 268: 475-480.

59

Kuraesin, T. 2009. Isoloasi Seleksi Fungi Pelaku Solubilisasi Batubara Subbituminous. Skripsi. Jurusan MIPA Biologi. Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah. Jakarta.

Mazur, L.J., J. Kim & the Commitee on Environmental Health. 2006. Spectrum of

Noninfectious Healt Effects from Molds. Pediatrics 118: 1909 – 1926. Laborda, F., I.F. Monistrol, N. Luna and M. Fernandez. 1999. Processes of

Liquefaction or Solubilization of Spanish Coal by Microorganism. Appl. Microbiol. Biotechnol. 57: 49-56.

Lehninger, L. A. 1982. Principle of Biochemistry Worth Publisher. Inc. USA. Lehninger, L. A.1994. Dasar-dasar Biokimia. Erlangga. Jakarta. Liu, R.Q, N.L. Jahson, G.C Magruder, M.D Ackerson, J.L Vega, E.C Clausen dan

J.L Gaddy. 1989. Serial Biological Conversion of Coal Into Liquid Fuels. Biotechnol. Bioeng. 73: 551-564.

Mustikasari, N.S. 2009. Pengaruh Jumlah Inokulum Phanerochaete

chrysosporium dan Konsentrasi Batubara Pada Pencairan (Solubilisasi Batubara). Skripsi. Jurusan Mikrobiologi. Institut Teknologi Bandung. Bandung.

Novia, L. Cundari, S. Murti, M. Faisal. 2009. Modeling Proses Pencairan

Batubara Menggunakan Software Fluent 6,3 CDF Code. Seminar Nasional Kimia Indonedia. Bandung.

Perez, J., J. Munoz-Dorado, T. de la Rubia and J. Martinez. 2002. Biodegradation

and Biological Treatment of Cellulose, Hemicellulose and Lignin. Introduction Microbiol. 5: 53-63.

Poedjiadi, A. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. UI Press. Jakarta Scott, C.D., Faison, B.D., Woodward, C.A. 1991. Anaerobic Liquefaction/

Solubilization of Coal by Microorganism and Isolated Enzyme. Presented at The Liquefaction Contractor Review Meeting, Dept. of Energi. USA.

Scott, C.D. and S.N. Lewis. 1990. Solubilization of coal by microbial action. In :

Wise, L. D (editor). Bioprocessing and Biotreatment of Coal. Marcel Dekker Inc. New York.

Selvi, V.A. and Banerjee, R. 2007. Coal Biotechnology: Bio-conversion of

Different Rank Indian Coal for The Extraction of Liquid Fuel and Fertilizer. Appl. Biochem. Biotechnology 7: 16-21.

60

Selvi, V.A., R. Benerjee, L.C. Ram, G. Singh. 2009. Biodepolymerization Studies of Low Rank Indian Coals. World J. Microbiol. Biotechnol. 25: 1713-1720.

Silva, M.E., C.J. Vengadajellum, H.A. Janjua, S.T.L. Harrison, S.G. Burton and

D.A. Cowan. 2007. Degradation of low rank coal by Trichoderma atroviride ES11. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 34:625–631.

Speight, J.G. 1994. The Chemistry and Technology of Coal, 2nd edition, Revised

and Expanded. Marcel Dekker Inc. New York. Sugoro, I. 2009. Aplikasi Teknik Nuklir Untuk Biosolubilisasi Batubara. Proposal

Disertasi: ITB. Bandung. Sugoro, I., T. Kuraesin, M.R. Pikoli, S. Hermanto, P. Aditiawati. 2009. Isoloasi

Seleksi Fungi Pelaku Solubilisasi Batubara Subbituminous. Jurnal biologi Lingkungan 3(2): 75-87

Tao, X.X., L.Y. Pan, K.Y. Shi, H. Chen, S.D. Yin, Z.F. Luo. 2009.

Biosolubilization of Chinese Lignite I: Exstraseluller Protein Analysis. Mining Sciene and Technology 16: 358-362.

Ummubalqis. 2000. Karakterisasi Protease dari Ekskretori atau Sekretori Stadium

L3 Ascaridia gall. Jurnal Institut Pertanian Bogor 28-40. Ward, B. 1985. Isolation and Application of Coal-Solubilizing Microorganism. In:

Wise, L.D (editor). Bioprocessing and Biotreatment of Coal. Marcel Dekker Inc. New York.

Yuwono, T. 2005. Biologi Molekular. Jakarta. Erlangga.

61

LAMPIRAN Lampiran 1. Kerangka berpikir

Biosolubilisasi batubara

Melimpahnya cadangan batubara kualitas rendah

di Indonesia

Teknologi alternatif ?

Bagaimana karakteristik enzim ekstraseluler dan produk biosolubilisasi batubara kultur kapang tersebut ?

Serbuk batubara tidak diiradiasi gamma:

(0 kGy) dan diiradiasi (5 kGy)

Kapang: Penicillium sp. dan

Trichoderma sp.

Kebutuhan BBM semakin meningkat

62

Lampiran 2. Bagan kerja

Diinkubasi pada suhu ruang t: 0, 7, 14,28 dan 35 hari

Parameter

Kadar protein ekstraseluler dengan

Metode Lowry

Hidrolisis FDA

pH medium

Analisis senyawa dengan

GC-MS

Biosolubilisasi 250 dan 450

nm

Kultur stok kapang Serbuk batubara

Peremajaan kapang Tidak diiradiasi dan diiradiasi gamma

Kontrol: tanpa batubaraKultur spora 0 kGy dan 5 kGy

Medium MMSS

Analisis data

Uji kualitatif enzim

ekstraseluler

Karakterisasi enzim ekstraseluler

dengan SDS-PAGE

63

Lampiran 3. Komposisi medium

No. Medium Jumlah 1. Potato Dextrose Agar (PDA)

• PDA • 1 % agar bakto • Dilarutkan dalam 1 liter

akuades

39 gr 10 gr

2. Medium Minimal Salt (MMS) • MgSO4.7H2O • ZnSO4.7H2O pH 5,5 • K2HPO4 • FeSO4 • NH4(SO4) • Dilarutkan dalam 1 liter

akuades

0,52 gr 0,003 gr 5 gr 0,005 gr 1 gr

Lampiran 4. Komposisi reagen Lowry

No. Reagen Jumlah

1. Reagen Lowry I • 2 % Na2CO3 dalam 0, 1 NaOH • 2,7 % K.Na Tartat • 1 % Cu SO4

49 ml 0,5 ml 0,5 ml

2. Reagen Lowry II • Folin • Akuades

10 ml 10 ml

64

Lampiran 5. Komposisi larutan elektroforesis

No. Larutan Jumlah 1. Larutan Poliakrilamid 30 %

• Akrilamid • BIS (Methylene Bis Acrylamide) • Akuades

22,2 gr 0,8 gr 100 ml

2. Larutan Ammonium Persulfat 10 % • Ammonium persulfat • Akuades

0,1 gr/ml 1 ml

3. Larutan Staining • Coomassie Brilliant Blue R-250 • Metanol • Asam asetat • Akuades

1 gr 300 ml 100 ml 600 ml

4. Larutan Destaining • Metanol • Asam asetat • Akuades

300 ml 100 ml 600 ml

5 Gel Separating Buffer (1,5 M Tris-HCl) • Tris (Hydroxymethyl aminomethane) • SDS (Sodium Dedocyl Sulfate) • pH • Akuades

18,2 gr 0,4 gr 8,8 100 ml

6 Gel Stacking Buffer (0,5 M Tris-HCl) • Tris (Hydroxymethyl aminomethane) • SDS (Sodium Dedocyl Sulfate) • pH • Akuades

6,1 gr 0,4 gr 6,8 100 ml

7. Buffer Running • Tris (Hydroxymethyl aminomethane) • SDS (Sodium Dedocyl Sulfate) • Glisin • Akuades

3 gr/l 1 gr/l 14,4 gr/l 1 ml

65

Lampiran 6. Hasil pengujian pH medium kapang

Penicillium sp. Trichoderma sp. Hari kontrol 0 kGy 5 kGy kontrol 0 kGy 5 kGy

0 4,62 3,45 3,38 4,90 3,40 3,33 7 2,97 2,71 2,74 2,86 2,69 2,71 14 3,16 2,89 2,92 3,02 2,82 2,78 21 3,53 2,96 3,00 3,13 2,96 2,92 28 3,72 3,00 3,02 3,22 3,00 2,97 35 3,88 3,01 3,02 3,42 3,00 2,95

Kontrol : tanpa serbuk batubara. Lampiran 7. Hasil pengujian biosolubilisasi batubara

Penicillium sp. Trichoderma sp. Absorbansi Absorbansi

0 kGy 5 kGy 0 kGy 5 kGy

Hari

250 nm

450 nm

250 nm

450 nm

250 nm

450 nm

250 nm

450 nm

0 0,254 0,032 0,224 0,00 0,229 0,00 0,264 0,033 7 2,402 0,017 2,445 0,021 2,628 0,033 2,620 0,028 14 2,323 0,041 1,978 0,033 2,664 0,051 2,671 0,042 21 2,215 0,048 1,799 0,026 2,684 0,098 2,704 0,077 28 2,085 0,037 1,779 0,028 2,562 0,069 2,594 0,069 35 1,718 0,063 1,692 0,053 2,787 0,220 2,761 0,178

Lampiran 8. Hasil pengujian hidrolisis FDA

Penicillium sp. Trichoderma sp.

Absorbansi Absorbansi

Hari

kontrol 0 kGy 5 kGy kontrol 0 kGy 5 kGy 0 0,15 0,041 0,04 0,27 0,045 0,038 7 0,28 0,195 0,095 0,1 0,05 0,07 14 0,085 0,85 0,85 0,27 0,085 0,1 21 0,185 0,67 0,305 0,5 0,125 0,09 28 0,37 0,05 0.2 0,15 0,3 0,24 35 0,425 0,21 0,21 0,3 0,07 0,1

Kontrol : tanpa serbuk batubara.

66

Lampiran 9. Hasil pengujian kadar protein ekstraseluler kapang

Penicillium sp. Trichoderma sp. Absorbansi Absorbansi

Hari

kontrol 0 KGy

5 KGy

Kontrol 0 KGy

5 KGy

0 0,23 0,31 0,22 0,28 0,225 0,25 7 0,38 0,275 0,23 0,79 0,45 0,585 14 0,38 0,29 0,24 0,895 0,55 0,57 21 0,38 0,38 0,22 0,93 0,51 0,495 28 0,405 0,28 0,22 0,81 0,47 0,46 35 0,6 0,22 0,225 0,75 0,525 0,44

Kontrol : tanpa serbuk batubara. Kadar protein y = 0,7097× + 0,2049 Lampiran 10. Kurva standar protein BSA

Kadar protein (mg/ml)

Absorbansi

1,2 1 0,8 0,85 0,4 0,54 0,2 0,275

y = 0.7097x + 0.2049R2 = 0.946

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

Kadar protein (mg/ ml)

Abso

rban

si

Pembuatan kurva standar ditujukan untuk menentukan konsentrasi protein

ekstraseluler kultur kapang Penicillium sp. dan Trichoderma sp. Hasil yang

diperoleh berupa persamaan garis yaitu, y = 0,7095× + 0, 2049 dan nilai R2 =

67

0,946. Sumbu x menunjukkan kadar protein (mg/ml) dan sumbu y menunjukkan

nilai absorbansi.

Lampiran 11. Kurva standar marker

Berat Molekul (KDa) RF Log BM

200 0,111 2,30103

97,4 0,278 1,98855

66,2 0,389 1,82085

45 0,5 1,65321

31 0,722 1,49136

21,5 0,917 1,33243

y = -1.1624x + 2.3296R2 = 0.9554

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

RF

Log K

Da

Kurva standar marker dibuat untuk mengetahui berat molekul protein

kapang Penicillium sp. dan Trichoderma sp. pengsolubilisasi batubara.

Perhitungan berat molekul diperoleh dari persamaan garis, dimana hasil yang

diperoleh adalah y = -1,1624× + 2,3296 dan nilai R2 = 0,9554.

68

Lampiran 12. Uji statistik analisis varians

12.1. Kapang Penicillium sp.

Sumber Keragaman Jumlah kuadrat

Derajat bebas

Derajat tengah F Signifikansi

pH medium 1,630 2 0,815 5,473 0,016 Galat 2,234 15 0,149

Jumlah 3,864 17

Biosolubilisasi 250 nm 0,097 1 0,097 0,160 0,698 Galat 6,093 10 0,609

Jumlah 6,191 11

Biosolubilisasi 450 nm 0,002 2 0,001 2,832 0,106 Galat 0,003 10 0,000

Jumlah 0,004 12

FDA 0,023 2 0,011 0,157 0,856 Galat 1,096 15 0,073

Jumlah 1,119 17

Kadar Protein 0,019 2 0,010 1,543 0,246 Galat 0,093 15 0,006

Jumlah 1,112 17

Uji Anova dengan hipotesis :

H0 : Tidak adanya perbedaan yang signifikan pada seluruh perlakuan.

H1 : Ada perbedaan yang signifikan pada seluruh perlakuan.

Pada tabel, tampak nilai signifikansi pH medium 0,016 ≤ 0,05, maka H0

ditolak atau pH medium pada perlakuan ada perbedaan yang signifikan,

sedangkan pada biosolubilisasi 250nm, biosolubilisasi 450 nm, FDA dan kadar

protein ekstraseluler ≥ (besar dari atau sama dengan) 0,05 maka H0 diterima atau

tidak adanya perbedaan yang signifikan pada seluruh perlakuan.

69

12.2. Kapang Trichoderma sp.

Sumber Keragaman Jumlah kuadrat

Derajat bebas

Derajat tengah F Signifikansi

pH medium 0,865 2 0,433 1,963 0,175 Galat 3,307 15 0,220

Jumlah 4,173 17 Biosolubilisasi 250 nm 0,000 1 0,000 0,000 0,986

Galat 9,814 10 0,981 Jumlah 9,814 11

Biosolubilisasi 450 nm 0,000 1 0,000 0,036 0,854 Galat 0,045 10 0,005

Jumlah 0,045 11 FDA 0,097 2 0,048 4,341 0,033 Galat 0,167 15 0,011

Jumlah 0,264 17 Kadar Protein 0,318 2 0,159 5,641 0,015

Galat 0,422 15 0,028 Jumlah 0,740 17

Uji Anova dengan hipotesis :

H0 : Tidak adanya perbedaan yang signifikan pada seluruh perlakuan.

H1 : Ada perbedaan yang signifikan pada seluruh perlakuan.

Pada tabel, tampak nilai signifikansi hidrolisis FDA dan kadar protein

ekstraseluler 0,033 dan 0,015≤ 0,05, maka H0 ditolak atau ada perbedaan yang

signifikan, sedangkan pada pH medium, biosolubilisasi 250 nm, dan

biosolubilisasi 450 nm, ≥ (besar dari atau sama dengan) 0,05 maka H0 diterima

atau tidak adanya perbedaan yang signifikan pada seluruh perlakuan.

70

Lampiran 13. Kromatogram hasil GC-MS kontrol

Keterangan : batubara yang tidak diiradiasi (0 kGy)

1. 2,4-dimetilheptana (C9H20) 6. heksadekana (C16H34) 2. n-oktana (C8H18) 7. nonadekana (C19H40) 3. 4,7-dimetilundekana (C13H28) 8. eikosana (C20H42) 4. 3,7-dimetilundekana (C13H28) 9. 2,6,10,14-Tetrametilheptadekana (C21H44) 5. n-Tetradekana (C14H30)

Keterangan : batubara yang diiradiasi (5 kGy) 1. 2,3,3-trimetilpentana (C8H18) 7. n-nonane (C9H20) 2. 3,3-dimetilheksana (C8H18) 8. 2,3,4-trimetilheksana (C9H20) 3. n-oktana (C8H18) 9. 1-iododekana(C10H21I) 4. 2,4-dimetilheptana (C9H20) 10. 6-etil-2-metiloktana (C11H24) 5. 2,4-dimetil-1-heptena (C9H18) 11. 4,7-dimetilundekana (C13H28) 6. 4-metiloktana (C9H20) 12. n-pentadekana (C15H32)

71

Lampiran 14. Kromatogram hasil GC-MS biolubilisasi batubara oleh kapang Penicillium sp.

kGy

Keterangan : batubara yang tidak diiradiasi (0 kGy) 1. 2,4-dimetilheptana (C9H20) 2. 3,7-dimetilundekana (C13H26) 3. n-tetradekana (C14H30) 4. 2,6,10,14-tetrametilheptadekana (C21H44)

Keterangan : batubara yang diiradiasi (5 kGy) 1. 3,7-dimetilundekana (C13H28) 2. n-tetradekana (C14H30)

72

Lampiran 15. Kromatogram hasil GC-MS biosolubilisasi batubara oleh kapang Trichoderma sp.

Keterangan : batubara yang tidak diiradiasi (0 kGy) 1. 2,4-dimetilheptana (C9H20) 2. 3,7-dimetilundekana (C13H28)

Keterangan : batubara yang diiradiasi (5 kGy) 1. 2,4-dimetilheptana (C9H20) 2. 3,7-dimetilundekana (C13H28) 3. n-tetradekana (C14H30) 4. n-heksadekana (C16H34)

73

Lampiran 16. Foto-foto hasil biosolubilisasi batubara.

(A) (B)

Foto 1. Kontrol (tanpa batubara) pada hari ke-7 inkubasi oleh kapang Penicillium sp.(A) dan kapang Trichoderma sp. (A)

(A) (B)

Foto 2. Hasil biosolubilisasi batubara oleh kapang Penicillium sp. pada hari ke-7

inkubasi. (A) batubara yang tidak diiradiasi (0 kGy) dan (B) batubara yang diiradiasi (5 kGy).

74

(A) (B)

Foto 3. Hasil biosolubilisasi batubara oleh kapang Trichoderma sp. pada hari ke-14 inkubasi. dan (A) batubara yang diiradiasi (5 kGy) dan (B) batubara yang tidak diiradiasi (0 kGy)

Foto 4. Hasil analisis kadar protein ektraseluler kapang, tanda panah menunjukkan

terbentuknya warna yang lebih gelap menandakan terdapatnya enzim ektraseluler kapang.

75

(B)

(A) Foto 5. Hasil Analisis Hidrolisis FDA (Fluorescen Diacetat) Sebelum bereaksi

(A) dan Terjadi reaksi (B). Tanda panah menunjukkan reaksi yang terjadi, ditandai dengan berubahnya warna menjadi warna kuning (B).

(A) (B)

Foto 6. Isolat kapang Penicillium sp. (A) dan Trichoderma sp. (B)