PEMBUATAN PREPARAT DAUN NUSA INDAH

(Mussaenda  frondosa)

Nita Listiyani (3425111402) & Siska Handayani (3425111429)

*Corresponding author: Jurusan Biologi FMIPA Universitas Negeri Jakarta (UNJ). Jl. Pemuda

No. 10 Rawamangun, Jakarta Timur. Indonesia. Tel.: +62 21 4894909

E-mail address: biologi2011@yahoo.com

(Disusun untuk Memenuhi Tugas Mata Kuliah Mikroteknik)

BIOLOGI REGULER 2011

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Mikroteknik merupakan teknik pembuatan sediaan atau preparat secara  mikroskopis,

tentunya pendekatan teoritis tidaklah memadai untuk memahami secara menyeluruh mengenai

mikroteknik, karena lebih menekankan pemahaman pada wilayah aplikatifnya meskipun pada

dasarnya landasan teoritis juga diperlukan dalam rangka memberikan beberapa petunjuk yang

harus dilalui agar proses pembuatan sediaan sesuai dengan prosedural kerja dan alasan

penggunaan ataupun pemilihan bahan yang akan digunakan dalam pembuatan sediaan

mikroskopis. Beberapa metode yang dikenal dalam pembuatan preparat tumbuhan, yaitu

metode Whole mount, sediaan irisan, sediaan uraian, sediaan rentang, sediaan gosok, sediaan

supravital, sediaan remasan, dan metode paraffin.

Pada praktikum kali ini menggunakan daun Mussaenda  frondosa dengan metode

paraffin, yaitu cara pembuatan preparat permanen dengan menggunakan paraffin sebagai

media embedding dengan tebal irisan kurang lebih mencapai 6 µm-8 µm.

Preparat awetan merupakan salah satu alat untuk mempermudah dalam melakukan

pengamatan pada beberapa mata kuliah biologi, salah satunya Anatomi Tumbuhan. Namun,

preparat yang tersedia kurang memadai. Oleh karena itu, pada praktikum mikrotek ini akan

dibuat preparat awetan jaringan tumbuhan untuk mmempermudah mahasiswa mengamati dan

melihat preparat.

B. Perumusan Masalah

Bagaimanakah cara pembuatan preparat daun Mussaenda  frondosa?

C. Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah untuk menyediakan preparat awetan jaringan tumbuhan bagi

keperluan praktikum di Jurusan Biologi.

D. Manfaat Penelitian

1. Menyediakan preparat tumbuhan yang belum ada di laboratorium Jurusan Biologi

Universitas Negeri Jakarta.

2. Menambah pengetahuan tentang pembuatan preparat yang baik dan benar.

3. Menambah pengetahuan tentang anatomi tumbuhan.

BAB II

KERANGKA TEORI DAN PERUMUSAN HIPOTESIS

A. Deskripsi Teoritik

1. Mikroteknik

Mikroteknik atau teknik histologi merupakan ilmu atau seni mempersiapkan

organ, jaringan atau bagian jaringan untuk dapat diamati dan ditelaah. Penelaahan

umumnya dilakukan dengan bantuan mikroskop, karena struktur jaringan secara

terperinci pada galibnya terlalu kecil untuk dapat dilihat dengan mata telanjang. Ruang

lingkup yang mencakup materi mikroteknik dapat diperoleh dari sejumlah definisi dan

peristilahan yang bisa dipakai, hanya saja sebaiknya kita mencamkan dalam pikiran kita

bahwa suatu spesimen mikroteknik dapat merupakan sebagian atau seluruhan dari

struktur yang ditetapkan. Selain dilekapkan dengan kaca preparat, spesimen tadi

umumnya dilindungi dengan kaca penutup, yaitu sepotong kaca yang sangat tipis ataupun

plastik yang tembus pandang yang direkatkan diatas spesimen tersebut (Gunarso, 1989).

Sedangkan menurut Amar (2008), Mikroteknik adalah ilmu yang akan

mempelajari metode/ prosedur pembuatan preparat mikroskopik.

Mikroteknik merupakan teknik pembuatan sediaan atau preparat secara mikroskopis,

tentunya pendekatan teoritis tidaklah memadai untuk memahami secara menyeluruh

mengenai Mikroteknik, sebab yang namanya teknik lebih menekankan pemahaman pada

wilayah aplikatifnya meskipun pada dasarnya landasan teoritis juga diperlukan dalam

rangka memberikan beberapa petunjuk yang harus dilalui agar proses pembuatan sediaan

sesuai dengan prosedural kerja dan alasan penggunaan ataupun pemilihan bahan yang

akan digunakan dalam pembuatan sediaan Mikroskopis (Zaifbio, 2010)

Ada beberapa metode untuk membuat suatu preparat dalam mikroteknik,

diantaranya, yaitu:

a. Metode whole mounth

Menurut (Joyner, 2008 dalam zaifbio 2010) Whole mounth merupakan metode

pembuatan preparat yang nantinya akan diamati dengan mikroskop tanpa

didahului adanya proses pemotongan. Jadi pada metode ini, preparat yang diamati

adalah preparat yang utuh baik itu berupa sel, jaringan, organ maupun individu.

Metode ini mempunyai kelebihan dan kelemahan masing-masing. Kelebihan

metode ini adalah dapat mengamati seluruh bagian tanaman dengan jelas tiap

bagian-bagiannya. Sedangkan kelemahannya adalah metode ini hanya bisa

dilakukan pada tanaman dengan ukuran yang kecil saja tidak bisa tanaman yang

besar sehingga metode ini perlu terus dikembangkan dengan melakukan bebagai

percobaan (Gunarso, 1989).

b. Metoda Sediaan Irisan (Sectioning)

Cara pengerjaan melalui irisan atau sayatan ini dianggap sebagai teknik rutin

ataupun teknik bagi penyiapan spesimen histologi amaupun patologi. Tebal

tipisnya sayatan bergantung pada pengalaman serta tujuan penyiapan spesimen.

Tebal sayatan yang umum berkisar antara 6-15 mikron (1 mikron = 0,001 mm).

Ukura sayatan juga sangat bervariasi, mulai dari saytaan pembuluh darah yang

sangat kecil hingga sayatan otak.

c. Metoda Sediaan Uraian (Teasing Preparations)

Untuk dapat memisahkan komponen suatu jenis jaringan maupun organ tisu atau

jaringan diuraikan dengan menggunakan jarum penguraian. Dengan demikian

pengertian teasng ini berarti juga pembedahan dalam skala kecil. Tingkatnya pada

pembedahan biasa dan pembedahan mikro yang dilakukan dengan menggunakan

jarum pengurai. Teasing ini dilakukan pada jenis sediaan segar yang telah

difiksasi dan mengalami pewarnaan. Secara umum jenis tisu yang bisa ditelaah

melalui metode ulas ini adalah darah, limfa, cairan sum-sum tulang belakang,

semen janan, sediaan air seni, serta beberapa lainnya. (Gunarso, 1989).

d. Metoda Sediaan Rentang

Pada metoda ini preparat belum difiksasi, diperlakukan sedemikian rupa sehingga

disamping jelas juga mendekati keadaan aslinya dengan melalui perentangan.

Jenis bahan siapan yang uum direntang saat difiksasi adalah otot, syaraf, jenis

jaringan tipis (selaput yang membungkus jantung, hati dan lain-lain) (Gunarso,

1989).

e. Metode Sediaan Gosok

Jenis jaringan yang keras sifatnya, seperti tulang, gigi, kuku dan beberapa lainnya

mungkin sekali sangat sukar untuk dibuat sediaan sayatan (kecuali bila

mengalami berbagai perlakuan khusus sebelumnya). Untuk mengatasi hal diatas

tadi, maka umum juga dibuat sediaan dengan metoda gosok. Tulang misalkan

tulang paha, terlebih dahulu dipotong-potong hingga ukuran beberapa mili hingga

1 – 2 cm. Potongan tersebut kemudian digosok pada batu hingga cukup tipis

untuk dapat diamati pada mikroskop (Gunarso, 1989).

f. Metode Sediaan Supravital

Selain jenis-jenis metoda yang dimanfaatkan materi yang mengalami matian dan

fiksasi. Untuk pengamatan sel-sel darah yang masih hidup umumnya digunakan

zat warna vital seperti Yanus green atau Neutral red, karena sel darah mempunyai

kemampuan untuk menghisap zat warna pada konsentrasi yang sesuai. Bila kedua

zat warna tersebut dipakai secara bersama-sama maka memungkinkan kita untuk

mengamati mitokondria. Hanya saja akan terjadi perubahan yang sangat cepat

pada sel, karena sel dapat mati oleh kedua warna tadi secara bersamaan (Gunarso,

1989).

g. Metode Sediaan Remasan (Squash)

Metode remasan banyak dikakukan untuk penyaiapan pengamatan kromosom

baik hewan maupun tumbuhan. Dengan metoda ini bahan diremas atau

dihancurkan sehingga masing-masing sel akan terlepas yang memudahkan

pengamatan selanjutnya. Jadi tujuan peremasan ini bukan berarti menghancurkan

sel-selnya, tapi masing-masing sel bebas terlepas satu sama lain dengan tetap

dipertahankan bentuk aslinya.

h. Metode Paraffin

Metode parafin termasuk metode irisan yang merupakan metode rutin atau

standar. Pengamatan secara mikroskopis dari suatu jaringan normal sifatnya

maupun yang mengidap suatu penyakit (patologis) akan lebih baik hasilnya

dilakukan dari preparat jaringan yang telah dipersiapkan dengan baik, telah

dillakukan penyayatan cukup tipis serta diberi pewarnaan yang sesuai, sehingga

berbagai elemen yang diteliti lebih mudah untuk diamati (Gunarso, 1989).

Adapun tahapan pembuatan preparat metode parafin adalah sebagai berikut :

1. Sampling

Merupakan proses awal dalam metode parafin. Pada sampling ini diambil

beberapa organ sesuai keperluan. Jika organ terlalu besar maka dipotong-

potong terlebih dahulu.

Menurut Eching (2009) Pengambilan jaringan :

a) Harus secepatnya di ambil terutama pada kadafer

b) Pemotongan harus dengan pisau yang tajam

c) Ukuran potongan sebaiknya 1 cm

d) Secepatnya difiksasi

Tujuannya untuk mencegah terjadinya perubahan-perubahan pasca mati dan

perubahan struktur lain yang dapat menyesatkan dalam pengamatan.

2. Fiksasi

Tujuan utama fiksasi adalah memberikan perlakuan tertentu terhadap

elemen-lemen jaringan, terutama inti sel atau nukleinya, sehingga dapat

diwetkan dalam kondisis yang sedikit banyak mendekati keadaan aslinya.

Selain itu, fiksasi juga mencegah terjadinya kerusakan jaringan yang

disebabakan oleh mikroorganisme maupun perusakan oleh enzim yang

terkandung dalam jaringan itu sendiri, yang dikenal dengan autolisis. Dengan

kata lain fiksasi bertujuan :

- Mematikan (menghentikan proses-proses metabolisme) jaringan

dengan cepat sehingga keadaannya sedikit banyak mendekati keadaan

aslinya.

- Mencegah autolysis

- Menaikkan daya pewarnaan karena adanya bahan-bahan keras yang

merupakan komponen cairan fiksatif.

- Mencegah mengkerutnya globula-globula protein sel

- Mempertinggi sifat reaktif gugusan-gugusan karboksilat, amoni

primer,sulfihidril

- Membuat sel-sel lebih kuat/keras

3. Dehidrasi

Dehidrasi adalah proses mengeluarkan air dari dalam jaringan tisu dengan

menggunakan bahan-bahan kimia tertentu. Dehidrasi merupaka langkah

penting yang memerlukan perlakuan yang prosesnya tidak terputus-putus.

Kesalahan yang terjadi akan mengakibatkan terhalangnya proses penamanan

dalam parafin yang merupakan proses lanjutan setelah proses dehidrasi

tersebut.

Sehubungan dengan hal itu maka dehidran yang kita gunakan hedaklah

memenuhi beberapa persyaratan sebagai berikut :

- Harus mampu menarik air dari tisu menggantikan kedudukan air

tersebut

Dehidran itu sendiri dapat digantikan kedudukannya oleh meduium

penjernih

- Tidak merusak danmengganggu tisu yang telah difiksasi sebelumnya

sehingga misalnya tisu akan menjadi terlalu lunakkembali ataupun

malah memperkeras tisu tersebut menjadi rapuh

- Dehidran yang paling umum dalam mikroteknik bagi metode parafin

adalah alkohol. Dalam penggunaannya dipakai serangkaian alkohol

dengan konsentrasi berbeda, dimulai dengan alkohol 35% - 50% - 70%

- 80% - 95% - 100%. Alkohol 70% umum dikenal sebagai Stopping

point dengan pengertian tisu dapat disimpan agak lama (biasanya

dibiarkan bermalam untuk dilanjutkan pada keesokan harinya maupun

hari-hari berikutnya).

4. Penjernihan (Clearing)

Tujuan utama proses penjernihan adalah menggatiakn tempat alkohol

dalam tisu yang telah mengalami proses dehidrasi dengan suatu solven atau

medium penjernih menjelang proses penanaman sebelum dilakukan proses

penyayatan. Setelah kita menggunakan xylol atau benzene pada proses

penjernihan ini, pada umumnya tisu akan menjadi transparan : hal ini yang

menjadi alasan bahwa hal ini dikenal sebagai proses penjernihan. Lama tisu

dalam medium penjernih bergantung pada :

- Ketebalan serta tingkat kepadatan tisu

- Jenis reagen yang dipakai

- Untuk jenis tisu yang melalui proses dehidrasi dengan sempurna, maka

proses penjernihan (xylol, benzene) berlangsung selama setengah

hingga tiga jam. Bila tisu dibiarkan cukup lama dalam medium

penjernih ini, maka besar kemungkinan tisu akan menjadi keras dan

rapuh yang tentu menyukarkan dalam penyayatan.

5. Infiltrasi

Yang dimaksud dengan infiltrasi yaitu usaha menyususpkan media

penanaman kedalam tisu dengan jalan menggantikan kedudukan dehidran dan

bahan penjernih. Media penamanam/embedding yang umum dipakai adalah

parafin. Parafin dibedakan berdasarkan titik didihnya, jadi ada yang bertitik

didih 48°C, 54°C, 56°C dan 58°C. Utuk jenis tisu hewan yang biasanya

digunakan parafin bertitik didih 58°C. Sebelum jaringan masuk kedalam

parafin murni maka tisu terlebih dahulu berada dalam xylol : arafin dengan

perbandingan 1:3, 1:1, 1:3 da selanjutnya masuk kedalam parafin murni.

6. Penanaman (Embedding)

Penanaman merupakan proses memasukkan atau menanam tisu kedalam

blok-blok parafin (cetakan) sehingga memudahkan pada proses penyayatan

dengan bantuan mikrotom. Beberapa teknik percetakan tersebut

menggunakan :

- Cetakan terbuat dari timah atau logam berat lainnya yang berbentuk L

dialas kaca dengan cara ini satu persatu tisu akan dapat dicetak

- Cetakan terbuat dari kertas. Sebaiknya disiapkan dari bahan kertas

karton atau manila

- Cetakan berbentuk bak yang terbuat dari aluminium, dengan cara ini

tisu dapat ditanamkan sekaligus

7. Pemotongan (Section)

Proses penyayatan mencakup berbagai cara akan menghasilkan sayatan

tipis tisu baik yang telah mengalami proses penanaman maupun tidak. Dalam

mikroteknik, cara lazim digunakan adalah penyayatan dengan menggunakan

mikrotom dengan berbagai peralatan pembantu seperti pisau mikrotom, kuas

bulu, spatula, gunting serta pensil penoreh..

Mikrotom merupakan alat khusus yang diracang untuk menyayat material

atau tisu-tisu dengan sayatan-sayatan yang cukup tipis untuk penelaahan

dengan mikroskop. Dalam metode paraffin, umumnya digunakan paraffin

untuk menghasilkan pita paraffin. Untuk memperoleh hasil sayatan yang baik

dibutuhkan beberapa persayaratan sebagai berikut :

- Tisu yang telah dipersiapkan dengan sempurna

- Pisau yang cukup tajam

- Pemilihan jenis mikrotom yang tepat

- Operator yang cukup terampil dan terlatih

8.  Afiksasi (afixing)

Afiksasi atau proses perlekatan adalah proses perlekatan atau penetapan

sayatan tisu yang pada kaca preparat dengan bantuan media prekat tertentu.

Pada proses ini diperlukan berbagai persiapan antara lain :

a. Kaca preparat bersih

b. Media prekat

c. Akuades

d. Meja pemanas/hot plate

e. Peralata berupa pinset, skapel, gunting, kuas dan lain sebagainya.

Dari beberapa jenis formula media prekat yang umum digunakan dalam kerja

rutin adalah media merekat albumin. Mula-mula putih telur dan gliserin dikock

hingga rata, busa yang terjadi dibuang dan bila perlu dilakukan penyaringan,

kemudian dibubuhkan kristal-kristal thymol yang berfungsi sebagai pencegah

berkembangnya jamur dan bakteri serta beberapa tetes akuades sebagai

pengencer.

9. Pewarnaan (staining)

Pewarnaan bertujuan agar dapat mempertajam atau memperjelas berbagai

elemen tisu, terutama sel-selnya, sehingga dapat dibedakan dan ditelaah

dengan mikroskop. Motoda pewarnaan yang sering dilakukan dalam pembuata

preparat metode parafin adalah metoda pewarnaan Hematoxilin-eosin.

Seperti merupakan peraturan, hamatoxillin digunakan terlebih dahulu dan

setelah melalui proses diferensiasi, maka barulah eosin digunakan. Pertukaran

tempat keduanya tampaknya akan menimbulkan kesukaran, karena pewarna

hematoxilin akan mewarnai lebih cepat dari pada pewarna paduannya yang

umumnya berperan sebagai counterstain yang intensitas pewarnaanya dapat

diatur tanpa mempengaruhi pewarnaan hematoxilin. 

10. Mounting

Merupakan proses akhir dari pembuatan preparat metoda parafin. Sebelum

ditutup secara permanen maka sebaiknya jaringan dilihat pada mikroskop

apakah jaringan tersebut sudah dapat diamati dengan baik atau tidak. Pada

mounting tutup dengan canada balsem dan gelas penutup. Hindari terbentuk

gelembung udara kemudian beri label dan diamati kembali diwabah

mikroskop.

2. Tanaman Nusa Indah (Mussaenda  frondosa)

Bunga nusa indah memiliki batang  yang tingginya mencapai sekitar  2-5 meter.

Berbentuk bulat, memiliki percabangan yanga  rapat, permukaan batang yang  kasar,

berwarna coklat. Bunga nusa indah juga mempunyai daun  tunggal, berhadapan,

bertangkai bulat, berbulu, panjang panjangnya sekitar  1-3 cm.  Berwarna

hijau kemerahan,helaian daun bentuk oval atau lonjong, ujung dan pangkal runcing, tepi

rata, pertulangan menyirip, panjang 8-15 cm, lebar 4-8 cm, permukaan berbulu.

Mempunyai susunan bunga majemuk, di ujung cabang atau batang, bentuk malai,

kelopak semu bentuk oval, ukuran seperti daun, dasar mahkota bentuk tabung, ujung

lepas, 4 helai, warna oranye, permukaan berbulu. Mempunyai biji tunggang, berwarna

kuning kecoklatan, dan bijinya berbentuk lanset, kecil, berwarna coklat. Akar dari bunga

nusa indah adalah berakar serabut dan berwarna putih kekuningan. Adapun klasifikasi

dari tumbuhan Mussaenda sebagai berikut:

Kingdom   : Plantea

Divisi         : Spermatophyta

Kelas         : Dicotyledoneae

Ordo          : Rubiales

Family       : Rubiaceae

Genus        : Mussaenda

Spesies      : Mussaenda  frondosa

   Bunga nusa indah (Mussaenda frondosa) dapat dijumpai di halaman muka

rumah yang fungsinya mempercantik tampilan rumah tersebut. Namun, tanaman hias

yang terkadang bisa tumbuh liar di semak dan lereng bukit ini ternyata memiliki khasiat

sebagai obat.  Dapat tumbuh pada daerah  dataran rendah hingga dataran tinggi atau pada

ketinggian 1 meter hingga 1.700 meter di atas permukaan laut. Dapat berbunga pada

musim panas dan pemanenan dapat dilakukan sepanjang tahun.

Nilai komersial dari bunga nusa indah belum dapat diketahui karena bunga nusa

indah dapat dijumpai di halaman rumah sebagai tanaman hias. Karena bunga nusa indah

atau biasa disebut dengan daun putri hanya digunakan sebagai obat tradisional dan belum

ada obat herbalnya, jadi boleh di katakan nilai jualnya belum ada.

BAB III

METODOLOGI

A. Tujuan Operasional Penelitian

1. Mendapatkan potongan daun Mussaenda  frondosa berukuran 0,5 cm.

2. Menanam daun Mussaenda  frondosa pada parafin.

3. Mendapatkan potongan preparat daun Mussaenda  frondosa dengan menggunakan

mikrotom.

4. Mewarnai preparat daun Mussaenda  frondosa dengan safranin dan fastgreen.

5. Mendapatkan hasil pewarnaan yang baik.

B. Metodologi Penelitian

Metode yang digunakan adalah metode deskriptif.

C. Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan pada Oktober hingga Desember 2013 di Laboratorium

Mikroteknik dan Laboratorium Biokimia Jurusan Biologi Universitas Negeri Jakarta pada

hari Senin pukul 15.00 hingga selesai, serta di Laboratorium Histologi Universitas Indonesia.

D. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah silet, penggaris, oven, beaker glass, gelas

ukur, corong, pipet, pinset, botol kaca, penangas, kaki tiga, kertas saring, bunsen, kaset blok,

kertas kalender dan aspirator.

Bahan yang d igunakan da l am p rak t i kum in i ada l ah daun nusa i ndah

( Mussaenda  frondosa ), akuades, larutan fiksasi seperti larutan FAA, alkohol 70%,

alkohol 96%, xilol,  parafin cair, minyak parafin, safranin 1%, larutan A dan

larutan B.

E. Metode Kerja

Metode kerja yang dilakukan dalam pembuatan preparat daun n usa indah

(Mussaenda  frondosa) adalah sebagai berikut:

a. Proses pembuatan alkohol bertingkat (70%, 80%, 90%, dan 100%)

b. Proses pembuatan larutan FAA

Larutan terdiri dari 50 cc ethyl alcohol (96%), 5 cc asam asetat glacial, 10 cc

formaldehid (37-40%), 35 cc akuades

Bahan-bahan yang diperlukan dicampurkan dan dimasukkan ke dalam botol kaca

dan simpan selama satu minggu

c. Proses fiksasi

Siapkan alat dan bahan yang diperlukan

Potong daun nusa indah (Mussaenda  frondosa) menjadi potongan-potongan

kecil (0,5 cm x 0,5 cm) sebanyak 7 potongan

Memasukkan bahan yang sudah dipotong ke dalam botol vial, kemudian diberi

larutan FAA hingga batang terendam dan diamkan selama satu minggu

Melakukan aspirasi menggunakan alat aspirator selama 5 menit atau hingga organ

tenggelam

Mengganti larutan FAA dengan alkohol 70% yang diberi pewarna safranin 1%

sebanyak 5 -7 tetes dan simpan selama 6 hari

Lalu pindahkan ke dalam alkohol 96% selama masing-masing 1 jam berturut-

turut.

d. Proses penjernihan atau dehidrasi

Masukkan potongan daun nusa indah (Mussaenda  frondosa) ke dalam larutan

alcohol 70%, 80%,90% dan 100% secara berturut-turut selama ± 30 menit; lalu

masukkan ke dalam larutan xilol 1 dan xilol 2 selama ± 30 menit; lalu ke dalam

minyak parafin.

e. Proses infiltrasi

Masukkan potongan daun nusa indah (Mussaenda  frondosa) ke dalam parafin

lunak dengan 2 hingga 3 kali pergantian selama 1 jam

f. Proses penanaman (embedding)

Buat tempat penanaman dengan menggunakan kalender yang berbentuk persegi

atau persegi panjang (sesuai dengan ukuran organ tanaman yang digunakan)

Masukkan parafin cair, diamkan sampai parafin tersebut agak membeku

Masukkan bahan ke dalam parafin yang sudah agak membeku. Usahakan bahan

diletakkan di tengah-tengah blok

Diamkan sampai membeku

g. Proses blocking

Pindahkan bahan yang sudah ditanam di blok pada kaset dengan

menempelkannya pada kaset dengan menggunakan parafin

h. Proses pembuatan larutan A dan larutan B

Larutan A terdiri dari gelatin 1 gram, calcium propionate 1 gram, benzalkonium

chloride 1 cc dan air 100 cc.

Larutan B terdiri dari chromealum 1 gram, formalin 40% dan air 90 cc.

Masukkan semua bahan larutan A ke dalam botol kaca, campur menjadi satu.

Demikian juga dengan larutan B.

i. Proses penyayatan

Sayat bahan dengan menggunakan mikrotom (di Universitas Indonesia) dan silet

(Universitas Negeri Jakarta)

Sayatan dengan menggunakan mikrotom, hasil berbentuk pita panjang dan

dimasukkan kedalam waterbath, lalu tempelkan langsung pada gelas objec

Sayatan dengan silet, hasil berupa sayatan. Letakkan sayatan di object glass yang

sudah ditetesi dengan larutan A, kemudian tetesi larutan B di atas sayatan dan

dilakukan di atas pemanas dengan suhu 40ºC.

j. Proses pewarnaan

Preparat dimasukkan ke dalam xilol (xilol 1 dan xilol 2) masing-masing selama 5

menit

Lalu masukkan ke dalam alkohol 100%, alkohol 95%, alkohol 90%, alkohol 80%

dan alkohol 70% masing-masing selama 5 menit

Setelah itu masukkan ke dalam aquades selama 5 menit

Setelah itu masukkan ke dalam haematoxylin sebagai pewarna selama kurang

lebih 2 menit

Kemudian cuci dengan air mengalir selama 5-10 menit

Lalu masukkan ke eosin selama 2 menit.

Lalu masukkan ke dalam alkohol 70%, alkohol 80%, alkohol 90% dan 100%

masing-masing selama 2 menit

Masukkan ke dalam xilol 1 dan 2 masing-masing selama 2 menit

Setelah itu, bahan ditutup dengan menetesi canada balsam di atas preparat, setelah

itu ditutup dengan menggunakan cover glass.

Kemudian lihat preparat dalam mikroskop.

F. Teknik pengumpulan data

Data yang diambil berupa gambar mikroskopis dari preparat daun nusa i ndah

(Mussaenda  frondosa).

G. Teknik analisis data

Teknik analilis berdasarkan anatomi preparat daun nusa i ndah (Mussaenda  frondosa)

yang tampak dalam mikroskop.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Penelitian

Preparat Daun Nusa Indah Perbesaran 40x

(Laboratorium Mikroteknik Universitas Negeri Jakarta)

Preparat Daun Nusa Indah Perbesaran 4x

(Laboratorium Histologi Universitas Indonesia)

Trikoma

Preparat Daun Nusa Indah Perbesaran 10x

(Laboratorium Histologi Universitas Indonesia)

Preparat Daun Nusa Indah Perbesaran 40x

(Laboratorium Histologi Universitas Indonesia)

B. Pembahasan

Praktikum kali ini membuat preparat daun nusa indah (Mussaenda  frondosa) dengan

menggunakan me tode pa ra f i n . D igunakan daun nusa i ndah

(Mussaenda  frondosa) untuk mengamati trikoma pada daun nusa indah (Mussaenda  frondosa).

Tahap awa l yang dilakukan adalah menyediakan bahan-bahan yang akan dibutuhkan selama

pembuatan preparat dan membersihkan alat-alat yang akan digunakan. Hal tersebut dilakukan

untuk mempermudah pekerjaan praktikan serta terhindar dari kontaminasi agar hasil yang

diperoleh maksimal.

Setelah dipotong sepanjang ± 5 cm, jaringan kemudian melalui tahap fiksasi dengan

menggunakan larutan FAA (Formalin, Asam asetat glasial, dan alkohol 96%), tahap ini

bertujuan untuk menjaga atau mengawetkan seluruh stuktur sel sehingga sedapat mungkin

berada dalam keadaan sama atau hampir sama dengan keadaan aslinya pada waktu masih

hidup serta memperlambat atau menghentikan proses metabolism sel pada

jaringan. Larutan FAA yang digunakan bertujuan untuk mempercepat penetrasi alkohol dan

asam asetat ke dalam jaringan agar pematian dan fiksasi  dapat  berjalan dengan

cepat, serta merupakan larutan yang stabil dan pengawet yang baik.

Faktor-faktor yang berperan dalam fiksatif adalah buffer (pH), suhu yang rendah

mencegah autolisis,untuk mendapatkan daya penetrasi yang tinggi digunakan irisan setipis

mungkin, perubahan volume, osmolaliitas pada larutan fiksatif, penambahan deterjen sehingga

fiksatif cepat masuk, konsentrasi, dan waktu fiksatif. (Botanika, 2008).

Setelah difiksasi, jaringan terlebih dahulu dicuci dengan merendamnya ke dalam aquades

selama beberapa detik. Hal ini bertujuan untuk menghilangkan larutan FAA yang ada pada

jaringan. Kemudian, jaringan melalui tahap dehidrasi dengan menggunakan alkohol bertingkat

dengan konsentrasi mulai dari 70%, 80%, 90%, dan 96%. Jaringan direndam ke dalam alkohol

bertingkat dengan waktu masing-masing selama 15 menit. Tujuan dari tahap dehidrasi ialah

agar kandungan air dalam jaringan agar keluar.  Penggunaan dari alkohol bertingkat tersebut agar

jaringan kandungan airnya dapat keluar sedikit demi sedikit hingga pada konsentrasi 96%

pengeluaran airnya pun maksimal, serta mencegah terjadinya lisis pada sel dalam jaringan

tersebut.

Selanjutnya, jaringan direndam ke dalam larutan campuran alkohol 96% : xylol  secara

bertingkat dengan perbandingan 3:1, 1:1, dan 1:3 masing-masing selama 10 menit yang biasa

disebut dengan tahap dealkoholisasi. Tahap ini bertujuan untuk mengeluarkan alkohol yang

terdapat di dalam jaringan yang kemudian digantikan oleh larutan xylol yang mampu berikatan

dengan parafin. Selain itu, tujuan dari perbandingan pada campuran tersebut dimana campuran

alkohol : xylol pertama ialah 3 : 1 agar  sel tidak kaget akan penambahan larutan lain sehingga

mencegah kerusakan pada sel.

Tahap berikutnya ialah penjernihan dimana jaringan direndam ke dalam

larutan xylol murni I dan xylol murni II dengan waktu masing-masing 10 menit. Langkah ini

dilakukan untuk mengeluarkan alkohol yang masih tersisa dalam jaringan sehingga larutan

dalam jaringan hanya larutan xylol saja. Selanjutnya, jaringan direndam ke dalam campuran

larutan xylol : parafin dengan perbandingan  1 : 9.  Hal ini dilakukan untuk menghilangkan xylol

dari jaringan. Selanjutnya jaringan mengalami tahap infiltrasi,dimana jaringan direndam ke

dalam parafin cair murni selama 30 detik yang bertujuan untuk menghilangkan kandungan xylol-

nya secara maksimum serta untuk merekatkan jaringan.

Setelah tahap infiltrasi, dilakukan proses penanaman atau embedding dengan

cara merendam jaringan dalam parafin murni selama 15 menit diudara terbuka dan 15 menit di

dalam oven, kemudian setelah mencair jaringan dimasukkan ke dalam kertas kubus yang

disebut blok dan dituangkan kembali parafin murni kemudian dibiarkan pada suhu kamar agar

parafin membeku selama. Hal ini bertujuan agar jaringan dapat dengan mudah terpotong tanpa

merusak jaringan batang tersebut.

Selanjutnya dibuat kotak keras yang agak tebal dengan ukuran kira-kira 5 X 2,5 X 2 cm-

(panjang X lebar X tinggi), lalu isi dengan paraffin yang sedang mencair dalam blok paraffin

tadi, kemudian sebelum paraffin membeku sepenuhnya, masukkan bahan. Lalu isi lagi dengan

paraffin cair hingga penuh dan menutupi seluruh organ. Biarkan permukaan paraffin membeku,

kemudian tekanlah seluruh kotak kedalam air sampai paraffin membeku, atau dapat juga

dimasukkan kedalam freezer sampai seluruh paraffin sama sekali membeku. Baru setelah itu

paraffin dapat dikeluarkan dari kotaknya.

Embedding merupakan proses pelilinan suatu organ dengan menggunakan kotak kertas.

Proses ini memudahkan dalam membuat irisan yang sangat tipis dengan menggunakan

mikrotom. Beberapa keuntungan menggunakan kotak kertas dalam embedding yaitu bisa

membuat arah sayatan dan menandai suatu jaringan. Jaringan atau sampel akan ditanam di ketas

kotak, dengan terlebih dahulu parafin membeku pada bagian dasar dalam kotak dan setelah

penempelan jaringan dilanjutkan dengan penutupan dengan parafin sampai. Untuk mengiris

preparat, digunakan alat mikrotom biasanya dengan ukuran 10 mikron sampai 14 mikron. Irisan

akan berbentuk seperti pita-pita. Pemindahan irisan menggunakan kuas kecil yang telah dibasahi

ujungnya dengan air (Widjajanto dan Susetyoadi Setjo, 2001).

Proses penyayatan (sectioning) diawali dengan pengirisan blok parafin dengan scalpel,

sehingga permukaan blok parafin yang akan diiris dengan mikrotom berbentuk segi empat. Letak

mata pisau pada mikrotom menentukan hasil yang diperoleh. Hasil sayatan diambil dengan

menggunakan kuas secara hati-hati. Pita hasil sayatan ditempel pada kaca objek lalu diletakkan

di atas meja penangas ( haeting plate). Meyer albumin memiliki kandungan putih telur dan

gliserin dan merupakan pelakat alami yang sangat baik. Dapat juga dengan dimasukkan ke dalam

waterbath agar pita paraffin dapat menempel di kaca objek. Agar spesimen dapat menempel

sempurna pada kaca objek dibutuhkan rentang waktu yang relative cepat antara peletakkan

spesimen pada kaca objek dengan dimasukkan ke waterbath. (Widjajanto dan Susetyoadi Setjo,

2001).

Setelah embedding, dilakukan proses pewarnaan. Zat warna yang digunakan tidak hanya

satu macam karena tidak semua sel dapat menyerap satu macam zat warna. Pada saat pewarnaan

preparat akar inisel dalam jaringan tidak terwarnai. Hal ini dapat disebabkan oleh waktu yang

digunakan untuk pemberian warnanya terlalu singkat sehingga zat warna belum terserap

sempurna oleh jaringan. Pewarna yang diberikan pada irisan dalam jangka waktu tertentu,

kurang atau lebih waktu yang digunakan menyebabkan warna preparat menjadi kurang atau

terlalu gelap. Sedangkan hasil preparat yang tidak utuh dapat disebabkan oleh suhu sekitar

ruangan yang kurang mendukung saat dilakukan pengirisan selain itu masih tersisanya air atau

alkohol dalam jaringan juga dapat menyulitkan dalam pengirisan (Widjajanto dan Susetyoadi

Setjo, 2001).

Untuk mewarnai bahan yang telah ditempel tersebut adalah dengan cara merendamkan

kaca obyek tersebut kedalam bejana pewaarna (bejana coplin), biasanya dibutuhkan bejana

coplin tersebut kira-kira 12 buah, tergantung dengan pewarna yang kita pakai. Masing-masing

bejana diberi label dengan nama zat yang berada didalamnya, demikian pula dengan tutupnya.

Selanjutnya diamati dibawah mikroskop apakah trikoma pada daun nusa indah

(Mussaenda  frondosa) terlihat atau tidak.

Karakteristik tumbuhan yang akan diambil spesimennya juga menentukan waktu pada

tahap-tahap pemrosesan. Misalnya waktu yang berlebih pada suatu tahap pengecatan akan

mengakibatkan suatu warna menjadi terlalu gelap dan mungkin warna lainnya menjadi kurang

atau bahkan hilang. Keberhasilan pembuatan preparat permanen ini tergantung pada lima tahap

yang utama yaitu fiksasi, dehidrasi, penjernihan, perembesan dan pengeblokan parafin serta

pewarnaan. Larutan fiksatif yang dipilih, perembesan parafin yang bagus dan zat warna yang

akan digunakan menentukan keberhasilan preparat irisan (Setjo, 2004).

Selain itu, dilakukan pula pembuatan preparat di Laboratorium Histologi Universitas

Indonesia untuk membandingkan hasil preparat dengan yang sudah dibuat di Laboratorium

Mikroteknik Universitas Negeri Jakarta. Hasil yang diperoleh ternyata signifikan. Pada hasil

yang dilakukan di Laboratorium Mikroteknik Universitas Negeri Jakarta, saat diamati di bawah

mikroskop, hasilnya tidak terlalu jelas. Sedangkan hasil yang lain terlihat jelas sekali.

Berdasarkan analisis yang telah kami lakukan, hal ini disebabkan diantaranya karena:

a. Larutan yang digunakan di Laboratorium Histologi Universitas Indonesia masih baru

sehingga hasil yang diperoleh lebih bagus. Sedangkan larutan yang digunakan di

Laboratorium Mikroteknik Universitas Negeri Jakarta mungkin saja sudah terlalu

lama, atau mungkin sudah melewati batas pemakaian.

b. Paraffin yang digunakan mungkin saja bukan paraffin yang baru. Karena pada saat

dibandingkan blok paraffinnya saja sudah berbeda.

c. Alat yang tersedia terbatas sehingga praktikan tidak bisa melakukan praktikum

dengan maksimal

BAB V

PENUTUP

A. Kesimpulan

Pembuatan preparat awetan dengan metode parafin dimulai dengan proses fiksasi,

penjernihan, infiltrasi, penanaman, penyayatan dan pewarnaan. Pada preparat daun nusa

indah (Mussaenda  frondosa) t e r l i ha t adanya t r i koma . Preparat awetan jaringan

tumbuhan adalah salah satu media pembelajaran Biologi yang sangat efektif, khususnya pada

praktikum Anatomi Tumbuhan, dalam hal ini untuk melihat bagian trikoma pada daun.

Pembuatan preparat merupakan upaya untuk mempermudah pengamatan suatu bahan. 

B. Saran

Pada saat melakukan proses pemotongan preparat di mikrotom diharapkan ketebalannya

sesuai agar tidak terlalu tebal ataupun terlalu tipis. Saat melakukan pewarnaan, dilakukan

sesuai dengan prosedur dan waktu yang sudah ditetapkan karena akan berpengaruh terhadap

hasil akhir. Dibutuhkan sifat berhati-hati, sabar dan teliti dalam semua rangkaian prosedur

pembuatan preparat.

DAFTAR PUSTAKA

Amar. 2008. Materi Mikroteknik. http://amar1286.multiply.com/journal/item/10 (di akses pada

tanggal 17 Desember 2013 pukul 01.31)

Botanika, 2008, Fixation, Embedding, Sectioning, http://botanika.biologija.org, Diakses pada

tanggal 19 Desember 2013 pukul 21.04.

Gunarso, Wisnu. 1989. Bahan Pengajaran Mikroteknik. Bogor : DEPDIKBUD Institiut

Pertanian Bogor.

Imron, Tamyis, A., 2008. Pembuatan Preparat Jaringan Tumbuhan dengan Metode Parafin.

Lap.prak mikroteknik Universitas Brawijaya. http://cyber-biology.blogspot.com. Diakses

pada tanggal 19 Desember 2013 pukul 20.40.. 

Widjajanto dan Susetyoadi Setjo. 2001. Mikroteknik Tumbuhan. Malang : Universitas Negeri

Malang.

Zaifbio. 2010. Preparat Wholemount Kutu Daun Bunga (Triboliun Confusum).

http://zaifbio.wordpress.com/category/mikroteknik/ (di akses pada tanggal 17 Desember 2013

pukul 12.45).

LAMPIRAN GAMBAR

Organ di dehidrasi di alkohol

Pencairan Paraffin Proses Aspirasi

Organ yang sudah ditanam Blok paraffin yang sudah membeku

Beberapa tahap Pewarnaan

Keseluruhan Teknik Pewarnaan

Organ yang sudah diwarnai