ppt jurnal fix.pptx

Upload: amelia-gustin

Post on 08-Jan-2016

243 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

PowerPoint Presentation

Metode dan Bahan PenelitianMaterial

Pembentukan Plasmid phCMV1-MOMP untuk Vaksin DNA

Keterangan :Primer yang digunakan untuk amplifikasi PCR adalah phCMV1 MOMP BamH I Dir (untuk forward) dan phCMV1 MOMP Not I Rev (untuk reverse) dengan urutan masing-masing: 5'GGATCCACCATGGCTTCCTCCTTGCATGCTCTGCCTG3 ', dan 5'CCACCGCGGCCGCTCATTAAGTAAGTCGACGGAACTGAGCA3'. lanjutanPurifikasi Kitosan

Persiapan DMOMP di Nanopartikel Kitosan

lanjutanEfisiensi Enkapsulasi dan Analisis Pelepasan secara In Vitro

Efisiensi enkapsulasi DMCNP ditentukan oleh gradien ultrasentrifugasi sukrosa sebagai gambaran menggunakan rumus: Enkapsulasi Efisiensi = A - B / A 100 dimana (A) adalah total jumlah DNA dimuat dan, (B) adalah DNA bebas. Analisis pelepasan DMOMP dari DMCNP dievaluasi menggunakan cairan usus yang serupa (pH 7,0) dan cairan pencernaan yang serupa (pH 2.0). Sampel diinkubasi di PBS (pH 7,4) dan diinkubasi pada 37C. Sampel dikumpulkan di beberapa interval waktu (hari 0,08, 1, 2, 4, 5, dan 7) dan pelepasan sampel DNA diukur menggunakan NanoDrop ND1000 pada 260 nm. Pelepasan produk dari setiap waktu dipercepat dengan 5 M NaCl dan diperkuat dengan PCR dan diamplifikasi pada elektroforesis gel agarosa untuk verifikasi produk DMOMP tertentu.Produk yang dihasilkan dikonfirmasi sebagai DMOMP yang mengacu pada klon positif DMOMP dengan ukuran 1154 pasang basa (bp).Priteksi Assessment DMCNP

Integritas proteksi DMOMP enkapsulasi nanopartikel kitosan divalidasi dengan metode sebelumnya dengan beberapa modifikasi. DMCNP dan DMOMP (1 mg/mL) diperlakukan dengan enzim pencernaan Nde I dan Sal I kombinasi dengan atau tanda kitosanase selama 2 jam pada suhu 37C.Untuk analisis DNAase 1, suspensi DMOMP atau DMCNP diinkubasi di DNAase 1 selama 15 menit pada 37 C dan reaksi dihentikan dengan penambahan asam iodoacetic (DNAase 1 inhibitor). Semua sampel dianalisis pada gel agarosa 0,8% untuk ada atau tidaknya DNA atau nanopartikel. Kemiripan pita divisualisasikan dengan alat dokumentasi gel Chemilmager.Uji Stabilitas

Penentuan Zeta Potensial Karaterisasi Morfologi dan Ukuran

Analisis morfologi dan perkiraan ukuran nanopartikel menggunakan mikroskop elektron transmisi (TEM) dan pemindaian mikroskop elektron (SEM). Sampel TEM dipreparasi dan divisualisasikan, begitu juga dengan sampel SEM divisualisasi dengan single drop yang ditempatkan pada slide kaca yang dipasang pada potongan SEM.Analisis FTIR dan Visualisasi UV

FTIR merekam DMCNP dan CNP nanopartikel dalam mode attenuated total reflektansi (ATR) menggunakan spektrofotometer IR. Spektrum diperoleh dengan 64 scan/sampel mulai 4000-400cm-1 dan resolusi 4 cm-1 dan ruang sampel itu dibersihkan dengan gas N2. UV-Vis dilakukan untuk memastikan enkapsulasi DMOMP dalam kitosan. Nanopartikel diencerkan dengan air deionisasi dan absorbansi dan panjang gelombang spektral digunakan untuk menentukan apakah penyerapan terjadi di luar nanopartikel.Uji SitotoksisitasSitotoksisitas dari DMOMP dan DMCNP untuk sel Cos-7 diukur menggunakan 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl ) -2,5-difenil tetrazolium bromide (MTT) dan Sel-Sel Titer 96 Proliferasi Assay kit.Prosedur kerja:persen viabilitas = [A] tes / [A] kontrol 100 [A] tes adalah absorbansi dari sampel uji dan [A] kontrol absorbansi dari sampel kontrol.Analisis Transfeksi dan Western blot

Cos-7 sel (1106 sel/well) ditranfeksi oleh elektroporasi dengan DMOMP dan DMCNP pada konsentrasi 2, 5, dan 10 mg menggunakan Amaxa Sel Nucleofector kit-RSel transfeksi diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37 C dengan 5% CO2, setelah itu dicuci dalam PBS dan 10% asam trikloroasetat, diikuti dengan pencucian beruntun dengan 70%, 90%, dan 100% etanol dengan terakhir dicuci dalam 1tris buffer saline (lar. Garam) dan tween 20.Sel dihambat selama 30 menit dalam blocking buffer (3% dry milk dalam 1tris buffer salin), dicuci dengan PBS dan kemudian diinkubasi selama 1 jam dengan sel kambing anti-C. trachomatis antibodi poliklonal diikuti oleh FITC sekunder anti IgG kelinci (H+L)Untuk beberapa eksperimen sel diwarnai dengan DAPI dikombinasikan dengan anti-fade (Invitrogen) larutan mounting.Imunofluoresensi sel divisualisasikan menggunakan mikroskop Nikon Eclipse Ti-USelain transfeksi dari Cos-7 sel melalui elektroporasi, sel juga ditransfeksi kimia menggunakan Lipofectamine reagen 2000 (Invitrogen). Prosedur kerja:

Cos-7 sel ditanam dalam 6-well plate (4105 sel/well) selama 24 jam setelah ditransfeksi dengan DMCNP atau vector phCMV 1 pada media transfeksi Opti-MEM dan diinkubasi pada 37 C selama 48 jam.Sel lisat dikumpulkan menggunakan M-Per reagen ekstraksi protein mamalialisat yang dihasilkan dijalankan pada gel SDS-PAGE dipindahkan ke membran PVDF dan diperiksa menggunakan anti-MOMP antibodi poliklonal, diikuti oleh Alexa fluor 680 antibodi sekunderAntibodi tetap diamati menggunakan aparat Odyssey LI-COR.Hewan Uji

Penelitian ini menggunakan tikus betina umur 6-8 minggu. Mencit ditempatkan dalam kondisi standar lingkungan bebas patogen pada suhu sekitar 25C, dan disediakan makanan steril dan air ad libitum. Tikus (6 per kelompok) disuntik intramuskular dengan DMCNP (80 mg / 200 uL PBS) atau dengan 200 uL PBS. Tikus (2 per kelompok) pada hari ke-8 diambil dan disimpan otot paha dan limpanya di RNAlater pada -80 C sampai dianalisis.Isolasi RNA dari Jaringan Tikus

Sampel RNA diekstraksi dari otot paha dan limpa tikus menggunakan Qiagen kit ekstraksi gel yang terdiri dari enzim pencernaan DNAase-I. Kuantifikasi RNA dibuat menggunakan NanoDrop ND-1000 pada spektrofotometer pada absorbansi 260 nm. DNA komplementer (cDNA) dihasilkan dari kualitas RNA menggunakan kit superscript II reverse transcriptase (Life Technologies). RT-PCR amplifikasi transkrip gen MOMP dilakukan dengan menggunakan cDNA sebagai template, dan primer yang sama seperti yang digunakan untuk kloning.HASILPurifikasi dan Ekspresi DMOMPProtein membran luar utama C. trachomatis diisolasi, diamplifikasi dengan PCR, dan dikloning ke dalam vektor phCMV1 menghasilkan struktur vaksin, DMOMP. Klon DNA dimurnikan untuk dianalisis oleh enzim pencernaan restriksi pada elektroforesis gel agarosa.Verifikasi klon positif juga dikonfirmasi oleh sekuensing DNA (Auburn University Genomics dan laboratorium Sequencing, Auburn, AL, USA).