plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - core.ac.uk · v halaman persembahan sesungguhnya sesudah...

UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOLIK

DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav)

TERHADAP KULTUR SEL SiHa

SKRIPSI

Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh :

Nur’aniyah

NIM : 048114040

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

2008

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii

UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOLIK

DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav)

TERHADAP KULTUR SEL SiHa

SKRIPSI

Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh :

Nur’aniyah

NIM : 048114040

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

2008


iii


iv


v

HALAMAN PERSEMBAHAN

Sesungguhnya sesudah kesulitan itu ada kemudahan

(Surat Al Insyirah : 5)

Anggaplah setiap step dalam hidup ini adalah proses untuk mencapai

suatu kebahagiaan

Barang siapa berbuat kebaikan seberat benda yang terkecilpun,

maka ia akan melihatnya dan barang siapa berbuat keburukan

seberat benda yang terkecilpun, maka ia akan melihatnya

(Surat Al Zalzalah : 7 & 8)

Dan sesungguhnya akhir itu adalah lebih baik bagimu

daripada permulaan (surat Ad Duha : 4)

Kupersembahkan karya ini untuk :

Tuhanku Allah SWT ( 4JJI )

Mama, Mimi, Teteh Romi, Teteh Tika tercinta

atas kasih sayang, do’a dan dukungannya

Orang-orang yang menyayangiku

Teman-teman dan Almamaterku


LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma :

Nama : Nur’aniyah Nomor Mahasiswa : 048114040

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Uni-

versitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :

“Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz &

Pav) Terhadap Kultur Sel SiHa” beserta perangkat yang diperlukan (bila ada).

Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma

hak untuk menyimpan, me-ngalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam

bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di

Internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari

saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama

saya sebagai penulis.

Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya. Yogyakarta, 19 Juli 2008 Yang menyatakan

(Nur’aniyah)


vi

PRAKATA

Atas berkat rakhmat Allah SWT dan karunia – Nya skripsi yang berjudul

”Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav)

terhadap Kultur Sel SiHa” ini dapat diselesaikan.

Selesainya skripsi ini tidak lepas dari bantuan banyak pihak untuk itu

penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada :

1. Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi, Universitas Sanata

Dharma, Yogyakarta.

2. Drs. A. Yuswanto S.U., Ph.D., Apt., selaku dosen pembimbing yang telah banyak

meluangkan waktu, tenaga, dan atas segala masukan serta sarannya dalam

penyusunan skripsi ini.

3. Yohanes Dwiatmaka, M. Si., selaku dosen penguji yang telah berkenan menguji

dan atas segala arahan, saran, kritik, dan waktunya.

4. Drs. Mulyono, Apt., selaku dosen penguji yang telah berkenan menguji dan atas

segala arahan, saran, kritik, dan waktunya.

5. Drs. P. Sunu Hardiyanta, S. J., M. Sc., yang telah memberikan bimbingan dalam

pengolahan data statistik dan memberikan banyak masukan dan saran.

6. Mbak Yuli dan segenap teknisi Laboratorium Ilmu Hayati Universitas Gadjah

Mada yang telah membantu jalannya penelitian sehingga dapat terselesaikan

dengan baik.

7. Mama, mimi, teteh romi & mas wendy, teteh tika & mas arief, atas kasih sayang,

dorongan motivasi, do’a dan dukungannya selama ini.


vii

8. Mas Ardiansyah yang senantiasa memberi dorongan motivasi, do’a, serta berbagi

suka dan duka.

9. Rissa, Tika, Nophie, Rinta, Rina, Made ayu, Wida, Anna, Atin, Amanda, dan

Novi buat persahabatan yang indah. Aku tak merasa sendiri karena kalian semua.

10. Ririt, Sisca, Meri, Eva, atas canda tawa, keluh kesah, kebersamaan dan

kerjasamanya selama penelitian.

11. Teman-teman kosku : Fitri, Nancy, Agnes, Nita, Presty, dan teman-teman kelas

FKK 2004 buat kebersamaan yang indah selama ini.

12. Semua pihak yang telah banyak membantu penyusunan skripsi ini.

Atas segala bantuan yang telah diberikan selama ini, penulis mengucapkan

banyak terima kasih. Penulis juga menyadari sepenuhnya penulisan skripsi ini tidak

terlepas dari keterbatasan dan kekurangan penulis. Oleh karena itu, diharapkan kritik

dan saran yang membangun demi penyempurnaan skripsi ini. Besar harapan penulis

bahwa skripsi ini dapat bermanfaat dan dapat mendorong mahasiswa untuk berkarya

lebih baik bagi perkembangan ilmu pengetahuan dan kemajuan dunia farmasi di

Indonesia.

Penulis


viii


ix

INTISARI

Penyakit kanker merupakan salah satu penyakit yang ditakuti karena banyak mengakibatkan kematian di seluruh dunia. Banyak studi telah dikembangkan untuk memperoleh senyawa antikanker dari bahan alam, salah satunya yaitu daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav). Tujuan dari penelitian ini yaitu untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun sirih merah memiliki efek sitotoksik terhadap sel SiHa.

Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola satu arah. Uji sitotoksisitas dilakukan dengan memberi perlakuan terhadap sel SiHa dengan ekstrak etanolik daun sirih merah dengan kadar tertentu. Metode uji sitotoksisitas yang digunakan adalah metode direct counting (perhitungan langsung). Data yang diperoleh berupa persen kematian sel dan harga LC50 yang kemudian diolah dengan analisis probit dan anova satu arah.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanolik daun sirih merah bersifat sitotoksik terhadap sel SiHa. Harga LC50 yang diperoleh dari ekstrak etanolik daun sirih merah adalah 200,6 µg/ml. Dengan demikian, dapat disimpulkan bahwa ekstrak etanolik daun sirih merah diperkirakan mengandung senyawa yang memiliki aktivitas antikanker.

Kata kunci: daun sirih merah, kanker, sel SiHa, sitotoksisitas, LC50


x

ABSTRACT

Cancer is one of the most frightened disease because it causes death in all of the world. A lot of studies have been done to gain a new anticancer compound, one of them is the leaves of celebes pepper (Piper crocatum Ruiz & Pav). The objective of the research is to find out whether the ethanolic extract of celebes pepper leaves have cytotoxic against SiHa cells.

This research is pure experimental with complete random and one way design. The cytotoxic test was obtained by applying a series concretation of ethanolic extract of celebes pepper leaves to SiHa cells. The cytotoxicity effect was determined using direct counting. The data were collected by counting the percentage of death cells and the LC50 value were analyzed using probit statistic analysis and one way Anova.

The result indicated that the ethanolic extract of celebes pepper leaves had cytotoxic effect to SiHa cells. The LC50 value obtained from the ethanolic extract of celebes pepper leaves is 200,6 µg/ml. Therefore, the ethanolic extract of celebes pepper leaves might contains of compound that has anticancer activity.

Keyword: celebes pepper leaves, cancer, SiHa cell, citotoxicity, LC50 value.


xi

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL .................................................................................. .. ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING............................................ iii

HALAMAN PENGESAHAN ....................................................................... iv

HALAMAN PERSEMBAHAN .................................................................... v

PRAKATA..................................................................................................... vi

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ........................................................ viii

INTISARI....................................................................................................... ix

ABSTRACT..................................................................................................... x

DAFTAR ISI.................................................................................................. xi

DAFTAR TABEL.......................................................................................... xv

DAFTAR GAMBAR ..................................................................................... xvi

DAFTAR LAMPIRAN.................................................................................. xvii

BAB I PENGANTAR................................................................................... 1

A. Latar Belakang ...................................................................................... 1

1. Permasalahan ............................................................................... 3

2. Keaslian penelitian....................................................................... 4

3. Manfaat penelitian........................................................................ 4

B. Tujuan ................................................................................................... 4

1. Tujuan umum…… ....................................................................... 4

2. Tujuan khusus…………………………………………………. 4


xii

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ........................................................... 5

A. Tanaman Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) ............................... 5

1. Keterangan botani ........................................................................ 5

2. Sinonim ........................................................................................ 5

3. Nama daerah ................................................................................ 5

4. Deskripsi ...................................................................................... 5

5. Kandungan kimia ......................................................................... 6

6. Khasiat dan penggunaan .............................................................. 7

7. Penelitian mengenai tanaman sirih merah ................................... 8

B. Metode Penyarian..................................................................................... 9

1. Definisi ekstrak ............................................................................ 9

2. Cairan pelarut ............................................................................... 10

3. Maserasi ....................................................................................... 10

C. Kanker…………….................................................................................. 11

D. Sel SiHa………........................................................................................ 13

E. Uji Sitotoksisitas ...................................................................................... 14

1. Metode MTT................................................................................ 15

2. Metode direct counting ................................................................ 16

F. Landasan Teori......................................................................................... 17

G. Hipotesis ................................................................................................... 17

BAB III METODOLOGI PENELITIAN .................................................... 18

A. Jenis dan Rancangan Penelitian............................................................... 18


xiii

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional.......................................... 18

1. Variabel bebas.............................................................................. 18

2. Variabel tergantung...................................................................... 18

3. Variabel pengacau terkendali....................................................... 18

4. Definisi operasional ..................................................................... 19

C. Alat dan Bahan......................................................................................... 19

1. Alat ............................................................................................. 19

2. Bahan ........................................................................................... 20

D. Tata Cara Penelitian................................................................................. 20

1. Determinasi tanaman.................................................................... 20

2. Pengumpulan daun sirih merah.................................................... 21

3. Pembuatan ekstrak etanolik daun sirih merah ............................. 21

4. Sterilisasi alat dan bahan.............................................................. 22

5. Pembuatan medium pencuci dan medium penumbuh ................. 22

6. Preparasi sel SiHa ........................................................................ 23

7. Pembuatan larutan uji................................................................... 24

8. Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah .................... 24

E. Analisis Hasil............................................................................................ 25

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................... 27

A. Determinasi Tanaman.............................................................................. 27

B. Pengumpulan Daun Sirih Merah.............................................................. 27

C. Pembuatan Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah...................................... 28


xiv

D. Sterilisasi Alat dan Bahan........................................................................ 29

E. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Pada Sel SiHa................. 30

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ....................................................... 42

A. Kesimpulan .............................................................................................. 42

B. Saran......................................................................................................... 42

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................... 43

LAMPIRAN................................................................................................... 47

BIOGRAFI PENULIS ................................................................................... 68


xv

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Nilai absorbansi ekstrak etanolik daun sirih merah

dengan metode MTT......................................................... 33

Tabel II. Potensi ketoksikan ekstrak etanolik daun sirih merah

terhadap kultur sel SiHa.................................................... 35

Tabel III. Jumlah sel SiHa yang hidup dari tiap sumuran hasil

perhitungan langsung (Direct Counting) pada

Haemocytometer............................................................... 48

Tabel IV. Hasil perhitungan jumlah sel SiHa yang hidup dari

masing-masing sumuran.................................................... 48

Tabel V. Persentase kematian sel SiHa.............................................. 49

Tabel VI. Nilai r (koefisien korelasi) pada level

signifikansi 5% dan 1% ..................................................... 59


xvi

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Reaksi pembentukan kristal formazan........................................ 31

Gambar 2. Foto kristal formazan di bawah mikroskop................................. 31

Gambar 3. Grafik hubungan kadar ekstrak etanolik daun sirih merah

terhadap persen kematian sel SiHa penetapan I.......................... 35

Gambar 4. Grafik hubungan log kadar ekstrak etanolik daun sirih merah

vs angka probit penetapan I ........................................................ 37


vs angka probit penetapan II ....................................................... 37


vs angka probit penetapan III.................................................... 38

Gambar 7. Foto penampakan morfologi sel SiHa dalam sumuran

pada jam ke-24.............................................................................. 40

Gambar 8. Foto tanaman sirih merah............................................................. 47


vs angka probit pada sel SiHa....................................................... 62

Gambar 10. Foto alat dan bahan...................................................................... 66


xvii

DAFTAR LAMPIRAN Halaman

Lampiran 1. Foto tanaman sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav)...... 47

Lampiran 2. Data uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah

(Piper crocatum Ruiz & Pav) terhadap kultur sel SiHa....... 48

Lampiran 3. Uji distribusi data dengan Kolmogorov-Smirnov

pada sel SiHa dan Analisis Hasil dengan One Way

Anova.................................................................................... 50

Lampiran 4. Cara perhitungan jumlah sel SiHa yang hidup dalam tiap

sumuran hasil perhitungan langsung (direct

counting)............................................................................... 51

Lampiran 5. Cara perhitungan persentase kematian sel SiHa………...…. 54

Lampiran 6. Cara perhitungan harga LC50…………………………...…. 56

Lampiran 7. Perhitungan nilai korelasi LC50 ekstrak etanolik

daun sirih merah terhadap sel SiHa

pada taraf kepercayaan 95%………………………...…....... 59

Lampiran 8. Grafik hubungan antara log kadar dengan angka

probit……...........................................………………….…. 51

Lampiran 9. Harga probit sesuai dengan persentasenya......………….… 63

Lampiran 10. Foto alat dan bahan yang digunakan.....……………….… 64

Lampiran 11. Identifikasi tanaman………………………...…................ 67


1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Kanker termasuk penyakit yang sangat ditakuti karena penyakit ini sulit

disembuhkan, bahkan bisa menyebabkan kematian. Kanker merupakan penyakit yang

disebabkan karena adanya sel abnormal. Hingga kini penyebab pertumbuhan sel

tubuh yang abnormal tersebut belum dapat diketahui secara pasti.

Penderita kanker semakin meningkat setiap tahunnya. Di negara yang telah

maju yang telah berhasil membasmi penyakit infeksi, kanker merupakan penyebab

kematian kedua setelah penyakit kardiovaskular. Di Amerika Serikat kanker

merupakan penyebab utama kematian pada wanita antara 30-54 tahun dan anak-anak

antara 3-14 tahun (Ganiswara dan Nafrialdi, 1995). Di Indonesia setiap tahunnya

terdapat 100 penderita kanker baru dari setiap 100.000 penduduk (Anonim, 2007a).

Saat ini kanker cervix menjadi kanker pembunuh nomor satu di Indonesia. Jumlah

penderita kanker cervix adalah 90 hingga 100 per 100.000 penduduk, atau sekitar

230.137 orang yang 63% diantaranya sudah berada di stadium 3-4 dan 50%

diantaranya meninggal (Angel, 2008).

Antikanker diharapkan memiliki toksisitas selektif artinya menghancurkan

sel kanker tanpa merusak sel jaringan normal. Pada umumnya antineoplastik

menekan pertumbuhan atau proliferasi sel dan menimbulkan toksisitas, karena

menghambat jumlah pembelahan sel normal yang proliferasinya cepat misalnya

sumsum tulang, epitel germinativum, mukosa saluran cerna, folikel rambut dan


2

jaringan limfosit. Terapi hanya dapat dikatakan berhasil baik, bila dosis yang

digunakan dapat mematikan sel tumor yang ganas dan tidak terlalu mengganggu sel

normal yang berproliferasi (Ganiswara dan Nafrialdi, 1995).

Karena itu sangat diharapkan suatu antikanker yang memiliki toksisitas

selektif menghancurkan sel kanker tanpa merusak sel normal. Untuk mencari

pengobatan kanker yang selektivitas aksinya ini, maka dilakukan berbagai penelitian

yang terus dikembangkan sampai ke tingkat molekuler. Pada tingkat molekuler

kelainan atau kerusakan sel yang mengubah sel normal menjadi sel kanker yang

ganas terlihat jelas (Sofyan, 2000).

Kesadaran akan bahaya bahan-bahan kimiawi hasil sintesis yang terkandung

dalam obat-obatan modern menyebabkan obat-obatan tradisional yang diwariskan

secara turun-temurun menjadi lebih penting dan bernilai. Bahan-bahan untuk itupun

telah disediakan secara melimpah oleh alam Indonesia (Soedibyo, 1998). Merebaknya

kecenderungan atau tren hidup kembali ke alam (back to nature) semakin menambah

keingintahuan masyarakat tentang khasiat tanaman obat.

Salah satu tanaman yang dipercaya masyarakat dapat menyembuhkan

kanker adalah tanaman sirih merah. Secara empiris ekstrak daun sirih merah dalam

pemakaian secara tunggal atau diformulasikan dengan tanaman obat lainnya mampu

membasmi aneka penyakit seperti diabetes mellitus, peradangan akut pada organ

tubuh tertentu, luka yang sulit sembuh, kanker payudara dan kanker rahim, leukemia,

TBC, radang pada lever, lemah sahwat, ambeien, jantung koroner, darah tinggi dan

asam urat (Sudewo, 2005).


3

Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai efek

sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap sel kanker untuk mengetahui

apakah ekstrak etanolik daun sirih merah mempunyai aktivitas terhadap sel kanker.

Jenis sel kanker yang berbeda dapat mempunyai sensitivitas dan selektivitas yang

berbeda pula terhadap obat-obat antikanker, oleh sebab itu perlu dilakukan penelitian

uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap berbagai sel kanker. Pada

penelitian ini dilakukan uji efek sitotoksik terhadap kultur sel SiHa.

Penelitian uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur

sel SiHa ini penting untuk mendapatkan informasi ilmiah tambahan tentang efek

sitotoksik ekstrak daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa yang bisa mendukung

pencarian obat antikanker dari bahan alam dan dapat digunakan sebagai dasar untuk

mengembangkan suatu senyawa antikanker.

1. Permasalahan

Berdasarkan latar belakang yang ada maka dirumuskan permasalahan

sebagai berikut :

a. apakah ekstrak etanolik daun sirih merah mempunyai efek sitotoksik terhadap

kultur sel SiHa?

b. seberapa besar harga LC50 dari ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur

sel SiHa?


4

2. Keaslian penelitian

Sejauh pengetahuan penulis, belum pernah dilakukan penelitian mengenai

uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa.

3. Manfaat penelitian

a. Manfaat teoritis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan informasi ilmiah

dan memperkaya teori yang telah ada mengenai khasiat, kegunaan, dan efek

sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa.

b. Manfaaat praktis

Hasil penelitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai pembuktian secara

ilmiah penggunaan ekstrak etanolik daun sirih merah sebagai obat antikanker dari

bahan alam.

B. Tujuan Penelitian

1. Tujuan umum

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun sirih

merah memiliki efek sitotoksik.

2. Tujuan khusus

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui seberapa besar harga LC50 dari

ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa.


5

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Tanaman Sirih Merah

1. Keterangan botani

Famili : Piperaceae

Genus : Piper

Spesies : Piper crocatum Ruiz & Pav.

(Anonim, 2007b)

2. Sinonim

Piper ornatum N. E. Br.

3. Nama daerah

Sirih merah

4. Deskripsi

Tanaman sirih merah tumbuh menjalar. Batangnya bulat berwarna hijau

keunguan dan tidak berbunga. Daunnya bertangkai membentuk jantung dengan

bagian atas meruncing, bertepi rata, dan permukaannya mengkilap dan tidak berbulu.

Panjang daunnya bisa mencapai 15-20 cm. Warna daun bagian atas hijau bercorak

putih keabu-abuan bagian bawah daun berwarna merah hati cerah. Daunnya

berlendir, berasa sangat pahit, dan beraroma wangi khas sirih. Batangnya beruas

dengan jarak buku 5-10 cm. Di setiap buku tumbuh bakal akar.

Sirih merah bisa tumbuh dengan baik di tempat yang teduh dan tidak terlalu

banyak terkena sinar matahari. Jika terkena sinar matahari langsung pada siang hari


6

secara terus-menerus warna merah daunnya bisa menjadi pudar, buram dan kurang

menarik (Sudewo, 2005).

5. Kandungan Kimia

Berdasarkan penelitian yang dilakukan menunjukkan bahwa sirih merah

mengandung flavonoid, alkaloid, senyawa polifenolat, tanin dan minyak atsiri

(Sudewo, 2005).

Flavonoid

Flavonoid merupakan golongan terbesar dari senyawa fenol yang umumnya

ada dalam bentuk terikat pada gula sebagai glikosida dan aglikon. Yang terdapat pada

tanaman biasanya merupakan bentuk kombinasi glikosida (Harbone, 1987). Golongan

flavonoid dapat digambarkan sebagai deretan senyawa C6 – C3 – C6 yang artinya

kerangka karbonnya terdiri atas dua gugus C6 (cincin benzen tersubsitusi)

disambungkan oleh rantai alifatik 3 karbon.

Flavonoid merupakan senyawa polar karena mempunyai gugus OH dan

gula, maka umumnya flavonoid larut dalam pelarut polar seperti etanol, metanol, dan

air. Aktivitas flavonoid dalam sistem biologis sangat berarti antara lain sebagai

antioksidan, antivirus, antihistamin, peluruh kemih, antihipertensi, dan bakterisida.

Beberapa senyawa flavonoid juga dapat menghambat monoamin oksidase (MAO),

protein kinase, DNA polimerase, dan hipoksigenase (Robinson, 1995). Flavonoid

telah menunjukkan perannya sebagai antioksidan, antimutagenik, antineoplastik, dan

aktivitas vasodilatator. Potensi antioksidan flavonoid dapat digunakan untuk

mencegah kerusakan oksidatif pada pengendalian sejumlah penyakit (Miller, 1996).


7

Alkaloid

Istilah alkaloid pada umumnya mencakup senyawa bersifat basa yang

mengandung satu atau lebih atom nitrogen, biasanya dalam gabungan, sebagai bagian

dari sistem siklik (Harborne, 1987). Alkaloid sebagai golongan dibedakan dari

sebagian besar komponen tumbuhan lain berdasarkan sifat basanya (kation). Senyawa

ini biasanya terdapat dalam tumbuhan sebagai garam berbagai asam organik

(Robinson, 1995).

6. Khasiat dan penggunaan

Tumbuhan sirih merah digunakan sebagai obat di masyarakat, antara lain

sebagai anti diabetes, jantung koroner, radang prostat, TBC, asam urat dan antikanker

(Sudewo, 2005).

Secara empiris ekstrak daun sirih merah dalam pemakaian secara tunggal

atau diformulasikan dengan tanaman obat lainnya mampu membasmi aneka penyakit.

Efek zat aktif yang terkandung dalam daun sirih merah dapat merangsang saraf pusat

dan daya pikir. Di samping itu, juga memiliki efek pencegah ejakulasi dini,

antikejang, antiseptik, analgetik, antiketombe, pelindung organ hati, antidiare,

antikoagulan, mempertahankan kekebalan tubuh, dan penghilang bengkak. Daun sirih

merah juga mampu mengatasi penyakit seperti diabetes mellitus, peradangan akut

pada organ tertentu, luka yang sulit sembuh, kanker payudara dan kanker rahim, tifus,

leukemia, TBC, lemah syahwat, ambeien, batuk, maag kronis, jantung koroner, darah

tinggi, dan asam urat (Sudewo, 2005).


8

7. Penelitian tanaman sirih merah

Penelitian yang pernah dilakukan sebelumnya menunjukkan bahwa sirih

merah mengandung flavonoid, alkaloid, senyawa polifenolat, tanin dan minyak atsiri

(Sudewo, 2005).

Beberapa dari flavonoid terlihat efektif menaikkan antikanker dan agen

kemopreventif kanker (Grotewold, 2006). Diet tinggi flavonoid, buah-buahan, dan

sayuran melawan berbagai macam penyakit, terutama penyakit kadiovaskular dan

beberapa tipe dari kanker (Ness and powles, 1997). Salah satu studi menunjukkan

bahwa flavonoid menghambat karsiogenesis in vitro dan diindikasikan juga substansi

in vivo (Caltagirone et al., 2000; Miyagi et al., 2000). Genistein dan daidzein dapat

menghambat perkembangan dari kanker yang berkenaan dengan hormon dan non

hormon maupun keduanya, termasuk kanker payudara, kanker prostat dan kanker

kulit pada tikus. Banyak flavonoid dapat menghambat proliferasi dari berbagai tipe

kultur sel kanker manusia (Grotewold, 2006). Penghambatan proliferasi sel kanker

payudara pada manusia dan keterlambatan dari tumorigenesis oleh flavonoid juga

ditemukan (So et al., 1996).

Flavonoid, diantaranya resveratrol dan quercetin pada kadar 100 µM

mampu menghambat aspek-aspek angiogenesis (proliferasi, migrasi sel endotelial dan

pembentukan pipa pembuluh darah) (Igura et al., 2001). Silymarin, suatu flavonoid

antioksidan, sedang dikembangkan sebagai agen inhibitor terhadap enzim COX-2

(Tosetti et al., 2002). Beberapa penelitian mengenai flavonoid merekomendasikan


9

kemungkinan aksinya sebagai senyawa kimia yang mampu menghambat kanker dan

diantaranya melalui penghambatan angiogenesis.

Fraksi alkaloid daun jarong (Achyrantes aspera linn) diketahui dapat

menghambat siklus pembelahan sel pada stadium metafase (Adyana, 2006). Alkaloid

yang berasal dari tanaman vinka bekerja spesifik pada siklus sel dengan menghambat

proses mitosis. Alkaloid dari tanaman juga mempunyai kemampuan mengikat tubulin

yaitu suatu protein yang menyusun mikrotubulus dengan menghambat atau

memblokade polimerasi protein ke dalam mikrotubulus (Chabner et al., 2001).

Golongan alkaloid tanaman dapat menyebabkan gangguan pada membran

sel sehingga berakibat komponen penyusun membran akan berubah dan proses

fisiologi membran akan terganggu dengan terjadi kerusakkan dan pengkerutan pada

membran tersebut (Gill et al., 2001; Jujena et al., 2001).

B. Metode Penyarian

Penyarian adalah kegiatan penarikan zat yang dapat larut dari bahan yang

tidak dapat larut dengan pelarut air. Faktor yang dapat mempengaruhi kecepatan

penyarian adalah kecepatan difusi zat yang larut melalui lapisan- lapisan batas antara

cairan penyari dengan bahan yang mengandung zat tersebut (Anonim, 1986).

1. Definisi ekstrak

Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif

dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai,

kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dari massa atau serbuk yang


10

tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan

(Anonim, 1995).

2. Cairan pelarut

Cairan pelarut dalam proses pembuatan ekstrak adalah pelarut yang baik

(optimal) untuk senyawa kandungan yang berkhasiat atau yang aktif, dengan

demikian senyawa tersebut dapat terpisahkan dari bahan dan dari senyawa kandungan

lainnya, serta ekstrak hanya mengandung sebagian besar senyawa kandungan yang

diinginkan. Faktor utama untuk pertimbangan pada pemilihan cairan penyari adalah

sebagai berikut : selektivitas, kemudahan bekerja dan proses dengan cairan tersebut,

ekonomis, ramah lingkungan, dan keamanan (Anonim, 2000). Etanol dapat

melarutkan alkaloid, minyak menguap, glikosida, kurkumin, kumarin, antrakinon,

flavonoid, steroid, dammar, klorofil, lemak, tannin, dan saponin, dengan demikian zat

pengganggu yang larut hanya terbatas (Anonim, 1986).

3. Maserasi

Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi dilakukan

dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari. Maserasi digunakan

untuk penyarian simplisia yang mengandung zat aktif yang mudah larut dalam cairan

penyari. Cairan penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol, air-etanol, atau

pelarut lain (Anonim, 1986).


11

C. Kanker

Kanker adalah segolongan penyakit yang ditandai dengan pembelahan sel

yang tidak terkendali dan kemampuan sel-sel tersebut untuk menyerang jaringan

biologis lainnya, baik dengan pertumbuhan langsung di jaringan yang bersebelahan

atau dengan migrasi sel ke tempat yang jauh (Anonim, 2007c). Kanker adalah suatu

penyakit di mana terjadi pertumbuhan sel-sel jaringan tubuh yang tidak normal, cepat,

dan tidak terkendali. Dalam keadaan normal, sel hanya akan membelah diri bila tubuh

membutuhkannya seperti mengganti sel-sel yang rusak atau mati. Sebaliknya, sel

kanker akan membelah diri meskipun tidak dibutuhkan sehingga terjadi kelebihan

sel-sel baru (Dalimartha, 2006).

Dikenal beberapa jenis kanker, seperti karsinoma, sarkoma, limfoma

(neoplasma sistem limfatik) atau leukemia (neoplasma ganas sel darah putih).

Karsinoma merupakan tumor ganas yang berasal dari sel epitel, misalnya kanker

payudara, kanker kulit, dan kanker lambung. Sarkoma merupakan tumor ganas yang

berasal dari jaringan mesodermal, misalnya fibrosarkoma (tumor ganas jaringan ikat),

limfosarkoma (tumor ganas sistem limfatik), dan osteosarkoma (tumor ganas pada

tulang) (Dalimartha, 2006). Kanker dibedakan menjadi dua macam jenis kanker yaitu

kanker jinak (benigna) dan kanker ganas (maligna) (Macdonald and Ford, 1997).

Disebut kanker jinak apabila kanker membentuk suatu massa sel tunggal dan belum

mempengaruhi sel atau jaringan sekitarnya. Jika sel telah menginvasi jaringan

disekitarnya dan masuk ke dalam aliran darah atau limfa maka disebut kanker ganas

(Albert et al, 1994).


12

Kanker timbul dari sel tunggal yang mengalami mutasi. Mutasi gen dapat

menyebabkan pertumbuhan sel meningkat dibandingkan yang lain dan membiarkan

sel-sel tersebut tidak terkendali perkembangannnya (Macdonald and Ford, 1997).

Sejalan dengan pertumbuhan dan perkembangbiakannya, sel-sel kanker membentuk

suatu massa dari jaringan ganas yang menyusup ke jaringan di dekatnya dan bisa

menyebar ke seluruh tubuh. Kanker pada dasarnya merupakan sel dengan proliferasi

yang tidak terkendali dengan kerusakan gen pada regulator siklus sel. Pertumbuhan

kanker merupakan proses mikroevolusioner yang dapat berlangsung dalam beberapa

bulan atau beberapa tahun. Proses pertumbuhan ini dinamakan karsinogenesis di

mana dimulai dari satu sel kanker yang memperbanyak diri dan membentuk satu

koloni kecil dalam jaringan yang sama dan mengakibatkan terjadinya perubahan

genetik (Sherr, 1996).

Karsinogenesis merupakan proses terjadinya kanker yang berlangsung lama.

Karsinogenesis dapat terjadi akibat salah satu atau kombinasi faktor karsinogen

kimiawi, alami, radiasi, biologis dan genetik. Perubahan akibat rangsangan faktor

karsinogen tersebut melibatkan perubahan gen dari sel neoplasia atau sel yang

mengalami transformasi (Soeripto, 1998). Kanker terjadi karena pemaparan berulang-

ulang oleh satu atau lebih karsinogen yang memicu perubahan sel dan menginisiasi

transformasi menjadi sel ganas (Meleka, 1983).


13

Sel kanker memiliki karakteristik sebagai berikut :

a. Sel kanker mampu mencukupi kebutuhan sinyal pertumbuhannya sendiri. Sinyal

pertumbuhan diperlukan agar sel dapat terus membelah. Berbeda dari sel normal,

sel kanker dapat tetap dan terus tumbuh.

b. Tidak sensitif terhadap sinyal anti-pertumbuhan. Sel kanker tidak merespon

adanya sinyal yang dapat menghentikan terjadinya pertumbuhan dan pembelahan

sel, dengan demikian, sel kanker dapat terus membelah.

c. Sel kanker mampu menghindar dari mekanisme apoptosis. Apoptosis merupakan

program bunuh diri sel ketika sel tersebut mengalami kerusakan, baik struktural

maupun fungsional, yang tidak dapat ditolerir lagi. Namun sel kanker dapat

menghindar dari kematian dengan mengeblok jalur terjadinya apoptosis di dalam

sel.

d. Sel kanker memiliki potensi tak terbatas untuk mengadakan replikasi.

e. Sel kanker mampu menginduksi angiogenesis untuk mencukupi kebutuhannya

akan oksigen dan nutrisi. Akan terbentuk cabang baru pada pembuluh darah yang

menuju sel kanker yang kemudian akan mensuplai kebutuhan nutrisi dan oksigen

dari sel kanker.

f. Sel kanker mampu menginvasi jaringan di sekitarnya dan membentuk anak sebar.

(Hanahan dan Weinberg, 2000)

D. Sel SiHa

Sel SiHa adalah salah satu kanker cervix yang menyebabkan kematian yang

tinggi pada wanita. Sel SiHa diperoleh dari fragmen sampel jaringan primer dari


14

suatu karsinoma cervix dan merupakan squamosa yang tidak terdiferensiasi.

Morfologi sel SiHa mirip dengan sel epitelial dan sel ini mengandung Human

Papilloma Virus 16 (HPV-16) (Anonim, 2007d).

Kanker serviks berkembang secara bertahap, tetapi progresif. Proses

terjadinya kanker ini dimulai dengan sel yang mengalami mutasi lalu berkembang

menjadi sel displastik sehingga terjadi kelainan epitel yang disebut displasia

(Dalimartha, 2006). Kanker cervix kebanyakan terjadi sebagai squamosa karsinoma

yaitu sekitar 95% dan sedikit terjadi pada sel endocervical columnal sebagai

adenosquamosa karsinoma yaitu sekitar 5%. Faktor- faktor penyebab kanker cervix

antara lain berhubungan seks pada usia dini, pasangan seks berganti-ganti, perokok

dan terpapar oleh Human Papilloma Virus (HPV) dan virus herpes simplek II. Pada

metastasis melalui sistem limfatik, jarang terjadi metastasis yang jauh (King, 2000).

E. Uji Sitotoksisitas

Uji sitotoksisitas adalah uji in vitro dengan menggunakan kultur sel yang

digunakan dalam evaluasi keamanan obat, kosmetika, zat tambahan makanan,

pestisida, dan digunakan juga untuk mendeteksi adanya aktivitas anti neoplastik dari

suatu senyawa (Freshney, 1986). Pengembangan metode in vitro sebagai alternatif

pengganti pengujian menggunakan hewan uji mempunyai relevansi yang cukup baik

yang bertujuan untuk mendeteksi potensi ketoksikan suatu obat pada manusia (Doyle

and Griffiths, 2000).

Uji sitotoksisitas merupakan uji toksisitas secara in vitro pada suatu kultur

sel. Metode in vitro mempunyai beberapa kelebihan dibandingkan metode in vivo,


15

yakni metode in vitro lebih ekonomis, lebih mudah dan ditinjau dari segi

kemanusiaan atau moralitas percobaan, metode in vitro lebih manusiawi daripada in

vivo. Namun kerugian in vitro adalah kadang-kadang tidak memberikan efek senyawa

uji yang sama dengan bila diberikan secara in vivo (Freshney, 1986).

1. Metode MTT

Uji sitotoksik dilakukan dengan metode mikrotitrasi yang merupakan

metode uji yang efisien, dalam satu plate terdapat 96 sumuran sehingga lebih banyak

data yang didapatkan. Tiap sumuran memiliki luas 28 – 32 mm2 dengan kapasitas

medium sebanyak 0,1 atau 0,2 ml. Dengan metode uji ini semua populasi sel terpapar

sampel uji (Freshney, 2000).

Salah satu metode yang digunakan untuk mengetahui viabilitas sel pada uji

sitotoksisitas adalah dengan menggunakan metode MTT. Pada metode MTT, garam

tetrazolium MTT (3-(4,5-dimetil- tiazol-2- il)-2,5-difeniltetrazolium bromida),

diabsorbsi ke dalam sel dan direduksi melalui reaksi yang ada di mitokondria untuk

membentuk formazan. Produk formazan terakumulasi di sel karena tidak dapat

menembus membran sel (Barille, 1997). Kemampuan sel untuk mereduksi MTT

merupakan indikasi adanya aktivitas mitokondria, yang menggambarkan jumlah sel .

Pembacaan absorbansi dilakukan pada panjang gelombang 550 nm dengan

menggunakan microplate reader (Castell & Gomez-Lechon, 1997). Metode ini cepat,

sensitif, akurat dan dapat mengukur sampel dalam jumlah banyak (Doyle & Griffiths,

2000).


16

2. Metode Direct Counting

Metode yang paling umum dilakukan untuk penghitungan sel yang akurat

dan efisien adalah dengan menggunakan haemocytometer. Dalam metode ini

digunakan suatu bilik hitung dengan kedalaman 0,1 mm dan persegi untuk

mempermudah penghitungan. Menggunakan zat warna seperti trypan blue,

penghitungan sel yang hidup dan sel yang tidak hidup dapat dilakukan. Sampling

yang akurat, pengenceran dan pengisian bilik secara tepat sangat penting. Pengisian

yang berlebihan, adanya gelembung udara dan bilik hitung yang kurang bersih

menyebabkan kesalahan penghitungan. Kesalahan statistik dapat dikurangi dengan

menghitung cukup sel dengan replikasi yang tetap.

Penghitungan dengan haemocytometer adalah metode yang paling

sederhana dan versatile dengan keuntungan yaitu memberikan pengukuran langsung

(aktual sel) (Doyle and Griffiths, 2000).

Jika suatu uji sitotoksisitas menghasilkan harga LC50 kurang dari 1000

µg/ml maka senyawa tersebut dinyatakan bersifat toksik dan bila lebih besar dari

1000 µg/ml maka senyawa tersebut dinyatakan tidak toksik terhadap senyawa uji

(Meyer et al, 1982). Menurut NCI (National Cancer Institute) yang menyatakan suatu

senyawa berpotensi sebagai antikanker bila memiliki harga LC50 = 20 µg/ml

(Suffness dan Pezzuto, 1991).


17

F. Landasan Teori

Penelitian yang pernah dilakukan menunjukkan bahwa sirih merah

mengandung flavanoid, alkaloid, senyawa polifenolat, tanin dan minyak atsiri.

Genistein dan daidzein dapat menghambat perkembangan dari kanker yang

berkenaan dengan hormon dan non hormon maupun keduanya, termasuk kanker

payudara, kanker prostat dan kanker kulit pada tikus. Banyak flavonoid dapat

menghambat proliferasi dari berbagai tipe kultur sel kanker manusia. Alkaloid yang

berasal dari tanaman vinka bekerja spesifik pada siklus sel dengan menghambat

proses mitosis.

Cairan penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol, air-etanol, atau

pelarut lain. Etanol dapat melarutkan alkaloid, minyak menguap, glikosida,

kurkumin, kumarin, antrakinon, flavonoid, steroid, dammar, klorofil, lemak, tannin,

dan saponin, dengan demikian zat pengganggu yang larut hanya terbatas.

G. Hipotesis

Ekstrak etanolik daun sirih merah memiliki efek sitotoksik terhadap kultur

sel SiHa.


18

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian tentang sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah (Piper

crocatum Ruiz & Pav) terhadap kultur sel SiHa ini termasuk penelitian eksperimental

murni yang mengikuti rancangan acak lengkap pola satu arah.

B. Variabel dan Definisi Operasional

1. Variabel

a. Variabel bebas

Kadar ekstrak etanolik daun sirih merah 125 µg/ml; 250 µg/ml; 500 µg/ml;

750 µg/ml; dan 1000 µg/ml.

b. Variabel tergantung

Persentase kematian sel SiHa.

c. Variabel pengacau terkendali

1. Medium tumbuh sel dikendalikan dengan menggunakan medium RPMI

1640-serum.

2. Tempat tumbuh dan waktu pemanenan daun sirih merah dikendalikan

dengan memanen daun pada tempat dan waktu yang sama.

3. Kematian alami sel dapat dikendalikan dengan kontrol dan pemberian

nutrisi.


19

2. Definisi Operasional

a. Sitotoksisitas ialah sifat toksik atau beracun dari ekstrak etanolik daun sirih

merah terhadap kultur sel SiHa.

b. Ekstrak etanolik adalah ekstrak etanolik daun sirih merah dan dinyatakan

dalam µg/ml.

c. Sel SiHa adalah salah satu sel kanker cervix yang menyebabkan kematian

yang tinggi pada wanita dan mengandung Human Papilloma Virus 16 (HPV-

16).

d. LC50 ialah konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah yang mampu

membunuh atau menyebabkan kematian sejumlah 50% kultur sel SiHa dan

dinyatakan dalam µg/ml.

C. Alat dan Bahan

1. Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : alat-alat gelas,

autoklaf, alumunium foil, Waterbath, Oven, Blender, Ayakan, inkubator CO2

(Memmer), timbangan analitik (Mettler Toledo), tissue, glove, masker, yellow tips,

blue tips, effendorf, tabung conical (Nunc), tissue culture flask (Nunc), swing rotor

sentrifuge, mikropipet, membran dialisis (Sigma), lemari pendingin (Sharp), cell

counter (Nunc), 96-well plate (Nunc), laminar air flow (Labconco), mikroskop

(Olympus IMT-2), haemocytometer (Neubauer), ELISA reader.


20

2. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain :

a. Bahan utama : daun sirih merah segar

b. Bahan untuk ekstraksi : etanol 70 %

c. Uji sitotoksisitas :

1. Kultur sel SiHa yang diperoleh dari stok Laboratorium Hayati Universitas

Gadjah Mada, Yogyakarta.

2. Medium pencuci sel : RPMI 1640 (Sigma), Natrium bikarbonat, dan

hepes.

3. Medium penumbuh sel : RPMI 1640 (Sigma), FBS (Fetal Bovine Serum)

10 %, Penisilin-Streptomisin 1 % (Gibco), Fungison 0,5 % (Gibco).

4. Pewarna Trypan blue (Sigma)

5. DMSO (Dimetil Sulfoksidase)

6. Reagen Stopper : SDS (sodium dodesil sulfat) dalam HCl 0,01 N (Merck)

7. MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)

(Sigma)

8. Tripsin 0,5 %

9. Aquabidest

D. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi tanaman

Bahan utama yang akan digunakan dalam penelitian yaitu daun sirih merah

segar, yang telah dideterminasi terlebih dahulu di Laboratorium Biologi Farmasi,


21

Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta dan dipastikan juga

kebenarannya menggunakan acuan baku ( Backer dan Van den Brink, 1965).

2. Pengumpulan daun sirih merah

Bahan yang digunakan berupa daun sirih merah, diambil dari tanaman sirih

merah di daerah Mantenan, Mertoyudan, Magelang, Jawa Tengah.

3. Pembuatan ekstrak etanolik daun sirih merah

a. Pembuatan serbuk

Daun sirih merah yang telah dikumpulkan selanjutnya dicuci dengan air

mengalir untuk menghilangkan kotoran-kotoran yang melekat, kemudian ditiriskan

sampai sisa-sisa air menghilang. Daun kemudian dikeringkan dalam oven dengan

suhu 65-70°C. Setelah kering, lalu diserbuk dengan blender sampai halus dan diayak

menggunakan ayakan 0,75 mm.

b. Pembuatan ekstrak daun sirih merah

Serbuk simplisia diekstrak secara maserasi memakai etanol 70%. Untuk tiap

100 gram serbuk digunakan 700 ml etanol 70%. Maserasi yang digunakan adalah

secara remaserasi, yakni dengan menambahkan 100 gram serbuk simplisia dengan

500 ml etanol 70% dalam Erlenmeyer, kemudian ditutup dan dibiarkan selama 24 jam

terlindung dari cahaya matahari untuk mencegah reaksi yang dikatalisis oleh cahaya

atau perubahan warna. Setelah 24 jam sari diserkai, dis aring, ampas diperas. Ampas

yang diperoleh kemudian ditambah cairan penyari sebanyak 200 ml, diaduk dan

diserkai. Bejana ditutup, dibiarkan di tempat sejuk, terlindung dari cahaya, selama 2

hari kemudian endapan dipisahkan. Rendaman harus dikocok berulang-ulang (kira-


22

kira 3 x sehari). Setelah 2 hari maserat disaring dengan kertas saring, kemudian

ditampung. Maserat yang terkumpul kemudian dipekatkan di atas waterbath dengan

suhu 60-65oC, dibantu dengan kipas angin sampai kental.

4. Sterilisasi alat dan bahan

Alat–alat gelas yang akan digunakan dalam keadaan steril, dicuci sampai

bersih dan dikeringkan dalam oven. Setelah kering, alat-alat tersebut dibungkus

dengan kertas payung, kemudian di sterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu

121oC selama 20 menit dengan tekanan 2,05 abs bar (Hagman, 2005).

5. Pembuatan medium pencuci dan medium penumbuh

a. Pembuatan medium pencuci

Media RPMI 1640 dilarutkan dalam aquabidest kurang lebih 80 ml,

ditambah 2,3 g natrium bikarbonat, 2 g Hepes, diencerkan sampai 100 ml. Larutan

selanjutnya dihomogenkan dengan magnetic stirrer, kemudian di buffer dengan HCL

1 N hingga pH nya 7,2 sampai 7,4 dengan pH meter. Selanjutnya larutan disterilkan

dengan penyaringan menggunakan membran filter polietilensulfon steril berdiameter

0,22 µm secara aseptis. Medium disimpan dalam almari es pada suhu 4oC (Freshney,

1986; Jacoby dan Pastan, 1979., Sambrook et al, 1989).

b. Pembuatan medium penumbuh

Untuk medium RPMI 1640-serum, ditambahkan FBS (Fetal Bovine Serum)

10%, penisilin-streptomisin 1% dan fungison 0,5% dalam medium RPMI 1640 dan

disterilkan dengan filter polietilensulfon berdiameter 0,22 µm. Media disimpan dalam


23

almari es pada suhu 4oC (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook,

Fritsch dan Maniatis, 1989).

6. Preparasi sel SiHa

a. Propagasi sel SiHa

Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera dicairkan dalam

penangas air 37oC, kemudian ampul disemprotkan dengan etanol 70%. Ampul dibuka

dan sel SiHa dipindahkan dalam tabung conical steril yang berisi medium RPMI

1640. Suspensi sel disentrifugasi selama 5 menit, supernatan dibuang, diganti dengan

medium RPMI yang baru, kemudian disuspensikan pelan-pelan. Suspensi sel

disentrifugasi kembali selama 5 menit. Supernatan dibuang, pelet sel ditambahkan 1

ml medium penumbuh yang mengandung 10% FBS. Resuspensikan secara perlahan

sampai homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan

diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 37oC dengan aliran 5% CO2. Setelah 24

jam, medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya

cukup untuk penelitian lebih lanjut (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979;

Sambrook et al, 1989).

b. Panen sel SiHa

Setelah jumlah sel cukup (kurang lebih setelah berumur 7 hari), media

diganti dengan RPMI 1640 baru sebanyak 5 ml kemudian sel dilepaskan dari dinding

flask dengan cara diresuspensikan menggunakan pipet Pasteur. Sel dipindahkan

dalam tabung conical steril dan ditambahkan medium RPMI sampai volume 10 ml

dan disentrifugasi 3000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan pelet sel


24

diresuspensikan perlahan dengan 1 ml medium. Sel kemudian dihitung menggunakan

haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah medium sehingga memperoleh

konsentrasi sel sebesar 2,0x104 sel/100 µl dan siap dipakai untuk penelitian lebih

lanjut (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989).

7. Pembuatan larutan uji

Ekstrak kental ditimbang, dilarutkan dengan pelarut DMSO dan diaduk

dengan homogen untuk mendapatkan sediaan ekstrak induk dengan konsentrasi 100

mg/ml. Sebelum digunakan sediaan ekstrak disterilkan dengan filter membran. Dari

sediaan steril ekstrak induk tersebut dibuat sediaan uji dengan konsentrasi ekstrak

etanolik daun sirih merah 125 µg/ml; 250 µg/ml; 500 µg/ml; 750 µg/ml; dan 1000

µg/ml.

8. Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah

a. Uji sitotoksisitas dengan metode MTT

Untuk uji sitotoksisitas, sebanyak 100 µl suspensi sel SiHa dengan

kepadatan 2x104/100 µl dimasukkan ke dalam sumuran 96 well plate yang telah berisi

100 µl ekstrak etanolik daun sirih merah dengan kadar 1000 µg/ml pada sumuran A1,

B1 dan C1 pada kolom 1, kemudian pada sumuran A2, B2 dan C2 di kolom 2

ditambahkan 100 µl suspensi sel SiHa pada sumuran yang telah berisi 100 µl ekstrak

daun sirih dengan kadar 750 µg/ml, demikian seterusnya hingga diperoleh seri kadar

yang terendah yang digunakan dalam penelitian. Untuk kontrol digunakan 100 µl

suspensi sel SiHa dalam media penumbuh. Selanjutnya 96-well plate diinkubasikan


25

selama 24 jam pada suhu 37oC, dalam inkubator dengan aliran 5% CO2 (Freshney,

1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989).

Pada akhir inkubasi, ke dalam masing-masing sumuran ditambahkan 10 µl

MTT 5 µg/ml dalam media RPMI 1640, lalu diinkubasikan semalam pada suhu 37oC,

dalam inkubator dengan aliran CO2 5%. Sel hidup akan bereaksi dengan MTT dan

membentuk warna ungu. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 100 µl reagen

stopper pada setiap sumuran dan inkubasi semalam pada suhu kamar. Serapan setiap

sumuran dibaca deangan ELISA reader pada panjang gelombang 550 nm. Besarnya

serapan berbanding lurus dengan jumlah sel yang hidup.

b. Uji Sitotoksisitas dengan Metode Direct Counting

Seratus µl suspensi sel SiHa dengan kepadatan 2,0x104 sel/ 100 µl

dimasukkan ke dalam sumuran pada 96-well plate, ditambah ekstrak uji pada kadar

masing-masing 125 µg/ml; 250 µg/ml; 500 µg/ml; 750 µg/ml; dan 1000 µg/ml. Untuk

kontrol digunakan 100 µl suspensi sel SiHa dalam media penumbuh. Selanjutnya

plate diinkubasi dalam inkubator dengan aliran 5% CO2 selama 24 jam pada suhu

37oC. Pada akhir masa inkubasi tiap sumuran diresuspensi, ditambah 50 µl Trypan

blue, diresuspensi lagi untuk homogenisasi diambil 10 µl untuk pengamatan.

Ditempatkan dalam haemocytometer, sel siap dihitung dengan counter dibawah

mikroskop.

9. Analisis hasil

Uji sitotoksisitas dilakukan dengan menggunakan metode perhitungan

langsung (direct counting). Disini harga persentase kematian dapat ditentukan dengan


26

menghitung jumlah sel hidup sebagai kontrol dikurangi dengan jumlah sel hidup

dengan adanya perlakuan, kemudian dibagi dengan jumlah sel hidup sebagai kontrol

dan dikalikan 100 %.

% kematian sel

= %100×−

∑∑ ∑

kontrolkelompokhidupsel

perlakuankelompokhidupselkontrolkelompokhidupsel

Untuk menghitung harga LC50 dilakukan perhitungan secara statistik menggunakan

analisis probit (Mursyidi, 1985). Analisis probit merupakan salah satu analisis regresi

untuk mengetahui hubungan konsentrasi-respon (persen kematian sel) agar diperoleh

persamaan garis lurus sehingga dapat digunakan untuk menentukan LC50. Sedangkan

untuk menganalisis signifikansi antara perlakuan dan kontrol dilakukan pengolahan

data dengan statistik Anova satu arah dengan sebelumnya dilakukan uji Kolmogorov-

Smirnov untuk mengetahui distribusi datanya.


27

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Determinasi Tanaman

Penelitian ini menggunakan bahan utama berupa daun sirih merah.

Determinasi tanaman bertujuan untuk memastikan kebenaran tanaman sebelum

digunakan dalam suatu penelitian. Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium

Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Unive rsitas Gadjah Mada, Yogyakarta dengan

mengacu pada referensi baku (Backer dan Van den Brink, 1965). Hasil yang

diperoleh dari determinasi menyatakan bahwa tanaman yang digunakan dalam

penelitian adalah benar tanaman sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav).

B. Pengumpulan Daun Sirih Merah

Daun sirih merah yang digunakan dalam penelitian ini diambil pada bulan

September tahun 2007 di Desa Mantenan, Kecamatan Mertoyudan, Kabupaten

Magelang, Jawa Tengah. Daun sirih merah diambil dari satu pohon dan dalam waktu

sekali panen dengan tujuan untuk menghindari kemungkinan terjadinya perbedaan

kualitas dan kandungan kimia yang terdapat pada daun sirih merah. Pengambilan

bahan dari daerah yang berbeda dapat mengakibatkan kandungan kimia yang

bervariasi. Dipilih daun yang tidak terlalu tua dan terlalu muda, sehingga diharapkan

mempunyai kandungan senyawa aktif yang optimal.

Daun sirih merah yang telah terkumpul dibersihkan dengan dari kotoran-

kotoran yang menempel, seperti debu, serangga, dan benda asing lainnya. Daun sirih

merah yang sudah dibersihkan kemudian dikeringkan sampai kering dengan cara


28

dimasukkan ke dalam oven pada suhu 60 – 70 °C untuk mengurangi kandungan air,

dengan demikian reaksi enzimatis dapat diminimalkan dan menjamin agar

kualitasnya tetap baik. Simplisia yag sudah kering diserbuk dengan blender dan

diayak dengan ayakan 0,75 mm untuk memperkecil ukuran partikel. Dalam bentuk

serbuk, luas permukaan partikel yang dapat kontak langsung dengan cairan penyari

menjadi lebih besar sehingga kandungan kimia yang terkandung dapat tersari secara

maksimal.

C. Pembuatan Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah

Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi. Seratus gram serbuk sirih

merah direndam dengan cairan penyari etanol 70%. Pemilihan etanol sebagai cairan

penyari didasarkan pada kandungan senyawa yang ada dalam daun sirih merah yaitu

flavonoid, alkaloid, polifenolat, minyak atsiri dan tanin yang dapat larut ke dalam

etanol. Selain itu, etanol sebagai cairan penyari dikarenakan etanol merupakan pelarut

universal. Beberapa kelebihan etanol antara lain lebih selektif, kapang dan kuman

sulit tumbuh dalam etanol 20% keatas, tidak beracun, netral, absorbsinya baik, etanol

dapat bercampur dengan air pada segala perbandingan, panas ya ng digunakan untuk

pemekatan lebih sedikit.

Penyarian simplisia daun sirih merah menggunakan metode maserasi

Beberapa kelebihan dari metode maserasi adalah cara pengerjaan dan peralatan yang

digunakan sederhana dan mudah diusahakan. Selain itu metode maserasi tidak

menggunakan pemanasan sehingga senyawa-senyawa yang tidak tahan panas tinggi

dapat terhindar dari kerusakan. Maserasi dilakukan dalam bejana tertutup agar etanol


29

tidak menguap karena etanol mudah menguap pada suhu kamar dan mencegah

masuknya kontaminan dari luar.

Pada proses maserasi, serbuk daun sirih merah direndam selama 3x24 jam

sambil sesekali diaduk. Perendaman dimaksudkan agar susunan sel sampel akan

dapat larut dalam cairan penyari. Sedangkan pengadukan bertujuan agar penyari

dapat mengalir secara berulang-ulang ke dalam serbuk halus sehingga memungkinkan

adanya interaksi antara penyari dengan serbuk. Pada umumnya larutnya zat aktif akan

terjadi apabila penyari menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang

berisi zat aktif yang dapat larut dalam penyari. Zat aktif dapat keluar dari rongga sel

kemungkinan karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam

dan di luar sel.

D. Sterilisasi Alat dan Bahan

Sterilisasi bertujuan untuk menghilangkan kontaminasi mikroorganisme dari

alat yang akan digunakan dalam penelitian ini. Proses sterilisasi sangat penting dalam

penelitian ini karena objek penelitian merupakan sel yang sangat rentan terhadap

adanya kontaminan sehingga dengan adanya kontaminan akan mempengaruhi

kematian sel. Oleh karena itu alat-alat yang akan digunakan dalam penelitian ini

harus disterilkan terlebih dahulu untuk menghilangkan semua pengotor dan

kontaminan yang bisa mengganggu pada saat penelitian.

Alat-alat tersebut dicuci sampai bersih, dikeringkan dan dibungkus dengan

kertas payung kemudian disterilisasi. Sterilisasi dilakukan dengan autoklaf selama

kurang lebih 20 menit dengan suhu 1210C dan tekanan 2,05 abs bar. Prinsip kerja dari


30

autoklaf ialah sterilisasi dengan uap bertekanan yaitu dengan menaikkan tekanan

hingga suhu tinggi sehingga terbentuk uap air panas. Uap air panas tersebut akan

membunuh mikroorganisme dengan menyebabkan terjadinya koagulasi dan

denaturasi protein pada mikroorganisme.

E. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah

Uji sitotoksisitas dilakukan untuk mengetahui potensi ketoksikan ekstrak

etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa. Dengan uji ini dapat diketahui

konsentrasi yang dapat menghambat pertumbuhan sel sampai 50 %. Dapat dikatakan

bahwa uji sitotoksisitas yang dilakukan bersifat kuantitatif, yaitu dengan parameter

uji sitotoksisitas yang digunakan adalah LC50 (Lethal Concentration 50 %) yang

merupakan implementasi potensi ketoksikan suatu senyawa.

Uji sitotoksisitas yang dilakukan pada awalnya menggunakan metode MTT.

Pemilihan metode MTT karena metode MTT ini termasuk metode yang cukup akurat

karena absorbansi yang terbaca sebanding dengan jumlah sel hidup yang masih aktif

melakukan metabolisme. Selain itu, uji ini juga dirasa cukup aman, sederhana, dan

cepat. Aman karena tidak memerlukan penggunaan zat-zat yang berbahaya,

sederhana karena perlakuan yang harus diberikan pada sampel sebelum diuji relatif

cukup mudah, dan cepat karena waktu yang dibutuhkan cukup singkat sehingga

sangat memungkinkan untuk menguji sampel dalam jumlah yang cukup banyak.

Namun metode MTT ini juga memiliki kelemahan. Salah satunya adalah tidak tepat

untuk menguji sampel yang berwarna karena dikhawatirkan dapat mempengaruhi

absorbansi yang terbaca oleh ELISA Reader.


31

MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)

merupakan suatu garam yang larut air. Prinsip uji sitotoksisitas dengan metode MTT

adalah terjadinya reduksi garam tetrazolium MTT oleh enzim mitokondrial

dehidrogenase yang terdapat dalam mitokondria sel sehingga terbentuk formazan

yang berwarna ungu.

NN

NN

S

N

CH3

CH3NH

N

NN

S

N

CH3

CH3

NADH

NAD+

MTT Formazan

Br

Gambar 1. Reaksi Pembentukan Formazan

Intensitas warna yang terbentuk kemudian ditetapkan absorbansinya dengan

pembacaan ELISA reader. Pengukuran menggunakan ELISA Reader dilakukan pada

panjang gelombang 550 nm. Intensitas warna yang terbaca berbanding lurus dengan

jumlah sel yang hidup. Semakin besar absorbansi berarti semakin banyak sel hidup

yang aktif melakukan metabolisme dan sebaliknya, semakin kecil absorbansi yang

terbaca menunjukkan semakin sedikit sel yang hidup.

Gambar 2. Formazan di Bawah Mikroskop (perbesaran 100x)


32

Namun pada penelitian ini, ternyata ELISA reader tidak mampu membaca

dengan tepat intensitas warna ungu formazan yang terbentuk akibat reaksi MTT

dengan kultur sel SiHa. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh warna coklat dari

ekstrak etanolik daun sirih merah yang digunakan sebagai senyawa uji. Warna coklat

dari ekstrak etanolik ini dapat berpengaruh pada nilai absorbansi yang dihasilkan,

karena kemungkinan terjadi penambahan intensitas warna sehingga absorbansi yang

terbaca menjadi lebih besar daripada nilai yang sebenarnya. Pada penelitian ini

dilakukan pengukuran absorbansi dari perlakuan dan kontrol pada masing-masing

konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah.

Hasil yang diperoleh antara pembacaan absorbansi dengan ELISA reader

ternyata tidak signifikan dengan foto kultur sel SiHa. ELISA reader memberikan

absorbansi yang rendah namun pada foto terlihat bahwa kultur sel SiHa pada seri

konsentrasi selnya masih hidup. Seharusnya apabila absorbansinya rendah maka sel

banyak yang mati. Karena hasil uji sitotoksisitas dengan metode MTT memberikan

data yang fluktuatif, maka selanjutnya dilakukan metode penghitungan langsung

(direct counting).

Nilai absorbansi hasil uji sitotoksisitas dengan metode MTT pada inkubasi

selama 24 jam dapat dilihat pada tabel berikut :


33

Tabel 1. Tabel nilai absor bansi ekstrak etanolik daun sirih merah dengan Metode MTT

Penetapan I II III

Kadar ekstrak etanolik daun sirih

merah (µg/ml) Absorbansi Absorbansi Absorbansi Kontrol 0,994 1,050 1,127

125 0,897 0,879 0,903 250 0,863 0,860 0,907 500 0,847 0,851 0,865 1000 0,924 0,882 0,936 2000 0,969 0,928 0,938 4000 1,034 0,983 0,977 8000 1,133 1,118 1,071 16000 1,353 1,337 1,330 32000 1,520 1,483 1,458

Dari tabel di atas dapat dilihat bahwa semakin besar kadar ekstrak etanolik

daun sirih merah maka semakin besar pula nilai absorbansi yang diperoleh, hal ini

dikarenakan pengaruh dari warna ekstrak etanolik daun sirih merah yang ikut terbaca.

Padahal intensitas warna yang terbaca berbanding lurus dengan jumlah sel yang

hidup. Semakin besar absorbansi berarti semakin banyak sel hidup yang aktif

melakukan metabolisme dan sebaliknya, semakin kecil absorbansi yang terbaca

menunjukkan semakin sedikit sel yang hidup. Dengan demikian, metode MTT pada

penelitian ini tidak dapat digunakan.

Selanjutnya uji sitotoksisitas menggunakan metode direct counting

(Perhitungan langsung), yang dilakukan dengan menghitung jumlah sel hidup

perlakuan kemudian dibandingkan dengan jumlah sel hidup kontrol (kontrol media).

Metode ini disebut juga metode trypan blue, metode ini tidak dipengaruhi oleh warna

dari ekstrak etanolik daun sirih merah. Pada metode ini, penghitungan dilakukan


34

secara manual terhadap sel hidup setelah sebelumnya kultur sel diwarnai dengan

reagen trypan blue. Sel yang mati akan menyerap reagen sehingga warnanya lebih

gelap daripada sel hidup.

Kelemahan dari metode direct counting adalah waktu yang dibutuhkan

untuk menghitung sel terlalu lama dan subjekstivitasnya sangat tinggi. Oleh karena

itu sebaiknya perhitungan sel dilakukan oleh satu orang dan orang yang sama untuk

menghindari atau mengurangi variabel kesalahan yang terlalu besar.

Pada penelitian ini, seri kadar yang digunakan sebanyak 5 konsentrasi

dengan konsentrasi tertinggi 1000 µg/ml dan konsentrasi terendah 125 µg/ml.

Sebagai kontrol dimasukkan media kultur RPMI 1640 100 µl beserta suspensi kultur

sel SiHa. Plate diinkubasi dalam inkubator CO2 5 % + 95 % O2 selama 24 jam.

Jumlah sel yang hidup dihitung di bawah mikroskop menggunakan haemocytometer

dengan penambahan trypan blue. Untuk mempermudah perhitungan sel dilakukan

resuspensi terlebih dahulu. Hal ini bertujuan untuk melepaskan sel dari dinding plate.

Pengaruh pemberian ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel

SiHa dapat dilihat pada tabel sebagai berikut :


35

Tabel II. Tabel potensi ketoksikan ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa

Persen kematian sel SiHa (%) Kadar ekstrak etanolik daun sirih merah

(µg/ml) Penetapan I Penetapan II Penetapan III

125 42,86 41,43 41,43 250 54,29 52,86 54,29 500 65,71 65,71 65,71 750 74,29 74,29 74,29 1000 77,14 77,14 77,14

Harga LC50 diperoleh dengan analisis probit (Mursyidi, 1985). Untuk

memperoleh harga LC50 ini diperlukan data yang tercantum pada tabel II dan harga

probit untuk tiap persentase kematian sel dapat dicari dari tabel probit, kemudian

dibuat regresi linier antara log kadar dengan harga probit.

Grafik kadar vs % kematian sel SiHa

0102030405060708090

0 200 400 600 800 1000 1200

Kadar (microgram/ml)

% k

emat

ian

Gambar 3. Grafik hubungan kadar ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap % kematian sel SiHa penetapan I


36

Pada gambar 3 dan tabel II dapat dilihat bahwa kenaikan kadar ekstrak

etanolik daun sirih merah akan menaikkan persentase kematian sel SiHa, hal ini

berarti jumlah sel yang hidup semakin kecil. Pada tabel II, penetapan I kadar

terendah ekstrak etanolik daun sirih merah 125 µg/ml menyebabkan persen kematian

terkecil yaitu 42,86 %, sedangkan pada kadar tertinggi 1000 µg/ml menyebabkan

persen kematian terbesar yaitu 77,14 %. Penetapan II, kadar terendah ekstrak etanolik

daun sirih merah 125 µg/ml menyebabkan persen kematian terkecil ya itu 41,43 %,

sedangkan pada kadar tertinggi 1000 µg/ml menyebabkan persen kematian terbesar

yaitu 77,14 %. Sedangkan pada penetapan III, kadar terendah ekstrak etanolik daun

sirih merah 125 µg/ml menyebabkan persen kematian terkecil yaitu 41,43 %,

sedangkan pada kadar tertinggi 1000 µg/ml menyebabkan persen kematian terbesar

yaitu 77,14 %.

Dari uji sitotosisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel

SiHa diperoleh harga LC50 sebesar 200,6 µg/ml. Berdasarkan NCI (National Cancer

Institute), suatu senyawa dinyatakan berpotensi sebagai antikanker bila memiliki

harga LC50

= 20 µg/ml (Suffness dan Pezzuto, 1991). Meskipun harga LC50 cukup

besar tetapi belum dapat mengatakan bahwa ekstrak etanolik daun sirih merah tidak

berpotensi sebagai antikanker dikarenakan senyawanya masih berupa ekstrak dan

belum berupa senyawa tunggal. Dapat dilihat dari tabel potensi ketoksikan dari tiap

penetapan, maka ekstrak etanolik daun sirih merah ini masih mempunyai kemampuan

untuk membunuh sel SiHa. Hal ini menunjukkan bahwa di dalam ekstrak etanolik


37

daun sirih merah ini mempunyai suatu senyawa yang dapat membunuh sel kanker,

meskipun dalam jumlah kecil.

Grafik log kadar vs angka probit

y = 1,039x + 2,6264R2 = 0,9999

0

1

2

3

4

5

6

7

-3 -2 -1 0 1 2 3 4

Log kadar

Ang

ka p

robi

t

Gambar 4. Grafik hubungan log kadar ekstrak etanolik daun sirih merah vs angka probit penetapan I


y = 1,095x + 2,466R2 = 1

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

-3 -2 -1 0 1 2 3 4

Log kadar

Ang

ka p

robi

t

Gambar 5. Grafik hubungan log kadar ekstrak etanolik daun sirih merah vs angka probit penetapan II


38


y = 1,087x + 2,491R2 = 1

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

-3 -2 -1 0 1 2 3 4

Log kadar

Ang

ka p

robi

t

Gambar 6. Grafik hubungan log kadar ekstrak etanolik daun sirih merah vs angka probit penetapan III

Untuk memperjelas hubungan antara kadar ekstrak etanolik daun sirih

merah yang diberikan dengan persen kematian sel yang diperoleh maka dibuat grafik

hubungan antara log kadar ekstrak etanolik daun sirih merah vs angka probit seperti

terlihat pada gambar 4, 5, dan 6. Pada gambar 4, 5, dan 6 terlihat bahwa terdapat

hubungan yang linier antara log kadar ekstrak etanolik daun sirih merah dengan

angka probit.

Selain itu dilakukan pula penelitian terhadap sel kanker yang lain, yaitu pada

sel HeLa dengan harga LC50 sebesar 1.143,1 µg/ml (Atmaningsih, 2008), sel Raji

dengan harga LC50 sebesar 395,5 µg/ml (Dwikusumaningtyas, 2008), sel T47D

dengan harga LC50 sebesar 587,7 µg/ml (Neritika, 2008), dan sel Myeloma dengan

harga LC50 sebesar 434,1 µg/ml (Meri, 2008). Berdasarkan harga LC50 yang

diperoleh, dapat dilihat bahwa masing-masing sel kanker mempunyai harga LC50


39

yang berbeda-beda. Hal ini kemungkinan disebabkan karena masing-masing sel

kanker mempunyai karakteristik dan morfologi sel yang berbeda pula, sehingga

besarnya harga LC50 yang diperoleh pada masing-masing sel kanker berbeda. Seperti

halnya pada sel HeLa, sel HeLa diketahui mempunyai membran sitoplasma yang

lebih tebal, oleh karenanya dibutuhkan jumlah ekstrak daun sirih merah yang lebih

besar untuk dapat berpenetrasi ke dalam sel.

Selain mengamati jumlah sel yang hidup yang merupakan implementasi

persen kematian sel, ketoksikan ekstrak etanolik daun sirih merah juga dapat dilihat

dari gambaran morfologi sel secara mikroskopik untuk mengetahui adanya perbedaan

morfologi sel yang dikenai perlakuan dan yang tidak dikenai perlakuan.

(a)

(c)

(b)

(d)

i

ii


40

Gambar 7. Foto penampakan morfologi sel SiHa dalam sumuran pada jam ke 24 (a) kontrol sel (b) perlakuan dengan ekstrak etanolik daun sirih merah kadar 250 µg/ml (c) perlakuan dengan ekstrak etanolik daun sirih merah kadar 500 µg/ml (d) perlakuan dengan ekstrak etanolik daun sirih merah kadar 750 µg/ml (perbesaran 100x) Ket : (i) sel hidup (ii) sel mati

Sel SiHa yang masih hidup tampak seperti helaian daun, berbentuk panjang,

tampak cerah dan menempel di dasar sumuran. Dikarenakan membran sel nya masih

utuh sehingga trypan blue tidak dapat berikatan dengan protein. Sel SiHa yang mati

tampak berbentuk bulat, tampak gelap keruh, berukuran lebih kecil, dan tidak

menempel di dasar sumuran. Hal ini dikarenakan pada sel yang mati terjadi kerusakan

membran yang mengakibatkan protein di dalam sel akan keluar dan berikatan dengan

trypan blue sehingga tampak berwarna biru.

Selain dari morfologi kita juga dapat mengetahui ketoksikan ekstrak

etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa dengan membandingkan kerapatan

sel antara kontrol media dengan perlakuan ekstrak etanolik daun sirih merah.

Semakin besar konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah, maka kerapatan sel

hidupnya akan semakin kecil. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak etanolik daun sirih

merah memberikan pengaruh dengan menginduksi kematian sel. Langkah lain yang

dapat ditempuh untuk memperkecil harga LC50 dari ekstrak etanolik daun sirih merah

ini adalah dilakukannya fraksinasi sehingga diperoleh senyawa-senyawa yang lebih

efektif dalam membunuh sel kanker.

Analisis variansi (anova) satu arah digunakan untuk menguji apakah rata-

rata lebih dari dua sampel berbeda signifikan atau tidak. Pada penelitian ini anova

digunakan untuk menguji apakah ada beda antara perlakuan dan kontrol. Sebelum


41

dilakukan analisis variansi (anova), terlebih dahulu dilakukan uji Kolmogorov-

Smirnov untuk mengetahui apakah data yang ada terdistribusi normal atau tidak. Dari

hasil uji Kolmogorov-Smirnov diperoleh hasil bahwa distribusinya normal. Dari hasil

analisis anova satu arah diperoleh hasil bahwa ada perbedaan secara signifikan antara

kelompok perlakuan dan kelompok kontrol yang digunakan (a < 0,05). Dengan

demikian, dapat disimpulkan bahwa ekstrak etanolik daun sirih merah mempunyai

efek sitotoksik terhadap kultur sel SiHa. Hasil penelitian ini tidak berbeda dengan

penelitian terhadap sel Hela, sel T47D, sel Raji, dan sel Myeloma, yakni sama-sama

mempunyai aktifitas sitotoksik karena hasilnya berbeda signifikan antara kontrol dan

tiap perlakuan. Selain uji-uji diatas, dilakukan juga uji linieritas untuk mengetahui

apakah data yang diperoleh linier atau tidak. Dari hasil analisis diperoleh bahwa

harga LC50 ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap sel SiHa signifikan untuk taraf

kepercayaan 95 %, di mana r hitung lebih besar dari r tabel. Pada penetapan I

diperoleh nilai r hitung = 0,99856 dan r tabel = 0,878; penetapan II diperoleh nilai r

hitung = 0,99914 dan r tabel = 0,878; dan penetapan III diperoleh nilai r hitung =

0,99927 dan r tabel = 0,878. Dari uraian nilai r hitung yang diperoleh dengan nilai r

tabel diatas dapat dilihat bahwa nilai r hitung yang diperoleh pada masing-masing

penetapan lebih besar dari nilai r tabel, maka dapat disimpulkan bahwa korelasinya

linier.


42

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Ekstrak etanolik daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) memiliki

efek sitotoksik terhadap kultur sel SiHa dengan harga LC50 sebesar 200,6 µg/ml.

B. Saran

1. Perlu dilakukan fraksinasi terhadap ekstrak etanolik daun sirih merah untuk

selanjutnya diteliti potensi sitotoksisitasnya.

2. Penelitian lebih lanjut untuk mengetahui sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih

merah terhadap sel normal.

3. Perlu dilakukan ekstraksi dengan pelarut yang berbeda, terutama pelarut nonpolar

yang dilanjutkan dengan uji sitotoksisitasnya untuk mengetahui potensi

ketoksikan pada pelarut tersebut.


43

DAFTAR PUSTAKA

Adyana, I.D.P., 2006, Efek Anti Telomerase Fraksi Alkaloid Terhadap Pembelahan dan Mitosis Sel Mieloma Mencit, Skripsi, Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga.

Albert, B., P., Lewis, J., Ratt, M., Roberts, K. dan Watson, J.D., 1994, Molecular

Biology of The Cell, Third Edition, Garland Publishing Inc., New York Angel, 2008, http://angel.crysta-corp.com/?p=51, diakses februari 2008 Anonim, 1986, Sediaan Galenik, 1-2, 10, Departemen Republik Indonesia, Jakarta Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, edisi IV, 7, Departemen Kesehatan Republik

Indonesia, Jakarta Anonim, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, cetakan I, 9-11,

Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta Anonim, 2007a, Apa Yang Harus Anda Ketahui Tentang Kanker,

http://www.mastel.or.id/indonesia/Artikel%20Kesehatan/Apa%20Yang%20Harus%20Anda%20Ketahui%20Tentang%20Kanker.htm, Diakses pada Oktober 2007

Anonim, 2007b, Piper crocatum taxonomy,

http://zipcadezoo.com/plants/p/piper_crocatum.asp, diakses pada tanggal 9 Agusus 2007

Anonim, 2007c, http://en.wikipedia.org/wiki/Cancer, diakses pada oktober 2007. Anonim, 2007d, SiHa Cell, http://www.bs.izs.it/cataloghi/cellule/308.htm, diakses

pada September 2007 Atmaningsih, F. R., 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah

(Piper crocatum Ruiz & Pav) Terhadap Kultur Sel HeLa, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Backer, C. A., dan Backuizen van den Brink, R. C.,1965, Flora of Java, Volume I

dan II, N. V. Noordhoff, Graningen. Barille, F.A., 1997, In Vitro Methods in Pharmaceutical Research, 2-3, 34-43,

Academic Press, Valencia, Spanyol.


44

Caltagirone, S., Rossi, C., Poggi, A., Ranelletti, F. O., Natali, P. G., Brunetti, M., Aiello, F.B., and Piantelli, M., 2000, Flavonoids Apigenin and Quercetin Inhibit Melanoma Growth and Metastatic Potential, Int J Cancer, 87 : 595-600.

Castell, J. V., & Gomez-Lechon, M. J., 1997, In Vitro Methods in Pharmaceutical

Research, 3-6, Academic Press, California. Chabner, B.A., D.P.Rian, L.Paz-Ares, R.G. Carbonero, and P. Calabresi, 2001,

Antineoplastic Agents In Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th Edition, Graw-Hill, Medical Publishing Division, P.1417-1421.

Dalimartha, Setiawan, 2006, Ramuan Tradisional Untuk Pengobatan Kanker, cetakan

8, Penerbit Swadaya, Jakarta. De Muth, James E., 1999, Basic Statistics And Pharmaceutical Statistical

Applications, 585, Marcel Dekker, Inc., New York Doyle, A., and Griffiths, J.B., 2000, Cell and Tissue Culture for Medical Research,

John Willey and Sons Ltd, New York, 12-16, 47-50, 402 – 415 Dwikusumaningtyas, E., 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah

(Piper crocatum Ruiz & Pav) Terhadap Kultur Sel Raji, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Freshney, R.I., 1986, Animal Cell Culture A Practical Approach, 1st Edition, 71-73,

IRL Press, Washington DC Freshney, R.I., 2000, Culture of Animal Cells, A manual of Basic Technique, 4th

Edition, 71-73, A John Wiley & Sons, inc, New York Ganiswara, S.G dan Nafrialdi, 1995, Antikanker dan Immunosupresan dalam

Farmakologi dan Terapi, Edisi 4, editor Sulistia G. Ganiswara dkk, 686-687, Bagian Farmakologi, Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta

Gill, S.M.K., N. Balasioner, and P. Parte, 2001, Intermitent Treatment With

Taxmoxiven on Reproduction in Male Rat, Asian. J. Andri 3(2)-P 155-158. Grotewold, Erich, 2006, The Science of Flavonoids, Departement of Cellular and

Molecular Biology, Springer Science Business Media, Inc, The Ohio State University Columbus, Ohio, USA.


45

Hagman, D.E., 2005, Sterilization, in, Beringer, Paul., Remington’s The Science and Practice of Pharmacy, 21th edition, 776-781, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia.

Hanahan, D., dan Weinberg, R. A., 2000, The Hallmarks of Cancer, Cell 100, 57-70 Harborne, J. B., 1987, Metode Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisis

Tumbuhan, Terbitan kedua, Penerbit ITB, Bandung. Igura, K., Ohta T., Kuroda Y., and Kaji K., 2001, Resveratrol and Quercetin Inhibit

Angiogenesis in Vitro, Cancer Lett, 171 (1): 11-6. Jacoby, W.B., and Pastan, I.H., 1979, Methods in Enzymology Cell Culture, Volume

VIII, Academia Press Inc, New York. Jujena, P., S. M.K.Gill., S. Dsolisa., V. Padwai., N. Balasimor., M. Aleem, and Zool,

2001, Anti Fertility Effect Estradiol in Adult Female Rat, J. Endokrinol. Invest 249(8): 598-607.

King, R.J.B., 2000, Cancer Biology, 2nd

edition, School of Biological Sciences, University of Surrey, England.

Macdonald F. and Ford C.H.J., 1997, Molecular Biology of Cancer, edisi I, 1-2, Bios

Scientific Publisher Ltd, Oxford OX4 IRE, UK Meleka, F.M., 1983, Dimensions of the Cancer Problem, 5-9, Karger, New York. Meri, 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum

Ruiz & Pav) Terhadap Kultur Sel Myeloma, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Meyer, B.N., Ferrigni, N.R., Putnam, J.E., Jacobsen, L.B., Nochols, D.E., Mc

Laughlin, J.L., 1982, Brine Shrimp: A Convenient General Bioassay for Active Plant Concenient, Planta Medica, Volume 45, 32-34.

Miller, R. E., Rausher, M. D., dan Manos, P. S., 1996, Phylogenetic Systematics of

Ipomoea (Convolvulaceae) Based on ITS and Waxy Sequence, Syst Bot, No. 24, 209-227.

Miyagi, Y., Om, A. S., Chee, K. M., and Bennink, M. R., 2000, Inhibition of

Azoxymethane-Induced Colon Cancer by Orange Juice, Nutr Cancer, 36: 224-229.


46

Mursyidi, A., 1985, Statistika Farmasi dan Biologi, 101-102, 157, Penerbit Ghalia Indonesia, Jakarta

Neritika, Kartina., 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper

crocatum Ruiz & Pav) Terhadap Kultur Sel T47D, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Ness, A. R., and Powles, J. W., 1997, Fruit and Vegetables, and Cardiovascular

Disease: a review, Int J Epidemiol, 26: 1-13. Robinson, T., 1995, Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, terjemahan oleh Kosasih

Padmawinata, edisi ke enam, Penerbit ITB, Bandung. Sambrook, Fritsch, E.F., Maniatis, T., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory

Manual, 2nd Edition, Coldspring Harbor Laboratory Press. Sherr, C.J., 1996, Cancer Cell Cycle, Science, Volume 274, 5293, 1672 – 1677. So, F. V., Guthrie, N., Chambers, A. F., Moussa, M., and Carroll, K. K., 1996,

Inhibition of Human Breast Cancer Cell Proliferation and Delay of Mammary Tumorigenesis by Flavonoids and Citrus Juices, Nutr Cancer, 26: 167-181.

Soedibyo, M., 1998, Alam Sumber Kesehatan, Manfaat dan Kegunaan, cet 1, Balai

Pustaka, Jakarta Soeripto, 1998, Mekanisme Molekuler Karsinogenesis, Bagian Patologi Anatomi,

Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Sofyan, R., 2000, Terapi Kanker Pada Tingkat Molekuler, Cermin Dunia Kedokteran,

No.127, 5-10. Sudewo, B., 2005, Basmi Penyakit dengan Sirih Merah, cet I, 39-41, P.T. Agromedia

Pustaka, Jakarta Suffness, M., dan Pezzuto, J.M., 1991, Assay Related to Cancer Drug Discovery,

Methods in Plant Biochemistry: Assay for Bioactivity, Volume VI, 71-133, Academic Press, London.

Tosetti, F., Ferrari, N., de Flora S., and Albini A., 2002, ‘Angioprevention’:

Angiogenesis is a Common and Key Target for Cancer Chemopreventive Agents, FASEB J., 16:2-14.


47

Lampiran 1

Foto tanaman sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav)

Gambar 8. Foto tanaman sirih merah


48

Lampiran 2 Data uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) terhadap kultur sel SiHa

Tabel III. Jumlah sel SiHa yang hidup dari tiap sumuran hasil perhitungan langsung (direct counting) pada haemocytometer :

Penetapan

No Kadar

Ekstrak Sirih Merah (µg/ml) I II III

1 Kontrol 70 70 70 2 1000 16 16 16 3 750 18 18 18 4 500 24 24 24 5 250 32 33 32 6 125 40 41 41

Tabel IV. Hasil perhitungan jumlah sel SiHa yang hidup dari masing-masing sumuran

Penetapan I

No. Rata-rata jumlah sel

hidup kontrol (sel/ml)

Kadar ekstrak sirih merah (µg/ml)

Jumlah sel hidup (sel/ml)

1 1000 8.000 2 750 9.000 3 500 12.000 4 250 16.000 5

35.000

125 20.000

Penetapan II





1 1000 8.000 2 750 9.000 3 500 12.000 4 250 16.500 5

35.000

125 20.500


49

Penetapan III





1 1000 8.000 2 750 9.000 3 500 12.000 4 250 16.000 5

35.000

125 20.500

Tabel V. Persentase kematian sel SiHa

Persen kematian sel SiHa (%) Kadar ekstrak etanolik daun sirih merah

(µg/ml) Penetapan I Penetapan II Penetapan III

125 42,86 41,43 41,43 250 54,29 52,86 54,29 500 65,71 65,71 65,71 750 74,29 74,29 74,29 1000 77,14 77,14 77,14


50

Lampiran 3 Uji distribusi data dengan Kolmogorov-Smirnov pada sel SiHa

& Analisis Hasil dengan One Way Anova

One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test SiHa

LC50 N 18

Mean 16750,0000

Normal Parameters(a,b)

Std. Deviation 9445,27582

Absolute ,192 Positive ,192

Most Extreme Differences

Negative -,177 Kolmogorov-Smirnov Z ,817 Asymp. Sig. (2-tailed) ,517

a Test distribution is Normal. b Calculated from data. ANOVA LC50

Sum of

Squares Df Mean Square F Sig. Between Groups 151629166

6,667 5 303258333,333 10917,300 ,000

Within Groups 333333,333 12 27777,778

Total 1516625000,000 17


51

Lampiran 4 Cara perhitungan jumlah sel SiHa yang hidup dalam tiap sumuran hasil

perhitungan langsung (direct counting)

Jumlah sel SiHa yang hidup dari tiap sumuran hasil perhitungan langsung (direct

counting), dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut :

Jumlah sel/sumuran = 4X

x 10 x 200

Keterangan :

X = jumlah sel hidup hasil perhitungan langsung pada haemocytometer

4 = jumlah bilik dalam haemocytometer

10 = jumlah volume yang masuk dalam bilik haemocytometer (10 µl)

200 = jumlah volume total (200 µl)

Kontrol

Penetapan I = 470

x 10 x 200 = 35.000

Penetapan II = 470

x 10 x 200 = 35.000

Penetapan III = 470

x 10 x 200 = 35.000

Rata-rata kontrol = 3

000.35000.35000.35 ⊕⊕ = 35.000


52

Kadar 1000 µg/ml

Penetapan I = 416

x 10 x 200 = 8.000

Penetapan II = 416

x 10 x 200 = 8.000

Penetapan III = 416

x 10 x 200 = 8.000

Kadar 750 µg/ml

Penetapan I = 418

x 10 x 200 = 9.000

Penetapan II = 418

x 10 x 200 = 9.000

Penetapan III = 418

x 10 x 200 = 9.000

Kadar 500 µg/ml

Penetapan I = 424

x 10 x 200 = 12.000

Penetapan II = 424

x 10 x 200 = 12.000

Penetapan III = 424

x 10 x 200 = 12.000


53

Kadar 250 µg/ml

Penetapan I = 432

x 10 x 200 = 16.000

Penetapan II = 433

x 10 x 200 = 16.500

Penetapan III = 432

x 10 x 200 = 16.000

Kadar 125 µg/ml

Penetapan I = 440

x 10 x 200 = 20.000

Penetapan II = 441

x 10 x 200 = 20.500

Penetapan III = 441

x 10 x 200 = 20.500


54

Lampiran 5 Cara perhitungan persentase kematian sel SiHa

Presentase kematian sel SiHa dapat dihitung dengan menggunakan rumus

sebagai berikut :

% kematian sel

= %100×−

∑∑ ∑

kontrolkelompokhidupsel

perlakuankelompokhidupselkontrolkelompokhidupsel

Kadar 1000 µg/ml

Penetapan I = 000.35

000.8000.35 − x 100 % = 77,14 %

Penetapan II = 000.35

000.8000.35 − x 100 % = 77,14 %

Penetapan III = 000.35

000.8000.35 − x 100 % = 77,14 %

Kadar 750 µg/ml


000.9000.35 − x 100 % = 74,29 %


000.9000.35 − x 100 % = 74,29 %


000.9000.35 − x 100 % = 74,29 %


55

Kadar 500 µg/ml


000.12000.35 − x 100 % = 65,71 %


000.12000.35 − x 100 % = 65,71 %


000.12000.35 − x 100 % = 65,71 %

Kadar 250 µg/ml


000.16000.35 − x 100 % = 54,29 %


500.16000.35 − x 100 % = 52,86 %


000.16000.35 − x 100 % = 54,29 %

Kadar 125 µg/ml


000.20000.35 − x 100 % = 42,86 %


500.20000.35 − x 100 % = 41,43 %


500.20000.35 − x 100 % = 41,43 %


56

Lampiran 6 Cara perhitungan harga LC50

Perhitungan harga LC50 dilakukan dengan : antara log kadar dan angka probit dibuat

hubungan regresi liniernya.

Penetapan I

A = 2,62639

B = 1,03896

r = 0,99856

Y = BX + A

Y = 1,03896 X + 2,62639

5 = 1,03896 X + 2,62639

5 – 2,62639 = 1,03896 X

X = 03896,137361,2

X = 2,28460191

LC50 = anti log x

LC50 = anti log 2,28460191


57

Penetapan II

A = 2,46598

B = 1,09497

r = 0,99914

Y = BX + A

Y = 1,09497 X + 2,46598

5 = 1,09497 X + 2,46598

5 – 2,46598 = 1,09497 X

X = 09497,153402,2

X = 2,31423692

LC50 = anti log x

LC50 = anti log 2,31423692


58

Penetapan III

A = 2,49094

B = 1,08696

r = 0,99927

Y = BX + A

Y = 1,08696 X + 2,49094

5 = 1,08696 X + 2,49094

5 – 2,49094 = 1,08696 X

X = 08696,150906,2

X = 2,308327813

LC50 = anti log x

LC50 = anti log 2,308327813

Rata-rata LC50 = anti log (3

308327813,231423692,22,28460191 ++)

LC50 = anti log 2,302388881

= 200,6 µg/ml


59

Lampiran 7 Perhitungan nilai korelasi LC50 ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap sel

SiHa pada taraf kepercayaan 95%

Tabel VI. Nilai r (koefisien korelasi) pada level signifikansi 5% dan 1% Degrees of Freedom

(DF) 5% 1%

1 .997 1.000 2 .950 .990 3 .878 .959 4 .811 .917 5 .754 .874 6 .707 .831 7 .666 .798 8 .632 .765 9 .602 .735 10 .576 .708 11 .553 .684 12 .532 .661 13 .514 .641 14 .497 .623 15 .482 .606 16 .468 .590 17 .456 .575 18 .444 .561 19 433 .549 20 .423 .537 21 .413 .526 22 .404 .515 23 .396 .505

(De Muth, 1999)


60

Nilai korelasi ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap sel SiHa : § Penetapan 1 :

r2 = 0,9999 r = 0,99856 [rtabel (95%, 3) = 0,878] ----- rhitung > rtabel, sehingga korelasinya linier -----

§ Penetapan 2 : r2 = 1 r = 0,99914 [rtabel (95%, 3) = 0,878] ----- rhitung > rtabel, sehingga korelasinya linier -----

§ Penetapan 3 : r2 = 1 r = 0,99927 [rtabel (95%, 3) = 0,878] ----- rhitung > rtabel, sehingga korelasinya linier -----


61

Lampiran 8

Grafik hubungan antara log kadar dengan angka probit

Penetapan I


y = 1,039x + 2,6264R2 = 0,9999

0

1

2

3

4

5

6

7

-3 -2 -1 0 1 2 3 4

Log kadar

Ang

ka p

robi

t

Penetapan II


y = 1,095x + 2,466R2 = 1

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

-3 -2 -1 0 1 2 3 4

Log kadar

Ang

ka p

robi

t


62

Penetapan III


y = 1,087x + 2,491R2 = 1

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

-3 -2 -1 0 1 2 3 4

Log kadar

Ang

ka p

robi

t

Gambar 9. Grafik hubungan antara log kadar ekstrak sirih merah vs angka probit pada sel

SiHa


63

Lampiran 9

HARGA PROBIT SESUAI DENGAN PERSENTASENYA

Probit Persentase 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

0 - 2,67 2,95 3,12 3,25 3,36 3,45 3,52 3,59 3,66 10 3,72 3,77 3,82 3,87 3,92 3,96 4,01 4,05 4,08 4,12 20 4,16 4,19 4,23 4,26 4,29 4,33 4,36 4,39 4,42 4,45 30 4,48 4,50 4,53 4,56 4,59 4,61 4,64 4,67 4,69 4,72 40 4,75 4,77 4,80 4,82 4,85 4,87 4,90 4,92 4,95 4,97 50 5,00 5,03 5,05 5,08 5,10 5,13 5,15 5,18 5,20 5,23 60 5,25 5,28 5,31 5,33 5,36 5,39 5,41 5,44 5,47 5,50 70 5,52 5,55 5,58 5,61 5,64 5,67 5,71 5,74 5,77 5,81 80 5,84 5,88 5,92 5,95 5,99 6,04 6,08 6,13 6,18 6,23 90 6,28 6,34 6,41 6,48 6,55 6,64 6,75 6,88 7,05 7,33

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 99 7,33 7,37 7,41 7,46 7,51 7,58 7,65 7,75 8,88 8,09

(Mursyidi, 1985)


64

Lampiran 10

Foto alat dan bahan yang digunakan saat penelitian

96-well plate (Nunc) tissue culture flask (Nunc)

cell counter (Nunc) & haemocytometer (Neubauer) Pereaksi-pereaksi yang digunakan


65

swing rotor sentrifuge

mikroskop (Olympus IMT-2)


66

laminar air flow (Labconco)

96-well plate (Nunc) dengan perlakuan

Gambar 10. Foto alat dan bahan


67

Lampiran 11


68

BIOGRAFI PENULIS

Penulis bernama Nur’aniyah yang lahir pada tanggal 30 Desember 1985 di

Indramayu, Jawa Barat. Penulis merupakan anak ketiga dari pasangan Bapak

Wadirah dan Ibu Carmi. Tahun 1992 menempuh pendidikan di SD Bugel VI Sukra,

Indramayu dan lulus pada tahun 1998. Kemudian tahun 1998 sampai tahun 2001

menempuh pendidikan di SLTP Negeri 1 Sukra, Indramayu. Setelah menyelesaikan

pendidikan SLTP, tahun 2001 melanjutkan ke SMU Bruderan Purwokerto dan lulus

pada tahun 2004. Tahun 2004 penulis melanjutkan pendidikan S1 di Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.


plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - core.ac.uk · v halaman persembahan sesungguhnya sesudah...

Documents