plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - core.ac.uk · sel, kerusakan struktur sel, molekul...

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN RADIKAL 1,1-DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL (DPPH) DAN PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT SARI BUAH APEL BLUDRU

(Diospyros blancoi A. DC.)

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Johanes Baptista Yunio Rahmawan

NIM : 098114086

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA 2013

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN RADIKAL 1,1-DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL (DPPH) DAN PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT SARI BUAH APEL BLUDRU

(Diospyros blancoi A. DC.)

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Johanes Baptista Yunio Rahmawan

NIM : 098114086

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA 2013


ii


iii


iv


v


vi

HALAMAN PERSEMBAHAN

“Sumeh, ngrepepeh, loma,

seneng-seneng dinggo nggoleki

sing disenengi”

Kerto Wiharjo (alm.)

“Memperbaiki masa lalu bukanlah kemajuan, mengambil langkah pasti kedepan, itulah kemajuan”

(Kahlil Gibran)

Kupersembahkan Skripsi ini untuk :

Tuhan Yesus Kristus, Sang Terang

yang telah membimbing hidupku hingga saat ini.

Ibu dan Ayah yang telah mengajarkan nilai-nilai kehidupan.

Keluarga besar Eyang Mpu Kromo Sentono, kerabat Singo Yudho

Terimakasih atas dukungannya baik moril maupun materil.


vii

PRAKATA

Puji Syukur kepada Tuhan atas semua berkat dan penyertaan-Nya kepada

penulis sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “UJI

AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN RADIKAL 1,1-DIFENIL-

2-PIKRILHIDRAZIL (DPPH) DAN PENETAPAN KANDUNGAN

FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT SARI BUAH APEL BLUDRU

(Diospyros blancoi A. DC.)” ini dengan baik. Laporan akhir ini disusun untuk

memenuhi salah satu persyaratan utnuk memperoleh gelar Sarjana Strata 1

Program Studi Ilmu Farmasi (S.Farm).

Penulis banyak mengalami kesulitan dan masalah dalam menyelesaikan

laporan ini. Tetapi dengan adanya bantuan dari berbagai pihak, akhirnya penulis

dapat menyelesaikan laporan akhir ini. Oleh karena itu dengan segala kerendahan

hati penulis ingin mengucapkan terima kasih atas segala bantuan yang telah

diberikan kepada:

1. Ipang Djunarko,M.Sc.,Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma.

2. Yohanes Dwiatmaka,M.Si., selaku Dosen Pembimbing yang telah memberikan

bantuan dan bimbingan selama rancangan, pengusulan skripsi, saat dilakukan

penelitian dan selama penulisan skripsi dengan kesabaran dan penuh perhatian.

3. Prof.Dr.C.J. Soegihardjo,Apt., selaku Dosen Penguji yang menguji sekaligus

memberi arahan, kritik, dan saran yang membangun bagi penulis.

4. Jeffry Julianus, M.Si., selaku Dosen Penguji yang menguji sekaligus memberi

arahan, kritik, dan saran yang membangun bagi penulis.


viii

5. Keluarga (Ibu, Ayah, kakak tercinta) dan keluarga besar Eyang Mpu Kromo

Sentono atas kasih sayang dan dukungan yang telah diberikan kepada penulis,

baik itu secara moral maupun materil.

6. Segenap laboran Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia (Mas Wagiran) dan

Farmasi Fisika (Om Agung) atas segala bantuan selama penulis melakukan

penelitian di laboratorium Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia dan Farmasi

Fisika.

7. Yulio Nur Aji Surya dan Theresia Nindyati, tim DPPH yang kompak, saling

mengisi kekurangan dan memperjuangkan tujuan. Tanpa kalian skripsi ini tidak

akan selesai.

8. Teman-teman FST 2009, atas kerjasama, doa, semangat, kritik, saran, kegilaan,

canda tawa, segala kritik dan masukannya.

9. Semua pihak yang telah memberikan bantuan dan dukungan yang tidak dapat

disebut satu per satu.

Penulis menyadari bahwa dalam penulisan skripsi ini banyak kesalahan

dan kekurangan mengingat keterbatasan kemampuan dan pengetahuan penulis.

Untuk itu penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun dari semua

pihak. Akhir kata semoga laporan ini dapat berguna bagi pembaca.

Yogyakarta, Juli 2013

Penulis


ix

DAFTAR ISI

Halaman HALAMAN JUDUL…………………………………………………….. i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING…………………………. ii

HALAMAN PENGESAHAN…………………………………………… iii

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA…………………………………. iv

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA... v

HALAMAN PERSEMBAHAN.........................................................……. vi

PRAKATA………………………………………………………………. vii

DAFTAR ISI…………………………………………………………….. ix

DAFTAR TABEL……………………………………………………….. xiii

DAFTAR GAMBAR…………………………………………………….. xiv

DAFTAR LAMPIRAN…………………………………………………... xvi

INTISARI……………………………………………………………….... xvii

ABSTRACT…………………………………………………………….... xiii

BAB I PENGANTAR……………………………………………………. 1

A. Latar Belakang………………………………………………………… 1

B. Permasalahan………………………………………………………...... 3

C. Keaslian penelitian…………………………………………………..... 3

D. Manfaat penelitian………………………………………………......... 4

E. Tujuan umum dan khusus .................................................................... 4

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA…………………………………….. 5

A. Tanaman Apel Beludru………………………………………………… 5

1. Klasifikasi tanaman ..……………………………………………… 5


x

2. Nama ain…..……………………………………………................. 5

3. Gambaran umum apel beludru…………………………………….. 5

4. Penyebaran tanaman………………………………………………... 6

5. Kandungan kimia apel beludru ……………………………………. 6

B. Senyawa Fenolik……………………………………………………... 7

C. Metode Folin-Ciocalteu…………………………………………….... 9

D. Radikal Bebas ….……..……………………………………………… 10

E. Antioksidan . ......................................................................................... 11

F. Metode DPPH ……………………………………………………….. 12

G. Ekstraksi ……………………………………………............................ 13

H. Spektrofotometri …………………………………… .………………. 14

I. Landasan Teori ………………………………………………………. 15

J. Hipotesis ……………………………………………………………... 16

BAB III METODE PENELITIAN………………………………............ 17

A. Jenis dan Rancangan Penelitian………………………………………. 17

B. Variabel……………………………………………………………….. 17

1. Variabel bebas……………………………………………………... 17

2. Variabel tergantung………………………………………………… 17

3. Variabel pengacau terkendali……………………………………… . 17

4. Variabel pengacau tak terkendali………………………………….. . 17

C. Definisi Operasional............................................................................ 17

D. Bahan dan Alat Penelitian .................................................................... 18

1. Bahan penelitian ............................................................................... 18


xi

2. Alat penelitian .................................................................................. 18

E. Tatacara Penelitian ............................................................................... 19

1. Determinasi tanaman ........................................................................ 19

2. Pengumpulan bahan ......................................................................... 19

3. Preparasi buah apel beludru ............................................................. . 19

4. Pembuatan larutan pembanding dan uji ........................................... 20

5. Uji pendahuluan ............................................................................... 21

6. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total ..................... 22

7. Penetapan kandungan fenolik total ................................................. 23

8. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan ...................................... 23

9. Uji aktivitas antioksidan .................................................................. 24

10. Analisis hasil ................................................................................. 25

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................... 26

A. Hasil Determinasi Tanaman ................................................................. 26

B. Hasil Pengumpulan Bahan .................................................................. 26

C. Hasil Preparasi Sampel ........................................................................ 28

1. Hasil pembuatan sari buah .............................................................. 28

2. Hasil fraksinasi sari buah ................................................................. 29

D. Hasil Uji Pendahuluan ......................................................................... 31

1. Uji pendahuluan senyawa fenolik. .………..……..….….………… 31

2. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan …………………………… 32

E. Hasil Optimasi Metode Uji Fenolik Total..…..……..……..……....... 33

1. Penentuan Operating time (OT) ……............................................. 33


xii

2. Penentuan panjang gelombang maksimum………………….......... 34

F. Hasil Estimasi Kandungan Fenolik Total…....…....…........................ 35

G. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan….....…...…......... 38

1. Penentuan panjang gelombang maksimum………………...……... 38

2. Penentuan Operat Time…………………..…................................. 40

H. Estimasi Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH……………… 41

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN…………………………………. 51

A. Kesimpulan…………………………………………………………… 51

B. Saran………………………………………………………………….. 51

DAFTAR PUSTAKA…………………………………………………… 52

LAMPIRAN……………………………………………………………… 57

BIOGRAFI PENULIS…………………………………………………… 92


xiii

DAFTAR TABEL

Halaman Tebel I. Hasil Scanning panjang gelombang maksimum asam galat

yang direaksikan dengan folin ciocalteu.................................. 35

Tabel II. Hasil pengukuran absorbansi seri baku asam galat yang

direaksikan dengan folin-ciocalteu ....................................... 36

Tabel III. Hasil penentuan jumlah fenolik total fraksi etil asetat sari buah

apel beludru ........................................................................... 37

Tabel IV. Hasil scanning panjang gelombang maksimum pada berbagai

konsentrasi ............................................................................. 39

Tabel V. Hasil aktivitas antioksidan kuersetin dengan metode DPPH. 45

Tabel VI. Hasil aktivitas antioksidan fraksi etil asetat sari buah apel

beludru dengan metode DPPH ............................................. 46

Tabel VII. Hasil perhitungan IC50 kuersetin dan fraksi etil asetat

sari buah apel beludru ........................................................... 47

Tabel XIV. Penggolongan tingkat kekuatan antioksidan kuersetin dan

fraksi etil asetat sari buah apel beludru.................................... 50


xiv

DAFTAR GAMBAR

Halaman Gambar 1. Struktur kuersetin (Apak dkk., 2007) ……........................ 7

Gambar 2. Struktur kimia dari beberapa tipe flavonoid

(Shandar et al., 2011) ……………………………………. 8

Gambar 3. Struktur asam galat

(Kalita, Kar dan Handique)……………………………… 9

Gambar 4. Senyawa fenolik dalam suasana basa

(Sambada, 2011)….….....…...…...….…...…..….….….…. 10

Gambar 5. Reaksi senyawa fenolik dengan pereaksi Folin-Ciocalteu

(Sambada, 2011)….….....…...…...….…...…..….….….…. 10

Gambar 6. 1,1-Diphenyl-2-picryl hydrazyl

(Molyneux, 2004)….….....…...…...….…...…..….….….…. 13

Gambar 7. Uji pendahuluan keberadaan senyawa

fenolik………………………………………………........... 32

Gambar 8. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan........…..................... 33

Gambar 9. Grafik penentuan OT asam galat......................................... 34

Gambar 10. Kurva kalibrasi asam galat dalam penetapan fenolik total... 37

Gambar 11. Grafik penentuan OT kuersetin...………............................. 40

Gambar 12. Grafik penentuan OT fraksi etil asetat................................. 41

Gambar 13. Reaksi antara radikal DPPH dengan senyawa

antioksidan(Nisizawa, 2005)................................................ 43

Gambar 14. Konsentrasi kuersetin Vs % IC…............................................ 46

Gambar 15. Konsentrasi fraksi etil asetat Vs % IC.................................. 47


xv

Gambar 16. Histogram rerata IC50 dari kuersetin dan fraksi etil asetat dengan

interval kepercayaan 95%..................................................... 49


xvi

DAFTAR LAMPIRAN Halaman

Lampiran 1. Surat pengesahan determinasi tanaman apel beludru

(Diospyros blancoi A. DC.).................................................. 57

Lampiran 2. Gambar tanaman apel beludru yang diambil di kompleks

Universitas Sanata Dharma ................................................ 58

Lampiran 3 Perhitungan rendemen ........................................................ 59

Lampiran 4. Data penimbangan untuk pengujian aktivitas

Antioksidan ........................................................................ 60

Lampiran 5. Data perhitungan konsentrasi DPPH, larutan pembanding,

dan larutan uji ................................................................... 62

Lampiran 6. Scanning pengkoreksi ........................................................ 66

Lampiran 7. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan ......................... 69

Lampiran 8. Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal

DPPH .................................................................................. 75

Lampiran 9. Perhitungan nilai IC50 kuersetin dan fraksi etil asetat

sari buah apel beludru ......................................................... 78

Lampiran 10. Penimbangan uji kandungan fenolik total ......................... 79

Lampiran 11. Scanning kontrol asam galat ............................................... 80

Lampiran 12. Optimasi penentuan kandungan fenolik total ..................... 80

Lampiran 13. Penentuan kandungan fenolik total ..................................... 85

Lampiran 14. Uji statistik............................................................................ 90


xvii

INTISARI

Antioksidan berperan dalam menghambat oksidasi dengan mengikat radikal bebas. Akibatnya kerusakan sel yang berujung pada penyakit degeneratif dapat dihambat. Penelitian ini dilakukan untuk menentukan aktivitas antioksidan serta kandungan fenolik total fraksi etil asetat sari buah apel beludru (Diospyros blancoi A. DC.). Sebelumnya telah diketahui tanaman lain yang bergenus Diospyros memiliki kandungan senyawa fenolik berupa kuersetin.

Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan secara kuantitatif maupun kualitatif menggunakan radikal 1,1 difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) dan dinyatakan dengan nilai Inhibition Concentration 50 (IC50). Keberadaan senyawa beraktivitas antioksidan akan mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi kuning. Penentuan fenolik total dengan metode Folin-Ciocalteu dinyatakan dengan nilai massa ekuivalen asam galat. Senyawa fenolik akan dioksidasi oleh Folin-Ciocalteu dalam suasana basa sehingga terbentuk larutan dengan warna biru.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat sari buah apel beludru mempunyai aktivitas antioksidan sangat kuat dengan nilai IC50 sebesar (30.0 ± 0,09) µg/mL. Kandungan fenolik total sebesar (393.5 ± 0.35) mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat.

Kata kunci: Antioksidan, buah apel beludru (Diospyros blancoi A. DC), fraksi

etil asetat, DPPH, kandungan fenolik total


xviii

ABSTRACT

Antioxidant plays a role in inhibiting oxidation by binding to free radicals. As a result, the cell damage that leads to degenerative diseases can be inhibited. This research was conducted to determine the antioxidant activity and total phenolic content of ethyl acetate fraction of velvet aple (Diospyros blancoi A. DC.) juice. Previously known that other plants from genus Diospyros contain phenolic compounds such as quercetin.

Antioxidant activity test performed quantitatively and qualitatively using radical 1,1-diphenyl-2 pikrilhidrazil (DPPH) and expressed as the value Inhibition Concentration 50 (IC50). The existence of active antioxidant compounds will change DPPH color from purple to yellow. Determination of total phenolic using Folin-Ciocalteu method expressed as equivalent mass of gallic acid. Phenolic compounds will be oxidized by the Folin-Ciocalteu under alkaline conditions, forming a blue solution.

The results showed that the ethyl acetate fraction of velvet apple juice has very strong antioxidant activity with IC50 of (30.0 ± 0.09) mg / mL. Total phenolic content of (393.5 ± 0.35) mg gallic acid equivalents per gram of ethyl acetate fraction.

Keywords: antioxidant, velvet apple (Diospyros blancoi A. DC), ethyl acetate fraction, DPPH, total phenolic content


1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Radikal bebas adalah atom atau molekul yang mempunyai elektron tidak

berpasangan pada orbital terluarnya sehingga bersifat reaktif (Clarkson and

Thompson, 2000). Untuk mencapai kestabilan radikal bebas mencari pasangan

elektron dari molekul disekitarnya (Frei, 1994; Trevor, 1995; Prakash, 2001).

Berbagai kemungkinan dapat terjadi akibat radikal bebas seperti gangguan fungsi

sel, kerusakan struktur sel, molekul termodifikasi yang tidak dikenali sistem imun,

dan bahkan mutasi. Target utama radikal bebas adalah protein, asam lemak tak

jenuh dan lipoprotein, serta unsur DNA (Winarsi, 2007).

Menurut Suhartono (2002) antioksidan adalah senyawa kimia yang dapat

menyumbangkan elektron, sehingga suatu radikal bebas dapat diredam. Secara

alami tubuh memiliki antioksidan endogen seperti enzim SOD (superoxyde

dismutase), glutation, dan katalase yang dapat menetralkan radikal bebas, namun

jumlahnya terbatas sehingga membutuhkan suplai antioksidan dari luar tubuh

(Frei, 1994; Trevor, 1995; Prakash, 2001).

Antioksidan dapat berasal dari bahan alam maupun sintetis. Efek samping

antioksidan sintetik yang belum diketahui menyebabkan antioksidan alami

menjadi alternatif yang dibutuhkan (Sunarni, 2005). Oleh sebab itu eksplorasi

sumber antioksidan alam yang berasal dari tumbuhan semakin berkembang.

Senyawa-senyawa polifenol mampu menghambat autooksidasi melalui

mekanisme radikal scavenging dengan menyumbangkan satu elektron yang tidak


2

berpasangan pada radikal bebas (Pokorny, Yanishlieva, and Gordon, 2001).

Penelitian yang dilakukan oleh Lee, Jiang, Juan, Lin, and Hou (2006)

menunjukkan bahwa Diospyros blancoi A. DC. mengandung konstituen fenolik

lebih dari 30 mg ekivalen asam galat per gram ekstrak tanaman. Sehingga tujuan

penelitian ini adalah untuk mengetahui aktivitas antioksidan dari apel bludru

khususnya pada bagian buah (fructus).

Apel bludru umumnya digunakan penduduk Asia Tenggara untuk masalah

jantung, hipertensi, diabetes, gigitan ular dan serangga, serta digunakan untuk

diare (Das, Hamid, Bulubul, Sultana, and Islam, 2010). Kuersetin yang

merupakan salah satu anggota flavonoid ditemukan pada tanaman yang masih satu

genus dengan apel bludru (Diospyros blancoi) yaitu American Persimmon

(Diospyros virginiana L ) (Duke, 2001), sehingga diperkirakan apel bludru juga

memiliki kandungan flavonoid.

Digunakan pelarut air karena senyawa fenolik merupakan metabolit

sekunder yang mempunyai cincin aromatik yang terikat dengan satu atau lebih

substituen gugus hidroksil (-OH) sehingga pada umumnya larut dalam pelarut

polar (Markham, 1988). Fraksi etil asetat digunakan dalam penelitian karena

merupakan pelarutyang paling baik untuk aglikon flavonoid dan dianjurkan untuk

proses pemurnian (Robinson, 1995).

Penentuan aktivitas antioksidan dalam penelitian ini menggunakan metode

DPPH. Radikal DPPH memiliki kemampuan untuk direduksi atau distabilisasi

oleh antioksidan diukur dengan menentukan penurunan absorbansi pada panjang

gelombang 517 nm. Oleh karena itu DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) biasa


3

digunakan untuk mengkaji kapasitas penangkapan radikal (Duh et al., 1999). Nilai

aktivitas antioksidan diketahui melalui nilai IC merupakan konsentrasi yang

menyebabkan penurunan 50% dari konsentrasi DPPH awal (Sunarni, 2005). Pada

penelitian ini juga dilakukan penentuan kandungan fenolik total dengan metode

Folin-Ciocalteau sebagai standar penentuan kandungan fenolik total setara massa

ekivalen asam galat pada uji aktivitas antioksidan (Aqil et al., 2006).

B. Permasalahan

1. Berapakah kandungan fenolik total fraksi etil asetat sari buah apel bludru yang

dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat ?

2. Berapakah nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat sari buah apel bludru

dengan menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan dengan IC50 ?

C. Keaslian Penelitian

Uji aktivitas antioksidan tanaman apel bludru pernah dilakukan oleh Das,

et al. (2010) menggunakan daun, buah, dan kulit batang apel bludru yang

diperoleh dari Departemen Botani Universitas Dhaka. Kemudian dalam keadaan

kering diekstrak dengan metanol 97% selama 7 hari. Uji aktivitas antioksidan

dilakukan dengan metode DPPH serta ditetapkan kandungan fenolik totalnya

menggunakan spektrofotometri UV-VIS.

Perbedaan antara penelitian ini dengan penelitian sebelumnya adalah

bahwa dalam penelitian ini menggunakan fraksi etil asetat buah apel bludru dari

tanaman apel bludru yang berada disekitar Kampus III Universitas Sanata Dharma


4

Paingan, Sleman, Yogakarta dan dalam keadaan segar diolah untuk mendapatkan

fraksi etil asetat dari sari buah apel bludru. Kemudian diuji aktivitas antioksidan

menggunakan radikal DPPH dan ditetapkan kandungan fenolik totalnya dengan

meggunakan metode Folin-Ciocalteu.

D. Manfaat penelitian

1. Manfaat teoritis: penelitian ini diharapkan dapat memberikan pengetahuan

tentang aktivitas antioksidan fraksi etil asetat sari buah apel bludru dengan

menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan dengan IC50.

2. Manfaat praktis: penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang

aktivitas antioksidan buah apel bludru sehingga bisa dimanfaatkan untuk

pemeliharaan kesehatan manusia untuk menangkal radikal bebas.

E. Tujuan Penelitian

1. Tujuan umum: menetapkan kandungan fenolik total meggunakan metode Folin-

Ciocalteu dan menguji aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH fraksi

etil asetat sari buah apel beludru.

2. Tujuan khusus:

a. Mengetahui nilai kandungan fenolik total fraksi etil asetat sari buah apel

beludru yang dinyatakan dalam mg ekivalen asam galat.

b. Mengetahui nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat sari buah apel bludru

dengan menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan dengan IC50.


5

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Tanaman Apel Beludru

1. Klasifikasi tumbuhan

Tanaman apel beludru menurut USDA (United States of Department

Agriculture) diklasifikasikan sebagai berikut:

Kingdom : Plantae

Subkingdom : Tracheobionta

Superdivision : Spermatophyta

Division : Magnoliophyta

Class : Magnoliopsida

Subclass : Dilleniidae

Order : Ebenales

Family : Ebenaceae

Genus : Diospyros L.

Species : Diospyros blancoi A. DC.

2. Nama lain

Sinonim : Diopyros discolor

Indonesia : Buah mentega, bisbul

Inggris : Velvet apple, mabolo

Melayu : Buah mentega

Filipina : Mabolo, kamagong (Morton, 1987).

3. Gambaran umum apel beludru

Menurut IPNI (International Plant Names Index) A. DC. merupakan

singkatan dari Alphonse Louis Pierre Pyramus de Candolle.


http://plants.usda.gov/java/ClassificationServlet?source=profile&symbol=Plantae&display=63

http://plants.usda.gov/java/ClassificationServlet?source=profile&symbol=Tracheobionta&display=63

http://plants.usda.gov/java/ClassificationServlet?source=profile&symbol=Spermatophyta&display=63

http://plants.usda.gov/java/ClassificationServlet?source=profile&symbol=Magnoliophyta&display=63

http://plants.usda.gov/java/ClassificationServlet?source=profile&symbol=Magnoliopsida&display=63

http://plants.usda.gov/java/ClassificationServlet?source=profile&symbol=Dilleniidae&display=63

http://plants.usda.gov/java/ClassificationServlet?source=profile&symbol=Ebenales&display=63

http://plants.usda.gov/java/ClassificationServlet?source=profile&symbol=Ebenaceae&display=63

http://plants.usda.gov/java/ClassificationServlet?source=profile&symbol=DIOSP&display=63

http://plants.usda.gov/java/ClassificationServlet?source=profile&symbol=DIBL3&display=63

http://plants.usda.gov/java/ClassificationServlet?source=profile&symbol=DIBL3&display=63

6

Tanaman buah mentega ini berbentuk pohon atau perdu. Tinggi tanaman

rata-rata 8-33 m, diameter batang 80 cm dan berakar tunggang. Daunnya tunggal,

berseling, bentuk lonjong, ujung daun runcing, tangkai pendek dan warna daun

hijau gelap. Panjang daun 15-22,8 cm dan lebar daun 5-9 cm dengan pinggir daun

rata. Daunnya berukuran besar, oleh karena itu tanaman ini dapat digunakan

sebagai pohon pelindung dan penahan angin. Bunga terletak di ketiak daun,

berkelamin tunggal atau hermafrodit, bunga jantan umumnya majemuk sedangkan

bunga betina soliter. Buah berbentuk oval antara 5-19 cm (Morton, 1987).

4. Penyebaran Tanaman

Apel beludru berasal dari Kepulauan Filipina yang umumnya terletak

dikawasan hutan ketinggian rendah dan menengah. Tanaman ini bisa ditemui dari

pulau Luzon hingga pulau paling selatan Filipina, yaitu pulau Sulu. Apel beludru

umumnya dibudidayakan untuk diambil buahnya, selebihnya hanya sebagai pohon

naungan dipinggir jalan. Selanjutnya, pada tahun 1881 tanaman ini juga

ditemukan didaerah Jawa dan Melaya, Kebun Raya Singapura, bahkan tanaman

ini banyak digunakan sebagai tanaman hias di India. Pada perkembangan

selanjutnya tanaman ini menyebar di berbagai daerah Amerika seperti Miami,

Karibia, Jamaika, dan Kuba (Morton, 1987).

5. Kandungan kimia apel bludru

Hasil penelitian yang dilakukan Howlader, Rahman, Khalipa, Ahmed,

and Rahman (2012) menunjukkan bahwa Diospyros blancoi memiliki konstituen

kimia seperti flavonoid, alkaloid, tanin, gula, dan gum. seperti Dalam penelitian yang

dilakukan oleh Lee, et al. menunjukkan bahwa ekstrak tanaman apel bludru


memiliki kandungan fenolik

ekstrak tanaman. Dalam penelitian yang dilakukan Duke (2011) ditemukan

adanya kandungan kuersetin pada tanaman yang masih bergenus sama

Diospyros virginiana

Gambar

Berdasarkan teori

bahwa spesies tumbuhan yang termasuk dalam genus yang sama dari suatu famili

tumbuhan tertentu akan mengandung senyawa

senyawa kimia dengan kerangk

berbeda tergantung dari ekosistem dan tantangan alam yang dihadapi oleh spesies.

Senyawa fenolik merupakan sumber antioksidan alami yang aman

digunakan dan merupakan golongan

antioksidan. Aktivitas antioksidan dari fenolik didapatkan dengan cara mereduksi

radikal bebas sehingga radikal menjadi stabil ( Marxen, Vanselow, Lippemeier,

Hitze, Ruser, and Hansen, 2007)

memiliki kandungan fenolik lebih dari 30 mg ekivalen asam galat per gram

Dalam penelitian yang dilakukan Duke (2011) ditemukan

adanya kandungan kuersetin pada tanaman yang masih bergenus sama

Diospyros virginiana L.

Gambar 1. Struktur kuersetin (Apak dkk., 2007)

Berdasarkan teori kemotaksonomi, Venkataraman (1976)


tumbuhan tertentu akan mengandung senyawa-senyawa kimia yang sama atau

senyawa kimia dengan kerangka struktur yang sama, hanya saja intensitasnya bisa


B. Senyawa Fenolik


digunakan dan merupakan golongan mayoritas senyawa yang bertindak sebagai



Hansen, 2007).

7

lebih dari 30 mg ekivalen asam galat per gram

Dalam penelitian yang dilakukan Duke (2011) ditemukan

adanya kandungan kuersetin pada tanaman yang masih bergenus sama, yaitu

, Venkataraman (1976) mengemukakan


senyawa kimia yang sama atau

hanya saja intensitasnya bisa



mayoritas senyawa yang bertindak sebagai




8

Flavonoid berbeda dalam penyusunan gugus hidroksil, metoksi dan bagian

gugus glikosida dan dalam konjugasi antara cincin A dan B. Variasi dalam cincin

C merupakan pembagian dalam subkelas. Dilihat dari struktur molekular mereka,

maka dapat dibagi dari delapan kelas (Sandhar, Kumar, Prasher, Tiwari, Shalhan,

and Sharma, 2011).

Flavone Flavonones Flavonol Isoflavone

Anthocyanidin Catechin Dihydroflavonol Chalcone

Gambar 2. Struktur kimia dari beberapa tipe flavonoid (Sandhar et al., 2011).

Reaksi yang terjadi pada fenol dapat melalui gugus hidroksilnya atau

dengan menggantikan atom hidrogen pada cincin aromatiknya. Sifat lainnya yang

menarik ia1ah fenol mampu mengkompleks protein sehingga beberapa enzim

dapat dihambat. Sifat ini menguntungkan proses ekstraksi, karena dapat

diharapkan selarna ekstraksi tidak terjadi reaksi enzimatik. Tetapi, fenol peka


terhadap oksidasi dan ini bisa menyebabkan perubahan fenol se1arna ekstraksi

(Simpson, 1985).

Kandungan fenolik total dalam suatu sampel dapat

kolorometri dengan metode Folin

reduksi kimia reagen fenol yaitu campuran asam fosfomolibdat

adanya senyawa fenolik, sehingga dihasilkan produk berwarna biru yang memiliki

serapan kuat pada panjang gelombang 765 nm. Intensitas serapan pada panjang

gelombang tersebut proporsional dengan jumlah senyawa fenolik dalam sampel

(Waterhouse, 2002).

Metode Folin

dengan standar asam gala

Gambar 3. S

Metode kolorimetri yang biasa digunakan adalah

satu metode yang memiliki reaksi oksidasi yang cepat dengan fenol dengan

menggunakan alkali (biasanya sodium karbonat), dimana nilai yang didapat


Kandungan fenolik total dalam suatu sampel dapat

kolorometri dengan metode Folin-Ciocalteu. Prinsip metode ini adalah adanya

reduksi kimia reagen fenol yaitu campuran asam fosfomolibdat-fosfotungstat oleh


kuat pada panjang gelombang 765 nm. Intensitas serapan pada panjang


C. Metode Folin-Ciocalteu

in-Ciocalteu merupakan metode pengukuran kadar

dengan standar asam galat (Nely, 2007).

. Struktur asam galat (Kalita, Kar dan Handique, 2011)

Metode kolorimetri yang biasa digunakan adalah Folin



9


Kandungan fenolik total dalam suatu sampel dapat diukur secara

Ciocalteu. Prinsip metode ini adalah adanya

fosfotungstat oleh


kuat pada panjang gelombang 765 nm. Intensitas serapan pada panjang


iocalteu merupakan metode pengukuran kadar polifenol

Handique, 2011).

olin Ciocalteu, salah




signifikan dengan konsentrasi ion fenolat (Cicco dan Latanzio, 2011).

kandungan fenolik total dilakukan dengan cara memberikan

Ciocalteu dan reaksi yang terjadi adalah oksidasi

pereaksi fenol Folin-

molibdotungstat menghasilkan

gelombang 745-750 nm (Ronald

Gambar 4. Senyawa fenolik dalam suasana basa (Sambada, 2011)

Gambar 5. Reaksi senyawa fenolik dengan pereaksi Folin


berpasangan pada orbital terluarnya

memperoleh pasangan elektron senyawa ini sangat reaktif dan merusak jaringan.

signifikan dengan konsentrasi ion fenolat (Cicco dan Latanzio, 2011).

ik total dilakukan dengan cara memberikan

yang terjadi adalah oksidasi dari ion fenolat senyawa uji

-Ciocalteu, dimana oksidasi dari senyawa fenol oleh reagen

menghasilkan produk dengan warna biru sekitar panjang

750 nm (Ronald et al., 2005).

. Senyawa fenolik dalam suasana basa (Sambada, 2011)

. Reaksi senyawa fenolik dengan pereaksi Folin-Ciocalteu (Sambada, 2011).

D. Radikal Bebas


berpasangan pada orbital terluarnya (Clarkson and Thompson, 2000).


10

signifikan dengan konsentrasi ion fenolat (Cicco dan Latanzio, 2011). Estimasi

ik total dilakukan dengan cara memberikan reagen Folin

dari ion fenolat senyawa uji oleh

imana oksidasi dari senyawa fenol oleh reagen

warna biru sekitar panjang

. Senyawa fenolik dalam suasana basa (Sambada, 2011).

Ciocalteu


(Clarkson and Thompson, 2000). Untuk



11

Radikal bebas yang terbentuk cenderung untuk mengadakan reaksi berantai yang

bila terjadi dalam tubuh dapat menimbulkan kerusakan-kerusakan yang serius

(Percival, 1998). Untuk mencapai kestabilan atom atau molekul, radikal bebas

akan bereaksi dengan molekul di sekitarnya untuk memperoleh pasangan elektron.

Reaksi seperti ini berlangsung terus menerus dalam tubuh dan bila tidak

dihentikan maka akan menimbulkan penyakit seperti kanker, jantung, katarak,

penuaan dini, serta penyakit degeneratif lainnya (Andayani, Lisawati, dan

Maemunah, 2008).

E. Antioksidan

Antioksidan dapat didefinisikan sebagai senyawa yang apabila dalam

konsentrasi rendah berada bersama substrat yang teroksidasi, dapat menunda atau

menghambat oksidasi senyawa tersebut (Halliwell, 1994). Antioksidan merupakan

suatu senyawa yang berperan dalam menghambat oksidasi yang diperantarai

oksigen. Senyawa antioksidan memegang peranan penting dalam pertahanan

tubuh terhadap penyakit. Hal tersebut disebabkan senyawa antioksidan dapat

mencegah pengaruh buruk yang disebabkan oleh senyawa radikal bebas (Percival,

1998).

Sistem antioksidan dibagi menjadi dua kelompok, yaitu kelompok

enzimatik dan non-enzimatik. Antioksidan enzimatik terdiri dari superoxide

dismutase (SOD), katalase dan glutathione peroxidase. Antioksidan nonenzimatik

terdiri dari vitamin E, vitamin A, provitamin A (β-karoten), dan vitamin C.


12

Antioksidan enzimatik secara alamiah dihasilkan oleh tubuh sedangkan

antioksidan non-enzimatik diperoleh dari luar tubuh (Fouad, 2005).

Pada saat ini penggunaan bahan pengawet dan antioksidan sintetis tidak

direkomendasikan oleh Badan Pengawas Obat dan Makanan (BPOM) karena

diduga dapat menimbulkan penyakit kanker (carcinogen agent). Seperti

penggunaan tBHQ pada dosis tinggi menyebabkan kanker otak, hal ini dikarekan

terbentuknya radikal semikuinon anion dan ROS yang menyerang sel otak. Begitu

pula dengan BHT dan BHA, dalam konsentrasi tinggi dapat menginduksi tumor

pada perut dan liver hewan uji. Karena itu, perlu dicari alternatif lain, yaitu bahan

pengawet dan antioksidan alami yang bersumber dari bahan alam. Bahan

pengawet dan antioksidan alami ini hampir terdapat pada semua tumbuh-

tumbuhan dan buah-buahan tersebar di seluruh tanah air Indonesia (Hernani,

2005).

F. Metode DPPH

Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam penelitian

antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH)

(Windono et al., 2001).

DPPH merupakan radikal bebas yang stabil (dengan atom N di tengah)

serta dapat bereaksi dengan senyawa yang dapat mendonorkan atom hidrogen,

dapat berguna untuk pengujian aktivitas antioksidan komponen tertentu dalam

suatu ekstrak (Dinis et al., 1994).


13

Karena adanya elektron yang tidak berpasangan, DPPH memberikan

serapan kuat pada 517 nm. Ketika elektronnya menjadi berpasangan oleh

keberadaan penangkap radikal bebas, maka basorbansinya menurun secara

stoikiometri sesuai jumlah elektron yang diambil. Keberadaan senyawa

antioksidan dapat mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi kuning

(Dehpour et al., 2009).

Salah satu parameter yang telah diketahui sebagai interpretasi hasil dari

metode DPPH yang dilakukan adalah “inhibit concentration 50” atau nilai IC50.

Nilai ini didefinisikan sebagai konsentrasi substrat yang menyebabkan 50%

hilangnya aktivitas DPPH. Nilai aktivitas antioksidan diketahui melalui nilai IC50

yang dihasilkan, bahwa semakin tinggi aktivitas antioksidan suatu senyawa, maka

semakin tinggi nilai IC50 yang dihasilkan (Molyneux, 2004).

Gambar 6. 1,1-Diphenyl-2-picryl hydrazyl (Molyneux, 2004)

G. Ekstraksi

Penyarian atau ekstraksi merupakan suatu peristiwa perpindahan massa

zat aktif yang semula berada di dalam sel kemudian ditarik oleh cairan penyari.

Pada umumnya penyarian akan bertambah baik jika permukaan simplisia yang

bersentuhan dengan penyari semakin luas (Harborne, 1987).


14

Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi

senyawa aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut

yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan ( Dirjen POM,

1995). Untuk mendapatkan senyawa yang khas (zat aktif) dalam suatu tumbuhan,

diperlukan metode ekstraksi yang cepat dan teliti. Pemilihan metode ekstraksi

tergantung pada sumber bahan alami dan senyawa yang akan diisolasi tersebut

(Harborne, 1987).

Dalam memilih penyari, seseorang harus mampu mempertimbangkan

banyak faktor. Menurut Depkes (1986) cairan penyari yang baik harus memiliki

kriteria berikut ini.

(1) Murah dan mudah diperoleh,

(2) Stabil secara fisika dan kimia,

(3) Tidak mudah menguap dan tidak mudah terbakar,

(4) Selektif

(5) Tidak mempengaruhi zat berkhasiat, dan

(6) Diperbolehkan oleh peraturan yang berlaku

Metode penyarian yang digunakan tergantung dari wujud dan kandungan

zat dari bahan yang disari. Cara penyarian dapat dibedakan menjadi: infundasi,

maserasi, perkolasi, dan penyarian yang berkesinambungan (Depkes, 1986).

H. Spekrofotometri Visibel

Spektrofotometri visibel adalah salah satu teknik analisis fisika-kimia yang

mengamati tentang interaksi atom atau molekul dengan radiasi elektromagnetik

pada panjang gelombang 380-780 nm (Mulja dan Suharman, 1995). Menurut

Molyneux (2004), absorbansi DPPH terjadi dengan baik pada daerah cahaya


15

tampak (visible), oleh sebab itu digunakan spektrofotometri visibel untuk

pengukuran absorbansinya.

Interaksi antara senyawa yang mempunyai gugus kromofor dengan radiasi

elektromagnetik pada daerah UV-Vis (200-800 nm) akan menghasilkan transisi

elektromagnetik dan spektra absorbansi elektromagnetik. Jumlah radiasi

elektromagnetik yang diserap akan sebanding dengan jumlah molekul

penyerapnya, sehingga spektra absorbansi dapat digunakan untuk analisis

kuantitatif (Fessenden dan Fessenden, 1995).

Bila suatu molekul senyawa organik menyerap sinar UV atau tampak

maka di dalam molekul tersebut terjadi perpindahan (transisi elektron) dari

berbagai jenis tingkat energi orbital dari molekul tersebut (Sastromihardjojo,

2001). Absorbsi cahaya oleh suatu molekul merupakan suatu bentuk interaksi

antara gelombang cahaya (foton) dan atom atau molekul. Proses absorbsi cahaya

UV-Vis berkaitan dengan promosi elektron dari satu orbital molekul dengan

tingkat energi elektronik tertentu ke orbital lain dengan tingkat energi elektronik

yang lebih tinggi.

I. Landasan Teori

Radikal bebas tidak stabil sehingga secara reaktif menyerang molekul

alami tubuh maka menimbulkan penyakit degeneratif seperti kanker, jantung, dan

penuaan dini. Antioksidan sintetis seperti BHT dan BHA, dapat menginduksi

tumor dan kanker oleh karena itu tidak direkomendasikan oleh Badan Pengawas

Obat dan Makanan.


16

Buah apel bludru mengandung senyawa fenolik yang mempunyai aktivitas

antioksidan dengan mereduksi radikal bebas untuk menghambat terjadinya reaksi

samping yang merugikan.

Metode DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl) memanfaatkan suatu

radikal bebas stabil dengan adanya delokalisasi elektron bebas pada molekul

tersebut. Delokalisasi ini menyebabkan munculnya absorpsi pada panjang

gelombang 517 nm. Keberadaan senyawa antioksidan dapat mengubah warna

larutan DPPH dari ungu menjadi kuning.

Metode Folin-Ciocalteu menggunakan reagen fenol asam fosfomolibdat-

fosfotungstat yang akan mengoksidasi gugus fenolik hidroksil. Selama reaksi

belangsung, gugus fenolik-hidroksil bereaksi dengan pereaksi Folin-Ciocalteu,

membentuk kompleks fosfotungstat-fosfomolibdat berwarna biru. Warna biru

yang terbentuk akan semakin pekat setara dengan konsentrasi ion fenolat yang

terbentuk.

J. Hipotesis

1. Fraksi etil asetat sari buah apel beludru memiliki kandungan fenolik dinyatakan

dalam mg ekivalen asam galat.

2. Fraksi etil asetat sari buah apel beludru mempunyai nilai aktivitas antioksidan

dinyatakan dengan IC50.


17

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental rancangan acak

sederhana karena subjek uji diberi perlakuan.

B. Variabel

1. Variabel bebas berupa konsentrasi fraksi etil asetat sari buah apel bludru.

2. Variabel tergantung berupa % IC.

3. Variabel pengacau terkendali berupa tempat tumbuh tanaman, waktu

pemanenan, umur buah yang dipanen, dan jumlah (g) buah segar yang

digunakan.

4. Variabel pengacau tak terkendali berupa, cuaca atau musim, curah hujan, dan

kelembaban ruangan.

C. Definisi Operasional

1. Buah apel bludru adalah daging buah yang sudah masak dari tanaman apel

bludru disekitar Universitas Sanata Dharma, Paingan, Sleman, Yogakarta.

2. Sari buah apel beludru adalah hasil dari proses filtrasi berulang buah apel

beludru yang telah diblender dengan aquades.

3. Fraksi etil asetat adalah hasil fraksinasi sari buah apel bludru dengan

menggunakan etil asetat, dimana sebelumnya sari buah tersebut telah

difraksinasi terlebih dahulu menggunakan washbensin.


18

4.Persen inhibition concentration (%IC) adalah persen yang menyatakan

kemampuan fraksi etil asetat sari buah apel bludru untuk menangkap radikal

DPPH.

5. Inhibition concentration 50 (IC50) adalah nilai konsentrasi fraksi etil asetat sari

buah apel bludru yang menghasilkan penangkapan 50% radikal DPPH.

D. Bahan dan Alat Penelitian

1. Bahan penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: buah apel bludru

yang berasal dari kawasan Kampus III Universitas Sanata Dharma Paingan,

Sleman, Yogakarta. Bahan kimia kualitas farmasetis berupa akuades (Farmasi

Sanata Dharma). Bahan kimia kualitas pro analitik (E.Merck) berupa methanol.

Bahan kualitas pro analitik Sigma Chem. Co., USA meliputi kuersetin, DPPH ,

reagen Folin-Ciocalteu, asam galat. Bahan kualitas teknis Brataco Chemica, yaitu:

washbensin dan etil asetat.

2. Alat penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini berupa vortex (junke &

kunkel), spektrofotometer UV-VIS (Shimadzu), blender, corong, Buchner, oven,

mikropipet 10-1000 µL; 1-10 mL (Acura 825, Socorex), neraca analitik (Scaltec

SBC 22, BP 160P), vacuum rotary evaporator (Junke & Kunkel), waterbath

(labo-tech, Heraceus), tabung reaksi bertutup, dan alat-alat gelas yang lazim

digunakan di laboratorium analisis (Pyrex-Germany dan Iwaki).


19

E. Tatacara Penelitian

1. Determinasi tanaman

Determinasi tanaman apel bludru dilakukan di Laboratorium

Farmakognosi-Fitokimia, Fakultas farmasi Universitas Sanata Dharma menurut

Morton (1987) dan United States of Department Agriculture NRCS.

2. Pengumpulan bahan

Buah apel beludru diperoleh dari kawasan Kampus III Universitas Sanata

Dharma Paingan, Sleman, Yogakarta. Pada dasarnya apel beludru adalah tanaman

yang berbuah periodik sepanjang taun setiap 3-4 bulan. Pemanenan dilakukan

akhir bulan januari 2013 pada buah yang sudah masak dengan warna merah

kusam pada pagi hari. Untuk penelitian digunakan buah yang tidak berbiji.

3. Preparasi buah apel bludru

Buah segar apel beludru masak yang telah dikupas dan dibersihkan

dengan air mengalir kemudian dipotong sekecil dan setipis mungkin. Diambil 350

gram daging buah segar yang telah dipotong kemudian ditambahkan akuades

hingga terendam kemudian haluskan dengan blender. Sari buah merupakan filtrat

yang diperoleh melalui penyaringan berulang dengan bantuan pompa vakum.

Kemudian residu yang tersisa diperas menggunakan kain kasa. Lalu sari buah

yang didapat di ekstraksi cair-cair menggunakan washbensin dengan

perbandingan sari buah : washbensin (1:1 v/v), kemudian didiamkan sampai

terpisah sempurna. Fase air akan berada pada paling bawah, sedangkan fase

washbensin berada pada bagian atas. Langkah ini dilakukan sebanyak 3 kali.


20

Dari hasil partisi diperoleh dua fase, yaitu fraksi washbensin dan sari buah.

Selanjutnya, sari buah diekstraksi cair-cair kembali menggunakan etil asetat

dengan perbandingan sari buah : etil asetat (1:1 v/v) sehingga didapatkan sari

buah dan fraksi etil asetat. Setelah dipisahkan, fraksi etil asetat diuapkan dengan

vacum rotary evaporator hingga pelarut etil asetat tidak mengalir. Lalu hasil

fraksi tersebut digunakan analisis lebih lanjut.

4. Pembuatan larutan pembanding dan uji

a. Pembuatan larutan asam galat

Sebanyak 10 mg asam galat dilarutkan dan di ad aquades : metanol p.a

(1:1) hingga 10 mL. Diambil sebanyak 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; dan 1,5 mL larutan

tersebut, kemudian ditambahkan akuades : metanol p.a (1:1) sampai 10,0 mL,

sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat sebesar 50; 75; 100;

125; dan 150 µg/mL.

b. Pembuatan larutan stok kuersetin

Sebanyak 10 mg kuersetin dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0

mL.

c. Pembuatan larutan intermediet kuersetin

Diambil sebanyak 1 mL larutan stok kuersetin, kemudian ditambahkan

metanol p.a sampai 10,0 mL hingga didapatkan konsentrasi 100 μg/mL.

d. Pembuatan larutan pembanding

Diambil sebanyak 0,5; 0,75; 1; 1,25; 1,5 mL larutan intermediet

kuersetin, kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga


21

diperoleh konsentrasi larutan standar kuersetin sebesar 5; 7,5; 10; 12,5; dan 15

μg/mL.

e. Pembuatan larutan DPPH

DPPH sebanyak 15,7 mg dilarutkan menggunakan metanol p.a kedalam

labu ukur 100 mL sehingga diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4

mM. Larutan tersebut ditutup dengan alumunium foil dan harus selalu dibuat

baru.

f. Pembuatan larutan uji

i. Larutan uji untuk penentuan kandungan fenolik total

Sebanyak 10 mg fraksi etil asetat ditimbang, lalu ditambahkan 10

metanol p.a, kemudian diambil 3 mL dan ditambahkan metanol p.a sampai

diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 300,0 µg/mL.

ii. Larutan uji untuk aktivitas antioksidan

Larutan stok dibuat dengan 10,0 mg fraksi etil asetat yang dilarutkan

dengan metanol p.a dan ad sampai 10,0 mL. Larutan intermediet dibuat dengan

1 mL stok yang di ad sampai 10 mL. Kemudian Diambil sebanyak 1,5; 2,0;

2,5; 3,0; 3,5 mL, lalu ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga

diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 15; 20; 25; 30; 35 μg/mL.

5. Uji pendahuluan

a. Uji keberadaan senyawa fenolik

Sejumlah 0,5 mL larutan uji 300,0 µg/mL dan larutan pembanding

asam galat 150,0 µg/mL ditambah 2,5 mL pereaksi fenol Folin-Ciocalteu yang

telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v) kedalam tabung reaksi. Diamkan


22

selama 10 menit. Tambahkan 2 mL larutan natrium karbonat 1 M setelah itu

divortex 30 detik. Kemudian amati warna larutan tersebut.

b. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan

Sebanyak 1 mL larutan DPPH dimasukan ke dalam masing-masing

tiga tabung reaksi. Ditambahkan masing-masing dengan 1 mL methanol p.a,

larutan pembanding kuersetin 37,5 μg/mL , dan larutan uji 200 μg/mL.

Selanjutnya larutan tersebut ditambahkan dengan 3 mL metanol p.a. Larutan

tersebut kemudian divortex selamam 30 detik. Setelah 30 menit, amati warna

pada larutan tersebut.

6. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total

Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total ditentukan dengan

menggunakan metode spektrofotometri sesuai dengan penelitian Nusarini ( 2007).

a. Penentuan OT

Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; dan 150 μg/mL

ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan

akuades (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0 mL natrium

karbonat 1 M. Setelah itu, dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel

pada panjang gelombang 750 nm selama 30 menit. Dilakukan demikian juga

untuk fraksi etil asetat dengan konsentrasi 300 μg/mL.

b. Penentuan panjang gelombang maksimum

Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; dan 150 μg/mL

ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan

air (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat


23

1 M. Diamkan selama OT, dilakukan scanning panjang gelombang maksimum

dengan spektrofotometer visibel pada 600-800 nm.

7. Penetapan kandungan fenolik total

a. Pembuatan kurva baku asam galat

Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 75; 100; 125; dan 150 μg/mL

ditambah dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air

(1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 mL natrium karbonat 1M.

Setelah OT, absorbansinya dibaca pada λ maksimum terhadap blanko yang terdiri

atas akuades : metanol p.a (1:1), reagen Folin-Ciocalteu dan larutan natrium

karbonat 1M. Pengerjaan dilakukan 3 kali.

b. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji

Diambil 0,5 mL larutan uji 300 μg/mL, lalu dimasukan ke dalam labu

takar 10,0 mL dan dilanjutkan sebagaimana perlakuan pada pembuatan kurva

baku asam galat . Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai gram ekivalen asam

galat (mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat). Lakukan 3 kali replikasi.

8. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan

a. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum

Larutan DPPH sebanyak 0,5; 1,0; 1,5 mL dimasukkan kedalam 3 labu

ukur 10 mL. Kemudian ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas

sehingga konsentrasi DPPH menjadi 0,020; 0,040; dan 0,060 mM. Larutan

tersebut kemudian divortex selama 30 detik. Diamkan selama OT teoritis. Lalu

dilakukan scanning panjang gelombang serapan maksimum dengan

spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 400-600 nm.


24

b. Penentuan operating time (OT)

Sebanyak 2 mL larutan DPPH dimasukan kedalam masing-masing

tiga labu ukur 10 mL, ditambahkan masing-masing dengan 2 mL larutan

pembanding kuersetin 5,0; 10,0 dan 15,0 μg/mL. Selanjutnya larutan tersebut

ditambahkan dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut

kemudian divortex selama 30 detik. Setelah itu dibaca absorbansinya dengan

spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum yang didapat

selama 1 jam. Dilakukan demikian juga untuk larutan uji 15,0; 25,0; 35,0

μg/mL.

9. Uji aktivitas antioksidan

Uji aktivitas antioksidan ditentukan dengan menggunakan metode

spoktrofotometri sesuai dengan penelitian Nusarini (2007).

a. Pengukuran absorbansi larutan DPPH (kontrol)

Pada labu ukur 10 mL, dimasukan sebanyak 2 mL larutan DPPH.

Ditambahkan larutan tersebut dengan metanol p.a hingga tanda batas.

Kemudian larutan tersebut dibaca absorbansinya pada saat OT dan panjang

gelombang maksimum. Pengerjaan dilakukan sebanyak 3 kali. Larutan ini

digunakan sebagai kontrol untuk menguji larutan pembanding dan larutan uji.

b. Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan larutan uji

Sebanyak 2 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL

kemudian ditambah dengan 2 mL larutan pembanding dan uji pada berbagai

seri konsentrasi telah dibuat. Selanjutnya larutan tersebut ditambah dengan

metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30


25

detik dan diamkan selama OT. Larutan dibaca absorbansinya dengan

spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi.

Pengujian dilakukan dengan 3 kali replikasi.

c. Estimasi aktivitas antioksidan

Hasil dari prosedur 9 a dan b, dihitung nilai % IC dan IC50 untuk kuersetin

dan fraksi etil asetat buah apel bludru.

F. Analisis Hasil

Aktivitas penangkapan radikal DPPH (%) IC dihitung dengan rumus :

�� (�� ) – �� (�� )

�� x 100%

Data aktivitas tersebut dianalisis dan dihitung nilai IC50 mengunakan

persamaan regresi linear dengan sumbu x adalah konsentrasi larutan uji maupun

pembanding, sedangkan sumbu y adalah %IC. Lalu dianalisis secara statistik

untuk menentukan ada atau tidak adanya perbedaan bermakna antara IC50 larutan

pembanding dan larutan uji.

Uji kandungan fenolik total menghasilkan nilai mg ekivalen asam galat

dalam per g fraksi etil asetat. Nilai tersebut didapatkan dari analisis regresi linier

dengan data kurva baku secara intrapolasi.


26

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Determinasi Tanaman

Tujuan determinasi tanaman yaitu untuk memastikan kebenaran identitas

tanaman yang hendak digunakan dalam analisis fitokimia. Maka dari itu

determinasi tanaman merupakan langkah awal yang harus dilakukan dari suatu

penelitian dengan menggunakan sampel berupa tanaman. Determinasi tanaman

apel beludru telah dilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia, Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma menurut Morton (1987) dan United States of

Department Agriculture NRCS.

Pembuktian dikuatkan dengan surat determinasi (lampiran 1) tanaman

yang dikeluarkan oleh Laboratorium Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta yang menyatakan kebenaran identitas

tanaman yang digunakan dalam penelitian.

B. Hasil Pengumpulan Bahan

Buah apel beludru diperoleh dari kawasan Kampus III Universitas Sanata

Dharma Paingan, Sleman, Yogakarta. Pada dasarnya apel bludru adalah tanaman

yang berbuah periodik sepanjang tahun setiap 3-4 bulan. Pemanenan dilakukan

akhir bulan januari 2013 dengan kriteria buah yang sudah masak dengan warna

merah kusam, dilakukan pada pagi hari, tidak berbiji dan segera dilakukan

preparasi lebih lanjut pada buah yang masih segar.


27

Pemanenan dilakukan pada pagi hari agar kandungan metabolit sekunder

yang berfungsi sebagai antioksidan tidak berkurang, hal ini dikarenakan senyawa

antioksidan digunakan tanaman untuk melawan radiasi sinar UV didalam

tanaman (Andayani, Lisawati dan Maimunah, 2008) serta menjaga metabolit

sekunder yang terdapat dalam tanaman tidak diolah menjadi metabolit sekunder

lainnya melalui fotosintesis (World Health Organization, 2003). Alasan lain

dilakukannya pemanenan buah pada pagi hari yaitu untuk menghindari kesalahan

pengambilan buah yang masak berdasarkan warna. Berdasarkan pengamatan

peneliti buah apel beludru diselimitu bulu-bulu halus berwarna putih keemasan

yang menjadi kemerahan jika terpapar sinar matahari dalam waktu yang lama.

Berdasarkan dekripsi tanaman sesuai Morton (1987) buah apel beludru

memiliki empat hingga delapan biji buah, walaupun sering kali didapati buah

sama sekali tanpa biji. Untuk menghindari ketidakseragaman tersebut dan sesuai

kondisi pengumpulan bahan dimana didapatkan buah yang tidak berbiji, maka

dikatakan penelitian ini menggunakan buah apel beludru yang tidak berbiji.

Hasil sari buah yang didapatkan dalam penelitian ini berasal dari buah

segar yang langsung diproses sesuai cara kerja yang telah ditetapkan. Hal ini

bertujuan untuk menghindari aktivitas polifenol oksidase dari fungi yang dapat

mendegradasi senyawa-senyawa polifenol (Evans and Hedger, 2001).


28

C. Hasil Preparasi Sampel

1. Hasil pembuatan sari buah

Tujuan dilakukan pembuatan sari buah yang bukan merupakan metode

ekstraksi secara kimiawi didasarkan pada aplikasi buah apel beludru dalam

masyarakat sebagai bahan konsumsi dan bukan ditujukan sebagai sumber senyawa

antioksidan. Sehingga penelitian ini berguna untuk melihat aktivitas antioksidan

buah apel beludru saat dikonsumsi sebagai sari buah.

Sari buah dibuat melalui proses penghalusan menggunakan blender dan

penyaringan yang dibantu pompa vakum. Rangkaian proses ini termasuk metode

ekstraksi secara fisis-mekanis karena bertujuan menarik cairan dari padatan

(Suyitno, 1989). Awalnya 350 g buah apel bludru segar yang telah dikupas dan

dicuci air mengalir dipotong sekecil dan setipis mungkin untuk memudahkan

proses penghalusan. Penghalusan dengan blender dilakukan sampai semua bahan

berubah menjadi seperti bubur skim dan tidak terdapat bagian yang masih kasar.

Ekstraksi fisis-mekanis bergantung pada kehalusan bahan (besar-kecilnya

hancuran) dimana semakin kecil ukuran maka luas permukaan untuk setiap satuan

berat semakin besar dan cairan yang terekstraksi akan optimal. Faktor lain yang

mempengaruhi hasil ekstraksi mekanis adalah kandungan cairan dimana semakin

tinggi kandungan cairan maka akan menghasilkan ekstrak yang lebih banyak

(Suyitno, 1989). Sehingga sebelum proses penghalusan tersebut, ditambahkan

akuades sebanyak 600 mL hingga semua potongan buah segar terendam dan

nantinya berguna untuk meningkatkan volume sari buah yang dihasilkan.

Kemudian hasil penghalusan bahan disaring dengan bantuan pompa vakum antara


29

2 - 2,5 jam sampai ampas terlihat padat dan mengeras. Kemudian residu yang

tersisa diperas menggunakan kain kasa untuk mendapatkan sisa cairan yang

mungkin masih terkandung. Setelah didapat sari buah keruh, selanjutnya

dilakukan refiltrasi agar didapat sari buah jernih yang memudahkan proses partisi

pada proses selanjutnya. Total sari buah yang didapat dengan penambahan

akuades 600 mL adalah 470 mL.

Untuk mengekstraksi senyawa fenolik dalam bahan tumbuhan dapat

dilakukan dengan pelarut polar seperti etanol, metanol, n-butanol, aseton,

dimetilsulfoksida, dimetilformamida, dan air (Markham, 1988). Sari buah yang

didapat diharapkan mengandung senyawa fenolik yang hendak diuji karena

digunakan akuades yang juga berperan sebagai pelarut polar.

2. Hasil fraksinasi sari buah

Sari buah apel beludru yang didapat kemudian diekstraksi menggunakan

washbensin untuk menarik senyawa non polar. Indeks polaritas washbensin

adalah 3,8 yang bersifat sangat non polar, sehingga dapat digunakan untuk

mengekstraksi senyawa non polar seperti klorofil, vitamin, minyak dan lemak

(Snyder 1997).

Penggunaan washbensin untuk menarik senyawa nonpolar dari air sesuai

metode ekstraksi cair-cair dimana prinsip pemisahan senyawanya berdasarkan

kepolaran dengan dua pelarut yang kepolaranya berbeda. Sari buah yang didapat

diekstraksi menggunakan washbensin dengan perbandingan (1:1), sehingga

volume total setiap pemisahan dalam corong pisah adalah 200 mL yang terdiri


30

dari 100 mL sari buah dan 100 mL washbensin. Setelah itu akan terbentuk 2 fase

dalam corong pisah yang terdiri dari fase washbensin pada bagian atas dan fase air

pada bagian bawah. Berat jenis washbensin (0,730) lebih kecil dibanding air

(0,996) (Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995), hal ini

yang menyebabkan washbensin berada pada bagian atas.

Langkah tersebut dilakukan sebanyak tiga kali. Dilakukan. Ekstraksi

cair-cair dilakukan berulang disesuaikan dengan hukum nerst yang prinsipnya

ektraksi cair-cair berulang akan lebih efektif dibanding ektraksi tunggal (Bassett,

et al., 1991).

Fase air yang didapat dari proses ekstraksi dengan washbensin kemudian

diekstraksi kembali menggunakan etil asetat (1:1) dan dilakukan sebanyak 3 kali.

Etil asetat yang berbobot jenis kecil dibandingkan dengan air (0,898 : 0,996)

(Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995) akan berada pada

bagian atas. Ekstraksi menggunakan etil asetat yang bersifat lebih non polar

dibanding air ditujukan untuk menarik senyawa aglikon yang hendak diuji.

Memang tidak diketahui secara pasti senyawa fenol apa yang terkandung dalam

tanaman apel beludru (Diospyros blancoi), sehingga pendakatan yang dilakukan

untuk memprediksi kandungan senyawa fenoliknya adalah dengan melihat

kandungan metabolit tanaman yang masih satu genus. Menurut Duke (2011)

Diospyros virginiana L mengandung senyawa fenolik kuersetin.

Kuersetin adalah salah satu golongan flavones yang merupakan senyawa

aglikon yang bersifat lebih non polar (Andersen and Markham, 2006). Maka dari

itu fraksinasi menggunakan etilasetat ditujukan untuk menarik senyawa


31

flavonoids dengan golongan isoflavones, flavanones, methylated flavones, and

flavonols (Andersen and Markham, 2006).

Fraksi etilasetat yang didapat kemudian diuapkan pelarutnya dengan

vaccum rotary evaporator supaya tidak merusak kestabilan senyawa fenolik. Hal

ini dikarenakan vaccum rotary evaporator dapat menguapakan suatu pelarut

dibawah titik didihnya melalui prinsip titik didih yang akan turun ketika tekanan

diturunkan (Dave, 2010). Bobot fraksi etil asetat yang didapat sebesar 140 mg dan

rendemen fraksi etil asetat yang didapat adalah 0,046%.

D. Hasil Uji Pendahuluan

1. Uji pendahuluan keberadaan senyawa fenolik

Uji kualitatif senyawa fenolik pada fraksi etil asetat ini memakai prinsip

reaksi oksidasi-reduksi pada suasana basa. Dalam suasana basa yang berasal

natrium karbonat, senyawa fenolik akan berubah menjadi ion fenolat. Ion fenolat

bersifat lebih reaktif terhadap adanya pereaksi fenol Folin- Ciocalteu. Asam

fosfomolibdat-fosfotungstat dalam pereaksi fenol Folin- Ciocalteu akan tereduksi

oleh ion fenolat tersebut sehingga akan terbentuk larutan dengan warna biru

(Singleton dan Rossi, 1965). Pengujian menunjukkan hasil positif dengan larutan

uji berwarna biru seperti kontrol positif (gambar 7). Hal ini menunjukkan bahwa

fraksi etil asetat sari buah apel beludru mengandung senyawa fenolik.


32

Gambar 7. Hasil uji pendahuluan keberadaan senyawa fenolik (A = kontrol negatif [Folin Ciocalteu dan Na2CO3], B = kontrol positif [Asam Galat + Folin Ciocalteu

dan Na2CO3 ], C= larutan uji [fraksi etil asetat sari buah apel beludru + Folin Ciocalteu dan Na2CO3], D =Asam Galat, E =Fraksi etil asetat sari buah apel bludru) 2. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan

Uji pendahulan ini bertujuan untuk megetahui secara kualitatif apakah

fraksi etil asetat sari buah apel beludru memiliki aktivitas antioksidan atau tidak.

Uji ini berdasarkan reaksi antara radikal DPPH dengan senyawa antioksidan.

Keberadaan senyawa antioksidan dapat mengubah warna larutan DPPH dari ungu

menjadi kuning (Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel, dan Mohammad, 2009).

DPPH merupakan radikal bebas yang stabil pada suhu ruangan dan

berwarna violet dalam metanol. Radikal yang bereaksi dengan antioksidan

tersebut dapat merusak rantai yang bertanggung jawab sebagai warna ungu dan

menjadi warna kuning (Badarinath et al., 2010)

Pengujian menunjukkan hasil positif dengan larutan uji berwarna kuning

seperti kontrol positif (gambar 8). Hal ini menunjukkan bahwa fraksi etil asetat

sari buah apel beludru memiliki aktivitas antioksidan.

E D A C B


33

Gambar 8. Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan (A = kontrol negatif [blanko DPPH], B =kontrol positif [kuersetin + DPPH], C = larutan uji [fraksi etil asetat sari

buah + DPPH], D =kuersetin, E=Fraksi etil asetat sari buah apel beludru)

E. Hasil Optimasi Metode Uji Fenolik Total

1. Penentuan operating time (OT)

Penentuan operating time dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan

rentang waktu dimana reaksi antara baku pembanding (asam galat) dan larutan uji

(fraksi etil asetat sari buah) terhadap reagen (Folin Ciocalteu) yang diberikan telah

optimum. Penentuan operating time didasarkan dari waktu dimana absorbansi dari

baku pembanding dan larutan uji terhadap reagen mulai stabil atau selisih

absorbansi mulai kecil antara selang waktu yang diujikan. Estimasi waktu yang

dilihat adalah dalam waktu tiga puluh menit (asam galat) dan 60 menit (fraksi etil

asetat) dengan selang waktu lima menit. Panjang gelombang maksimum yang

dipakai adalah panjang gelombang yang telah didapatkan dalam penetapan lamda

maks teoritis, yaitu 750 nm.

E D B C A


34

Gambar 9. Grafik penentuan OT asam galat (Replikasi 3)

Dari hasil yang ditunjukan dengan grafik (gambar 5) OT yang didapatkan

untuk pengukuran asam galat adalah 20 menit. Serta hasil OT yang didapatkan

untuk pengukuran fraksi etil asetat adalah 40 – 50 menit (Lampiran, 12b).

2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum ( λ maks)

Panjang gelombang maksimum dimaksudkan untuk mendapatkan

serapan maksimum dari hasil reaksi antara asam galat dengan pereaksi Folin-

Ciocalteu. Pengukuran pada panjang gelombang maksimum akan menimbulkan

perbedaan respon yang besar untuk setiap beda konsentrasi. Dalam penentuan

panjang gelombang maksimum dilakukan pada 3 konsentrasi, yaitu pada

konsentrasi tinggi, tengah dan rendah, yaitu 50; 100; dan 150 µg/mL. Hal ini

bertujuan untuk merepresentasikan panjang gelombang maksimum dari setiap

konsentrasi.

Panjang gelombang yang didapatkan dari ketiga konsentrasi tersebut

adalah 751,0 nm.

00,10,20,30,40,50,60,70,8

0 10 20 30 40

Ab

sorb

ansi

Waktu (menit)

Penentuan Operating time Asam Galat

50,50 µg/mL

101 µg/mL

151,50 µg/mL


35

Tabel I. Hasil scanning panjang gelombang maksimum asam galat yang direaksikan dengan Folin Ciocalteu

Konsentrasi larutan Asam galat

λ maksimum hasil scanning(nm)

λ maksimum yang digunakan

λ maksimum teoritis

150 µg/mL 751,0

751,0

750 100 µg/mL 751,0

50 µg/mL 751,0

Untuk memastikan tidak adanya gangguan pembacaan absorban maka

dilakukan scanning pada larutan pembanding asam galat (Lampiran 11) dan

larutan uji fraksi etil asetat (Lampiran 6e) pada panjang gelombang maksimum

751 nm dan hasilnya menunjukkan tidak adanya serapan. Artinya tidak terdapat

kontaminan atau senyawa lain terukur pada panjang gelombang tersebut sehingga

dapat mengganggu pengukuran karena adanya interferensi atau overlapping.

F. Estimasi Kandungan Fenolik Total

Senyawa yang berperan utama dalam aktivitas antioksidan adalah

senyawa fenolik. Senyawa fenolik banyak terdistribusi dalam tanaman, maka

perlu dilakukan perhitungan kandungan fenolik total yang mungkin tedapat pada

fraksi etil asetat sari buah apel beludru tersebut. Prinsip metode kolorimetri Folin

Ciocalteu adalah reaksi oksidasi yang cepat dari fenol dengan menggunakan alkali

(biasanya sodium karbonat), dimana nilai yang didapat signifikan dengan

konsentrasi ion fenolat (Cicco dan Latanzio, 2011).

Kompleks biru yang terbentuk terjadi dengan reaksi oksidasi reduksi dari

ion fenolat senyawa uji dengan pereaksi fenol Folin-Ciocalteu. Dimana oksidasi


36

dari senyawa fenol oleh reagen molibdotungstat dengan produk warna biru sekitar

panjang gelombang 745-750 nm (Ronald,et al., 2005).

Hasil molar warna biru yang terbentuk sebanding dengan jumlah ion

fenolik yang teroksidasi oleh kompleks fosfotungstat-fosfomolibdat, juga semakin

pekatnya warna biru yang terbentuk juga menandakan semakin banyak kompleks

fosfotungstat-fosfomolibdat yang tereduksi (Singleton and Rossi, 1985).

Pembuatan kurva kalibrasi asam galat dilakukan sebanyak tiga kali dan

untuk menentukan kandungan fenolik total digunakan persamaan dengan nilai r

terbaik.

Tabel II. Hasil pengukuran absorbansi seri baku asam galat yang direaksikan dengan folin-ciocalteu

Asam galat

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

Konsentrasi (µg/mL)

Absorbansi terukur


Absorbansi terukur


Absorbansi terukur

51,0 0,231 51,0 0,242 50,50 0,221 76,5 0,354 76,5 0,363 75,75 0,346

102,0 0,485 102,0 0,489 101,00 0,481

127,5 0,632 127,5 0,637 126,25 0,626

153,0 0,767 153,0 0,769 151,50 0,760

y =5,2941.10-3 x – 0,0462 r= 0,9995

y = 5,2078.10-3x -0,0312

r = 0,9993

y = 5,3782.10-3 x – 0,0564

r = 0,9997


37

Gambar 10. Kurva kalibrasi asam galat dalam penetapan fenolik total

Tabel III. Hasil penentuan jumlah fenolik total fraksi etil asetat sari buah apel beludru

Replikasi fenolik total

(mg ekivalen) rata-rata ± SD

CV (%)

I 393,12

393,52 ± 0,35

II 393,75 0,0877

III 393,68

Dari ketiga persamaan yang telah didapatkan (Tabel II) dipilih persamaan

yang memiliki nilai r terbaik. Persamaan regresi linear yang paling baik diperoleh

dari replikasi III dengan y = 5,3782.10-3 x – 0,0564 dan R sebesar 0,9997. Nilai r

yang semakin baik menunjukkan koefisien korelasi yang baik dimana akan

membentuk garis lurus. Hal tersebut menunjukkan kesebandingan antara

penambahan konsentrasi asam galat dan penambahan absorbansi. Berdasarkan

perhitungan intrapolasi persamaan regresi linear y = 5,3782.10-3 x – 0,0564, maka

didapatkan kandungan fenolik total fraksi etil asetat sari buah apel beludru sebesar

(393,5 ± 0,35) mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat.

y = 5,378.10-3x - 0,0564r= 0,9997

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 50 100 150

Ab

sorb

ansi

Konsentrasi Asam Galat (µg/mL)

Konsentrasi Asam Galat Vs Absorbansi


38

G. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan

1. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum ( λ maks)

Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan untuk mendapatkan

daerah serapan maksimum DPPH sehingga dengan sedikit perubahan konsentrasi

DPPH akan menyebabkan perubahan absorbansi yang besar dan sensitivitas

penelitian menjadi maksimum. Pengukuran yang dilakukan pada panjang

gelombang maksimum juga ditujukan untuk mendapatkan linearitas seri

konsentrasi yang dibuat. DPPH dapat memberikan serapan karena memiliki gugus

kromofor dan auksokrom.

Sedangakan dengan adanya elektron tak berpasangan pada DPPH, akan

menimbulkan warna violet. Secara teoritis DPPH memberikan serapan kuat pada

panjang gelombang 517 nm (Dehpour et al., 2009) dan menurut Molyneux (2004)

panjang gelombang untuk pengukuran DPPH berkisar antara 515 nm-520 nm.

Berdasarkan pengujian, panjang gelombang maksimum yang dihasilkan adalah

516,0 nm berbeda dengan panjang gelombang maksimum teoritis yaitu 517 nm.

Perbedaan ini masih memenuhi kriteria yang tercantum dalam Farmakope

Indonesia edisi IV (1995) dimana batas pergeseran maksimum adalah 2 nm.

Perbedaan λ max tersebut disebabkan perbedaan instrumen pengukuran yang

digunakan.

Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan pada 3 konsentrasi,

yaitu 0,020; 0,040; dan 0,060 mM. Hal ini bertujuan agar merepresentasikan

panjang gelombang maksimum yang sama walaupun konsentrasinya berbeda-

beda. Absorbansi sampel dihitung dengan auto zero menggunakan metanol karena


39

berperan sebagai pelarut. Panjang gelombang yang didapatkan dari ketiga

konsentrasi tersebut adalah 516,0 ; 515,5 ; 516,0 nm. Panjang gelombang

maksimum ditetapkan dengan rerata hasil ketiga panjang gelombang yang

didapatkan yaitu 515,8 nm yang kemudian dibulatkan menjadi 516 nm.

Tabel IV. Hasil scanning panjang gelombang serapan maksimum pada berbagai konsentrasi

Konsentrasi larutan

DPPH

λ maksimum hasil scanning

λ maksimum yang digunakan

λ maksimum teoritis

0,02 mM 516.0

516.0 517 0,04 mM 515.5

0,06 mM 516.0

Untuk membuktikan ada atau tidaknya gangguan dari konstituen lain

maka dilakukan scanning pada pelarut (metanol), standar kuersetin, dan fraksi etil

asetat sari buah apel beludru dengan panjang gelombang antara 400 – 600 nm.

Hasil scanning pada Pelarut (Lampiran 6a), larutan pembanding

kuersetin (Lampiran 6c) dan larutan uji fraksi etil asetat (Lampiran 6d) pada

panjang gelombang 516 nm tidak terdapat serapan. Artinya tidak terdapat

kontaminan atau senyawa lain yang terukur pada panjang gelombang tersebut

yang dapat mengganggu pembacaan DPPH karena adanya interferensi atau

overlapping.


40

2. Penentuan operating Time

Penentuan OT berguna untuk menentukankan rentang waktu saat larutan

pembanding dan larutan uji mereduksi radikal DPPH dengan sempurna sehingga

diperoleh absorbansi yang stabil. Penentuan operating time didasarkan pada

waktu saat absorbansi pembanding dan larutan uji terhadap reagen mulai stabil

atau selisih absorbansi mulai kecil antara selang waktu yang diujikan. Nilai

absorbansi yang stabil akan membuat pengukuran menjadi reprodusibel dan

meminimalkan kesalahan analisis. Penentuan OT dilakukan dengan mengukur

absorbansi DPPH pada λ maksimum yang dihasilkan yaitu 516 nm, setiap 5 menit

selama 60 menit pada larutan pembanding dan larutan uji dengan kosentrasi

rendah, tengah, dan tinggi.

Gambar 11. Grafik penentuan OT kuersetin (Replikasi 3)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 10 20 30 40 50 60

Ab

sorb

ansi

Waktu (menit)

Penentuan Operating time Kuersetin

4,95 µg/mL

9,90 µg/mL

14,85 µg/mL


Gambar 12.

Penentuan OT dilakukan di berbagai kosentrasi agar merepresentasikan

waktu stabil yang sama pada rentang konsentrasi yang dibuat.

diperoleh kuersetin

memiliki OT pada menit 25

didapat memiliki selisih y

pengukuran kuersetin pada menit 35 dan fraksi etil asetat pada menit 30 untuk

memastikan semua konsentrasi sudah menunjukkan absorbansi y

Metode DPPH merupakan metode yang mudah, cepat, dan sensitif untuk

pengujian aktivitas antioksidan senyawa tertentu atau ekstrak tanaman

van Beek, Linssen, de Groot, dan Evstatieva, 2002; Prakash, Rigelhof, dan Miller,

2010 cit., Sambada, 2011

(radikal hidroksil) karena metode ini lebih praktis. Metode radikal hidroksil

. Grafik penentuan OT fraksi etil asetat (Replikasi 1


waktu stabil yang sama pada rentang konsentrasi yang dibuat.

kuersetin memiliki OT pada menit 30 – 40 dan fraksi etil asetat

memiliki OT pada menit 25 - 45, pada rentang waktu itulah absorbansi yang

didapat memiliki selisih yang kecil antara 0.001-0.003 Abs. Maka ditetapkan


memastikan semua konsentrasi sudah menunjukkan absorbansi yang stabil


pengujian aktivitas antioksidan senyawa tertentu atau ekstrak tanaman


, Sambada, 2011 ). Metode ini dipilih daripada metode deoksiribosa

karena metode ini lebih praktis. Metode radikal hidroksil

41

etil asetat (Replikasi 1)


waktu stabil yang sama pada rentang konsentrasi yang dibuat. Dari hasil yang

dan fraksi etil asetat

pada rentang waktu itulah absorbansi yang

. Maka ditetapkan


ang stabil.


pengujian aktivitas antioksidan senyawa tertentu atau ekstrak tanaman (Koleva,


Metode ini dipilih daripada metode deoksiribosa

karena metode ini lebih praktis. Metode radikal hidroksil

HHHaaasssiiilll EEEssstttiiimmmaaasssiii AAAkkktttiiivvviiitttaaasss AAAnnntttiiioookkksssiiidddaaannn dddeeennngggaaannn RRRaaadddiiikkkaaalll DDDPPPPPPHHH H.


42

memerlukan proses metode yang panjang dengan pembentukan radikal hidroksil

yang membutuhkan reaksi Fenton (Fe 3+ /ascorbate/EDTA/H202) (Sambada,

2011).

Untuk analisis kuantitatif, radikal DPPH memiliki kelebihan yakni

konsentrasinya dapat langsung ditetapkan sehingga praktis dapat digunakan untuk

determinasi senyawa antioksidan. DPPH sangat penting digunakan untuk

mengetahui aktivitas penangkapan radikal oleh senyawa polihidroksi aromatik

(Nishizawa et al., 2005).

Uji aktivias antioksidan didasarkan pada penangkapan radikal (radical

scavenging) terhadap 2,2-difenil-1-pikril hidrazil (DPPH). Dengan metode ini

dapat dilihat kemampuan suatu antioksidan dengan mengukur pengurangan

intensitas warna dari DPPH (Bondet, et al., 1997).

DPPH merupakan radikal nitrogen organik yang tidak stabil. DPPH akan

tereduksi oleh proses donasi hidrogen atau elektron dan warnanya akan berubah

dari violet ke kuning. Senyawa yang dapat menyebabkan ini dapat

dipertimbangkan sebagai antioksidan atau bahkan penangkap radikal (Halliwell

and Gutteridge , 2000).


43

O2N

NO2

NO2

N N + AH O2N

NO2

NO2

HN N + A

Gambar 13. Reaksi antara radikal DPPH dengan senyawa antioksidan (Nisizawa,2005)

Gambar 13 menunjukkan radikal bebas DPPH yang bereaksi dengan

antioksidan akan mengikat H yang berasal dari senyawa antioksidan, sehingga

sifat radikal bebas yang dimiliki oleh DPPH akan hilang. Hilangnya sifat radikal

tersebut menyebabkan intensitas warna violet yang mulai menghilang karena

delokalisasi elektron tidak lagi terjadi.

Untuk analisis kuantitatif, radikal DPPH memiliki kelebihan yakni

konsentrasinya dapat langsung ditetapkan sehingga praktis dapat digunakan untuk

determinasi senyawa antioksidan. DPPH sangat penting digunakan untuk

mengetahui aktivitas penangkapan radikal oleh senyawa polihidroksi aromatik

(Nishizawa et al., 2005).

Secara empiris apel bludru digunakan penduduk Asia Tenggara untuk

masalah jantung, hipertensi, diabetes, gigitan ular dan serangga, serta digunakan

untuk diare (Das, et al., 2010). Kuersetin ditemukan pada tanaman yang memiliki

genus sama dengan apel beludru, yaitu Diospyros virginiana L. Kuersetin ini

merupakan senyawa flavanoid yang cukup kuat sebagai senyawa antioksidan,

sehingga peneliti menduga bahwa buah apel beludru memiliki potensi sebagai


44

antioksidan dan penelitian ini bertujuan untuk mengetahui tingkat aktivitas

senyawa antioksidan pada buah apel beludru tersebut.

Penelitian ini menggunakan kontrol positif berupa kuersetin, yang

digunakan sebagai pembanding potensi kekuatan fraksi etil asetat sari buah apel

beludru karena telah terbukti sebagai senyawa flavonoid yang kuat sebagai

antioksidan dan diduga merupakan metabolit sekunder yang terkandung dalam

buah tersebut. Metanol digunakan sebagai blangko dalam pengukuran dengan

spektrofotometri visibel karena berperan sebagai pelarut. Digunakan metanol

dikarenakan metanol terbukti tidak mengganggu (interferensi) dalam reaksi DPPH

(Molyneux, 2004). Pengukuran dilakukan dalam panjang gelombang maksimum

hasil scanning, yaitu 516 nm.

Aktivitas antioksidan dengan metode penangkapan radikal DPPH ini

diukur menggunakan parameter IC50 yakni konsentrasi senyawa uji yang

dibutuhkan untuk mengurangi radikal DPPH sebesar 50 %. Nilai IC50 diperoleh

dari persamaan regresi linear yang menyatakan hubungan antara konsentrasi

larutan uji (standar ataupun sampel) dengan persen penangkapan radikal. Nilai

IC50 yang semakin kecil dari suatu senyawa uji, berarti daya antioksidan yang

dimiliki semakin besar.

Persamaan regresi linier yang digunakan untuk menentukan IC50 adalah

persamaan dengan nilai r terbaik. Nilai r yang semakin baik menunjukkan

koefisien korelasi yang baik dimana akan membentuk garis lurus. Hal tersebut

menunjukkan kesebandingan antara penambahan konsentrasi sampel (kuersetin

dan fraksi etil asetat) dan penambahan % IC. Untuk menentukan IC50 kuersetin


45

digunakan persamaan regresi linier dari replikasi III sedangkan untuk menentukan

IC50 fraksi etil asetat digunakan regresi linier dari replikasi I. Persamaan regresi

linier dan hasil pengukuran % IC untuk kuersetin ditunjukan pada Tabel V dan

Gambar 14 dan persamaan regresi linier dan hasil perhitungan % IC untuk fraksi

etil asetat ditunjukkan pada Tabel VI dan Gambar 15, sedangkan hasil IC50 untuk

kuersetin dan fraksi etil asetat sari buah apel beludru di tunjukan pada Tabel VII.

Tabel V. Hasil aktivitas antioksidan kuersetin dengan metode DPPH

Replikasi Konsentrasi

(µg/mL) Absorbansi

kontrol Absorbansi kuersetin

% IC Persamaan regresi

linier 5,10 0,701 17,82 7,65 0,564 33,88

I 10,20 0,853 0,468 45,13 y = 5,2365x – 7,786

12,75 0,345 59,55 r=0,9987

15,30 0,241 71,75

5,05

0,707 17,98

7,58

0,577 33,06

II 10,10 0,862 0,472 45,24 y = 5,3620x – 8,577

12,63 0,354 58,93 r=0,9996

15,15 0,235 72,74

4,95 0,698 18,65

7,43 0,567 33,92

III 9,90 0,858 0,456 46,85 y = 5,5988x – 8,516

12,38 0,338 60,61 r=0,9997

14,85 0,218 74,59


46

Gambar 14. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan kuersetin

Tabel VI. Hasil aktivitas antioksidan fraksi etilasetat sari buah apel beludru dengan

metode DPPH


(µg/mL) Absorbansi

kontrol Absorbansi larutan uji % IC

Persamaan regresi linier

15,15 0,654 25,09

20,20 0,577 33,91 y = 1,6691x + 0,125

I 25,25 0,873 0,498 42,96 r = 0,9995

30,30 0,433 50,40

35,35 0,358 58,99

15,30 0,653 24,77

20,40 0,575 33,76 y = 1,6829x – 0,517

II 25,50 0,868 0,492 43,32 r= 0,9990

30,60 0,424 51,15

35,70 0,356 58,99

14,85 0,658 25,31

19,80 0,588 33,26 y = 1,6858x + 0,343

III 24,75 0,881 0,502 43,02 r = 0,9991

29,70 0,439 50,17 34,65 0,364 58,68

y = 5,5988x - 8,516r = 0,9997

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 5 10 15 20

% IC

Konsentrasi Kuersetin (µg/mL)

Konsentrasi Kuersetin Vs % IC


47

Gambar 15. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan fraksi etil asetat

Tabel VII. Hasil perhitungan IC50 kuersetin dan fraksi etil asetat sari buah apel beludru

Kuersetin

Replikasi IC50

(µg/mL) Rerata ± SD % CV

I 11,04

10,80 ± 0,31 µg/mL 2,89 II 10,92 III 10,45

Fraksi etil asetat

Replikasi IC50

(µg/mL) Rerata ± SD % CV

I 29,88

29,92 ± 0,09 µg/mL 0,29 II 30,02

III 29,86

Dari tabel VII, rata-rata nilai IC50 kuersetin sebesar (10,8 ± 0,31) µg/mL, nilai ini

menunjukkan bahwa dibutuhkan kuersetin dengan konsentrasi (10,8 ± 0,31)

µg/mL untuk menghasilkan penurunan 50% dari aktivitas DPPH. Sedangkan rata-

rata nilai IC50 fraksi etil asetat sebesar (30,0 ± 0,09) µg/mL, nilai ini menunjukkan

y = 1,6691x + 0,125r = 0,9995

0

10

20

30

40

50

60

70

0 5 10 15 20 25 30 35 40

% IC

Konsentrasi Fraksi Etil Asetat (µg/mL)

Konsentrasi Fraksi Etil Asetat Vs % IC


48

bahwa dibutuhkan fraksi etil asetat sari buah apel beludru dengan konsentrasi

(30,0 ± 0,09) µg/mL untuk menghasilkan penurunan 50% dari aktivitas DPPH.

Nilai IC50 telah didapat, maka langkah selanjutnya, yaitu melakukan uji

kebermaknaan antara IC50 kuersetin dan fraksi etil asetat sari buah apel beludru

secara statistik. Software yang dipakai dalam pengujian dengan statistik adalah R

2.13.2. Uji yang dilakukan pertama kali adalah uji normalitas data. Menurut

Dahlan (2012), uji normalitas yang dilakukan jika data berjumlah kurang dari lima

puluh adalah uji normalitas Shapiro-Wilk. Uji ini digunakan untuk melihat suatu

data mengikuti distribusi normal atau distribusi tidak normal. Jika data mengikuti

distribusi normal bisa memakai mean sedangkan jika tidak bisa menggunakan

median dalam perhitungan. Uji normalitas data akan menentukan jenis uji

selanjutnya yang digunakan apakah parametrik (terdistribusi normal) atau non-

parametrik (terdistribusi tidak normal).

Hasil statistik menunjukkan nilai p untuk IC50 kuersetin sebesar 0,3698

dan 0,2195 untuk IC50 fraksi etil asetat. Data IC50 kuersetin dan fraksi etil asetat

memiliki nilai p lebih dari 0,05 (taraf kepercayaan 95%) maka nilai signifikansi

yang dihasilkan lebih besar daripada nilai signifikansi yang ditentukan. Dapat

disimpulkan bahwa IC50 kuersetin maupun fraksi etil asetat mengikuti distribusi

normal sehingga dapat dilanjutkan dengan uji parametrik. Sesuai dengan jenis

penelitian uji parametrik yang digunakan adalah uji t tidak berpasangan karena

hendak menguji perbedaan antara dua kelompok data yang berbeda objek, dalam

hal ini adalah kuersetin dan fraksi etil asetat. Uji t tidak berpasangan dilakukan

untuk melihat adanya perbedaan antara rerata. Dari hasil perhitungan dengan


program R, didapatkan nilai p adalah

kecil daripada nilai signifikansi yang ditentukan

95%). Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa nilai rerata

berbeda dengan IC50 fraksi etil asetat

Gambar 16. Histogram

Berdasarkan pen

merupakan senyawa dengan intensitas kekuatan antioksidan yang besar karena

memiliki nilai IC50 kurang

Perlu dilakukan

mengetahui apa saja senyawa yang mungkin terkandung dalam fraksi etilasetat

sari buah apel beludru.

10

15

20

25

30

35

Nila

i IC

50

µg/

mL

didapatkan nilai p adalah 5.483℮-08. Signifikansi yang dihasilkan lebih

signifikansi yang ditentukan, yaitu 0,05 (taraf kepercayaan

Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa nilai rerata

fraksi etil asetat sari buah apel beludru.

Histogram rerata IC50 dari kuersetin dan fraksi etil asetat dengan interval kepercayaan 95%

Berdasarkan penggolongannya kuersetin dan fraksi etil asetat ini


kurang dari 50 µg/mL (Tabel IX).

dilakukan analisa lebih lanjut dalam skrining fitokimia untuk


sari buah apel beludru.

0

5

10

15

20

25

30

35

Jenis Sampel

Kuersetin

Fraksi Etil Asetat

49

ignifikansi yang dihasilkan lebih

tu 0,05 (taraf kepercayaan

Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa nilai rerata IC50 kuersetin

dari kuersetin dan fraksi etil asetat dengan

olongannya kuersetin dan fraksi etil asetat ini


analisa lebih lanjut dalam skrining fitokimia untuk


Kuersetin

Fraksi Etil Asetat


50

Tabel VII. Penggolongan tingkat kekuatan antioksidan kuersetin dan fraksi etil asetat sari buah apel beludru

Intensitas (Ariyanto, 2006 cit.,

Sambada, 2011)

Nilai IC50 Kuersetin

Fraksi etilasetat

Sangat kuat <50 µg/mL √ √ Kuat 50-100 µg/mL - -

Sedang 101-150 µg/mL - - Lemah >150 µg/mL - -


51

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Kandungan fenolik total fraksi etil asetat sari buah apel beludru yang

dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat sebesar (393,5 ± 0,35) mg

ekivalen asam galat per gram fraksi etil asetat sari buah apel beludru.

2. Nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat sari buah apel beludru dengan

menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan sebagai IC50 sebesar

(30,0 ± 0,09) μg/mL (taraf kepercayaan 95%) dan tergolong sangat kuat.

B. Saran

1. Perlu dilakukan pemanfaatan lebih lanjut mengingat buah apel beludru

memiliki aktivitas antioksidan yang tergolong sangat kuat, baik dalam hal

produk maupun dikonsumsi oleh masyarakat.

2. Perlu dilakukan pengujian penangkapan radikal terhadap kulit buah apel

beludru.


52

DAFTAR PUSTAKA

Andayani, R., Lisawati Y., dan Maimunah, 2008, Penentuan Aktivitas Abtioksidan Kadar Fenolat Total dan Likopen Pada Buah Tomat (Solanum Lycopersicum L.), http://ffarmasi.unand.ac.id/pub/JSTFFeb2009% 20_regina_.pdf, diakses tanggal 2 Maret 2011

Andersen, Oyvind M., and Markham, Kenneth R., 2006, Flavonoids, Chemistry, Biochemistryand Applications, Taylor and Francis Group, United States of America, 2, 3.

Depkes, 1986, Sediaan Galenik, Jilid 2, Departemen Kesehatan RI, Jakarta, pp. 11-12.

Anonim, 2000. Tanaman Buah Kebun Raya Bogor. Penyunting: D. Latifah, Sudarmono, Sutrisno, T. Handayani. Seri koleksi kebun raya vol 1, No. 4. LIPI. 82h.

Apak, R., Guclu, K., Demirata, B., Özyürek, M., Celik, S. E., Bektaşoğlu , B., et al., 2007, Comparative Evaluation of Various Total Antioxidant Capacity Assays Applied to Phenolic Compounds with the CUPRAC Assay, 12, 1496-1547.

Aqil, F., Ahmad,I., dan Mehmood, Z., 2006, Antioxidant and Free Radical Scavenging Propertis of Tweleve Traditionally Used Indian Medical Plants, Turk J Biol, 30,177-183

Badarinath, A.V., Mallikarjuna RAo, K., , Chetty, C. Madhu Sudhana, Ramkanth, S., Rajan, T.V.S, Gnanaprakash, K., 2010, A Review on In-vitro Antioxidant Methods: Comparisions, Correlations and Considerations, Int. J. Pharm. Tech. Research, Vol.2, No.2, pp. 1276-1285.

Bassett, J., Denney, R.C., Jeffery, G.H., dan Mendham, J., 1991, Vogel’s Textbook of Quantitative Inorganic Analysis Including Elementary Instrumental Analysis, Longman Group UK Limited, London, 165-166.

Bondet, V., Brand-Williams, W. and Berset, C., 1996, Kinetics and Mechanisms of Antioxidant Activity using the DPPH• Free Radical Method, Lebensm.-Wiss. U.-Technol., vol. 30, 609–615.

Cicco, N., and Lattanzio, V., 2011, The Influence of Initial Carbonate

Concentration on the Folin-Ciocalteu Micro-Method for the Determination

of Phenolics with Low Concentration in the Presence of Methanol: A

Comparative Study of Real-Time Monitored Reactions, Am. J. Anal.

Chem., 840-845.


http://ffarmasi.unand.ac.id/pub/JSTFFeb2009%25

53

Clarkson, P.M., Thomson, H.S. 2000. Antioxidants: What role do they play in physical activity and health, Am J Clin Nutr. 729 (Suppl): 637.

Dahlan, M. S., 2012, Statistik untuk Kedokteran dan Kesehatan, Salemba Medika, Jakarta, p.17.

Das, S.C., Hamid, K., Bulbul, I.J., Sultana, S. dan Islam, S., 2010, In Vitro Antioxidant Activity of Different Parts of the Plant Diospyros discolor, Research Journal of Agriculture and Biological Sciences, 6(4): 472-475

Dave, A., 2010, Rotary Evaporation in the Kitchen, http://www.cooking issues.com/primers/rotovap, diakses tanggal 28 Mei 2013

Dehpour AA, Ebrahimzadeh MA, Nabavi SF, Nabavi SM (2009), Antioxidant activity of methanol extract of Ferula assafoetida and its essential oil composition, Grasas Aceites, 60(4): 405-412.

Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995, Farmakope Indonesia, edisi 4, 1061, 1036, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta

Duh, P., Y. Tu, and G. Yen, 1999, Antioxidant activity of water extract of Harng Iyur (Chrysanthemum morifolium Ramat), Lebensm Wiss U Technol 32: 269-277.

Duke, J.A., 2001, Handbook of Phytochemical Constituents of Gras Herbs and Other Economic Plants, CRC Press, Washington, D.C., pp.235

Dinis, T.C., Maderia, V.M., dan Almeida, L.M., 1994, Action of Phenolic Derivates (Acetoaminophen, Salycilate and 5-Aminosalycilate) as Inhibitors of Membrane Lipid Peroxidation and as Peroxyl Radical Scavengers, Archives of Biochemistry and Biophysics 315, 161-169.

Evans, C.S., dan Hedger, J.N., 2001, Degradation of Plant Cell Wall Polymers, in Gadd, G.M., (Ed.), Fungi in Bioremediation, Cambridge University Press, United Kingdom, 18.

Fessenden, R.J. dan Fessenden, J.S., 1995, Kimia Organik, Jilid II, 119-220, diterjemahkan oleh Pudjaatmaka, A.H., edisi ke 3, Penerbit Erlangga.Jakarta

Fouad, T., 2005, Antioxidant, Nature, and Chemistry, http://www.thedoctorslounge.net/medlounge/articles/antioxidant, diakses tanggal 3 maret 2011

Halliwell, B., 1994, Free Radicals and Antioxidants: a Personal View, Nutr. Rev., 52, 253-265.

Halliwell, B and Gutteridge, J.M.C., 2000, Free Radical in Biology and Medicine,

Oxford University Press, New York.


http://www.cooking/

http://www.thedoctorslounge.net/medlounge/articles/antioxidant

54

Harborne, J.B., 1987, Metode Fitokimia : Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, Ed. 2, diterjemahkan oleh Padmawinata, K., Penerbit ITB, Bandung, pp. 47-109

Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya, Majalah Ilmu Kefarmasian, pp. 117-135

Hernani ., 2005, Tanaman Berkhasiat Antioksidan, Penerbit Swadaya, Jakarta.

Howlader S.I., Rahman M., Khalipa A.B.R., Ahmed F., and Rahman M., 2012, Antioxidant and Antidiarrhoeal Potentiality of Diospyros blancoi, International Journal of Pharmacology 8 (5): 403-409

International Plant Names Idex (IPNI), Diospyros blancoi A. DC., http://www.ipni.org/ipni/idPlantNameSearch.do?id=322146-1, diakses tanggal 11 Juli 2013.

Kalita, D., Kar, R., dan Handique, J. G., 2011, A Theoretical Study On The Antioxidant Property Of Gallic Acid And Its Derivatives, Journal of Theoretical and Computational Chemistry, 11(2), 391-402.

Koleva, I.I., van Beek, T.A., Linssen, J.P.H., de Groot, A., dan Evstatieva, L.N., 2002, Screening of Plant Extracts For Antioxidant Activity: A Comparative Study on Three Testing Methods, Phytochemical Analysis, 13, 8-17.

Lee, M.H., Jiang, C.B., Juan, S.h., Lin, R.D. and Hou, W.C. 2006. Screening of medicinal plant extracts for antioxidant activity, Life Science, 73: 167-179.

Markham, K.R., 1988, Techniques of Flavoniods Identification, diterjemahkan oleh Padmawinata, K., 15. Penerbit ITB, Bandung.

Marxen, K., Vanselow, K.H., Lippemeier, S., Hitsze, R., Ruser, A., dan Hansen, U., 2007, Determination of DPPH Radical Oxidation Caused by Methanolic Extract of Some Mircroalgal Species by Linear Regression Analysis of Spectrofotometric Measurements, Sensors, 7(2007) , 20802095, Jerman.

Moeljatno, R., 2003, Khasiat dan Manfaat Dau Sirih Obat Mujarab dari Masa ke Masa , Agromedia Pustaka, Jakarta.

Molyneux, P., 2004, The Use of Stable Free Radical Diphenylpicryl Hydrazyl(DPPH) for Estimating Antioxidant Activity, Songnaklanakarin. J. Sci. Technol., 26, 211-218.

Morton, J., 1987, Fruit of Warm Climate, Mabolo, Miami, FL, 418-419

Mulja, M. dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Edisi I, Airlangga University Press, Surabaya, 1-35


http://www.ipni.org/ipni/idPlantNameSearch.do?id=322146-1

55

Nely, F., 2007, Aktivitas Antioksidan Rempah Pasar dan Bubuk Rempah Pabrik dengan Metode Polifenol dan Uji Atom (Active Oxygen Method), Tesis, 3, Institut Pertanian Bogor, Bogor

Nishizawa, M.,Kohno, M., Nishimura,M.,Katigawa ,A.,Niwano, Y., 2005, Non-

reductive scavenging of 1,1-diphenil-2-picryllhhydrazil (DPPH) by

peroxyradical: A useful method for quatitatif analysis and peroxyradical,

J.Chem. Pharm,53,714-716

Noorcholies Z., Wahjo D., dan Mulja H.S., 1997, Proses Bahan Tanaman Menjadi Obat di Indonesia, Surabaya.

Percival, M., 1998, Antioxidant, Advanced Notrition Publication, Inc.

Pokorny, J.,Yanishlieva, N., and Gordon M., 2001, Antioxidant in food; Practical Applications, CRC Press, New York.

Prakash, A., 2001, “ Antioxidant Activity “ Medallion Laboratories : Analithycal Progres Vol 19 No : 2. 1 – 4.

Robinson, T., 1995, Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, diterjemahkan oleh Padmawinata, K., hal. 191-213, Penerbit ITB Bandung.

Rohman, A., 2009, Kromatografi untuk Analisis Obat, Graha Ilmu, Jakarta

Ronald, L. Prior, Wu, Xianli, and Schaich, K., 2005, Standardized Methods for the Determination of Antioxidant Capacity and Phenolics in Foods and Dietary Supplements, J. Agr. Food Chem., 4290-4302.

Sambada, D. L. E., 2011, Uji Aktivitas Antioksidan Menggunakan Radikal DPPH dan Penetapan Kandungan Fenolik Total Fraksi Air Ekstrak Etanolik Daun Selasih, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Sandhar, Harlen K., Kumar, B., Prasher, S., Tiwari P., Salhan M., and Sharma P., 2011, A Review of Phytochemistry and Pharmacology of Flavonoids, I.P. S.,vol 1, 25-40.

Sastromihardjojo, 2001, Spektroskopi, Edisi ke 2, Liberty, Yogyakarta, pp. 39-42.

Simpson, T.I., 1985. Aromatics Compounds. In The Chemistry of Natural Products. ed. by R.H. Thompson. Blackie & Sons Ltd. Glasgow, pp. 56-107.

Singleton,V.L.& Rossi, J.A., 1965,Colorimetry of Total Phenolics withPhosphomolybdic-phosphotungstic Acid Reagents, Am. J. Enol. Vitic. 16:144-58.

Suhartono, E., Fujiati, Aflanie, I. (2002). Oxygen toxicity by radiation and effect of glutamic piruvat transamine (GPT) activity rat plasma after vitamine C


56

treatmen, Diajukan pada Internatinal seminar on Environmental Chemistry and Toxicology, Yogyakarta.

Sunarni, T., 2005, Aktivitas Antioksidan Penangkap Radikal Bebas Beberapa kecambah Dari Biji Tanaman Familia Papilionaceae, 53-61, Jurnal Farmasi Indonesia 2 ( 2 ) , Jakarta.

Suyitno, 1989, Rekayasa Pangan. PAU Pangan dan Gizi. UGM Yogyakarta

Snyder L.R., and Kirkland J.J,1997, Practical HPLC Method Development, 2nd

Ed, John Wiley and sons

United States of Department Agriculture (USDA) NRSC, Plant database: Diospyros blancoi A. DC., http://plants.usda.gov/java/nameSearch, diakses tanggal 31 Mei 2013.

Venkataraman, K., 1976, Review Article:Woods Phenolic in The Chemotaxonomy of The Moraceae, Phytochemistry, 1586

Wahdah, R., C. Nisa dan B.F. Langai. 2002. Identifikasi dan Karakterisasi Buah-

Buahan di Lahan Kering Kalimantan Selatan. Fakultas Pertanian Unlam bekerja sama dengan BPTP Kalimantan Selatan, Banjarbaru. 167h.

Winarsi, H., 2007, Antioksidan Alami Dan Radikal, edisi I, Kanisius, Yogyakarta, pp.17

Windono, T., Soedirman, S., Yudawati, U., Ermawati, E., Srielita, A., dan Erowati, T.I., 2001, Uji Peredam Radikal Bebas Terhadap 1,1-Diphenyl-2-picrilhydrazyl (DPPH) dari Ekstrak Kulit Buah dan Biji Anggur (Vitis vinifera L.) Probolinggo Biru dan Bali, Artocarpus, Surabaya, 1 (1), 34-43.

World Health Organization, 2003, WHO Guidelines on Good Agricultural and Collection Practices (GACP) for Medicinal Plants, Government of the Grand Duchy of Luxembourg, 11-15.


http://plants.usda.gov/java/nameSearch

57

Lampiran 1. Surat pengesahan determinasi tanaman apel beludru (

Diospyros blancoi A. DC.)

LAMPIRAN


58

Lampiran 2. Gambar tanaman apel beludru yang diambil di kompleks

Universitas Sanata Dharma


59

Lampiran 3 . Perhitungan Rendemen

a. Sari Buah Apel Beludru

Penggunaan pelarut (aquadest)

Wadah 1 (g) Wadah 2 (g)

Bobot Wadah 11,28 11,28

Bobot Wadah+Buah 163,33 163,81

Bobot Buah 152,05 152,53

Penggunaan Aquadest 300 mL 300 mL

Sari Buah 235 mL 235mL

Sari Buah Total 470 mL

Bobot buah apel bludru yang digunakan =304,58 g

b. Rendemen fraksi etil asetat sari buah apel beludru

Cawan (g)

Bobot cawan 51,66

Bobot cawan + fraksi etil asetat (setelah pemekatan dan

pengeringan hingga bobot tetap)

51,80

Bobot fraksi 0,14

140 mg

Bobot buah apel bludru yang digunakan = 304,58 g

Rendemen fraksi etil setat =��

�� 100%

= �,��

��,�� 100

= 0.046 %


60

Lampiran 4 . Data penimbangan untuk pengujian aktivitas antioksidan

a. Data penimbangan DPPH untuk OT Kuersetin

Replikasi 1 (g) Repilkasi 2 (g) Replikasi 3 (g)

Bobot kertas 0,2125 0,2086 0,2167

Bobot kertas + DPPH 0,2286 0,2245 0,2324

Bobot kertas + sisa 0,2126 0,2088 0,2168

Bobot DPPH 0,0160 0,0157 0,0156

b. Data penimbangan DPPH untuk seri konsentrasi Kuersetin


Bobot kertas 0,2132 0,2093 0,2215

Bobot kertas + kuersetin 0,2093 0,2254 0,2375


Bobot zat 0,0158 0,0159 0,0158

c. Data penimbangan DPPH untuk OT dan seri konsentrasi fraksi etil asetat


Bobot kertas 0,2077 0,2115 0,2203

Bobot kertas + DPPH 0,2237 0,2275 0,2363


Bobot DPPH 0,0158 0,0158 0,0159 d. Data penimbangan Kuersetin untuk OT dan seri konsentrasi


Bobot kertas 0,2136 0,2082 0,2192

Bobot kertas + Kuersetin 0,2239 0,2185 0,2294


Bobot Kuersetin 0,0102 0,0101 0,0099


61

e. Data penimbangan Fraksi Etil Asetat Sari Buah Apel Beludru untuk OT

dan seri konsentrasi


Bobot kertas 0,2145 0,2017 0,2239

Bobot kertas + Fraksi 0,2247 0,2121 0,2340


Bobot Fraksi 0,0101 0,0102 0,0099


62

Lampiran 5. Data perhitungan konsentrasi DPPH, larutan pembanding, dan

larutan uji

a. Konsentrasi DPPH untuk seri kosentrasi kuersetin.

Untuk seri kosentrasi kuersetin:

1. Replikasi 1

BM = 394,33

Mol = ��

�� =

��,��

��,�� = 0,0401 mmol

M= ��

�� =

�,��

�,� � = 0,401 mM

2. Replikasi 2

BM = 394,33

Mol = ��

�� =

��,� ��

��,�� = 0,0403 mmol

M= ��

�� =

�,��

�,� � = 0,403 mM

3. Replikasi 3

BM = 394,33

Mol = ��

�� =

��,� ��

��,�� = 0,0401 mmol

M= ��

�� =

�,��

�,� � = 0,401 mM

Untuk seri kosentrasi fraksi etil asetat:

1. Replikasi 1

BM = 394,33

Mol = ��

�� =

��,��

��,�� = 0,0401 mmol

M= ��

�� =

�,��

�,� � = 0,401 mM


63

2. Replikasi 2

BM = 394,33

Mol = ��

�� =

��,� ��

��,�� = 0,0401 mmol

M= ��

�� =

�,��

�,� � = 0,401 mM

3. Replikasi 3

BM = 394,33

Mol = ��

�� =

��,� ��

��,�� = 0,0403 mmol

M= ��

�� =

�,��

�,� � = 0,403 mM

b. Konsentrasi Kuersetin

1. Kosentrasi larutan induk

Replikasi 1Replikasi 2Replikasi 3

��,� ��

�� = 1020 µg/mL

��,� ��

�� = 1010 µg/mL

�,� ��

�� = 990 µg/mL

2. Kosentrasi larutan intermediet


��

�� = 102 µg/mL

��

�� = 101 µg/mL

��

�� = 99 µg/mL

3.Konsentrasi seri larutan pembanding kuersetin

Seri larutan pembanding

Konsentrasi larutan pembanding


Seri 1 5,10 µg/ml 5,05 µg/ml 4,95 µg/ml






64

Contoh perhitungan konsentrasi larutan pembanding (Replikasi 1) :

Larutan intermediet = 102 µg/mL

Konsentrasi larutan pembanding (seri 1) =

C1 x V1 = C2 x V2

102 µg/mL x 0,5 ml = C2 x 10 ml

C2 = 5,10 µg/mL

c.Fraksi etil asetat sari buah apel beludru (larutan uji)

1. Kosentrasi larutan induk


��,� ��

�� = 1010 µg/mL

��,� ��

�� = 1020 µg/mL

�,� ��

�� = 990 µg/mL

2. Kosentrasi larutan intermediet


��

�� = 101 µg/mL

��

�� = 102 µg/mL

��

�� = 99 µg/mL

3.Konsentrasi seri larutan uji

Seri larutan uji Konsentrasi larutan uji








65

Contoh perhitungan konsentrasi larutan uji (Replikasi 1) :

Larutan intermediet = 101 µg/mL

Konsentrasi larutan uji (seri 1) =

C1 x V1 = C2 x V2

101 µg/mL x 1,5 ml = C2 x 10 ml

C2 = 15,15 µg/mL


66

Lampiran 6. Scanning pengkoreksi

a. Scanning metanol

b. Scanning metanol : air (1:1 v/v)


67

c. Scanning kuersetin

d. Scanning fraksi etilasetat sari buah apel beludru (400-600 nm)


68

e. fraksi etilasetat sari buah apel beludru (600-800 nm)


69

Lampiran 7. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan

a. Penentuan λ maksimum,

1. Scanning DPPH 0,020 mM


70

2. Spektra DPPH 0,040 mM

3. Spektra DPPH 0,060 mM


71

4. Plot scanning λ maksimum

b. Penentuan Operating Time

1. Penetuan OT kuersetin

OT replikasi 1

Waktu (menit) Absorbansi konsentrasi replikasi I pada λ 516 nm

5,10 µg/mL 10 ,20 µg/mL 15,30 µg/mL

5 0,752 0,564 0,376

10 0,746 0,547 0,353

15 0,742 0,535 0,334

20 0,740 0,523 0,316

25 0,741 0,512 0,298

30 0,740 0,503 0,281

35 0,738 0,493 0,265

40 0,740 0,483 0,248

45 0,742 0,474 0,234

50 0,743 0,465 0,224

55 0,745 0,456 0,212

60 0,742 0,449 0,200


72

OT replikasi 2

OT replikasi 3 yang didapat antara 30 - 40 menit

Waktu (menit) Absorbansi konsentrasi replikasi II pada λ 516 nm

5,05 µg/mL 10,10 µg/mL 15,15 µg/mL

5 0,655 0,479 0,278

10 0,648 0,468 0,258

15 0,642 0,459 0,247

20 0,638 0,453 0,239

25 0,635 0,448 0,233

30 0,633 0,445 0,229

35 0,633 0,442 0,226

40 0,632 0,440 0,223

45 0,630 0,438 0,218

50 0,629 0,435 0,218

55 0,628 0,433 0,215

60 0,628 0,432 0,212

Waktu (menit) Absorbansi konsentrasi replikasi III pada λ 516 nm

4,95 µg/mL 9,90 µg/mL 14,85 µg/mL

5 0,556 0,443 0,340

10 0,553 0,432 0,327

15 0,552 0,426 0,320

20 0,551 0,422 0,315

25 0,552 0,418 0,311

30 0,551 0,415 0,307

35 0,551 0,413 0,305

40 0,551 0,411 0,303

45 0,555 0,408 0,301

50 0,559 0,406 0,298

55 0,556 0,403 0,295

60 0,555 0,401 0,291


73

2. Fraksi etil asetat sari buah apel beludru

OT replikasi 1 yang didapat antara 25 – 45 menit

Waktu (menit) Absorbansi konsentrasi replikasi I pada λ 516 nm

15,15 µg/mL 25,25 µg/mL 35,35 µg/mL

5 0,682 0,534 0,387

10 0,670 0,517 0,372

15 0,662 0,506 0,365

20 0,657 0,501 0,361

25 0,655 0,498 0,359

30 0,654 0,498 0,358

35 0,654 0,499 0,357

40 0,653 0,498 0,356

45 0,654 0,497 0,355

50 0,654 0,497 0,353

55 0,655 0,498 0,351

60 0,654 0,497 0,350


74

Waktu (menit) Absorbansi konsentrasi replikasi II pada λ 516 nm

15,30 µg/mL 25,50 µg/mL 35,70 µg/mL

5 0,676 0,535 0,402

10 0,665 0,520 0,384

15 0,658 0,507 0,371

20 0,655 0,498 0,362

25 0,653 0,494 0,358

30 0,653 0,492 0,356

35 0,652 0,491 0,354

40 0,653 0,489 0,353

45 0,652 0,486 0,351

50 0,651 0,485 0,348

55 0,650 0,485 0,346

60 0,650 0,484 0,344

OT replikasi 2 yang didapat 25 - 40 menit

Waktu (menit) Absorbansi konsentrasi replikasi III pada λ 516 nm

14,85 µg/mL 24,75 µg/mL 34,65 µg/mL

5 0,683 0,527 0,403

10 0,674 0,517 0,388

15 0,665 0,509 0,377

20 0,661 0,506 0,370

25 0,659 0,503 0,366

30 0,658 0,502 0,364

35 0,658 0,501 0,362

40 0,657 0,499 0,360

45 0,655 0,498 0,357

50 0,656 0,496 0,355

55 0,655 0,493 0,353

60 0,655 0,492 0,350

OT replikasi 3 yang didapat 25 – 40 menit


75

Lampiran 8. Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH

% IC = Absorbansi (larutan control)–Absorbansi sampel (larutan pembanding/uji)X100%

Absorbansi larutan control

1. Kuersetin


(µg/mL) Absorbansi

kontrol

Absorbansi larutan

pembanding % IC Persamaan regresi

linier

5,10 0,701 17,82

7,65 0,564 33,88

I 10,20 0,853 0,468 45,13 y = 5,2365x – 7,786

12,75 0,345 59,55 r=0,9987

15,30 0,241 71,75

Konsentrasi 5 ,10 µg/mL

%IC =�,��.��

�,�� 100 % = 17,82%

Konsentrasi 7,65 µg/mL

%IC =�,��.��

�,�� 100 % =33,88%


%IC =�,��.��

�,�� 100 % = 45,13%


%IC =�,��.��

�,�� 100 % = 59,55%


%IC =�,��.��

�,�� 100 % = 71,75%


76


(µg/mL) Absorbansi

kontrol

Absorbansi larutan


linier

5,05 0,707 17,98

7,58 0,862 0,577 33,06

II 10,10 0,472 45,24 y = 5,3620x – 8,577

12,63 0,354 58,93 r=0,9996

15,15 0,235 72,74


(µg/mL) Absorbansi

kontrol

Absorbansi larutan


linier

4,95 0,698 18,65

7,43 0,858 0,567 33,92

III 9,90 0,456 46,85 y = 5,5988x – 8,516

12,38 0,338 60,61 r=0,9997

14,85 0,218 74,59

2. Fraksi etil asetat sari buah apel beludru


(µg/mL) Absorbansi



15,15 0,654 25,09

20,20 0,873 0,577 33,91 y = 1,6691x + 0,125

I 25,25 0,498 42,96 r = 0,9995

30,30 0,433 50,40

35,35 0,358 58,99


%IC =�,��.��

�,�� 100 % = 25,09 %


%IC =�,��.��

�,�� 100 % =33,91 %

Konsentrasi1 25,25 µg/mL

%IC =�,��.��

�,�� 100 % = 42,96 %



77

%IC =�,��

�,�� 100 % = 50,40 %


%IC =�,��,��

�,�� 100 % = 58,99 %


(µg/mL) Absorbansi



15,30 0,653 24,77

20,40 0,868 0,575 33,76

II 25,50 0,492 43,32 y = 1,6829x – 0,517

30,60 0,424 51,15 r=0,9990

35,70 0,356 58,99

Replikasi

Konsentrasi

(µg/mL)

Absorbansi

kontrol

Absorbansi

larutan uji % IC

Persamaan regresi

linier

14,85 0,658 25,31

19,80 0,881 0,588 33,26

III 24,75 0,502 43,02 y = 1,6858x + 0,343

29,70 0,439 50,17 r=0,9991

34,65 0,364 58,68


78

Lampiran 9. Perhitungan nilai IC50 kuersetin dan fraksi etil asetat sari buah apel beludru

a. Kuersetin

Replikasi I

Persamaan regresi linier :y = 5,2365x – 7,784

( y = aktivitas antioksidan, x = kadar kuersetin dalam µg/mL)

IC50 adalah nilai x saat y = 50

50= 5,2365 x – 7,784

x= �� 7,784

5,2365= ��, �� µg/mL

Replikasi Persamaan IC50 (µg/mL)

II y = 5,3620x – 8,577 10,92

III y = 5,5988x – 8,516 10,45

b. Fraksi etil asetat sari buah apel beludru

Replikasi I

Persamaan regresi linier : y = 1,6691x + 0,125

( y = aktivitas antioksidan, x = kadar fraksi etil asetat dalam µg/mL)

IC50 adalah nilai x saat y = 50

50 = 1,6691x + 0,125

x= ��,��

�,��= ��, �� μ�/��


79

Replikasi Persamaan IC50 (µg/mL)

II y = 1,6829x – 0,517 30,02

III y = 1,6858x + 0,343 29,86

Lampiran 10. Penimbangan uji kandungan fenolik total

a. Data Penimbangan Asam Galat

0,354 0,363

0,485 0,489

0,632 0,637

0,767 0,769

b. Data Penimbangan Fraksi etil asetat sari buah apel beludru

Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g) Replikasi 3 (g)

Bobot Kertas 0,2068 0,2034 0,2153

Bobot Kertas + zat 0,2370 0,2337 0,2456

Bobot sisa 0,2069 0,2036 0,2154

Bobot zat 0,0301 0,0301 0,0302


80

Lampiran 11. Scanning kontrol asam galat

Lampiran 12. Optimasi penentuan kandungan fenolik total

a. Penentuan Operating TimeAsam Galat

Waktu (menit) Absorbansi konsentrasi replikasi I pada λ 751,0 nm 51 µg/mL 102 µg/mL 153 µg/mL

5 0,211 0,419 0,672 10 0,225 0,454 0,712 15 0,232 0,469 0,730 20 0,236 0,475 0,739 25 0,237 0,477 0,742

30 0,238 0,479 0,744 OT Replikasi 1 yang didapat 20 menit

Waktu (menit) Absorbansi konsentrasi replikasi II pada λ 751,0 nm 51 µg/mL 102 µg/mL 153 µg/mL

5 0,217 0,421 0,680 10 0,232 0,457 0,722 15 0,239 0,472 0,740 20 0,244 0,479 0,749 25 0,246 0,482 0,752 30 0,247 0,484 0,755

OT Replikasi 2 yang didapat 20 menit


81

Waktu (menit) Absorbansi konsentrasi replikasi III pada λ 751,0 nm

50,50 µg/mL 101 µg/mL 151,50 µg/mL 5 0,206 0,410 0,667 10 0,219 0,443 0,706 15 0,225 0,457 0,723 20 0,228 0,462 0,730 25 0,229 0,464 0,732 30 0,230 0,465 0,734

OT Replikasi 3 yang didapat 20 menit

b. Penentuan Operating Time fraksi etil asetat sari buah apel beludru

Waktu (menit) Absorbansi konsentrasi sampel pada λ 751,0 nm

Replikasi 1 (301µg/mL)



5 0,503 0,474 0,501 10 0,530 0,499 0,519 15 0,546 0,511 0,531 20 0,557 0,526 0,545 25 0,565 0,538 0,561

30 0,571 0,546 0,572 35 0,576 0,553 0,578 40 0,578 0,558 0,581

45 0,579 0,561 0,582 50 0,579 0,563 0,583

55 0,581 0,565 0,585 60 0,580 0,566 0,586

OT yang didapat 40 – 50 menit


82

c. Penentuan λ maksimum

1. Spektra asam galat 50 μg/mL


83



84



85

Lampiran 13.Penentuan kandungan fenolik total

a. Asam Galat

1. Kosentrasi larutan asam galat


��,� ��

�� = 1020 µg/mL

��,� ��

�� = 1020 µg/mL

��,� ��

�� = 1010 µg/mL

2. Konsentrasi seri larutan asam galat

Replikasi 1 (1020 µg/mL)

Seri 1 Seri 2

C1.V1 = C2.V2 C1.V1 = C2.V2

1020 µg/mL.0,5 mL = C2. 10 1020 µg/mL.0,75 mL = C2. 10mL

C2 = 51 µg/mL C2 = 76,5 µg/mL

Seri 3 Seri 4

C1.V1 = C2.V2 C1.V1 = C2.V2

1020 µg/mL.1 mL = C2. 10 mL 1020 µg/mL.1,25 mL = C2. 10

C2 =102,0 µg/mL C2 =127,5 µg/mL

Seri 5

C1.V1 = C2.V2

1020 µg/mL. 1,5 mL = C2. 10 mL

C2 =153,0 µg/mL


86

Seri Larutan Konsentrasi

(µg/mL) Absorbansi Persamaan

konsentrasi vs abs

Seri 1 51,0 0,231 y = 5,2941.10-3 x – 0,0462

r= 0,9995

Seri 2 76,5 0,354

Seri 3 102,0 0,485

Seri 4 127,5 0,632

Seri 5 153,0 0,767


Seri 1 Seri 2

C1.V1 = C2.V2 C1.V1 = C2.V2

1020 µg/mL. 0,5 mL = C2. 10 1020 µg/mL. 0,75 mL = C2. 10mL

C2 = 51,0 µg/mL C2 = 76,5 µg/mL

Seri 3 Seri 4

C1.V1 = C2.V2 C1.V1 = C2.V2

1020 µg/mL. 1 mL = C2. 10 mL 1020 µg/mL. 1,25 mL = C2. 10

C2 =102,0 µg/mL C2 =127,5 µg/mL

Seri 5

C1.V1 = C2.V2

1020 µg/mL. 1,5 mL = C2. 10 mL

C2 =153,0 µg/mL


87



konsentrasi vs abs

Seri 1 51,0 0,242

y = 5,2078.10-3x – 0,0312

r = 0,9993

Seri 2 76,5 0,363

Seri 3 102,0 0,489

Seri 4 127,5 0,637

Seri 5 153,0 0,769


Seri 1 Seri 2

C1.V1 = C2.V2 C1.V1 = C2.V2

1010 µg/mL. 0,5 mL = C2. 10 1010 µg/mL. 0,75 mL = C2. 10mL

C2 = 50,50 µg/mL C2 = 75,75 µg/mL

Seri 3 Seri 4

C1.V1 = C2.V2 C1.V1 = C2.V2

1010 µg/mL. 1 mL = C2. 10 mL 1010 µg/mL. 1,25mL = C2. 10

C2 = 101,00 µg/mL C2 = 126,25 µg/mL

Seri 5

C1.V1 = C2.V2

1010 µg/mL. 1,5 mL = C2. 10 mL

C2 = 151,50 µg/mL


88



konsentrasi vs abs

Seri 1 50,50 0,221 y = 5,3782.10-3x – 0,0564

r = 0,9997

Seri 2 75,75 0,346

Seri 3 101,00 0,481

Seri 4 126,25 0,626

Seri 5 151,50 0,760

b. Sampel (fraksi etil asetat sari buah apel beludru)

1. Konsentrasi larutan stock sampel :

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 ��,� ��

�� = 3010 µg/mL

��,� ��

�� = 3010 µg/mL

��,� ��

�� = 3020 µg/mL

2. Konsentrasi larutan sampel :

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 ��

�� = 301 µg/mL

��

�� = 301 µg/mL

��

�� = 302 µg/mL

Sampel replikasi 1

Penimbangan sampel = 30,1 mg , Volume 100 mL

Absorbansi sampel = 0,580

y = 5,3782.10-3x – 0,0564

0,580 = 5,3782.10-3x – 0,0564

x = �,�� ,��

�,��

= 118,33µg/mL

Kandungan fenolik total :

x.�

�= 0,11833 mg/mL . 100mL / 0,0301 g = 393,12 mg ekivalensi asam

galat per g fraksi.


89

Sampel replikasi 2

Jumlah sampel = 301 mg, volume 100 mL


y = 5,3782.10-3x – 0,0564

0,581 = 5,3782.10-3x – 0,0564

x = �,�� ,��

�,��

= 118,52µg/mL

Kandungan fenolik total =

x . �

� = 0,11852mg/mL.

��

�,�� = 393,75 mg ekivalensi asam galat per g

fraksi.

Sampel replikasi 3

Jumlah sampel = 302 mg, volume 100 mL


y = 5,3782.10-3x – 0,0564

0,583 = 5,3782.10-3x – 0,0564

x = �,�� ,��

�,��

= 118,89µg/mL

Kandungan fenolik total =

x . �

� = 0,11889mg/mL.

��

�,�� = 393,68 mg ekivalensi asam galat per g

fraksi.


Lampiran 14. Uji Statistik

Uji Statistikdalam mengolah data

a. Uji Normalitas

Lampiran 14. Uji Statistik

Uji Statistikdalam mengolah data menggunakan program R 2.13

Uji Normalitas

90

menggunakan program R 2.13.2


b. Uji T tidak berpasangan

(Tingkat kepercayaan 95%

Uji T tidak berpasangan

ingkat kepercayaan 95%)

91


92

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi yang berjudul “Uji Aktivitas Antioksidan Menggunakan Radikal 1,1-Difenil-2-Pikrilhidarzil (DPPH) dan Penetapan Kandungan Fenolik Total Fraksi Etil Asetat Sari Buah Apel Beludru (Diospyros blancoi A. DC.)” memiliki nama lengkap Johanes Baptista Yunio Rahmawan. Dilahirkan di kota Yogyakarta, 24 Juni 1991 dari pasangan Bapak Antonius Rujito dan Ibu Irene Sopiati. Penulis telah menyelesaikan pendidikan di TK Karang Sari pada tahun 1996 hingga 1997 lalu melanjutkan pendidikan dasar di SD Kanisius Gayam Yogyakarta pada tahun 1997 hingga 2003. Penulis melanjutkan pendidikan menengah di SMP Pangudi

Luhur 2 yogyakarta pada tahun 2003 hingga 2006 dan SMA Kolese De Britto Yogyakarta pada tahun 2006 hingga 2009. Kemudian penulis melanjutkan pendidikan perguruan tinggi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2009 hingga 2013. Selama menjadi mahasiswa di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, penulis cukup aktif dalam kegiatan kemahasiswaan, kepanitiaan dan kegiatan lain yang terdapat di dalam maupun di luar Universitas Sanata Dharma antara lain: Wakil Komisaris Badan Semi Otonom ISMAFARSI, peserta training of trainer Nasional (2009), anggota Pansus Insisasi Universitas, dan panitia Temu Alumni (2010).


plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - core.ac.uk · sel, kerusakan struktur sel, molekul...

Documents