petunjuk praktikum kjt 2019 - biologi.ub.ac.id · (schenk & hilderdrandt), medium wpm (woody...

PETUNJUK PRAKTIKUM

Disusun Oleh: Dr. Wahyu Widoretno, MSi.

Ir. Retno Mastuti, MAgSc., DAgSc.

LABORATORIUM KULTUR JARINGAN TUMBUHAN JURUSAN BIOLOGI - FAKULTAS MIPA

UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG

2019

Praktikum Kultur Jaringan Tumbuhan-2019 1

DAFTAR ISI

Halaman

Daftar Isi 1 Topik 1. Medium kultur jaringan 2 Topik 2. Perkecambahan biji anggrek secara in vitro 6 Topik 3. Perbanyakan vegetatif tanaman secara In Vitro 9 Topik 4. Kultur anther/polen 12 Topik 5. Pembuatan biji sintetik 15 Topik 6. Isolasi protoplas 17 Topik 7. Kultur suspensi sel 20 Lampiran 23

2

TOPIK 1. MEDIUM KULTUR JARINGAN Teori dasar

Keberhasilan metode kultur jaringan sangat tergantung pada jenis medium yang digunakan. Beberapa media kultur jaringan antara lain, medium Murashige dan Skoog (MS) (Murashige & Skoog, 1962), medium B5 (Gamborg et al., 1968), medium SH (Schenk & Hilderdrandt), medium WPM (Woody Plant Medium) dan medium N6. Komponen medium kultur jaringan tumbuhan meliputi: garam-garam anorganik, vitamin, asam amino, karbohidrat dan zat pengatur tumbuh. Garam-garam anorganik

Jaringan tumbuhan yang dikultur memerlukan sumber zat kimia anorganik tertentu secara kontinyu. Elemen-elemen mineral sangat penting dalam hidup tanaman. Disamping C, H, N, dan O, 12 elemen lain diketahui esensial bagi pertumbuhan tanaman. Menurut rekomendasi International Association for Plant Physiology, elemen yang diperlukan oleh tanaman dalam konsentrasi yang lebih besar dari 0,5 mmol/l dikenal sebagai makroelemen atau elemen mayor dan yang diperlukan dalam konsentrasi kurang dari 0,5 mmol/l disebut mikroelemen atau elemen minor.Garam potassium (K), nitrogen (N), calcium (Ca), magnesium (Mg), phosphor (P) dan sulphur (S) diperlukan dalam jumlah besar (makro/milimole). Nitrogen pada umumnya digunakan sebagai garam nitrat atau ammonium. Sulphur sebagai sulphate dan phosphor sebagai phosphat. Garam cooper (Cu), zinc (Zn), manganese (Mn), iron (Fe), boron (B), molybdenum (Mo), cobalt (Co) dan iodine (I) diperlukan dalam konsentrasi micromolar dan dianggap sebagai garam minor. Garam-garam ini esensial untuk pertumbuhan jaringan dan diperlukan dalam jumlah sangat sedikit. Sumber karbon dan energi

Semua media memerlukan gula sebagai sumber karbon dan sumber energi. Sumber karbon standar untuk kultur jaringan adalah sukrosa, walaupun beberapa jaringan tanaman dapatmenggunakan berbagai macam karbohidrat seperti glukosa, fruktosa, laktosa, maltosa, galaktosa dan pati. Dalam jaringan atau sel yang diukltur, proses fotosintesis terhambat sehingga untuk pertumbuhan jaringan diperlukan karbohidrat dalam medium. Sukrosa biasanya ditambahkan pada konsentrasi 20.000-45.000 mg/L. Proses sterilisasi dengan autoklaf dapat menyebabkan terjadi hidrolisis gula tetapi tidak menganggu pertumbuhan tanaman. Vitamin

Tanaman normal mensintesis vitamin yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembangan, tetapi sel-sel tanaman dalam kultur memerlukan vitamin B1 (thiamine), vitamin B6 (pyridoxine), nicotinic acid. Beberapa media mengandung asam pantotenat, biotin, asam. folat, as. bensoat, as. askorbat dan riboflavin. Vitamin mempunyai fungsi katalitik dalam sistem enzim dan diperlukan dalam jumlah kecil.


Myo-inositol Myo-inositol yang kadang-kadang disebut juga meso-inositol ditambahkan dalam

medium untuk membantu pertumbuhan dan diferensiasi tumbuhan. Myo-inositol ikut serta dalam beberapa reaksi metabolik penting, yaitu selain sebagai perantara pada perubahan glukosa menjadi asam galakturonat juga sebagai prekursor pektin dan penyusun dinding sel. Zat pengatur tumbuh

Keperluan zat pengatur tumbuh bagi sebagian besar kultur adalah auksin dan sitokinin. Auksin merupakan kelompok senyawa yang menstimulasi pemanjangan sel. Sitokinin merupakan senyawa yang memacu pembelahan sel. Auksin yang digunakan adalah IAA, NAA dan 2,4-D. Zat pengatur tumbuh IAA adalah auksin alami yang mudah terdegradasi oleh cahaya dan oksidasi enzimatik. Karena IAA oksidase dalam jaringan yang dikultur tinggi maka sebaiknya IAA ditambahkan dalam konsentrasi tinggi, yaitu 1-30 mg/l. Sedangkan NAA dan 2,4-D bisa diberikan dalam konsentrasi lebih rendah, yaitu 0,1-2 mg/l. Sitokinin yang sering digunakan dalam medium kultur adalah kinetin, benzyladenin (BA) dan zeatin. Kinetin dan BA adalah senyawa sintetik sedangkan zeatin merupakan senyawa alami. Suplemen organik

Senyawa komplek tertentu sering ditambahkan dalam media yang mensuplai nitrogen organic, karbon atau vitamin. Nitrogen organic dalam bentuk casein hydrlolusate (0,2-1 g/l) atau asam amino seperti glutamin dan asparagin, nukleotida seperti adenin ditambahkan dalam medium. Penambahan asamasam dalam siklus Kreb seperti asam sitrat, asam malat, suksinat atau fumarat dapat memacu pertumbuhan sel tanama yang dikultur pada medium yang hanya mengandung ammonium sebagai sumber nitrogen. Berbagai macam ekstrak seperti yeast extract, malt extract, air kelapa, juice tomat atau jeruk juga mampu memacu pertumbuhan sel/jaringan yang dikultur.

Jenis medium dasar yang paling umum digunakan adalah medium dasar MS (Tabel 1). Untuk membuat medium kultur jaringan, setiap komponen bahan kimia dapat disiapkan secara langsung. Namun untuk elemen mikronutrien dan vitamin serta zat pengatur tumbuh karena jumlah yang diperlukan sangat sedikit maka perlu dibuat larutan stok terlebih dahulu. Cara pembuatan larutan stok dapat dilihat di table 4 dan lampiran . Tujuan : Untuk mempersiapkan medium inisasi kalus, organogenesis, kultur anther dan suspensi sel dengan menggunakan medium dasar MS. Bahan dan alat : Neraca analitik, pipet ukur, gelas ukur, beaker glass, erlenmeyer, pH meter dan autoklav.

4

Tabel 1. Komposisi Medium Dasar Murashige dan Skoog (MS)

Komponen Jumlah (mg/L) Makronutrien KNO3 NH4NO3 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O KH2PO4

1 900 1 650 440 370 170

Mikronutrien MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O H3BO3 KI Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O FeSO4.7H2O (dilarutkan dengan Na2EDTA 37,3 mg/l)

22,3 8,6 6,2 0,83 0,25 0,025 0,025 27,8

Vitamin Thiamin-HCl Nicotinic acid Pyridoxine HCl Glycin

0,1 0,5 0,5 2

Myo-inositol 100 Sukrosa 30 000 pH 5.5 - 5.8

Cara kerja : Membuat medium MS 1 liter • Ambil larutan stok A, B, C, D, E, F, G, vitamin, myoinositol dengan volume sesuai

dalam table 2, masukkan ke dalam Erlenmeyer 1 liter. • Tambahkan sukrosa 3 g/L dan zat pengatur tumbuh dengan konsentrasi sesuai

perlakuan, dan tambahkan aquadest sampai volume 900 ml. • Ukur pH medium dengan pH meter antara 5,5-5,8. Perhatikan cara mengoperasikan

pH meter. Jika pH terlalu rendah naikkan dengan menambahkan NaOH 0,1 N dan jika pH terlalu tinggi turunkan dengan menambahkan HCl 0,1 N.

• Tambahkan agar 9 g/L, kemudian tambahkan aquadest sampai volume 1 liter. Sambil diaduk panaskan medium sampai mendidih kemudian masukkan ± 20 ml (sesuaikan dengan volume botol) ke dalam botol kultur dan tutup rapat dengan aluminium foil. Beri label yang bertuliskan jenis dan konsentrasi zpt yang ditambahkan.

• Sterilkan medium dengan autoklav pada suhu 121 C, tekanan 15 lbs (1,5 atm) selama 15 menit.

• Keluarkan dari autoklav dan simpan di ruang penyimpanan.


Tabel 2. Standart penimbangan untuk pembuatan stok medium MS

Larutan STOK Bahan Berat (g) untuk volume 100 ml

Pengambilan untuk 1 liter media

A (5x) NH4NO3 8.25 20 ml B (5x) KNO3 9.50 20 ml

C (10x) CaCl2.H2O 4.40 10 ml D (10x) MgSO4.7H2O 3.70 10 ml

KH2PO4 1.70 E (20x) FeSO4.7H2O 0.56 5 ml

Na2EDTA.2H2O 0.75 F (20x) H3BO3 0.12 5 ml

MnSO4.4H2O 0.34 ZnSO4.7H2O 0.17

G (200x) KI 0.20 0.5 ml Na2MoO4.2H2O 0.05 CuSO4.5H2O 0.005 CoCl2.6H2O 0.005

Vitamin (100x) Nicotinic acid 0.05 1 ml Pyridoxine-HCl 0.05 Thiamine-HCl 0.01 Glycine 0.20

Myo (10x) Myo-Inositol 1.00 10 ml Zpt Auksin/sitokinin 0.10 1ml untuk 1 ppm

Ket: Cara pembuatan larutan stok terdapat dalam lampiran Pengamatan : Tabel 3. Pengamatan ada/tidaknya kontaminasi. Catat saat munculnya, jenis kontaminannya (bakteri atau jamur) serta persentasenya.

Jenis medium

Saat munculnya kontaminan (hari)

Jenis kontaminan

Posisi kontaminan

Persentase kontaminasi

Pertanyaan-pertanyaan : 1. Mengapa beberapa komponen medium perlu dibuat stok sedangkan yang lain tidak ? 2. Bagaimanakah kondisi fisik larutan medium sampai medium menjadi padat ? 3. Apa yang terjadi pada medium yang sedang disterilisasi bila penurunan suhu dan tekanan autoklav tidak terjadi dengan sendirinya ? 4. Mengapa pH dibuat berkisar antara 5.5-5.8 ? 5. Mengapa penulisan label sebaiknya ditulis dengan pensil dan bukan tinta ?

6

TOPIK 2. PERKECAMBAHAN BIJI ANGGREK SECARA IN VITRO

Teori dasar Perbanyakan anggrek dapat dilakukan dengan cara perbanyakan vegetatif dan

generatif. Perbanyakan vegetatif dapat dilakukan dengan memisahkan bagian rumpun/bulb atau keiki. Sedangkan perbanyakan generatif dilakukan dengan biji.

Jika bunga anggrek berhasil diserbuki dan terjadi fertilisasi, buah/kapsul biji dapat menghasilkan ribuan biji (Gambar 1A). Satu buah mengandung 10.000 -100.000 biji. Bahkan, pada beberapa buah anggrek dapat mengandung 3.000.000 biji.

Biji anggrek sangat kecil (Gambar 1B) dan tidak mempunyai cadangan makanan sehingga sulit dikecambahkan. Bebearapa anggrek mempunyai biji dengan berat kurang dari 1 ug per biji, sedangkan beberapa yang lain tidak lebih besar dari 10 ug per biji. Di alam, biji anggrek tumbuh menjadi tanaman baru karena hidup bersimbiosis dengan jamur endomikoriza yang menyediakan makanan bagi biji anggrek yang sedang berkecambah.

Biji anggrek dapat dikembangkan melalui teknik kultur jaringan/in vitro. Perkecambahan biji anggrek dalam kondisi in vitro menunjukkan daya kecambah dan daya tumbuh yang lebih tinggi dibandingkan dengan perkecambahan biji anggrek dalam kondisi in vivo.

Media yang seringkali digunakan untuk menumbuhkan biji anggrek antara lain Knudson (Lampiran 2), dan Vacin & Went. Pada umumnya komposisi medium terdiri dari zat an organik dalam bentuk garam, sumber energi dalam bentuk gula seperti sukrosa, persenyawaan organik komplek seperti air kelapa, tomat dan pisang serta arang aktif.

Jika biji viable dan kondisi lingkungan dan nutrisi sesuai, biji akan berkecambah dalam beberapa hari atau minggu (kadang-kadang dalam beberapa bulan). Pada saat itu embrio membesar 2 kali lipat dari ukuran awal dan selaput biji akan pecah dan embrio akan berkembang menjadi protocorm. Pada awalnya perkembangan protocorm berbentuk bulat atau memanjang, kemudian menjadi berbentuk buah pear dengan bagian apek tumpul (Gambar 1CD). Warna protocorm bervariasi dari putih susu pada permulaan perkecambahan sampai hijau terang pada beberapa hari berikutnya. Pada tahapan ini juga dihasilkan beberapa rambut epidermis. Tujuan: Mengetahui respon perkecambahan biji anggrek secara in vitro dan mengamati morfologi biji dan perkembangan protocorm dan kecambah in vitro Bahan dan alat:

• Biji anggrek dendrobium yang masih terdapat di dalam buah masak yang masih utuh, medium Knudson C modifikasi

• Cawan petri, skalpel, pinset, Erlenmeyer, pipet tetes, mikroskop stereo • Alkohol, spiritus. Aquadest steril


Medium: Medium dasar yang digunakan untuk perkecambahan biji anggrek adalah medium Knudson C (Lampiran 2) Medium Knudson C + air kelapa 150 ml Medium Knudson C + air kelapa 150 ml/L + BA 1 mg/L Medium Knudson + BA 1 mg/L Gambar 1. Bunga anggrek

Gambar 2. Biji anggrek (A dan B) dan pertumbuhan protocorm dalam medium kultur in

vitro (C dan D) Cara kerja:

Sebelum ditanam, biji anggrek disterilisasi terlebih dahulu. Sterilisasi biji anggrek dapat dilakukan secara fisik maupun kimia

8

• Sterilisasi secara fisik. Buah anggrek yang masih utuh dicuci dengan aquadest steril, kemudian dicelupkan dalam alkohol 96% dan dibakar dengan api bunsen dan diulang 3 x

• Sterilisasi secara kimia. Buah anggrek yang masih utuh diterilisasi dengan 20% larutan NaClO 5,25% selama 10 menit dan dibilas dengan aquadest 3 kali, masing-masing selama 5 menit.

• Buah anggrek yang telah steril diletakkan ke dalam petridish dan dibelah membujur menjadi dua dengan pisau skalpel.

• Penyebaran biji anggrek ke medium dapat dilakukan dengan menggunakan pinset atau pipet.

• Penyebaran biji anggrek dengan menggunakan pinset dilakukan dengan cara biji anggrek yang terdapat dalam buah diambil dengan pinset, kemudian ditaburkan secara merata ke seluruh permukaan media kultur

• Penyebaran biji anggrek dengan pipet dilakukan dengan cara biji anggrek dicampur dengan sedikit aquadest steril, kemudian disedot dengan pipet dan disemprotkan ke dalam media kultur

• Biji anggrek yang telah ditaburkan dalam medium diinkubasi di dalam ruang inkubasi dengan suhu 24oC selama 6 minggu

• Setiap 2 minggu diamati respon pertumbuhan dan perkembangan biji anggrek di bawah mikroskop stereo. Bandingkan dengan biji anggrek sebelum dikultur.

Pengamatan: Tabel 4. Perkecambahan biji anggrek secara in vitro Medium Jumlah Protocorm Gambar morfologi protocorm Medium Knudson C + air kelapa 150 mg/L

Medium Knudson C + air kelapa 150 mg/L + BA 1 mg/L

Medium Knudson C + BA 1 mg/l


TOPIK 3. PERBANYAKAN VEGETATIF TANAMAN SECARA IN VITRO Teori dasar Pada saat ini, teknik kultur jaringan telah menjadi metode umum untuk sistem perbanyakan tanaman, khususnya untuk tanaman baru, tanaman yang mempunyai persentase perkecambahan rendah, hibrid yang unik, perbanyakan pohon-pohon elit dan tanaman yang selalu dihasilkan dengan cara perbanyakan vegetatif. Perbanyakan tanaman melalui kultur jaringan mempunyai beberapa keunggulan dibandingkan dengan teknik perbanyakan konvensional, yaitu bibit yang dihasilkan mempunyai sifat yang identik dengan induknya, mampu menghasilkan bibit dengan jumlah besar dalam waktu yang singkat, kesehatan dan mutu bibit lebih terjamin, kecepatan tumbuh bibit lebih cepat dibandingkan dengan perbanyakan konvensional. Teknik perbanyakan in vitro (mikropropagasi) ini dapat dilakukan melalui multiplikasi pucuk dari tunas aksilar, dengan pembentukan tunas adventif dan atau pembentukan embrio somatik adventif. Pembentukan tunas/embrio somatik yang didahului dengan terbentuknya kalus disebut organogenesis/embriogenesis somatik tak langsung sedangkan bila tanpa pembentukan kalus disebut organogenesis/embriogenesis somatik langsung. Regenerasi tanaman secara in vitro melalui jalur organogenesis atau embriogenesis somatik dipengaruhi oleh komponen medium kultur terutama zat pengatur tumbuh, faktor lingkungan, sumber eksplan dan genetik tanaman. Arah perkembangan eksplan dalam kultur in vitro dikontrol oleh rasio zat pengatur tumbuh auksin dan sitokinin. Rasio auksin:sitokinin yang relatif tinggi akan menginduksi pembentukan akar, sementara rasio yang rendah dari hormon yang sama memacu pembentukan tunas. Tahapan mikropropagasi meliputi beberapa tahapan, yaitu: seleksi tanaman induk, inisiasi kultur aseptik, multiplikasi tunas/embrio somatik, perakaran tunas atau perkecambahan embrio somatik, dan aklimatisasi planlet pada kondisi rumah kaca/lapang.Tahapan seleksi tanaman induk dimaksudkan untuk mendapatkan kualitas eksplan yang lebih baik dan untuk mengurangi masalah kontaminasi pada eksplan. Tanaman induk sebaiknya ditumbuhkan di dalam rumah kaca dan ditanam di bawah kondisi cahaya, temperature yang sesuai untuk meningkatkan kualitas eksplan. Tahapan inisiasi kultur aseptik merupakan tahapan yang sulit karena harus mendapatkan eksplan yang steril bebas kontaminan. Tahapan multiplikasi merupakan tahapan untuk mendapatkan jumlah propagul yang maksimal, biasanya dengan mengatur rasio antara sitokinin dan auksin untuk menstimulasi produksi tunas.Tahapan pengakaran tunas atau perkecambahan embrio somatik dimaksudkan untuk mendapatkan planlet yang siap untuk diaklimatisasi. Sedangkan tahapan aklimatisasi merupakan tahap adaptasi plantlet yang berasal dari kondisi steril ke kondisi semi steril sebelum dipindahkan ke lapangan. Diperlukan kondisi khusus seperti kelembaban dijaga agar tetap tinggi, suhu dan intensitas cahaya tidak terlalu tinggi agar tanaman tidak mengalami “shock”, dan akhirnya mati.

10

Tujuan : Perbanyakan tanaman secara in vitro dengan menggunakan eksplan daun/nodus batang

Bahan dan alat :

• Eksplan daun/nodus batang tanaman

• pinset, skalpel, cawan petri, botol kultur, alkohol 70% dan bayclin 10% Medium : Medium MS + NAA 0,1 mg/l + BA 0,3 mg/l Medium MS + NAA 0,3 mg/l + BA 0,3 mg/l Medium MS + NAA 0,3 mg/L + BA 0,1 mg/L Cara kerja : • Ambil eksplan daun/nodus batang tanaman, kemudian dicuci dengan air mengalir

selama 30 menit. • Eksplan disterilkan dalam larutan sterilan (30% Bayclean yang berbahan aktif 5.25%

NaClO) selama 15 menit dan dibilas tiga kali dengan aquadest steril masing-masing selama 5 menit.

• Potong daun dengan ukuran 0,5 cm x 0,5 cm atau potong bagian tepi batang dari setiap nodus yang terkena larutan sterilan.

• Potongan daun atau nodus kemudian dikultur dalam media kultur. • Letakkan daun dengan sisi abaksial berhadapan dengan medium atau nodus batang

dalam posisi sejajar dengan permukaan medium. Tiap botol diisi 2 potong eksplan • Kultur diinkubasi dalam kondisi terang pada suhu 25 oC. • Amati perubahan yang terjadi, yaitu: termasuk organogenesis langsung atau tidak

langsung, ada tidaknya pembengkakan eksplan, ada tidaknya terbentuk kalus, saat pertama kali muncul tunas dan akar dan jumlah tunas dan akar tiap eksplan pada 2 dan 4 minggu setelah kultur.

Pengamatan : Tabel 5. Pertumbuhan eksplan daun/nodus batang dalam kultur

Jenis medium Saat muncul organ (hari)

Σ Tunas/Akar pada minggu ke-

Ada tidaknya terbentuk kalus

Tunas Akar 2 4 MS+NAA 0,1 mg/L+ BA 0,3 mg/L MS+NAA 0,3 mg//L+BA 0,3 mg/L MS+NAA 0,3 mg/L+BA 0,1 mg/L


Pertanyaan : 1. Bagaimana perubahan morfologi eksplan daun/nodus batang dalam proses organogenesis ? 2. Bagaimanakah respon pertumbuhan terhadap ‘pola’ konsentrasi auksin atau kinetin

yang diberikan ? 3. Dari bagian jaringan eksplan mana tempat muncul tunas?

12

TOPIK 4. KULTUR ANTHER/POLLEN

Teori dasar Tujuan kultur anther dan pollen adalah produksi tanaman haploid melalui induksi androgenesis pada sel-sel haploid dari butir pollen imatur. Tanaman haploid sangat berguna bagi studi genetik maupun pemuliaan tanaman karena hanya mempunyai 1 set kromosom, sehingga genotipe resesif dapat diidentifikasi dengan mudah. Tanaman homosigot dapat diperoleh dengan cepat dengan penggandaan jumlah kromosom haploid ini menjadi dihaploid 2N (secara spontan atau dengan pemberian kholkiin). Tanaman dihaploid ini sangat bermanfaat dalam program pemuliaan tanaman karena dapat digunakan sebagai induk hybrid tanpa melalui 3-5 generasi untuk menghasilkan kultivar homosigot yang stabil.

Secara alami, tanaman haploid dapat mucul sebagai hasil dari proses parthenogenesis tetapi merupakan kejadian yang sangat jarang. Teknik in vivo yang digunakan untuk menginduksi produksi tanaman haploid antara lain, ginogenesis, androgenesis ovulum, eliminasi genom dengan hibridisasi antara tanaman yang mempunyai kekerabatan jauh, semigami, perlakuan kimia, temperature shock dan penyinaran. Namun demikian metode ini hanya menghasilkan tanaman haploid dengan frekuensi yang sangat rendah. Sebaliknya dengan teknik in vitro, tanaman haploid dapat diinduksi dengan kultur anther atau pollen dari sekitar 247 spesies dari 34 famili (Hu dan Guo, 1999). Beberapa faktor mempengaruhi keberhasilan kultur anther, antara lain genotipe, kondisi tanaman donor, tahapan perkembangan mikrospora, pretreatmen dan preinkubasi. Genotipe memegang peran utama dalam menentukan keberhasilan atau kegagalan dalam kultur anther. Produksi tanaman haploid melalui kultur anther sangat terbatas pada beberapa spesies tanaman. Umur dan kondisi fisiologis dari tanaman donor seringkali mempengaruhi hasil dari eksperimen kultur anther. Pada umumnya, anther yang berasal dari bunga yang dihasilkan lebih awal lebih responsive. Tahapan perkembangan pollen juga sangat penting, tahapan uninukleat biasanya sangat responsif. Seringkali perlakuan terhadap temperatur dingin 5oC selama beberapa jam dapat meningkatkan keberhasilan kultur anther.

Tanaman haploid dapat berkembang dari kultur secara langsung maupun tidak langsung melalui fase kalus (Gambar 1). Androgenesis langsung meniru embriogenesis sigotik tetapi tidak ada suspensor dalam embrio androgenik. Pada tahapan perkembangan globuler, sebagian besar embrio dilepaskan dari dinding pollen, yang akan terus berkembang dan akhirnya muncul plantlet dari anther setelah 4-8 minggu kultur. Androgenesis langsung ini terutama terjadi pada anggota famili Solanaceae dan Cruciferaceae.

Selama androgenesis tidak langsung, pola pembelahan sel awal hamper sama dengan lintasan androgenik langsung dan embriogenik sigotik. Tetapi setelah tahapan globuler, terjadi pembelahan yang tidak teratur dan terbentuk kalus. Kalus ini kemudian mengalami organogenesis untuk menghasilkan tanaman haploid. Androgenesis secara tidak langsung banyak terjadi pada tanaman cereal.


Bunga anggrek memiliki 4 bagian utama yaitu sepala (kelopak bunga), petala (mahkota bunga), benang sari dan putik. Bagian tengah bunga anggrek terdapat ginostemium (tempat menyatunya organ reproduktif jantan dan betina). Di atas ginostemium terdapat kepala sari tempat berkumpulnya serbuk sari/polen yang ditutupi oleh anther cap. Polen anggrek terkumpul dalam satu kelompok yang disebut polinia. Di bawah kepala sari terdapat stigma (Gambar 2).

Gambar 3. Androgenesis dan pembentukan tanaman haploid dengan kultur

anther dan polen

14

Tujuan: Untuk mengetahui respon pertumbuhan dan perkembangan anther bunga

dalam kultur in vitro Untuk mengetahui pengaruh perlakuan dingin terhadap respon anther dalam

kultur Eksplan: bunga anggrek Medium: medium N6 Cara kerja: • Kumpulkan kuncup bunga anggrek yang mempunyai panjang kelopak dan mahkota sama. • Sebelum dikultur bunga diberi perlakuan dingin dengan suhu 4-5oC selama 24 jam;

sebagai kontrol, bunga tidak diberi perlakuan dingin. • Bunga disterilkan dalam larutan baycline 30% selama 10 menit, kemudian dibilas

dengan aquadest steril selama 5 menit, diulang 2 kali. • Kuncup bunga dibuka dengan pinset dan skalpel. • Anther cap dibuka, polinia diambil dan dikultur pada medium N6. Setiap medium

(botol) diisi 2 polinia, diulang 5 kali. • Setelah 3 dan 6 minggu, amati respon pertumbuhan anther. Tabel 6. Pengaruh perlakuan dingi terhadap respon pertumbuhan anther bunga anggrek Lama Perlakuan dingin (jam)

Berat basah Ada tidaknya kalus dan berat kalus

Ada tidaknya embrio/jumlah embrio

0 24


TOPIK 5. PEMBUATAN BIJI SINTETIk

Teori dasar Biji sintetik/buatan terdiri dari embrio somatik yang diselubungi dalam lapisan protektif. Produksi biji sintetik telah membuka pandangan baru dalam bioteknologi tanaman. Teknologi biji sintetik merupakan bidang riset dalam kultur sel dan jaringan tanaman yang berkembang pesat. Ide awal dari biji sintetik ini pertama kali disampaikan oleh Murashige yang selanjutnya dikembangkan oleh beberapa peneliti. Biji sintetik merupakan teknik yang sangat menjanjikan untuk perbanyakan tanaman transgenik, tanaman yang tidak menghasilkan biji, dan tanaman yang mempunyai masalah dalam perbanyakan biji. Disamping perbanyakan tanaman secara cepat dan masal, teknologi biji sintetik juga membantu penanganan dan penanaman serta konservasi genotipe yang terancam punah dan genotipe pilihan. Tujuan utama dari sistem biji sintetik adalah untuk mendapatkan kembali plantlet utuh dari biji buatan di bawah kondisi in vitro maupun di bawah kondisi lapang. Persentase viabilitas yang tinggi dari biji sintetik yang disimpan dalam temperatur 4oC dibandingkan dengan temperatur ruang menunjukkan bahwa efisiensi temperatur rendah untuk penyimpanan biji sintetik. Salah satu prasyarat aplikasi teknologi biji sintetik adalah produksi embrio somatik yang vigor dan berkualitas tinggi yang dapat menghasilkan tanaman dengan frekuensi yang tidak jauh berbeda dengan biji alamiah. Ketidakmampuan memperoleh embrio berkualitas seringkali menjadi faktor pembatas dalam pengembangan biji sintetik. Teknologi biji sintetik memerlukan produksi sejumlah besar embrio somatik berkualitas tinggi dengan tingkat maturasi yang seragam Alginat hydrogel seringkali dipilih sebagai matrik untuk biji sintetik karena viskositasnya yang tidak terlalu tinggi dan toksisitas terhadap embrio somatik rendah. Alginat juga meningkatkan pembentukan kapsul dan rigiditas dari alginat memberikan proteksi yang lebih baik pada embrio somatik terhadap kerusakan mekanik dibandingkan dengan agar. Tujuan : Memperkenalkan teknologi pembuatan biji sintetik dan mengetahui respon perkecambahan biji sintetik dari tunas in vitro/embrio somatik Bahan dan Alat : • Embrio somatic/tunas in vitro • Larutan Na-alginate, calcium • Cawan petri, pipet, Erlenmeyer, hot plate

16

Cara Kerja: � Embrio somatik matur atau tunas pucuk berukuran 2-3 mm dari kultur in vitro ditempatkan dalam matrik enkapsulasi ● Embrio somatik/tunas pucuk diambil dengan beberapa matrik enkapsulasi dengan menggunakan pipet. Ukuran kapsul ditentukan oleh ukuran embrio somatik/tunas pucuk dan diameter pipet yang digunakan. � Embrio somatik/tunas pucuk diteteskan ke dalam larutan calcium sehingga terbentuk kapsul. � Amati keberhasilan pembuatan biji sintetik dengan menghitung jumlahkapsulyang

berisi embrio/tunas dibagi dengan jumlah kapsull total (kapsul berisis embrio/ tunas dan kapsul kosong) dikalikan 100.

� Kapsul atau biji sintetik dikumpulkan dan dicuci dalam air. Biji sintetik selanjutnya dikecambahkan dan dihitung persentase perkecambahannya

Gambar 4. Prosedur pembuatan biji sintetik Pengamatan:

Tabel 7. Persentase keberhasilan pembuatan biji sintetik dan persentase perkecambahan

No Persentase keberhasilan pembuatan biji sintetik

% perkecambahan

1 2 3


TOPIK 6. KULTUR SUSPENSI SEL Teori Dasar Kultur suspensi sel adalah kumpulan sel-sel dan agregat-agregat sel yang tersebar yang ditumbuhkan pada medium cair yang digojog. Kultur ini pada umumnya diawali dengan transfer fragmen kalus ke medium cair yang digojog dengan kecepatan tertentu selama periode kultur. Kalus friable akan lebih cepat dan mudah membentuk suspensi yang relatif homogen, sedangkan kalus kompak sebelum ditransfer ke medium cair sebaiknya dicacah terlebih dahulu agar menjadi bagian-bagian yang lebih kecil. Ada 2 macam penggojokan yang sering dilakukan, yaitu: rotary/orbital (gerakan sirkuler) dan gyratory (gerakan 2 arah). Tujuan penggojokan adalah untuk: memudahkan pemisahan sel-sel tunggal, meningkatkan pertukaran gas, mengurangi polaritas jaringan karena gaya gravitasi, meniadakan gradien nutrisi pada medium maupun pada permukaan sel serta mengurangi peluang akumulasi senyawa toksik. Beberapa hal yang perlu diperhatikan untuk mendapatkan kultur suspensi yang baik (mengandung sel-sel tunggal dalam jumlah banyak) adalah: 1) umur kalus yang digunakan sebagai inokulum, 2) densitas (perbandingan jumlah kalus dengan volume medium), 3) perbandingan volume medium dengan volume botol kultur, 4) kecepatan penggojogan, 5) komposisi medium, serta 6) frekuensi subkultur. Pertumbuhan sel pada kultur suspensi terdiri dari beberapa fase (Gambar 4), yaitu: fase lag, belum ditemukannya tanda-tanda pembelahan sel, fase eksponensial, terjadi peningkatan jumlah sel, fase linear, kecepatan pertumbuhan akan mencapai maksimal yang akan diikuti denga penurunan gradual kecepatan pertumbuhan, serta fase stationer, fase dimana tidak terjadi pembelahan lagi. Untuk memperoleh viabilitas sel yang tinggi sebaiknya subkultur dilakukan pada awal fase stationer. Tujuan : Untuk mengetahui pertumbuhan sel pada kultur cair Bahan dan Alat : • Kalus • Erlenmeyer 100 ml + medium cair (@ 20 ml) • Pinset, skalpel, pipet dan cawan petri + kertas saring • Penggojog (shaker) • Mikroskop, haemacytometer dan counter Medium : Medium MS cair + 2,4-D 0,5 mg/L Medium MS cair + 2,4-D 1 mg/l

18

Gambar 5. Kurva pertumbuhan suspensi sel Cara kerja : Pembuatan medium cair Langkah-langkah pembuatan medium cair sama dengan pembuatan medium padat kecuali penambahan agar. Masing-masing Erlenmeyer 100 ml diisi 20 ml medium cair. Kultur sel • Kalus embriogenik diambil dari botol kultur dengan pinset dan ditransfer ke dalam

cawan petri. • Kalus dipotong dengan skalpel dan hanya bagian kalus muda yang aktif membelah

yang digunakan sebagai inokulum. • Masing-masing Erlenmeyer yang telah berisi medium cair diisi 500 mg kalus. • Suspensi diinkubasi dengan penggojokan (kecepatan 100 rpm) di bawah kondisi

gelap. • Pada hari ke 0, 7 dan 14, sel diambil dengan pipet steril dan dihitung dengan

haemocytometer di bawah mikroskop. • Buatlah kurva pertumbuhan suspensi sel antara jumlah sel total per unit volume

terhadap waktu.


Pengamatan: Tabel 8. Kepadatan sel pada kultur cair Media Jumlah sel pada hari ke:

0 7 14 MS cair + 2,4-D 0,5 mg/l MS cair + 2,4-D 1 mg/l Jumlah sel

Lama kultur (hari) Gambar 6. Kurva pertumbuhan suspensi sel

20

TOPIK 7. ISOLASI PROTOPLAS Teori dasar Protoplas merupakan sel tumbuhan yang telah dihilangkan dinding selnya baik secara mekanik maupun enzimatik. Fungsi utama dinding sel adalah mencegah pengambilan air yang berlebihan sehingga mengakibatkan pecahnya sel. Sebelum dinding sel diambil, sel direndam dlam plasmolitikum isotonik. Biasanya digunakan manitol atau sorbitol tetapi seringkali juga digunakan sukrosa dan polyvinylpyrrolidon. Protoplas dapat dilepaskan dari dinding sel dengan proses mekanik yang melibatkan pemotongan jaringan yang telah mengalami plasmolisis sehingga protoplas menyusut dan bergerak meninggalkan dinding sel. Selanjutnya deplasmolisis menghasilkan ekspansi dan melepaskan protoplas dari ujung potongan sel. Dalam prakteknya teknik ini sulit dilakukan dan hasil protoplas yang viabel sangat sedikit. Tetapi salah satu keuntungannya adalah efek dari enzim pendegradasi dinding yang cukup kompleks dan merusak metabolisme protoplas dapat ditiadakan. Sejak awal tahun 1960 hampir semua kerja isolasi protoplas dilakukan dengan prosedur enzimatik. Setelah dibersihkan dari debris seluler dapat diperoleh protoplas viabel dalam jumlah yang lebih banyak. Teknik dasar terdiri dari : 1).Sterilisasi permukaan daun, 2). Pengaturan plasmolitikum yang sesuai, 3). Pengelupasan epidermis bawah atau pengirisan jaringan untuk mempermudah penetrasi enzim, 4). Perlakuan enzim sekuensial atau campuran, 5). Purifikasi protoplas dengan pengambilan enzim dan debris seluler, serta 6).Transfer protoplas pada medium yang sesuai dengan kondisi kultur yang tepat (Gambar 6). Gambar 7. Teknik dasar isolasi protoplas dari daun (Cocking dalam Bhojwani dan Razdan, 1996)


Tujuan : Mengetahui cara isolasi protoplas serta mengamati bentuk/jenis protoplas dan uji viabilitasnya

Bahan dan alat : • Jaringan sumber protoplas berupa daun/bunga atau kalus, larutan enzim, larutan pencuci dan larutan purifikasi dan pewarna untuk uji viabilitas

• Cawan petri, skalpel, pinset, tabung reaksi, nylon filter, haemocytometer, beaker glass, mikroskop inverted. Cara kerja : Isolasi protoplas • Daun/bunga/kalus sebanyak 1 g dipotong-potong kecil 1 mm dimasukkan ke dalam

5 ml larutan enzim yang tersusun atas enzim cellulose “onozuka” R-10 2% dan macerozye R-10 1% dan manitol 0,7M.

• Daun/bunga/kalus dalam larutan enzim diinkubasi dalam shaker bath dengan kecepatan 40 rpm tanpa cahaya dan dalam temperature 25 oC selama 4-8 jam.

• Parameter yang diamati dalam isolasi protoplas adalah: jumlah protoplas (rendemen) yang diperoleh dalam setiap gram botol basah donor (eksplan). Bersamaan dengan penghitungan rendemen protoplas, dihitung juga protoplas yang viable (hidup). Untuk menentukan jumlah protoplas viable dilakukan dengan pewarnaan vital Neutral red/evan blue. Amati juga bentuk, ukuran, dan warna protoplas.

Pencucian Protoplas • Protoplas sebelum digunakan untuk fusi atau kultur protoplas, dipisahkan dari debris

dengan filter nilon 80 mikromettr dan suspensi protoplas disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 100g.

• Buang supernatant dengan menggunakan pipet secara hati-hati kemudian dicuci dengan manitol 0,7M dan disentrifugasi kembali. Pencucian dilakukan sampai 2-3 kali.

Purifikasi Protoplas • Purifikasi protoplas dilakukan dengan cara sebagai berikut ambil pallet protoplas

dengan pipet secara perlahan-lahan, teteskan di atas permukaan larutan purifikasi (larutan sukrosa 0,75 M) yang telah diisikan di dalam tabung reaksi sehingga protopls ajkan mengapung memebentuk lapisan di atas larutan.

• Protoplas diambil dengan pipet steril dimasukkan dalam larutan manitol 0,7 M.

• Untuk melihat pengaruh pencucian dan purifikasi protoplas amati kembali protoplas di bawah mikroskop dan dihitung jumlah protoplas yang diperoleh.

22

Pertanyaan : 1. Mengapa inkubasi sumber protoplas dalam larutan enzim dilakukan pada keadaan gelap? 2. Mengapa protoplas yang sudah tidak mempunyai dinding sel di dalam larutan pencuci tidak pecah ? Pengamatan : Tabel 9. Isolasi Protoplas (pps)

Jaringan sumber

protoplas

Lama inkubasi

(jam)

∑pps pada saat isolasi

dan purifikasi

∑pps viable

Bentuk dan ukuran

pps Warna pps

4 6 8


LAMPIRAN 1. PEMBUATAN LARUTAN STOK MEDIUM MS

Beberapa garam-garam mineral terutama mikronutrien dan vitamin di dalam media kultur jaringan diperlukan dalam jumlah relatif kecil, oleh karena itu perlu dibuat stok untuk memudahkan penimbangan. Sedangkan garam-garam mineral dari unsur makronutrien diperlukan dalam jumlah relatif banyak sehingga dapat dibuat stok atau ditimbang langsung satu per satu pada saat membuat medium. Stok Makronutrien Garam-garam mineral untuk unsur makronutrien dibuat 4 stok, yaitu stok A (NH4NO3), stok B (KNO3), stok C (CaCl2.H2O), dan stok D (MgSO4.7H2O & KH2PO4). Stok A dan B dibuat 5 x konsentrasi sedangkan stok C dan D dibuat 10 x konsentrasi. Masing-masing komponen penyusun stok A, B, C, D ditimbang sebanyak yang tertera pada tabel 2, dimasukkan satu persatu dalam erlenmeyer 100 ml yang telah berisi aquadest steril ± 50 ml. Setiap kali memasukkan bahan kimia harus segera dilarutkan dengan diaduk. Setelah semua bahan larut, dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml dan tambahkan aquadest lagi sampai volume menjadi 100 ml. Pindahkan ke dalam botol stok dan diberi label stok A atau stok B (5x) 20 ml/l, stok C atau D (10x) 10 ml/l. Larutan stok disimpan dalam suhu 4oC. Stok Mikronutrien Garam-garam mineral untuk unsur mikronutrien dibuat 3 stok, yaitu stok E (Iron), stok F (H3BO3, MnSO4.4H2O, ZnSO4.7H2O), stok G (KI, Na2MoO4.2H2O, CuSO4.5H2O, CoCl2.6H2O). Stok E dan Stok F dibuat 20 x konsentrasi, sedangkan stok G dibuat 200 x konsentrasi. Stok E (Iron 20x konsentrasi) Timbang 0,56 g FeSO4.7H2O dan 0,75 g Na2EDTA.2H2O. Larutkan kedua bahan tersebut dalam kira-kira 35 ml akuades secara terpisah. Larutan FeSO4.7H2O dipanaskan hingga 40°C selama beberapa menit dan tambahkan beberapa tetes HCl. Kemudian tambahkan Na2EDTA.2H2O dan aduk hingga tercampur merata, diamkan hingga mencapai suhu kamar. Masukkan larutan dalam labu takar 100 ml dan tambahkan akuades sampai volume menjadi 100 ml. Pindahkan dalam botol stok dan beri label : Stok E/Fe-EDTA (20x) 5 ml/l. Larutan stok disimpan dalam suhu 4oC. Stok F (20x) dan stok G (200x) Larutan stok F dan G dibuat dengan menimbang komponen penyusun stok F atau G sebanyak yang tertera pada tabel 2, dimasukkan satu persatu dalam erlenmeyer 100 ml yang telah berisi aquadest steril ± 50 ml. Setiap kali memasukkan bahan kimia harus segera dilarutkan dengan diaduk. Setelah semua bahan larut, dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml dan tambahkan aquadest lagi sampai volume menjadi 100 ml. Pindahkan ke dalam botol stok dan diberi label stok F (20x) 5 ml/l, stok G (200x) 0,5 ml/l. Larutan stok disimpan dalam suhu 4oC.

24

Vitamin (100x konsentrasi) Vitamin dapat dibuat sebagai stok campuran beberapa macam vitamin. Timbang nicotinic acid, pyridoxin-HCl, thiamin-HCl dan glycine seperti yang tertera pada tabel 4. Masukkan dan larutkan bahan satu per satu ke dalam erlenmeyer 100 ml yang berisi akuades ± 50 ml. Masukkan ke dalam labu takar 100 ml kemudian tambahkan akuades sampai volume 100 ml. Pindahkan ke dalam botol stok dan diberi label stok Vitamin (100x) 1 ml/l. Larutan stok disimpan dalam suhu 4oC. Stok zat pengatur tumbuh Sitokinin Timbang sitokinin 0,1 g, masukkan dalam erlenmeyer 100 ml yang telah berisi

akuades ± 50 ml. Panaskan sebentar dan tetesi dengan NaOH 0,1 N sampai larutan menjadi jernih. Setelah dingin, masukkan dalam labu takar 100 ml dan tambahlan akuades sampai volume 100 ml. Pindahkan dalam botol stok dan beri label : Sitokinin, 100 mg/100ml, 1 ppm : 1 ml/l.

Auksin Timbang auksin 0,1 mg, masukkan dalam erlenmeyer 100 ml yang telah berisi

akuades ± 50 ml. Panaskan sebentar dan tetesi dengan HCl 0,1 N sampai larutan menjadi jernih. Setelah dingin, masukkan dalam labu takar 100 ml dan tambahlan akuades sampai volume 100 ml. Pindahkan dalam botol stok dan beri label : Auksin, 100 mg/100ml, 1 ppm : 1 ml/l.

Myo-inositol Bisa dibuat stok atau ditimbang setiap kali akan membuat medium. Jika dibuat stok,

cara pembuatan stok myo-inositol sama seperti pembuatan stok C.


2. Komposisi media N6

Komponen Jumlah (mg/L) Makronutrien KNO3 (NH4)2SO4 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O KH2PO4

2830 463 166 185 400

Mikronutrien MnSO4.4H2O MnSO4.H2O ZnSO4.7H2O H3BO3 KI FeSO4.7H2O (dilarutkan dengan Na2EDTA 37,3 mg/l)

4,4 3,3 1,5 1,6 0,8

27,8 Vitamin Thiamin-HCl Nicotinic acid Pyridoxine HC

1

0,5 0,5

Sukrosa 50 000 pH 5.5 - 5.8

26

3. Komposisi media Knudson C (modifikasi) MAKRONUTRIEN mg/L Ammonium nitrate ( NH4NO3) 500,000 Calcium nitrate (Ca(NO3)2 347,430 Magnesium sulphate (MgSO4) 122,090 Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) 250,000 MIKRONUTRIEN Stok mikro MS: E, F, G KARBOHIDRAT Sukrosa 20.000 Air kelapa 150 ml/L Agar 11 g/L


4. Format Laporan:

Judul/Topik Praktikum

1. Latar Belakang 2. Tujuan 3. Cara Kerja 4. Hasil dan Pembahasan 5. Kesimpulan 6. Referensi 7. Lampiran

petunjuk praktikum kjt 2019 - biologi.ub.ac.id · (schenk & hilderdrandt), medium wpm (woody...

Documents