percobaan inisiasi kalus dari skripsi dibuat untuk

SKRIPSI
PADA FAKULTAS FARMASI ^ r
Retno Sari 058210491
Disetujui oleh Pembimbing
M I L I t ' ITBRPUSTAEAA* 1-W NITERS1TAS / lK L A N O « A ’ , S U R A H A V A
Gunawan^ntirayanto Drs* Charoad Ahmad Sahid
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
Penelitian. ini dikerjakan atas kerja sama Sub Balai Pene litian Hortikultura Malang dengan Laboratorium Bioteknolo- gi Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Airlangga
KATA PENGANTAR
Penelitian dengan judul " PERCOBAAN INISIASI KALUS DARI BEBSRAPA DIOSCOREA SP. " setelah waktu yang cukup panjang, akhirnya dapat diselesaikan. Meskipun hasil yang dicapai belum cukup memadai, diharapkan dapat memberikan sumbangan bagi perkerabangan dan kemajuan penelitian di bi dang bioteknologi terutama teknik kultur jaringan tanaman obat.
Dengan memanjatkan puji syukur ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa, kami persembahkan apa yang telah dicapai bagi kemaduan ilmu pengetahuan.
Ucapan terima kasih yang setulusnya kami sampaikan kepada :
Bapak Dr, Gunawan Indrayanto dan Bapak Drs. Charaad Ahmad Sahid selaku dosen pembimbing,- yang telah banyak mera- berikan bimbingan dan saran serta dorongan moril.
Bapak Ir. F. Kasijadi KS selaku Kepala Sub Balai Pe nelitian Hortikultura Malang yang telah memberikan kesem- patan dan fasilitas untuk melaukan penelitian di laborato ry um Fisiologi.
Kepala Kebun /?aya Purv/odadi -Pasuruan beserta staf yang telah banyak membantu dalam mendapatkan bahan peneli tian.
Para dosen Fakultas Farraasi Universitas Airiangga yang telah memberikan saran dan dorongan moril
iii
Skripsi PERCOBAAN INISIASI KALUS... Retno Sari
Para staf Laboratorium Fisiologi Sub Balai Peneliti- an Hortikultura Malang yang banyak memberikan bantuan selama penelitian.
Tak lupa terima kasih yang sebesarnya kepada kedua orang tua dan saudara-saudara kami yang banyak memberikan bantuan moril materiil.
Surabaya, Desember 1987
DAFTAR ISI Halaraan
KATA PENGANTAR iii DAFTAR ISI ... - . . . . . . . . . . . . . . v DAFTAR TABEL. .......................... - . viii DAFTAR GAMBAR .................... . . . x DAFTAR L A M P I R A N ..........................xii- DAFTAR ISTILAH DAN SINGKATAN .............. xiii- BAB
I. PENDAHULUAN 1 . Latar belakang ................. .....1
2. Tujuan Penelitian . . . . . . . k
II. TINJAUAN PUSTAKA 1. Kultur jaringan . . . . . . . . . 5 2. Media kultur jaringan .................7 3. Kondisi lingkungan kultur jaringan. 11 4. Kultur kalus dan karakteristiknya . 12 5. Kultur jaringan sebagai sumber
metabolit sekunder . . . . . . 15
6. Produksi diosgenin dari kultur jaring an Dioscorea sp.................. 18
7. Tinjauan uraum tanaman Dioscorea sp. 19 7.-1 Sistematika tanaman Dioscorea sp. 19 7.2 Sifat-sifat tanaman Dioscorea sp. 20 7.3 Kandungan Dioscorea sp. . . . 21
III. METODOLOGI PENELITIAN 1. Bahan.............. .. 23
Halaman
1*1 Eksplan . . . . . . . . . . . . 23 1..2 Bahan kimia. ............... . 23 1.3 Agar .. . . . . . . . . • 23 1. if Media............... 23
2.. Alat ......................... 2 if 3* Cara kerja . ............... . . Zk
3*1 Sterilisasi alat . . . . . . 2if 3.1.1 Alat gelas, alat logam dan alu
minium foil 2if 3.1.2 Air suling................. .... 25 3*2 Pembuatan media 23 3*3 Penanaman eksplan. .. * . ... 23 3.4 Pemindahan kultur kalus. .- » .. 26 3.5 Pengamatan hasil .. .. ... ... 26 3.-5.1 Pemeriksaan makroskopis kalus . 26 3*5.2 Pengamatan pertumbuhan kalus . 26 3-5.3 Pengolahan data . . . . . . . . 27
IV- HASIL PENELITIAN 1. Sterilisasi • $Q
2. Pembentukan kalus • .................31 3. Pemeriksaan makroskopis kalus . 32 if. Hasil perhitungan............- . 36
V.. PEMEAHASAN..............................if 6 VI. KESIMPULAN .................. . . . .- 50
III..
vi
Halajoan
vii
DAFTAR TABEL
1.. Komposisi kimiawi media Murashige - Skoog •• * » ». - *. 28
2. Rancangan kombinasi zat pengatur tumbuh untuk pembentukan kalus Dioscorea sp. . 29
3* Cara sterilisasi yang digunakan terhadap eksplan Dioscorea sp. . . . . . . . 30
if. Pembentukan kalus dari eksplan Dioscorea sp. pada media MS dengan penambahan zat pengatur tumbuh .. .. .. «. 31
5. Waktu tumbuh kalus dari eksplan Dioscorea pentaphvlla L. . . . . . . . . 32
6. Waktu tumbuh kalus dari eksplan Dioscorea batatas Decne. . . . . . . 32
7. Pemeriksaan makroskopis kalus Dioscorea pentaphylla L. • . .. .. 33
8. Pemeriksaan makroskopis kalus Dioscorea batatas Decne. 3k
9. Indeks Pertumbuhan (IP) kalus Dioscorea •pentaphylla L. . .. .. . .. 36
10. Contoh perhitungan persamaan regresi dari data Indeks Pertumbuhan rata-rata dan v/aktu (kalus Dioscorea pentaph.ylla L. pada media KD^) . ............ 38
viii
11. Indeks Pertumbuhan (IP) kalus Dioscorea batatas Decne.............. /+1
12. Waktu duplikasi (td) kalus Dioscorea pentaphylla L. . . . . 45
13* Waktu duplikasi (t ) kalus Dioscorea batatas Decne. . . . . . . . 45
No. Teks Halaman
DAFTAR GAMBAR
1. Kurva pertumbuhan kalus .. «. .. - » l*f 2. Terjadinya organogenesis pada kalus ^ Dioscorea pentaphvlla L.. pada media
(A) KD1# (B) KD3 . ............... 3k
3. Kalus Dioscorea batatas Decne yang ditanam pada media (A) KD^; (B) KD^ pada minggu XV............. .. . 33
if. Sel-sel kalus Dioscorea pentaphvlla L.. ( pembesaran 50 X - 35
5. Grafik log Indeks Pertumbuhan rata-rata terhadap waktu (hari) dari kalus Dioscorea pentaphvlla L. . ..... 37
6a. Persamaan regresi dari grafik log Indeks Pertumbuhaa rata-rata terhadap waktu dari kalus Dioscorea pentaphvlla L* pada media (A) KD^ (B) kd7 ..... . . . . 39
6b. Persamaan regresi dari grafik log Indeks Pertumbuhan rata-rata terhadap waktu dari kalus Dioscorea pentaphvlla L. pada media (C) KDg (D) . * . » • .- .• • zo
7.. Grafik log Indeks Pertumbuhan rata-rata terhadap waktu (hari) dari kalus Dioscorea bat at as Decne.. .. .. .. .. *. 1+2.
8a. Persamaan regresi dari grafik log Indeks Pertumbuhan rata-rata terhadap waktu dari kalus Dioscorea batatas Decne pada media (A) KDej (B) KDrj Zj-3
x
8b.
No,
Persamaan regresi dari grafik log Indeks Pertumbuhan rata-rata terhadap waktu dari kalus Dioscorea batatas Decne pada media (C) KDg (D) kdx0. . . . . . . * . ,
Teks Halaman
DAFTAR LAMPI RAN
2. Dioscorea esculenta (Lour) Burk . .. .. .. 57
3* Dioscorea pentaphvlla L. .. . . . . 4- Dioscorea batatas Decne . . . . . . . . 59
Gambar 1. Dioscorea h i Dennst .. .. .. .. ., £0 2. Dioscorea esculenta (Lour) Burk. . . . . 61 3* Dioscorea pentaphvlla L.- . . . . . . 62 4* Dioscorea batatas Decne. •• .. .. - .. .• 63
Tabel Hasil penimbangan bobot basah. kalus Dioscorea pentaphvlla L. dalsun gram . . 64
Hasil penimbangan bobot basah kalus Dioscorea batatas Decne dalam gram . 65
No. Teks Halaman.
DAFTAR ISTILAH DAN SINGKATAN
BA benzylaminopurine; BAP 2,4 D 2,4 - dichlorophenoxyacetic acid Eksplan potongan jaringan; organ yang diguna-
kan untuk memulai kultur jaringan Friable rapuh IP Indeks Pertumbuhan IAA indole-3-acetic acid Kalus suatu massa meristematik yang tak ter
deferensisi dari sel tanaman yang ter bentuk pada kondisi in vitro
MS Murashige and Skoog NAA -naphthaleneacetic acid Subkultur pemindahan aseptik dari bagian suatu
kultur pada media t, waktu duplikasi
xiii
DAFTAR ISTILAH DAN SINGKATAN
BA 2,if D Eksplan
Friable IP IAA Kalus
MS NAA Subkultur
b enzylaminopurine; BAP 2,if - dichlorophenoxyacetic acid potongan jaringan; organ yang digunakan untuk memulai kultur jaringan rapuh Indeks Pertumbuhan indole-3-a.cetic acid suatu massa meristematik yang tak ter deferensisi dari sel tanaman yang ter bentuk pada kondisi in vitro Murashige and Skoog ck -naphthaleneacetic acid pemindahan aseptik dari bagian suatu kultur pada media waktu duplikasi
xiii
1
menguntungkan. merupakan sebab dilaksanakannya Program Keluarga Berencana Nasional. Salah satu sasaran. Pro gram Keluarga Berencana yakni sasaran langsung merupakan usaha menurunkan tingkat kelahiran melalui pema- kaian kontrasepsi. Hasil yang dicapai pada pelaksanaan Program Keluarga Berencana cenderung mengalami peningkatan (1). Pencapaian peserta Keluarga Berencana aktif secara nasional hingga tahun 1985/1986 sebesar 50,4 % dari jumlah pasangan usia subur dengan. penggunaan obat kontrasepsi mencapai lebih dari 60 % (2)* Obat kontrasepsi banyak digunakan karena. pemakaiannya mudah, praktis, efektif dan aman. untuk jangka lama.
Obat kontrasepsi yang digunakan merupakan hormon steroid. Sebagai bahan baku hormon steroid yang sering digunakan adalah diosgenin, stigma sterol, hek- sogenin, asam empedu dan jenis alkaloid steroid yang diperoleh dari tanaman. Kebutuhan akan hormon steroid makin meningkat sejalan dengan bertambahnya jumlah penduduk disamping sejalan dengan kemajuan teknik cara sintesa hormon steroid. Dengan makin meningkatnya kebutuhan akan hormon steroid maka dalam beberapa ta-
2
hun kemungkinan. akan kekurangan bahan untuk sumber bahan baku hormon steroid, Oleh karenanya perlu dikembangkan metode untuk mendapatkan bahan .-baku hormon steroid disamping pemanfaatan. dan pengembangan sumber daya alam (3)..
Dari hasil pertemuan ilmiah di Meksiko tahun 1975 diketahui sebagai sumber bahan baku steroid yang; pa ling banyak diproduksi adalah diosgenin (3)* Dios- genin merupakan metabolit sekunder yang diteraukan pada jenis tanaman Dioscorea. Tanaman Dioscorea di Indonesia terdapat lebih dari 1+0 jenis, baik yang sengaja ditanam majipun yang tumbuh liar.
Untuk mendapatkan senyawa/metabolit sekunder dari tanaman pada umumnya dapat dilakukan dengan bu- didaya tanaman. Kesulitan dalam produksi metabolit sekunder disebabkan oleh semakin berkurangnya sumber bahan alam yang tersedia, biaya produksi yang mahal, kesulitan ekonomis dan teknis penanaman (k)* Kemaju- an bidang bioteknologi membuka kemungkinan-kemungkinan baru dalam produksi metabolit sekunder yaitt dengan teknik kultur jaringan. Dengan t-eknik kultur jaringan diperoleh keuntungan antara lain: senyawa berguna diproduksi pada kondisi terkontrol, bebas dari pengaruh mikroba dan insekta, tidak tergantung iklim dan letak geografis (5).
Hasil penelitian yang dilakukan oleh 'Rokem et, al.
3
menunjukkan produksi diosgenin mencapai 7,8 % dari kultur jaringan Dioscorea deltoidea. Sejumlah jenis lain dari Dioscorea seperti Dioscorea composita. Dioscorea floribunda. Dioscorea glandulosa telah diteliti kemampuannya untuk memproduksi diosgenin jika ditanara pada kultur suspensi sel (6)* Dari peneliti an yang dilakukan Tjondronegoro dkk., beberapa jenis Dioscorea yaitu Dioscorea bulbifera. Dioscorea hispida. Dioscorea esculenta diketahui ke mampuannya memproduksi diosgenin jika ditanam pada media kultur jaringan (?)•
Dengan dasar penelitian yang telah dilakukan maka dapat dikembangkan produksi diosgenin dengan teknik kultur jaringan guna mencukupi kebutuhan bahan baku pembuatan hormon steroid. Dengan teknik kultur jaringan tahap awal yang harus -dilakukan adalah penanaman eksplan (potongan jaringan) pada media yang sesuai dimana akan dihasilkan suatu massa yang tak terdeferensiasi disebut kalus* Kultur kalus diketa hui mampu memproduksi metabolit sekunder. Untuk mendapatkan hasil yang optimal dalam produksi metabolit sekunder menurut Keinstein diperlukan cara induksi kalus dari tanaman antara lain dengan pembuatan kul tur dari tanaman, optimasi media untuk pertumbuhan kultur yang haik, tanpa memperhatikan kemampuannya dan lain-lain (8).
k
Dari kultur kalus, kalus yang terbentuk dapat disubkulturkan dengan memindahkan ke.'dalam media;, baru atau untuk produksi dalam jumlah besar dipindahkan ke- dalam kultur suspensi atau kultur fermentor* Kultur kalus untuk produksi dalam jumlah besar kurang menguntungkan karena tumbuhnya relatif lambat. Tetapi, sebagai tahap awal untuk mencapai kultur suspensi atau kultur fermentor, harus diketahui terlebih dahulu kemampuan pembentukan kalus dari suatu tanaman dan media yang sesuai untuk pertumbuhan kalus sebagaimana dikemukakan Heinstein (5,9>10), Dengan demikian dapat dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai kandungannya dan keuntungannya untuk dikembangkan dengan teknik kultur jaringan.
1.2 Tujuan penelitian Penelitian yang dilakukan bertujuan:
1. Menumbuhkan kalus dari tanaman Dioscorea sp. pada media buatan Murashige - Skoog dengan penambahan zat pengatur tumbuh tertentu.
2. Mengetahui gambaran pertumbuhan kalus Dioscorea sp«- dalam bentuk grafik log Indeks Pertumbuhan rata- rata terhadap waktu, pada beberapa kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh*
3. Mengetahui waktu duplikasi kalus Dioscorea sp. pada beberapa kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh.
5
11*1 Kultur jaringan Kultur jaringan dapat didefinisikan sebagi ba-
gian atau jaringan yang telah dipindahkan dari tanaman. asalnya dan ditumbuhkan dalam keadaan steril pada suatu media buatan, dan sel-selnya mampu tumbuh dan mengadakan pembelahan (5).
Kultur jaringan didasari oleh teori sel Schwann dan Schleiden yang menyatakan bahwa sel hewan dan sel tumbuhan merupakan satuan biologis terkecil yang mampu melakukan aktivitas hidup seperti metabolisme, reproduksi dan tumbuh. T.H. Morgan mengemukakan sifat totipotensi dari suatu sel dimana sel mampu berkem**. bang menjadi organisme. Pendapat tersebut menjadi salah satu dasar berkembangnya teknik kultur jaring an (8,9). Teknologi kultur jaringan tanaman dapat di- bagi dalam lima kelas berdasarkan bahan yang digunakan (9) :
a. Kultur kalus b. Kultur sel c. Kultur organ d. Kultur meristem dan morfogenesis e. Kultur protoplast Sel-sel tanaman dari semua jenis dapat dikul-
BAB II
6
turkan secara aseptik pada media nutrisi. Kultur dimulai dengan penanaman eksplan yang telah disterilkan pada media agar.. Dalam dua sampai empat minggu, tergantung dari jenis tanaman, suatu massa sel tak terorganisasi terbentuk yang disebut kalus. Kalus dapat disubkulturkan tak terbatas dengan memindahkan ke dalam media baru. Waktu yang diperlukan untuk mendapatkan jaringan kalus sangat berva- riasi tergantung jenis tanaman, asal eksplan dan komposisi nutrisi media (9).
Keuntungan teknik kultur jaringan dibandingkan teknik konvensional antara lain (6,9) : 1. Kondisi dapat dikontrol, sehingga dapat dihasil-
kan produksi tertentu yang diinginkan. 2.. Bebas pengaruh mikroba dan insekta. 3- Dapat ditanam dimana saja, 'tidak tergantung pada
letak geografis dan iklim,. Dengan keuntungan teknik kultur jaringan, maka
dapat dikeaibangkan imtuk-tiijuan. (4*5')‘ 1- Produksi senyawa-senyawa tertentu yang berguna
dalam bidang farmasi/medis. 2. Eiotransforaasi senyav/a-senyav/a tertentu menja-
di senyav;a yang dapat digunakan dalam bidang f annasi/me di s.
3.. Produksi senyawa-senyawa spesifik. if. Seleksi starin-strain tanaman unggul untuk dip a-
7
kai pada bidang pertanian dan hortikultura. 5. Multiplikasi tanaman secara cepat dan seragam.
XI*2 Media kultur jaringan Komposisi dari media kultur memegang peranan
penting dalam keberhasilan kultur jaringan. Ada be berapa macam media kultur jaringan antara lain : me dia Murashige - Skoog, B^, White, Heller, Gamborg et. al., Gautheret, Hildebrandt et. al. yang pada dasarnya sama, dengan modifikasi pada komposisi dan jum lah komponennya dimafta disesuaikan dengan tujuan penelitian (1 1 )*.
Media standar kultur jaringan terdiri dari komposisi yang seimbang antara makroelemen dan mikroelemen, vitamin, sumber karbon dan energi, senyawa organik, sumber nitrogen dan zat pengatur tumbuh* Penambahan bahan organik seperti air kela* pa, sari buah (tomat, semangka, jeruk), ekstrak tanaman (ekstrak ragi dan gandum) dan protein hidrolisat dapat merangsang terjadinya pembelahan sel (9,11,12)..
Komponen media kultur jaringan pada dasarnya terdiri dari: 1. Sumber karbon seperti sukrosa, glukosa, frukto-
sa, laktosa. Dari percobaan beberapa macam karbohidrat, sukrosa merupakan karbohidrat terbaik untuk sel tanaman, airaana hampir semua kultur
8
menunjukkan pertumbuhan optimal*. Sukrosa biasa ditambahkan pada konsentrasi 20.000 - 45.000 mg/1 (5,12,13).
2* Makroelemen anorganik Nutrisi makroelemen anorganik yang terutama dibutuhkan untuk pertumbuhan meliputi : 'IT, P, Mg, S, K, Ca, Cl*. Nitrogen dibutuhkan dalam jumlah besar, diberikan dalam bentuk ion nitrat dan atau amonium,. Magnesium dan Sulfur diberikan da lam bentuk MgSO^. 7 1 0.. Kalium dibutuhkan dalam jumlah besar pula, diberikan dalam bentuk KC1, KNO^, atau KH PO .. Penambahan CaCl ,. 2 HÔ dan Ca(N0^)2 4 ^ 0 atau bentuk garam lainnya untuk memenuhi kebutuhan kalsium. Sedangkan klorida berada dalam bentuk KC1 atau CaC^. Fosfor berada dalam bentuk Nal^PO^. H20 atau KI^PO^ (9).
3.- Mikroelemen Dibutuhkan oleh sel tanaman dalam jumlah kecil. Nutrisi mikroelemen yang diperlukan sel tanaman tihggi adalah Cu, Zn, Mn, Fe, Bo, dan Mo. Bebe rapa media juga mengandung Co dan I (9)*'
4- Vitamin Vitamin diperlukan dalam jumlah kecil. Mempunyai fungsi mengkatalisa sistem ensim. Tiamin r.ierupa- kan vitamin esensial yang diperlukan hampir semua kultur jaringan tanaman. Asam nikotinat dan
9
piridoksin merangsang pertumbuhan, Mio - inositol ditambahkan pada beberapa media dengan konsentrasi 100 mg/1 , dimaksudkan sebagai faktor pertum buhan. Vitamin lain yang biasa digunakan adalah asam para aminobensoat, asam askorbat, biotin, kholin, sianokobalamin, as§m folat dan riboflavin (9,13).
5. Zat pengatur tumbuh Zat pengatur tumbuh yang digunakan untuk kebanyakan kultur jaringan terutama kultur kalus adalah auksin dan sitokinin. Auksin mempunyai peranan antara lain terhadap pengembangan sel, penbentuk- an kalus dan pertumbuhan akar. Sitokinin mempunyai peranan dalam proses pembelahan sel (14). Termasuk dalam kelompok auksin yang sering digunakan untuk keperluan kultur jaringan adalah IAA, 2,/+ D, NAA, sedangkan sitokinin adalah kinetin, BA dan zea- tin.
V/eier et. al. meneliti pertumbuhan tobacco pith tissue culture dengan menggunakan auksin dan sitokinin dalam berbagai perbandingan. Pada konsentrasi sitokinin lebih besar dari auksin memper- lihatkan stimulasi pertumbuhan tunas dan daun. Sebalikr.ya jika konsentrasi sitokinin lebih kecil dari auksin mengakibatkan stimulasi pertumbuhan akar. Pada keadaan dimana konsentrasi kedua -
10
nya berimbang maka pertumbuhan tunas, daun dan akar berimbang juga. Pada konsen.trasi sitokinin sedang (intermediet) dan auksin rendah akan terbentuk kalus (14)« 2,4 D lebih potensial daripada IAA dan NAA. Kalus dapat terbentuk dari beberapa eksplan pada konsentrasi 2,4 D kurang dari 0 ,1 mg/1 ., meski beberapa jaringan membutuhkan 5 - 1 0 mg/1 untuk merangsang pembelahan sel. Un tuk pembentukan kalus penambahan 2,4 D 0,2 - 2 mg/1 cukup eSektif untuk semua jaringan. tanaman. Sitokinin ditambahkan dengan konsentrasi 0,5 - 2 mg/1 (9).
6. Asam amino dan bahan organik konrpleks Asam amino jarang ditambahkan dalam media kultur jaringan kecuali glisin* Jika diperlukan media diperkaya dengan kasein hidrolisat atau asam ca- samino* Penggunaan ekstrak alam seperti ekstrak ragi, ekstrak gandum dan sari buah dapat membantu. Sebagai contoh pertumbuhan in vitro dari eksplan beberapa jenis Citrus sangat dirangsang dengan penambahan sari jeruk pada media (9)- Pemilihan media tergantung pada jenis tanaman,
jaringan atau organ yang ditanam serta tujuan pene litian. Jika telah dilakukan penelitian yang berhasil dari suatu tanaman, cara terbaik adalah dengan mempergunakan metode yang digunakan pada penelitian
11
II.3 Kondisi lingkungan kultur jaringan (13) 1.- Temperatur
Menuru'UDe Capite, temperatur optimum beberapa kultur jaringan lebih tinggi dibandingkan tanam an. asalnya tetapi menurut Riker dan Hildebrandt sama dengan tanaman. asalnya. Secara umum kultur jaringan tanaman akan tumbuh baik pada tempera tur 20 - 28°C dengan temperatur optimal 26 - 27°C. Tetapi beberapa kultur jaringan. tanaman tidak mengalami kerusakan pada temperatur 5 - 10°C.
2. Cahaya Kultur suspensi tanaman umumnya tumbuh dengan pencahayaan. redup, meskipun Torrey dan Reinert melaporkan bahwa kecepatan tumbuh dalam keadaan gelap maupun terang untuk jaringan tanaman adalah sama. Blakerly dan Stewart melaporkan penca hayaan pada kultur jaringan Haplopannus gravilis menghasilkan kultur yang kompak dan kultur yang tumbuh dalam gelap bersifat rapuh. Untuk merangsang pertumbuhan kalus yang optimum, kultur sebaiknya diletakkan di tempat gelap#
12
3- pH Pada umumnya pH yang menguntungkan untuk pertum buhan kultur jaringan antara 5>0 - 6,5. White menyatakan. pH optimal adalah Beberapa media kultur ditambah dengan buffer phosphat karena selama sterilisasi dan selama waktu pertumbuhan pH dapat berubah. Namun penambahannya sangat terbatas karena pada konsentrasi tinggi akan menghambat pertumbuhan. kultur.
4. Aerasi dan agitasi Aerasi merupakan faktor penting untuk kekuatan pertumbuhan dari kebanyakan kultur suspensi ta naman. Aerasi dan agitasi yang memuaskan dicapai pada kultur yang tumbuh dalam carboys dengan me- lewatkan udara melalui fritted tube atau open ended glass tubing* Pengaduk magnjetik digunakan untuk menambah agitasi pada banyak tipe wadah kultur.
II.4 Kultur kalus dan karakteristiknya Kultur jaringan tanaman yang paling umum adalah
kultur kalus, dimana merupakan suatu massa yang tak terdeferensiasi dari sel tanaman (13). Pada mulanya kalus diketahui terbentuk akibat adanya luka pada jaringan tanaman dimana pada kondisi menguntungkan akan menutup luka dan mencegah infeksi mikroorganisme. Penelitian yang dilakukan oleh White kemudian
13
Gautheret dan Nobecourt di tahun 1930' an membukti- kan bahwa kalus dapat terbentuk dari jaringan ta naman yang diisolasi.. Kalus dapat dihasilkan dari semua bagian tanaman (15). Cara yang umum' adalah dengan menanam bagian tanaman yang steril pada me-.., dia kultur yang sesuai. Pemberian zat pengatur turn- buh pada konsentrasi tertentu akan merangsang pembentukan kalus. Kultur kalus dapat ditumbuhkan pada media padat dan media cair (13)*
Kalus dari jenis tanaman yarig berbeda bervari- asi dalam tekstur, kerapuhan dan warna.. Kultur ja ringan batang Citrus grandis mempunyai kalus berv/ar- na putih, kompak dan bernodul dengan pertumbuhan yang lambat, sedang kalus yang rapuh pertumbuhannya cepat. Pada kultur jaringan batang Plumbago, Heble et. al. mengamati adanya pemisahan dari beberapa lini sel yang mempunyai perbedaan kemampuan tumbuh, morfologi dan pigmentasi. Kalus berpigmen hijau tumbuh lebih baik dibawah cahaya daripada pada keadaan gelap. Pigmentasi dipengaruhi konsentrasi gula, ada nya amiliuiii terlarut, defisiensi nitrogen, temperatur, cahaya dan auksin eksogen (1 1 )*
Kalus yang terdiri dari sel-sel parenkim yang seragam sangat jarang, kecuali pada Agave dan Bp_s_a. Tergantung dari sumber/asal kalus, nutrisi media, dan interval waktu subkultur. Sel-sel kalus terdiri
14
dari tipe sel yang berv.ariasi ukuran danbentuk, isi sel dan ketebalan dinding selnya (1 1 ).
Kalus tumbuh selama periode waktu tertentu, biasanya selama dua minggu sampai kira-kira tiga bulan. Pada akhirnya akan dicapai ukuran optimum dan per tumbuhan akan menurun, Hal tersebut disebabkan makin
j*
berkurangnya nutrisi atau dehidrasi media, terben- ttiknya metabolit beracun, habisnya oksigen sel inti jaringan (12). Kurva pertumbuhan kalus selalu menghasilkan bentuk n S Kecepatan pertumbuhan mencapai maksimal setelah fase linier dan menjadi konstan pada fase stationer (Gambar 1) (9,16).
Gambar 1, Kurva pertumbuhan kalus
15
Produksi metabolit sekunder dalam kultur sel berkait- an erat dengan kurva pertumbuhan kalus, karena (17) : 1. Pembentukan metabolit paralel dengan pertumbuhan
sel. 2* Pembentukan metabolit diperlambat sampai pertum
buhan berhenti. 3* Pembentukan metabolit terjadi setelah lag phase.
II.5 Kultur jaringan sebagai sumber metabolit sekunder Dengan keberhasilan pertumbuhan in vitro dari
jaringan tanaman pada tahun 1930 an maka studi ter hadap kultur jaringan berkembang pesat. Teknik kul tur jaringan tanaman membuka kemungkinan baru dalam usaha menemukan produk-produk berguna dari tanaman obat untuk keperluan industri (18,19)»
Produk yang telah diidentifikasi terdapat pada kultur jaringan tanaman. antara lain steroid, terpe noid, sapogenin, alkaloid, karbohidrat, ensim, fla- vonoid, tanin, asam amino, glikosida, zat pengatur tumbuh, pigmen, senyawa fenol dan asam organik (19)* Adanya aktivitas mikroba fjuga telah diteliti (18).. Kultur jaringan mungkin memproduksi senyawa-senyawa yang sama/identik dengan tanaman induknya dan atau senyawa-senyawa yang lain sama sekali (5). Bahkan mungkin tidak mampu memproduksi senyawa spesifi* da-
16
biokomia yang diperlukan* 3.- Pembentukan struktur sel tertentu. 4- Perubahan lokalisasi substrat dan ensim.
Dengan adanya perbedaan kondisi dan lingkungan denganrtanaman asalnya maka ada kemungkinan kultur jaringan mempunyai profil metabolit sekunder yang berbeda sekali dengan tanaman asalnya baik kuantitatif maupun kualitatif. Beberapa kultur suspensi yang mempunyai kandungan senyawa alam lebih tinggi dibandingkan tanaman asalnya adalah Coleus blumei ( 12 % asam rosmarinat ), Catharanthus roseus ( 0,8 % serpentin ), Dioscorea deltoidea ( 7,8 % diosgenin ), Solanum aviculare ( 3 % asam betulinat ). Senyawa-senyawa yang diproduksi pada kultur jaringan tetapi tidak pada tanaman asalnya atau sedikit seka li antara lain : eduline dari Ruta graveolens. luci- dine dari Morinda citrifolia, paniculidis dari Andrographis paniculata* 3-metilpurpurin dari Digitalis lanata. Shikonin, suatu zat yang dipakai sebagai obat luka telah berhasil diproduksi secara industri dengan teknik kultur jaringan dari tanaman
17
Cara untuk meningkatkan produksi metabolit se kunder adalah dengan optimasi media kultur jaringan, optimasi kondisi dari bioreaktor/fermentor, penambahan prekursor atau elisitor pada media, biotransformasi dan seleksi strain.yang berproduktivi'tas tinggi. Untuk mencari strain-strain yang mampu mem produksi metabolit sekunder tertentu dalam jumlah besar dilakukan seleksi strain. Cara seleksi yang dikemukakan Heinstein merupakan perbaikan cara-cara terdahulu, Secara ringkas cara Heinstein antara la in (22) : 1. Pembuatan kultur tanaman. 2* Optimasi media untuk pertumbuhan kultur yang ba-
ik tanpa memperhatikan kemaunpuannya. 3. Mengembangkan metoda untuk menginduksi pemben
tukan metabolit sekunder. Dalam hal mendapatkan metabolit sekunder dengan
teknik kultur jaringan agar mempunyai nilai ekonomis, maka diperlukan beberapa kriteria yang harus dipe- nuhi (2 1) : 1. Konsentrasi produk harus lebih besar dari tanam-
asalnya. 2. Bahan dasar tanaman utuh untuk isolasi sangat su-
18
kar diperoleh. 3* Produk biotransformasi dari bahan dasar yang mu-
rah dan proses biotransformasi tidak dapat lewat cara kimia atau mikroorganisme.
4* Untuk produksi senyawa kimia yang sukar sekali diperoleh pada tanaman asalnya seperti intermediet biosintesa, ensim-ensim tertentu.
II. 6 Produksi diosgenin dari kultur jaringan Dioscorea Pada umumnya tanaman jenis Dioscorea mengandung
diosgenin 4 - 3 % bo bothering (22). Kaul dan Staba pada tahun 1968 pertama kali mengisolasi diosgenin dari kultur kalus Dioscorea deltoidea. Dihasilkan diosgenin dengan konsentrasi mendekati 1 % bobot kering. Dari penelitian lebih lanjut, kultur secara normal tumbuh dalam kultur suspensi dengan adanya 2,4 D 1 mg/1. Sedang tanpa 2,4 D setelah 11 minggu kandungan diosgenin berkurang sampai sepertiga jumlah normal* Dengan penambahan kolesterol produksi diosgenin meningkat menjadi 2,3 % bobot kering (18, 19). Dari hasil penelitian Rokem et. el. mengenai kultur jaringan Dioscorea deltoidea dicapai kadar diosgenin 7,8 % bobot kering (6). Kultur jaringan Dioscorea s.ylvatica mengandung diosgenin 1,2 % bobot kering (11), Diosgenin juga telah diisolasi dari kul tur jaringan D.composita. D. floribunda, D. tokoro D. sniculiflora (18)*
19
Dari kultur jaringan D. deltoidea dilaporkan biosintesa diosgenin berlabel jika jaringan diberi 4 C1^ dan 26 kolesterol. Juga telah diisolasi diosgenin radioaktif, yonogenin dan tokorogenin da ri kultur kalus D. tokoro dengan pemberian sikloar- tenol radioaktif, kolest-5-en,3 £,16 ,2 6 triol dan kolest-5-en,3 J5,16,22,26 tetrol (18)..
Penelitian yang dilakukan Tjondronegoro dkk. terhadap beberapa jenis Dioscorea. menunjukkan adanya diosgenin dari ekstrak kalus D. bulbifera. D. hispida dan D. esculenta. Analisa kuantitatif dari ekstrak kalus D. bulbifera pada media dengan penambahan NAA dan BAP mempunyai kandungan diosgenin lebih tinggi (0 ,4 %) daripada dengan 2 ,4 D (0,2.%) (7). Tal dan Golberg melaporkan bahwa amonium dan sitrat dibutuhkan untuk pertumbuhan dan pembentukan diosgenin. Produksi diosgenin maksimum pada N yang tinggi. Pada konsentrasi NH NO- 2,2 g/1 diperoleh 12,7 g. sel kering/liter. Jenis dan konsentrasi gula juga menentukan kandungan diosgenin. Dengan penambah an sukrosa 15 g/ 1 diperoleh 3,8 % diosgenin sesudah 21 hari dalam batch culture. Galaktosa pada konsen trasi 10 mg/ 1 menghasilkan diosgenin yang lebih tinggi dari penggunaan 30 rog/1 sukrosa (23)*
II.7 Tinjauan umun tanaman Dioscorea sp. II.7*1 Sistematika tanaman Dioscorea sp. (24,25)
20
II.7
Divisi : Spermatophyta Anak divisi : Angiospermae K e 1 a s : Monocotyledoneae Bangsa : Idliales S u k u : Dioscoreaceae M a. c g a : Dioscorea J e a i s : Dioscorea sp.. Suku Dioscoreaceae dikenal sebagai jenis ubi-ubian. Terdiri dari 10 marga yang terdi ri dari lebih kurang 650 jenis, Tersebar lu- as di daerah tropik dan subtropik. Tanaman Dioscorea di Indonesia terdapat lebih dari 40 jenis, baik yang sengaja ditanam atau tumbuh liar*
,2 Sifat-sifat tanaman Dioscorea (24»25j26,27) Habitus : herba tahunan, tumbuh menjalar
atau membelit. Didalam tanah membentuk tubera, satu atau banyak, adakalanya tumbuh tubera di ke- tiak.
Batang : tumbuh dari tubera, membelit, kadang bersayap atau berduri.
D a u n : tunggal kadang-kadang majemuk, berhadapan, berseling atau ter sebar. Pada umumnya berbentuk jantung.
21
Bunga : beraturan* selalu berkelamin satu, berumah satu. Daun +.- tenda bunga 6, dalam lingkar- an masing-masing 3 pada pangkal kerapkali melekat. Bunga jantan: benang sari 6, semua fertil atau berkurang 3 menjadi staminodia* Bunga beti- na: bakal buah tenggelam, kerapkali beruang 3> bakal biji 2 per ruang, tangkai pu- tik 1 bercabang 3*
B a a h : buah kotak atau buah buni de ngan 3 lobus, bersayap, membuka pada waktu masak, biji 1 samjxai 2 tiap sel datar pa da bagian atas atau meling- kar, beralbumin.
11.7*3 Kandungan Dioscorea sp. Kandungan tanaman Dioscorea sp. sangat ber- variasi tergantung jenisnya. Tubera terutama mengandung air 60 - 80 %, disamping karbohidrat 23 protein 2 %, sejumlah kecil vita min B, C, dan karoten. Selain itu tubera mengandung senyawa glikosida saponin, sterol, tanin, trigliserida dan komponen-komponen
22
asam fenolat. Diosgenin pada umumnya terdapat pada tan am an Dioscorea. Kandungan dios genin berbeda pada tiap organ tanaman. Pa- iLittg-'banyak terdapat pada umbi, menyusul bagian dekat umbi dan*'terns berkurang mender j kati pucuk batang (7,24*26).
23
111,1 Bahan III..1..1 Eksplan
Eksplan berasal dari daun Dioscorea hispida Dennst., Dioscorea esculenta (Lour) Burk., Dioscorea batatas Decne yang diperoleh dari Kebun Raya Purwodadi dan telah diketahui identitasnya, dan Dioscorea pentaphvlla L.. yang diperoleh dari daerah Surabaya, yang determinasinya telah dilakukan sesuai dengan buku Flora of Java (25).-
111.1.2 Bahan kimia Bahan kimia yang digunakan adalah produksi E. Merck Darmstadt dengan derajat " pro analisa M kecuali disebutkan lain. Bahan pensteril yang digunakan adalah Regular Klorox mengandung 5*25 % Natrium hipoklorit, pro duksi The Clorox Company, Oakland..
111.1.3 Agar Agar yang digunakan adalah agar batangan me- rek " AA " yang diperoleh dari pasar Klojen, Malang.
111.1.4 Media Media yang digunakan adalah media standar
BAB III
24
Murashige-Skoog (Tabel 1) dengan penambah an zat pengatur tumbuh pada berbagai kombinasi konsentrasi (Tabel 2),
III-2 Alat Alat yang digunakan pada penelitian : - Laminar air flow cabinet Pharmeq Lab..'' - Otoklaf 25 liter (American Portable Autoclave WAF Co Inc.)
- pH meter Fisher - Monopan balance - Gelas beker - Cawan petri - Erlenmeyer - Gelas ukur - Pipet volum - Pinset - Pisau scalpel - Lampu spiritus - Botol bermulut lebar (diameter 3*5 cm, tinggi 7 cm. )
III.3 Cara kerja III.3-1 Sterilisasi alat
III.3.1.1 Alat gelas, alat logam dan alumi nium foil. Dimasukkan ke dalam bungkus alumi-
25
nium f o i l kemudian di s t e r i l i s a s i
di dalam oven 160°C selama empat jam (9)..
111.3,1,2 Air suling Sterilisasi dilakukan di dalam otoklaf 121°c selama 15 menit.
III.3.2 Pembuatan media Pembuatan media dilakukan sesuai dengan metode Kurashige , Masing-masing komponen media dibuat larutan stok dan dengan mencampur larutan-larutan stok diperoleh larutan MS. pH media diatur + 5>7 dengan penambahan la rutan NaOH 0,1 N atau HCl 0,1 N. Setelah ditambah 1 % agar, larutan dituqng ke dalam botol bermulut lebar sebanyak 25 ml. Botol ditutup rapat dengan aluminium foil dan disterilkan dalam otoklaf 121°C, tekanan 20 psi selama 15 menit.
III.3-3 Penanaman eksplan Daun Dioscorea sp. dicuci bersih dengan air suling. Direndam dalam alkohol 90 % selama 2 menit, kemudian disterilkan dalam larutan Klorox 30 % (mengandung Natrium hipoklorit 1*575 %) selama 10 menit. Setelah dibilas tiga kali dengan air suling steril bebas mi neral, eksplan dipotong pada bagian tangkai
26
dekat pangkal helai daun + 5 mm, kemudian ditanam pada media. Semua pekerjaan dilakukan dalam laminar air flow cabinet.
III.3.4 Pemindahan kultur kalus Botol kultur yang berisi kalus dibuka tutup- nya kemudian mulut botol dibakar. Dengan menggunakan scalpel steril, kalus dipindahkan ke dalam media baru. Mulut botol dan tutup alu minium masing-masing dibakar, kemudian botol ditutup rapat.
III.3*5 Pengamatan hasil III.-3*-3*l Pemeriksaan makroskopis kalus
Pemeriksaan makroskopis kalus meliputi : - warna - tekstur - organogenesis
111.3.5.2 Pengamatan pertumbuhan kalus Parameter pertumbuhan kalus dihya^- takan dengan Indeks Pertumbuhan (IP). Indeks Pertumbuhan didefinisikan sebagai :
Bobot basah kalus akhir IP = ---------------------- x 100
Bobot basah kalus awal Bobot basah kalus akhir ditentukan tiap minggu dengan cara kalus di-
27
keluarkan dari botol kultur kemudian ditimbang. Bobot awal kalus di peroleh dengan cara: B ~ B — Bav/ ” media + kalus “ media
111.3.5*3 Pengolahan data Dari data yang diperoleh d 'buat gra fik log IP rata-rata terhadap waktu. Dengan menghitung persamaan regresi yang dilakukan pada minggu I sampai dengan minggu II, dapat diketahui waktu duplikasi (t ) dari kalus ya-
. itu dengan menggunakan (28): Persamaan regresi y = bx + a dimana: y = log IP rata-rata
x = waktu b = slope
28
Komponen Jumlah (mg/1)
CaCl2. 2 H20 440 Mgso^. 7 h2o" 370 KH2P0if 170
KI 0,83 H,BO, 3 3 6,20
MnSO^. 4 H20 22,30 ZnSO^* 7 H20 8,60 Na2MoO^# 2 H20 0,25 CuSO^. 5 h2o 0,025 CoC12. 6 H20 0,025 FeSO .. 7 H20 27 ,,80 Na2EDTA. 2 H20 37,30 Mio-inositol 100 Asam nikotinat 0,50 Piridoksin HC1 0,50 Glisin 2 Thiamin KC1 0,10 Agar 10000 Sukrosa 30000
Tab.el 2. Rancangan kombinasi zat pengatur tumbuh untuk pembentukan kalus Dioscorea sp
Ket: ZPT= Zat pengatur tumbuh ; KM= Kode media * Konsentrasi dalam ppm.
30
eksplan Dioscorea sp.
D. hispida Daun Klorox 40 % 4 menit -
D. esculenta Daun Klorox 40 % 4 menit -
D. pentaphylla Daun Klorox 40 % 4 menit - D. hispida Daun Klorox 10 % 10 menit
kemudian Klorox 1 %
10 menit D. esculenta Daun - idem - -
D. pentaphvlla Daun - idem - - D. esculenta Daun Klorox 20 % 10 menit -
D. esculenta Daun Klorox 20 % + Tween 2 10 menit
3
D. esculenta Daun Klorox 20 % 20 menit - D. hispida Daun - idem - - D. esculenta Daun HgCl2 10 ppm 10 menit -
D. hispida Daun - idem - -
D. batatas Daun Klorox 40 % 10 menit +
D. pentapnvlla Daun Klorox 40 % 10 menit +
31
IV.2 Pembentukan kalus Tabel 4* Pembentukan kalus dari eksplan Dioscorea sp.
pada media MS dengan penambahan zat penga tur tumbuh
* - = tidak tumbuh + = tumbuh
32
Tabel 5. Waktu tumbuh kalus dari eksplan Dioscorea nentanhylla L.
Kode media Waktu tumbuh (hari) Rata-rata I II III -IV- V
KD1 7 7 10 - 8 + 1 kd2 7 10 10 - - 9 + 1 KD^ 7 13 10 - - 10 + 1,7 kd6 7 10 - 10 - 9 + 1 KDg 7 13 13 - 13 11,5+ 1,5
KI1 16 13 - - 10 13 + 1,7
Tabel Waktu tumbuh kalus dari eksplan Dioscorea batatas Decne
Kode media Waktu tumbuh (hari) Rata-rataI II III IV V
KD^ - 9 - 12 .12 1 1 + 1 kd2 - - 8 8 7 7,7+ 9*3 KD^ - 9 12 - - 10,5+ 1,.5 KD6 12 9 - 12 - 1 1 + 1 KDa 14 14 13 13 14 13,6+ 0,3
KI1 13 13 14 14 14 13,6+ 0,3
33
Dioscorea pentaphvlla L.
KDr coklat muda kompak terbentuk dan daun
tunas
tunas
tunas
34
1] * " a
Gambar 2. Terjadinya organogenesis pada kalus Dioscorea pentaphvlla L«. pada media (A) KDlf (B) KD3
Tabel 8. Pemeriksaan makroskopis kalus Dioscorea batatas Decne
Kode media Warna Tekstur Organogenesis
KD1 putih — coklat rapuh - kd2 putih — coklat rapuh - KD^ putih — coklat rapuh - kd6 putih — coklat rapuh -
kd8 putih — * coklat rapuh -
KIi putih — * coklat rapuh -
35
* k'
L .
M
Gambar:3«- Kalus Dioscorea batatas J)ecae yang ditanam pada media (A) KDcj (B) KD« pada minggu ke IV ^ '
\ N ' c ; ! s v - 7 Jfc - „ V' *' '
* _______S v ^ ' ^ - - - ’ ^ A ^ i‘ 'r ^ ;
^ £ ' 1 * - V v \ '
* . 'V " V ' ' V fv' ,^ i* , v' \ - s, - * A' 1~ - v - ^ > - r , ' / p . f ;
: Ym s.
Gambar 4. Sel-sel kalus Dioscorea pentaphvlla L* (pembesaran 50 x)
36
IV*4 Hasil perhitungan Tabel 9* Indeks Pertumbuhan (IP) kalus
Dioscorea pentaphvlla L*.
log In de ks Pe rt um bu ha n
3?
Waktu (hari)
Gambar 5. Grafik log Indeks Pertumbuhan rata-rata terhadap waktu (hari) dari kalus Dioscorea pentaphvlla L..
38
Tabel 10.. Contoh perhitungan persamaan jregresi dari data Indeks Pertumbuhan rata-rata dan wak tu (kalus Dioscorea pentaphvlla L. pada media KD^)
n iVaktu IP log IP x2 y2 xy ^hit.X y
1. 7 119,38 2,0769 49 4,3133 14,3383 2,0284 2. 14 121,14 2,0833 196 4,3401 29,1662 2,1796 3. 21 239,10 2,3786 441 3,6377 49,9506 2,3308
I 42 6,5368 686 14,3113 93,6551 x 14 y 2,1796
42 . 6,5388 93,6551 -
Persamaan regresi : y = 0,0216x + 1,8772
Mb = 2,303
39
40
41
IP Kod^^^ medians.
KD5 109,-58 101,72 106,32
lug In de ks Pe rt um bu ha n
42
Waktu (hari)
Gambar 7. Grafik log Indeks Pertumbuhan rata-rata terhadap waktu (hari) dari kalus Dioscorea batatas Decne
43-
(A )
KD
(B )
KD
umrnqum^jad sâpuj 9o*[
45-
Kode media Slope (hari)
kd8 0,0181 16., 62 KD10 0,0205 16,62
14 , 68
Kode media Slope ** (hari)
kd^ 0,0159 18,93 kd7 0,0146 20,62 KDg 0,0142 21,19 KD1q 0,0175 17,20
46
PEMBAHASAN
Proses sterilisasi pada jenis tanaman Dioscorea dipengaruhi beberapa faktor antara lain lokasi pengambilan bahan dan morfologi dari bagian yang digunakan. Bahan yang diperoleh dari lapang ternyata mempunyai tingkat kontaminasi yang cukup tinggi. Adanya bulu-bulu halus pada daun menyulitkan penetrasi bahan pensteril seperti yang terjadi pada Dioscorea hispida Dennst dan Dioscorea esculenta (Lour) Burk. Pada daun Dioscorea batatas Dedne tidak terdapat bulu sedangkan Dioscorea pentaphylla L. berbulu kaku dan jarang, sehingga proses sterilisasi lebih mudah. Meski- pun demikian diperlukan konsentrasi yang cukup tinggi dari bahan pensteril (Klorox) yaitu 40 % dimana mengandung 2,1 % Natrium hipoklorit. Seperti yang dilakukan Tjondro- negoro dkk. ternyata tingkat kontaminasi dari bahan yang diperoleh dari lapang mencapai 80 - 9 0 dari kultur umbi. Oleh kareaanya penyimpanan tanaman dalam rumah kaca di- anjurkan. untuk memperkecil terjadinya kontaminasi (?) atau penggunaan biji sebagai bahan untuk inisiasi pembentukan kalus akan mempermudah proses sterilisasi (29)*
Selanjutnya untuk pembentukan kalus digunakan eksplan daun Dioscorea batatas Decne dan Dioscorea pentaphvlla L. Pembentukan kalus pada kedua jenis Dioscorea ini cukup su^v; lit. Dari 25 macam kombinasi zat pengatur tumbuh pada media
BAB V
47.
MS hanya 6 macam kombinasi yang berhasil yaitu : - MS + 0,5 ppm kinetin + 1 ppm 2,4 D - MS + 1 ppm kinetin + 0,5 ppm 2,4 D - MS + 1 ppm kinetin + 1 ppm 2,.4 D - MS + 1,5 ppm kinetin + 2 ppm 2,4 D - MS + 2 ppm kinetin + 1 ppm 2,4 D - MS + 2 ppm kinetin + 1 ppm IAA Keberhasilan pembentukan kalus disamping dipengaruhi
adanya zat pengatur tumbuh juga dipengaruhi oleh asal eksplan (organ yang digunakan), umur organ dan ukuran eksplan. Pada Dioscorea pentaphylla L. potongan helai da un lebih mudah membentuk kalus daripada tangkai daun. Se- dang pada Dioscorea batatas Decne terbentuknya kalus dari helai dan tangkai daun sama lambatnya. Kalus mulai tumbuh 7 - 1 4 hari setelah penanaman, tetapi proses pertumbuhan selanjutnya sangat lambat. Pembentukan kalus pada eksplan Dioscorea pentaphylla L.. diawali dengan terjadinya pembesaran massa, daun menggelembung dan menggulung. Kalus berwarna coklat - coklat keputihan dan kompak. Pada Dioscorea batatas Decne kalus tumbuh pada bagian yang ter- potong dari eksplan, berwarna putih yang kemudian menjadi coklat dan friable. Untuk mengatasi pertumbuhan kalus yang lambat, perlu dilakukan optimasi media pertumbuhan untuk mendapatkan pertumbuhan kalus yang optimal.
Browning terjadi pada kultur kalus Dioscorea pentaphylla L. satu bulaa. setelah penanaman.
Media yang ditanami berwarna coklat, kadang ungu kebiru- an. Browning terjadi karena oksidasi senyawa-senyawa fenolik akibat adanya pelukaan karena pemotongan. Terben- tuknya senyawa ini kemudian menyebar dan menurapuk didalam media sehingga warna media menjadi coklat. Pada keadaan ini sukar•terbentuk kalus karena senyawa fenolik yang menyebabkan browning menghambat pertumbuhan, maupun proses pemhelahan dan perpanjangan sel. Untuk mengatasi gejala browning jnaka disarankan penaigbahan anti ok-si-
dan antara-lain as'an* askorbat, sistein. Adanya variasi konsentrasi zat pengatur tumbuh dan
asal eksplan mempengaruhi pertumbuhan kalus dan terjadinya organogenesis. Pada media dengan konsentrasi zat pe ngatur tumbuh (1) 0,5 ppm kinetin + 1 ppm 2,4 D, (2) 1 ppm kinetin + 1 ppm 2,4 D, (3) 1 ppm kinetin + 0,5 ppm. 2,4 D terbentuk tunas dan daun dari kalus 'Dioscorea pentaphvlla.- L. setelah + 3 bulan (84 hari). Jumlah tunas mencapai 7 - 11 buah.
Kalus yang terbentuk setelah cukup besar baru disubkulturkan. Pengamatan terhadap pertumbuhan kalus dilaku kan dengan penimbangan bobot basah kalus. Dari hasil perhitungan Indeks Pertumbuhan dibuat grafik log Indeks Per tumbuhan terhadap waktu. Grafik log Indeks Pertumbuhan terhadap waktu menunjukkan bentuk sigmoid. Fase eksponen- sial dimulai pada minggu kedua sampai ketiga, kecuali pa da media KDg pertumbuhan kalus Dioscorea pentaph.ylla L.
:49
sampai minggu keempat belum mencapai fase stationer, demikian juga Dioscorea batatas Decne pada media KDr,.. De - ngan deraikian subkultur sebaiknya dilakukan antara ming gu kedua dan ketiga karena pada masa tersebut kecepatan pembentukan kalus meningkat.
Dari perhitungan waktu duplikasi diketahui waktu duplikasi kalus dalam penelitian ini untuk Dioscorea pentaphvlla L. paling cepat 13s94 hari pada me dia KD^ (MS + 1 ppm kinetin + 2 ppm. 2,4 D). Pada Dioscorea batatas Decne waktu duplikasi paling cepat pada media KD^q (MS + 2 ppm kinetin + 2 ppm. 2*4 D) yaitu 17,20 hari. Dari tabel 12 dan tabel 13 diketahui pertum buhan kalus Dioscorea pentaphvlla L* lebih cepat daripada Dioscorea batatas Decne*
50
Dari penelitian ini dapat disimpulkan: 1* Eksplan Dioscorea esculenta (Lour) Burk, dan
Dioscorea hispida Dennst,. pada penelitian ini tidak ^
berhasil disterilkan, sedang eksplan Dioscorea batatas Decne dan Dioscorea pentaphylla L. dengan penggunaan Klorox 40 % (mengandung 2,1 V> Natrium hipoklorit) diperoleh eksplan steril.
2. Media yang rc&npu menumbuhkan kalus dari eksplan Dioscorea batatas Decne dan Dioscorea pentaphylla L. adalah: - MS + 0,5 ppni kinetin + 1 ppm 2,4 D - MS + 1 ppm kinetin + 0,5 ppm 2,4 D - MS + 1 ppm kinetin + 1 ppm 2,4 D - MS + 2 ppm kinetin + 1 ppm 2,4 D - MS + 1,5 ppm kinetin + 2 ppm 2,4 D - KS + 2 ppm kinetin + 1 ppm IAA
3. Adanya variasi konsentrasi zat pengatur tuvabuh, asal eksplan dan ukuran eksplan mempengaruhi terjadinya or ganogenesis dan pertumbuhan kalus. Dioscorea pentaphylla L. memperlihatân pembentukan tu nas dan daun pada media (1) MS + 1 ppm kinetin + 1 ppm 2,4 D (2) MS + 0,5 ppm kinetin + 1 ppm 2,4 D (3) + 1 ppm kinetin + 0,5 ppm 2,4 D. Jumlah tunas antara 7 - 1 1 buah.
51
4.- Waktu duplikasi (t<j) paling cepat pada penelitian ini: - Kalus Dioscorea pentaphvlla L. pada media KS + 1 ppm kinetin + 2 ppm 2,4 D yaitu 13,94 hari,
- Kalus Dioscorea batatas Decne pada media MS + 2 ppm kinetin + 2 ppm 2,4 D yaitu 17,20 hari.
52
Dengan mengetahui kemampuan pembentukan dan pertum buhan kalus dari Dioscorea pentaphvlla L. dan Dioscorea batatas Decne pada penelitian yang telah dilakukan perlu diadakan penelitian optimasi media untuk mendapatkan pertumbuhan kalus yang optimal dan dilakukan identifikasi kandungannya.
53
RINGKASAN
Dilakukan percobaan inisiasi kalus terhadap 4 jenis Dioscorea. Pada proses sterilisasi daun Dioscorea hispida Dennst dan Dioscorea esculenta (Lour) Burk dipengaruhi adanya bulu-bulu halus sehingga menyuiitkan penetrasi dari bahan pensteril, disamping dipengaruhi juga oleh faktor lokasi pengambilan tanaman. Untuk percobaan selanjutnya di gunakan 2 jenis Dioscorea yang berhasil disterilkan yaitu Dioscorea pentaphylla L. dan Dioscorea batatas Decne.
Pembentukan kalus dari kedua jenis Dioscorea yang digunakan terjadi rata-rata 7 - 1 4 hari setelah penanaman eksplan pada media Murashige - Skoog dengan penambahan zat pengatur tumbuh kinetin, 2,4 D dan IAA. Pertumbuhannya lambat dan pada Dioscorea pentaphylla L. terjadi browning pada media. Organogenesis terjadi pada kalus Dioscorea pentaphylla L. + 3 bulan setelah penanaman dengan terbentuknya tunas dan daun.
Kurva pertumbuhan kalus dari k3dua jenis Dioscorea tersebut berbentuk sigmoid dengan waktu duplikasi kalus antara 13 - 21 hari.
54
1. Laporan Analisa Data. Program Keluarga Berencana Nasi onal Triwulan I Tahun 1985/1986* Badan Koordinasi Ke luarga Berencana Nasional. p. 20.
2. Panjaitan, Sahala. dan Gandung Sujiantov 1986. Dampak Praktek Peraakaian Kontrasepsi pada Tingkat Kelahiran.; Badan Koordinasi Keluarga Berencana Nasional, Biro Ana lisa Pelaksanaan Program: Jakarta, pp. 1,2.
3*- Hakim, A. dan S. Tatang, 1975* Prospek Alkaloid Solanum sebagai Sumber Bahan Baku Kormon Steroid di Indonesia.; Simposium Tanaman Obat ke 1. Bogor. pp. 105, 106.
4. Isnaeni. 1986. Optimasi Pembentukan Kalus dan Identi- fikasi Steroid dari Solanum mammosum L. Tesis. Univer sitas Airlangga. Surabaya, pp. 33-37*
5* Indrayanto, Gunawan. 1986. Prospek Kultur Jaringan Ta naman pada Bidang Farraasi. Buletin ISFI Jatinu 1 7 , 12-13...
6. Rokem, J.S., B. Tal dan I. Goldberg. 1985* Methods for Increasing Diosgenin Production by Dioscorea Cells in Suspension Culture. Journal of Natural Products. 48. 210- 212, 220. . .
7* Tjondronegoro, P.D. et. al. 1986. Usaha Peningkatan Kadar Diosgenin pada Dioscorea spp. dengan Cara Kultur In Vitro. Institut Pertanian Bogor. pp. 42-47.
8. Heinstein, P. 1985* Journal of Natural Products. 48 1- 10.
9* Dodds, J*H. and L.7/. Roberts. 1982. Experiments in Plant Tissue Culture..; Cambridge University Press: Cambridge, pp- 1-56
10. Thorpe, T.A. 1961. Plant Tissue Culture, Kethods ang Application in Agriculture.; Academic Press; New York, pp.. 21-23, 36b.
DAFTAR PUSTAKA
55
11.. Narayanaswamy, S. 1977. Regeneration of Plants from Tissue Culture.. In: Plant Cell,- Tissue, and Organ Culture, Chapter I..; Springer - Verlag: Berlin, pp. 180-186.
12. Thomas, E. and M.R. Davey.. 1975- From Single Celle to Plants.; Wykeham Publication Ltd: London, pp. 19-21, 56.
13* Puhan, Z. anc[ Martin S.M. 1975. The Industrial Poten- sial of Plant Cell Culture.. Nat.. Res. Counc. of Canada 11595. pp. 15-19, 23,24-
14. Abidin, Zainal. 1985. Tentang Zat Pengatur Tumbuh.; Penerbit Angkasa: Bandung, pp.. 14, 57-59*
15. Audus, L.J. 1953. Plant Growth Subtances.; Neill and Co. Ltd: Edinburgh, p. 325.
16. Bhojwani, S.S. and M.K. Razdan. 1980. Plant Tissue Culture Theory and Practise.; Elsevier, pp. 25-53.
17. Stohs, S.J. 1977. Metsbolisra of Steroid in Plant Tissue Culture. In: Plant Tissue Culture and Its Biotechnological Application..; Springer - Verlag: Berlin, pp. 7—11-
18. Khanha, Puspha. 1977. Tissue Culture and Useful Drug, A Review on Twenty Plant Species Grown In Vitro. In: Cultivation and Utilisation of Medicinal and Aromatic Plants.; Regional Research Laboratory; Jammu-Tawi. pp. 495-499.
19. Stohs, S.J. and H. Rosenberg. 1975. Steroid and Steroid Metabolism in Plant Tissue Culture. Lloydia. .3fi, 181-188.
20. Bohra, H. The Formation of Secondary Metabolite in Plant Tissue and Cell Culture. International Review of Cytology. 3uppl. 11 B. pp. 183-203.
56
21. Indrayanto, Gunawan. 1987. Produksi Metabolit Sekun der dengan Teknik Kultur Jaringan Tanaman. Seminar Nasional Metabolit Sekunder. PAU Teknologi - Univer- sitas Gajah Mada.- pp. 4-6.
22. Staba, E.J. 1977* Tissue Culture and Pharmacy. In: Plant Cell, Tissue, and Organ Culture, Chapter VI.; Springer - Verlag: Berlin, pp. 700-701.
23. Tal, B. and I. Goldberg. 1982. Growth and Diosgenin* Production by Dioscorea deltoidea Cells in Batch and Continuous Cultures. Planta Medica. 107--H0.*.'
24.- Heyne, K. 1950. De Nuttige Planten van Indonesia I, 3e Druk.; N.V. Vitgeverij van Hoeve’s Gravenhage: Bandung, pp. if5 -Zf61.
25. Backer, WSc5. C.A. and R.C. Bhakhuizen van den Brink Jr. 1968. Flora of Java, Vol. III.; Wolter Noordhoff N.V.: Groningen, pp. 154-155.
26. Claus, E.P. 1961. Pharmacognosy, 4th Edition.; Lea & Febiger: Philadelphia, pp. 129-131> 134*
27. Van Steenis, C.G.G.J. et. al. 1975* Flora untuk Seko- lah di Indonesia.; Penerbit Pradnya Paramita: Jakarta, pp. 160.161.
28. Mantell, S.H., J.A. Matthews and R. A. McKee. 1985. Principles of Plant Biotechnology.; Blackwell Scientific. Publications: Oxford, pp. 102-104.
29. Reinert, J. and M.M. Yeoman. 1982. Plant Cell & Tissue Culture.; Springer - Verlag: Berlin., pp. 52-54.
57
LAMPIRAN DISKRIPSI TAKSONOMI
1* Dioscorea hispida Dennst* (Gambar lampiran 1) Tanaman ini di Jawa dikenal dengan nama Gadung.
Merupakan tanaman yang banyak dikenal, tumbuh dengan baik secara liar maupun sengaja ditanam. Biasanya terdiri dari 20 - 30 tuber yang besar dengan disekitarnya terdapat tuber yang kecil, sehingga tanah akan membengkak. Sebagai makanan, sukar pengolahannya. Harus direndam dan dicuci berulang-ulang.
: perdu memanjat, tinggi mencapai 3 - 1 0 meter,
: berbentuk bulat, berbulu dan berduri, berwarna hijau kekuningan dengan diame ter 9 mm. atau lebih.
: majemuk terdiri dari 3 anak daun, berbu lu.
: berbentuk bulat, kadang memanjang. Berat mencapai 35 kg. kadang lebih. Kulitnya berwarna kekuning-kuningan sampai kelabu terang. Dagingnya berwarna putih sampai kuning jeruk.
2. Dioscorea esculenta (Lour) Burk. (Gambar lampiran 2) Tanaman ini dikenal dengan narna Gembili (Melayu,
Jawa), !luv:i butul (Sunda). Terraasuk jenis yang banyak
Habitus
Batang
Daun
Tubera
58
latang
Daun
Tubera
perdu meman.jat yang dapat mencapai tinggi 3 - 5 m. berbentuk bulat, berbulu halus dan ber* duri tersebar diseluruh batang, tunggal, berbentuk jantung, berbulu dan kadang terdapat duri pada bulu-bu- lunya. berbentuk bulat sampai bulat panjang, berjumlah banyak. Kulitnya berwarna coklat muda atau coklat kelabu dan ti pis sehingga mudah terobek. Dagingnya berwarna putih, berasa sedikit pahit pada bagian luar tetapi keseluruhannya mempunyai rasa manis. Tuber dilindungi batang kecil berduri.
3. Dioscorea pentaphylla L. (Gambar lampiran 3) Tanaman ini dimasukkan golongan setengah liar, ka
rena banyak ditemukan di hutan. Tubera dimakan dengan cara direbus atau dibakar. r. abitus Batang
Daun
Tubera
: perdu memanjat mencapai 5 - 10 m. : bulat dan berbulu, diameter + 7 mm. Terdapat banyak bulbil.
: majemuk palmatus dengan anak daun 3, 5 atau 7, berbulu.
: tunggal berbentuk bulat panjang atau
59
menjari, diliputi akar yang berbulu. Dagingnya berwarna putih atau kuning jeruk kadang terdapat bintik-bintik ungu.
k* Dioscorea batatas Decne (Gambar lampiran 4). Disebut juga Chinese yam, Chinese po.tato, Cinnamon
vine. Habitus : tanaman memanjat, tinggi mencapai 3 - 8 m, Batang : bulat, tidak berbulu. Daun : tunggal, dengan 7 - 9 tulang daun, berben
tuk jantung membulat dan bercangap, li- cin*
Tubera : - Identitas tanaman ini tidak banyak diketahui. Bia-
sanya tumbuh di daerah tropis, umbinya dapat dimakan. Tanaman ini sangat tahan terhadap cuaca.
Burkill, I.H. 1951. Dioscoreaceae. In: Flora Malesiana. Series I. Volume 4- Noordhoff - Kolff N.V. Djakarta* PP. 293 - 335. Bailey, L.H* The Standard Cyclopedia of Horticulture,. Volume I.; The Macmillan Company: New York.p*. 1013
60 ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
61
63
H as
il pe
ni m
ba ng
k :
H as
il pe
ni m
ba ng
«b ps ** rH o rH
-Vk -s? rs rH — < oCf\ r*'.#»o O o
-4- rN rH rH O IT\ r 'l if\
•ko O O
no •4- O'c\ rH vO »T\ •0 «n CV rH <v
c. t«o o o
CO 'v t O'st> U t •o n » CV rH i ' i
•i't © o
fd •> *H f°i
rH C\’ CV rH cv #» •k <Ao o O O o
*»t i UN CM v<\ U \ I c*~ vO O rH ^ [ rHH tv CM CV l-i
c> «v r. k e. O O O | O O
v£» u \ r~i | 00 mo» CO C - CO o U*\ CO ) o CM rH rH of * rH rH
O * cT d‘ 1 •»O •ko
O rH
r. o
•sT IT\ •sf m, *>o O o o
«r\ «o tv o'
01 » O O O
O r-3 rH vJDo cv -4 - o-~w *•O rH o
— i o rHri Oi o CO "<
vf UPv «s *
3 O o
rHOvf C'J
Oi o lT\ vO •<- rHvO CO o o iA ONc- C4 ur\ rH C \ C'J cv CV CVC« u •« «ko o o o o o *<i- vrv ON o rH CVCO f- - <n> vrv C*** rHCV CV C-- O \ 0rH 4.W H rH rHg» •t •ko o O O O o
CV rHvD
A •k •s O o o
gdlhub-gdl-s1-2013-sariretno-23565-1.halam-
gdlhub-gdl-s1-2013-sariretno-23565-2.kata-
gdlhub-gdl-s1-2013-sariretno-23565-3.dafta-
gdlhub-gdl-s1-2013-sariretno-23565-7.babi-
gdlhub-gdl-s1-2013-sariretno-23565-10.bab-
gdlhub-gdl-s1-2013-sariretno-23565-14.ring-
gdlhub-gdl-s1-2013-sariretno-23565-15.daft-
gdlhub-gdl-s1-2013-sariretno-23565-16.lamp-

percobaan inisiasi kalus dari skripsi dibuat untuk

Documents