PENGUMPULAN SPESIMEN DALAM PEMERIKSAAN HEMATOLOGI DAN

HEMOSTASIS

1. menjelaskan pertimbangan jaminan kualitas yang berhubungan dengan pengambilan

spesimen darah dengan venipuncture, oleh tusukan kulit, dan dari kateter dalam

pemeriksaan hematologi dan hemostasis.

2. menggambarkan tindakan pencegahan yang diperlukan selama spesimen darah

pengolahan dan penanganan untuk memastikan hematologi dan hemostasis hasil tes

yang valid

Pengumpulan spesimen darah yang tepat adalah langkah pertama dalam

memastikan hasil yang akurat dan dapat diandalkan dari pemeriksaan laboratorium

klinis. Bab ini berfokus pada aspek-aspek pengambilan spesimen darah yang dapat

mempengaruhi validitas hasil pemeriksaan hematologi dan hemostasis. Spesimen

darah untuk pemeriksaan hematologi dapat diperoleh dengan menggunakan metode

venipuncture , oleh tusukan kulit ( kapiler ), atau dari kateter, dengan memperhatikan

pemantapan mutu dari masing-masing metode ini. Terlepas dari metode yang

digunakan , pengumpulan spesimen membutuhkan pengetahuan tentang peralatan

yang diperlukan dan keterampilan teknis, mengutamakan kenyamanan dan

keselamatan pasien dan identifikasi spesimen, kesadaran dan kepatuhan terhadap

persyaratan keselamatan institusional, dan transportasi spesimen serta teknik

pengolahan yang tepat. Pengumpulan spesimen darah , atau proses pengambilan

darah, adalah keterampilan dipraktekkan oleh banyak anggota tim kesehatan termasuk

phlebotomists , teknisi laboratorium klinis, ilmuwan , dokter dan perawat. Istilah

phlebotomist yaitu setiap individu yang melakukan tindakan pengambilan darah dan

bertanggung jawab terhadap proses pengumpulan spesimen darah tersebut.

Kewaspadaan universal harus diikuti ketika mengumpulkan dan memproses semua

spesimen darah. semua phlebotomists harus mematuhi dan menjalankan tindakan

pencegahan ini.

PENGAMBILAN SPESIMEN DARAH DENGAN VENIPUNCTURE

Teknik yang paling umum digunakan untuk mendapatkan spesimen darah

adalah venipuncture. Bagian ini akan membahas tentang peralatan dan anti koagulan

yang digunakan dalam venipuncture, prosedur, dan hal-hal yang mempengaruhi

kualitas hasil pemeriksaan.

Peralatan

Pengumpulan specimen dengan system tabung evacuated .pengumpulan specimen

yang paling rutin digunakan adalah dengan menggunakan tabung kaca evacuated atau

tabung pengumpul terbuat dari plastik, dengan jarum yang lancip dan miring di kedua

ujungnya, dan pemegang jarum (lihat Gbr.2-1). Tabung evacuated (tidak mengandung

air) sehingga ketika sumbat karetnya ditusuk, darah secara otomatis tertarik ke dalam

tabung. Beberapa ukuran tabung evacuated yang tersedia, dan pemegangnya dalam

berbagai ukuran untuk mencocokkan diameter tabung yang digunakan. Sebagian

besar laboratorium, menggunakan tabung evacuated yang berukuran 5 atau 7 ml

untuk pengumpulan spesimen darah orang dewasa. Namun untuk pasien anak

umumnya digunakan tabung ukuran (2-3ml) biasanya cukup mengandung darah atau

serum untuk memenuhi sebagian persyaratan untuk pemeriksaan dan akan

mengurangi jumlah darah yang diambil dari orang dewasa sebesar 40% sampai 45%

jika mereka digunakan untuk dewasa pasien. Tabung bisa bebas dari zat aditif atau

dapat juga mengandung aditif yang berfungsi sebagai antikoagulan, pengawet,

penguat koagulasi, atau sebagai fasilitator untuk memisahkan sel dari serum atau

plasma. Zat aditif specific yang terkandung dalam tabung ditunjukkan dengan warna

stopper karet (lihat tabel 2-1). Informasi label tabung harus diperiksa dalam berbagai

situasi di mana warna stopper tabung yang sama mungkin mengandung aditif yang

berbeda. Tabung evacuated sebaiknya tidak digunakan setelah tanggal kadaluwarsa

yang tertera,udah lewat masa nya mungkin dapat kehilangan kekuatan vaccum atau

efektivitas aditifnya. Tabung untuk prosedur khusus juga tersedia (misalnya, tabung

khusus untuk Westergren penentuan laju endap darah;. Bab.9)

TINDAKAN PENCEGAHAN BAHAYA BIOLOGIS

Perhatian khusus diperlukan untuk menghindari resiko infeksi dari berbagai

patogen pada semua aspek dari praktik laboratorium serta prosedur keselamatan kerja,

yang dijelaskan dalam bab 24, hal ini harus dilakukan saat pengambilan darah.

Operator harus mengenakan plastik disposibel atau sarung tangan karet sekali pakai.

Diharapkan juga untuk memakai pelindung apron atau gaun, serta jika diperlukan

menggunakan kacamata pelindung. Sikap waspada diperlukan untuk mencegah

cedera, terutama ketika menggunakan jarum suntik, jarum dan lancet. Jarum suntik,

jarum dan lancet yang telah digunakan tidak boleh digunakan kembali. Peralatan yang

bersifat re-usable harus disterilisasi setelah digunakan (Lihat Bab 24 dalam buku

Practical Haematology).

METODE SYRINGE (JARUM SUNTIK)

Pengumpulan spesimen darah dengan menggunakan jarum suntik melibatkan

penggunaan plastik atau kaca jarum suntik dan jarum yang diproduksi khusus untuk

digunakan dengan jarum suntik. jarum suntik kaca harus dihindari karena koagulasi

terinisiasi ketika kontak darah permukaan kaca diobati. Penggunaan jarum suntik

memungkinkan phlebotomist untuk mengontrol jumlah tekanan yang dibutuhkan

untuk mengeluarkan darah dari vena. ini sangat membantu dalam sulit untuk menarik

pasien atau pasien anak-anak atau dalam kasus-kasus ketika pembuluh darah kecil

harus digunakan. ukuran jarum suntik terkecil harus digunakan untuk volume

spesimen darah yang diperlukan untuk menghindari tekanan yang berlebihan. Selain

runtuh pembuluh darah, tekanan yang berlebihan dapat menyebabkan hemolisis,

sehingga menghasilkan spesimen darah yang tidak dapat diterima. Untuk koleksi

anak, jarum suntik 3ml atau tuberkulin dapat digunakan.

Jarum

pemilihan ukuran jarum tergantung pada ukuran dan kedalaman dari vena

pasien dan jumlah darah yang bisa ditarik. jarum ditunjuk oleh nomor gauge,

yang mengacu pada diameter dalam, atau bore jarum dan panjang. misalnya, jarum

21G1 memiliki sejumlah ukuran dari 21 dan 1 inci panjangnya dari ujung jarum

penyisipan ke dalam tabung jarum suntik. semakin tinggi gauge, diameter lebih kecil.

jarum yang are19 -23 mengukur biasanya digunakan untuk venipuncture rutin; 20 -22

jarum pengukur yang paling sering digunakan untuk orang dewasa, sedangkan 23

ukuran jarum dapat digunakan untuk vena pediatrik atau sulit. penggunaan jarum

pengukur tinggi telah dilaporkan sebagai penyebab hemolisis selama

venipuncture. Spesimen hemolyzed tidak bisa diterima untuk hematologi dan

sebagian besar uji laboratorium lain.

Ukuran panjang jarum yang dipilih adalah preferensi individu. panjang

yang paling sering digunakan adalah 1 dan 1,5 inci. Jarum pendek lebih mudah

Untuk mengontrol dan menyebabkan kecemasan kurang sabar. Untuk sistem

tabung dievakuasi, jarum yang tersedia untuk koleksi sampel tunggal dan multi. jarum

sampel multi-harus digunakan jika lebih dari satu tabung darah perlu dikumpulkan

untuk mencegah kebocoran darah ke pemegang jarum selama perubahan tabung.

jarum sampel tunggal atau kupu-kupu (bersayap infus set) jarum yang diproduksi

khusus untuk jarum suntik. adapter juga tersedia yang memungkinkan jarum kupu-

kupu untuk digunakan dengan standar tabung koleksi dievakuasi dan pemegang (lihat

gambar 2-1 dan 2-2). Pengaturan ini meningkatkan kontrol selama venipuncture sulit

dan memungkinkan pengisian langsung dari tabung pengumpul.

Antikoagulan

Ketika darah dikumpulkan dalam tabung kaca tanpa aditif, koagulasi biasanya

terjadi dan serum dapat dipisahkan dari sel darah dengan sentrifugasi berikutnya.

Namun, beberapa pemeriksaan laboratorium, termasuk yang dilakukan di

hematologi. Memerlukan darah utuh atau plasma, dalam hal antikoagulan

harus tercampur langsung dengan darah untuk mencegah pembekuan.

Antikoagulan yang paling umum digunakan untuk prosedur hematologi adalah

asam ethylenediaminetetraacetic (EDTA), natrium sitrat, dan heparin. Konsentrasi

yang tepat dari antikoagulan untuk volume darah diambil sangat penting, Dan

kesalahan yang signifikan dapat terjadi jika rasio darah ke antikoagulan tidak

benar.

EDTA (Ethylene Diamine Tetraacetic Acid)

Garam kalium dari EDTA adalah antikoagulan yang paling umum digunakan

dalam hematologi. Pembekuan darah dihambat oleh chelation atau mengikat ion

kalsium. Konsentrasi antikoagulan optimal adalah 1,5 mg / ml darah (lihat tabel 2-

2). Jumlah ini tidak memiliki efek buruk pada jumlah sel rutin dan

mempertahankan morfologi sel ketika film darah dibuat dalam waktu 2 jam dari

koleksi. Perlu dicatat bahwa mungkin ada tabung di pasar dengan lebih rendah,

konsentrasi EDTA tidak dapat diterima. di sisi lain, EDTA berlebihan menginduksi

sel darah merah (RBC) penyusutan, menyebabkan nilai hematokrit dan laju endap

darah menjadi palsu menurun. EDTA mencegah agregasi platelet dan karena itu

adalah antikoagulan pilihan untuk jumlah trombosit. Itu bukan antikoagulan

yang memuaskan untuk pengujian koagulasi karena menghambat reaksi fibrinogen-

trombin dan faktor V tidak stabil dalam kehadirannya

Natrium Sitrat

antikoagulan pilihan untuk kebanyakan pengujian hemostasis trisodium sitrat . plasma

sitrat mempertahankan labil faktor pembekuan V dan VIII lebih baik daripada

antikoagulan lain untuk studi agregasi platelet . spesimen plasma sitrat juga lebih

sensitif terhadap efek heparin dan karena itu lebih disukai untuk tes untuk memantau

terapi heparin . di masa lalu , baik natrium sitrat dan natrium oksalat digunakan

sebagai antikoagulan untuk pengujian hemostasis . keduanya menghambat koagulasi

dengan mengikat kalsium terionisasi , tetapi ketika oxalated plasma recalcified dalam

sistem tes, kompleks larut atau endapan yang terbentuk yang dapat mengganggu

deteksi titik akhir oleh instrumen yang mengukur perubahan densitas optik . untuk

alasan ini sodium oksalat tidak dianjurkan untuk pengujian hemostasis . natrium sitrat

tersedia dalam konsentrasi 3,2 % ( 0109 M ) OR 3,8 % ( 0129 M ) dalam tabung

koleksi dievakuasi . rasio darah ke antikoagulan sitrat sangat penting untuk hasil tes

koagulasi valid. rasio standar sembilan bagian dari darah ke salah satu bagian dari

antikoagulan ( 9:1) . rasio ini memuaskan untuk spesimen dengan jumlah yang relatif

meningkat dari sitrat terikat dalam campuran sitrat - plasma menyebabkan

perpanjangan palsu kali pembekuan , terutama untuk waktu protrombin ( PT ) dan

waktu tromboplastin parsial ( PTT ) tes . hal ini terjadi karena jumlah standar kalsium

digunakan untuk recalsify plasma dalam prosedur ini tidak memadai untuk

menonaktifkan sitrat terikat berlebihan selain memulai pembekuan spesimen.

HEPARIN

Heparin adalah mukopolisakarida asam yang bertindak dengan antitrombin III

dan menghambat reaksi dari semua protease serin koagulasi . konsentrasi optimal

adalah 15 sampai 20 U / ml darah . Heparin tidak memuaskan untuk film darah

preparationecause menyebabkan distorsi morfologi trombosit dan leukosit . di

samping . sebuah colorition kebiruan di latar belakang film bernoda darah dengan

noda Romanowsky akan terjadi karena pH -nya . heparin adalah antikoagulan pilihan

untuk uji kerapuhan osmotik jika darah defibrinated tidak digunakan dan untuk uji

retensi paltelet . Namun , darah heparinized tidak boleh digunakan untuk studi

koagulasi karena heparin ini efek penghambatan pada trombin . heparin juga dapat

menyebabkan kesalahan dalam menghitung sel otomatis . misalnya , trombosit dari

beberapa individu akan mengaglutinasi di hadapan heparin .

Pertimbangan Pemantapan Mutu – venipuncture

1) Pantangan puasa

tidak diperlukan untuk prosedur hematologi rutin , namun perlu dicatat bahwa film

darah yang terbuat dari darah yang diambil dari orang tak lama setelah ia telah makan

lemak akan memiliki lubang kecil di seluruh film yang disebabkan oleh kilomikron

2) Prosedur Persiapan Pasien

proses mengeluarkan darah menyebabkan stres dan kecemasan pada banyak pasien ,

yang dapat mengubah nilai-nilai uji laboratorium tertentu termasuk ketinggian sel

darah putih ( WBC ) count. Phlebotomist karena itu harus berusaha untuk meredakan

ketakutan tersebut dengan berkomunikasi dengan pasien secara tenang, profesional

, dan meyakinkan . kepercayaan pasien dapat diperoleh dengan meminta kerjasama.

bila memungkinkan. pasien harus diyakinkan bahwa meskipun tusukan itu

sendiri mungkin sedikit menyakitkan, itu akan menjadi lebih cepat.

Posisi pasien

Posisi pasien harus dicatat pada permintaan karena nilai caount darah dapat bervariasi

tergantung pada apakah pasien duduk atau berbaring. misalnya, hematokrit dapat

menurun rata-rata 8% karena hemodelution ketika seorang pasien berbaring.

sebaliknya, ketika seorang pasien turun dari tempat tidur, hemokonsentrasi terjadi.

jenis yang sama ini variasi terjadi dengan jumlah WBC.

Pemilihan lokasi

Secara umum vena dari fossa antecubital akan digunakan untuk venipuncture rutin.

ketika memilih situs, beberapa faktor harus dipertimbangkan. Daerah dengan

hematoma, luka bakar, bekas luka, atau edema harus dihindari. koleksi dari pembuluh

darah di lengan di sisi mana mastektomi dilakukan adalah kontraindikasi karena

kemungkinan lymphostasis. Jika seorang pasien yang menerima infus (iv) infus,

spesimen harus diambil dari lengan yang berlawanan. Situasi tertentu dapat

menghalangi koleksi dari lengan yang berlawanan. dalam situasi seperti ini, darah

harus diambil di bawah situs iv dari vena selain satu dengan garis iv dan setelah

cairan iv telah dihentikan selama 2 menit. Penghentian iv hanya boleh dilakukan oleh

perawat pasien atau dokter. 5 ml darah harus dikumpulkan dan dibuang sebelum

pengambilan spesimen untuk menghindari potensial pengenceran sampel dengan

cairan iv. bukti menunjukkan bahwa spesimen darah dapat diterima untuk hematologi

dan profil biokimia serum untuk semua analit kecuali glukosa dan fosfor dapat ditarik

di bawah garis iv selama infus atau dari jarum iv setelah infus iv telah dihentikan

selama 2 menit dan sejumlah kecil darah pertama dibuang. Pada semua kasus ketika

mengambil spesimen dari bawah situs iv, phlebotomist harus mematuhi prosedur yang

direkomendasikan oleh laboratorium individu. Dari sisi mana spesimen diambil harus

dicatat pada formulir tes permintaan, Vena yang sulit untuk menemukan dapat dibuat

lebih menonjol dengan lembut memijat lengan dari pergelangan tangan ke siku dan

pemanasan atau menekan situs tusukan. Tangan yang kuat memompa oleh

pasien, namun dapat mengakibatkan hemokonsentrasi dan harus dihindari.

Penggunaan Tourniquet

Beberapa bentuk torniket tersedia. yang paling umum digunakan adalah pice lentur

lateks datar. torniket velcro, seraket, dan manset tekanan darah adalah jenis

tambahan. Yang seraket (Propper perusahaan manufaktur, inc, long island, NY)

terbuat dari kain dan dijamin menggunakan sabuk pengaman seperti alat (gambar 2-

1). Hal ini memungkinkan phlebotomist untuk sebagian melepaskan tekanan

vena, mencegah hemokonsentrasi, tanpa mengeluarkan tourniquet dari lengan

pasien. Tourniquet dapat dengan mudah diperketat jika diperlukan. Tourniquet tidak

boleh dibiarkan selama lebih dari 1 menit karena penggunaan yang terlalu lama

dapat menyebabkan hemokonsentrasi dan peningkatan aktivitas fibrinolitik. Jika

tourniquet yang tersisa di lengan selama lebih dari 1 menit ketika menemukan

vena, itu harus dihapus dan diterapkan kembali setelah 2 menit telah berlalu.

untuk menghindari aplikasi yang berkepanjangan, boleh dilakukan pengulangan

kembali tourniquet hanya setelah situs tersebut telah dibersihkan dan hanya sebelum

penyisipan jarum. Selama pengumpulan tourniquet harus dihapus sesegera mungkin

setelah aliran darah yang memadai ke dalam perangkat koleksi telah ditetapkan.

Aseptik sisi venipuncture

Sisi venipuncture harus dibersihkan secara menyeluruh dengan alkohol persiapan pad

komersial atau bola kapas atau kasa direndam dalam 70% isopropanol.

Mengeringkan area dengan kasa steril atau dengan udara. Sisa alkohol di lokasi

venipuncture, selain dapat menyebabkan rasa sakit pada pasien, juga dapat

menyebabkan hemolisis.

Pengumpulan Spesimen

Tabung pengumpul evacuated biasanya tidak akan mengisi sepenuhnya, sehingga

sebagian terisi kecil tetap. Namun, tabung harus diisi sebanyak vakum mereka

memungkinkan untuk menghindari rasio yang tidak tepat darah ke aditif. Tabung

dievakuasi mengandung antikoagulan atau addtives lain harus dicampur segera

(terutama jika K2EDTA digunakan) setelah pengangkatan dari pemegang atau setelah

mengisi dengan jarum suntik dengan lembut inversi 5 sampai 10 kali. Jika beberapa

tabung dikumpulkan, satu tabung bisa dicampur sementara yang lain hanya diisi

dengan darah. Tidak mencampur atau kocok kuat-kuat karena dapat

menyebabkan hemolisis. Ketika mengumpulkan beberapa tabung, penting untuk

melakukannya dalam urutan yang benar. urutan sebagai berikut. urutan berikut ini:

1) tabung kultur darah steril

2) tabung nonadditive

3) tabung yang berisi antikoagulan (mengumpulkan spesimen sitrat pertama diikuti

oleh heparin, EDTA, dan Oksalat atau fluoride

studi telah menyarankan bahwa urutan menarik dari beberapa tabung aditif ini penting

karena aditif dalam satu tabung dapat mencemari spesimen dikumpulkan ke dalam

tabung aditif berikutnya. sumber kesalahan di venipunctures diringkas dalam tabel 2-3

Bila menggunakan jarum suntik pertimbangan dasar yang sama seperti untuk metode

tabung dievakuasi berlaku. Namun, darah harus ditransfer dari syiringe ke tabung

dievakuasi. untuk non-hemostasis menguji jarum suntik dengan hati-hati

dimasukkan melalui tabung stopper, memungkinkan vakum untuk mengambil darah

perlahan-lahan ke dalam tabung.

Tabel. 2-3

Sumber Kesalahan Dalam Venipuncture

1 . kesalahan dalam persiapan venipuncture

- Identifikasi pasien yang tidak benar

- Kegagalan kepatuhan pasien terhadap pembatasan diet

- Tidak menenangkan pasien sebelum pengumpulan darah

- Penggunaan peralatan yang tidak tepat dan persediaan

- Metode tidak pantas pengumpulan darah

2 . kesalahan dalam prosedur venipuncture

- tidak mengeringkan area tusukan setelah membersihkan

dengan alkohol

- Jarum bevel menyisipkan sisi

- Penggunaan jarum yang terlalu kecil, menyebabkan hemolisis

- Venipuncture di area yang tidak diperbolehkan (ex: diatas iv)

- berkepanjangan aplikasi tourniquet

- salah order tabung draw

- tidak mencampur darah dalam tabung berisi aditif segera

- Menarik kembali jarum suntik plunger terlalu tegas

- tidak melepaskan tourniquet sebelum penarikan jarum

3 . kesalahan setelah venipuncture selesai

- Kurang penekanan ke area bekas venipuncture

- Getaran kuat dari anticoagulan spesimen darah

- Memaksa darah melalui jarum suntik ke tabung

- Mislabeling tabung

- Kesalahan pelabelan yang tidak preventif penyakit menular

- Kesalahan input tanggal, waktu , dan inisial pada permintaan

- Transportasi lambat spesimen ke laboratorium

Darah tidak harus dipaksa melalui jarum suntik karena hal ini dapat menyebabkan

hemolisis. Jika tabung non dievakuasi digunakan, jarum suntik dan tabung cap

dikeluarkan dan darah dibiarkan mengalir perlahan di sisi tabung. karena ada

apotensial untuk aktivasi koagulasi dalam jarum suntik, urutan mengisi tabung

dievakuasi setelah koleksi jarum suntik berbeda dari yang diikuti ketika mengisi

tabung langsung menggunakan jarum dan dudukan. Dalam kasus terakhir, perangkat

pengumpulan kultur darah diisi pertama diikuti dengan antikoagulan yang

mengandung tabung dalam urutan yang tercantum di atas. Akhirnya, mengisi setiap

tabung non antikoagulan yang mengandung yang akan diproses untuk koleksi serum.

PENGUMPULAN SPESIMEN METODE TUSUKAN KAPILER

Pertimbangan Jaminan Kualitas - Tusukan Kapiler

Darah vena lebih disukai untuk kulit atau spesimen kapiler tusukan untuk sebagian

besar tes hematologi. Namun, ada beberapa situasi di mana tusukan kulit harus

digunakan untuk mendapatkan spesimen darah. bayi, terutama borns baru, memiliki

volume darah lebih kecil dibandingkan orang dewasa, menggambar darah dengan

venipuncture rutin setiap hari dapat dengan cepat menyebabkan anemia rumah sakit-

diinduksi. tusuk kulit juga merupakan sarana yang jauh lebih aman pengumpulan

darah. venipuncture seringkali sulit dan bahkan berbahaya bila dilakukan pada anak-a

nak sangat kecil dan bayi. untuk orang dewasa, tusuk kulit mungkin diperlukan karena

obesitas, luka bakar, atau pembuluh darah yang sangat kecil atau rusak parah, atau

ketika cairan iv mengalir ke satu-satunya vena diakses. tusuk kulit juga digunakan

untuk menyimpan pembuluh darah pasien yang menerima kemoterapi dan pada orang

tua bila memungkinkan. darah yang dikumpulkan oleh tusukan kulit merupakan

campuran dari kapiler, vena, dan darah arteri dan juga berisi interstitial dan cairan

intraseluler, oleh karena itu, nilai-nilai laboratorium diperoleh mungkin berbeda dari

yang diperoleh pada spesimen vena. misalnya, jumlah eritrosit, hematokrit,

hemoglobin, dan platelet yang rendah pada tusukan kulit harus dicatat pada daftar

permintaan. mengacu pada referensi standar untuk prosedur yang tepat

Sumber Kesalahan

Spesimen hemolyzed merupakan sumber umum kesalahan, terutama dalam spesimen

darah yang diperoleh dari tusukan kulit bayi. eritrosit bayi lebih rentan dibandingkan

orang dewasa, dan nilai-nilai hematokrit mereka jauh lebih tinggi, sehingga risiko

hemolisis agak lebih besar. sumber penting lainnya dari kesalahan termasuk

kegagalan untuk mengeringkan situs sepenuhnya setelah membersihkan dengan

alkohol, tusukan kulit terlalu dalam, kegagalan untuk menghapus penurunan pertama

darah, memijat kuat atau memerah susu dari daerah menyebabkan hemolisis, dan

menangkap disengaja gelembung udara dalam tabung kapiler atau unopette (Becton

dickinson, rutherford, NJ) pipet yang digunakan untuk pengumpulan jumlah spesimen

yang tepat (misalnya, untuk menghitung trombosit) aliran darah yang memadai untuk

pengumpulan volume spesimen yang diperlukan. meremas berlebihan bisa

mencairkan spesimen, dengan cairan jaringan sehingga hasil tes tidak valid. juga

harus berhati-hati untuk menggunakan lanset tidak lebih dari 2,4 mm untuk tusukan

tumit bayi untuk menghindari risiko osteomyelitis

sejumlah perangkat yang tersedia saat ini yang memungkinkan jumlah yang lebih

besar dari darah kapiler yang akan dikumpulkan yang dapat dengan mudah

dikumpulkan dalam tabung kapiler atau Unopettes; ini termasuk microtainer dan

microvette, capiject dan samplette. perangkat ini mungkin aditif bebas atau

mengandung aditif mirip dengan tabung koleksi dievakuasi. saat menggunakan

perangkat ini sangat penting untuk mengikuti petunjuk produsen tepat untuk mengisi

volume maksimum dan minimum dan pencampuran. jika instruksi ini tidak diikuti,

hasil tes kemungkinan akan berubah karena rasio yang tidak tepat aditif untuk

spesimen atau antikoagulan tidak efektif urutan imbang juga penting whe

mengumpulkan spesimen oleh punture kulit. spesimen untuk jumlah trombosit

pengguna harus dikumpulkan terlebih dahulu. film darah perifer dapat dilakukan

berikutnya, jika diperlukan, diikuti dengan pengisian perangkat antikoagulan

mengandung. EDTA anticoagulated tabung harus diisi terlebih dahulu, diikuti dengan

tabung antikoagulan lain yang mengandung. kontainer yang akan diproses untuk

koleksi serum harus diisi lalu.

PENGAMBILAN SPECIMEN DARI kateter

Phlebotomist paling tidak mengumpulkan sediaan darah dari kateter berdiamnya.

Namun, phlebotomist harus menyadari tuntutan khusus untuk koleksi tersebut untuk

membantu anggota lain dari tim kesehatan memberikan laboratorium dengan

spesimen yang cocok . umumnya volume tertentu darah harus dibuang (volume

buangan ) sebelum mengisi tabung spesimen .

penelitian telah menunjukkan perubahan yang signifikan dalam hasil tes hematologi

ketika volume membuang kurang dari jumlah yang optimal dianjurkan. hematokrit

secara signifikan lebih tinggi dan lebih rendah ketika WBC menghitung volume

membuang kurang dari empat kali kateter volume ruang mati. Dalam hasil studyPTT

lain inversly sebanding dengan membuang volum dihapus dari jalur arteri heparinized

. volume membuang tergantung pada panjang dan diameter kateter. Mengumpulkan

darah dari kateter untuk spesimen hemostasis tidak dianjurkan. Namun jika itu tidak

dapat dihindari, mungkin perlu untuk membuang sebanyak 30 ml, terutama jika

waktu trombin pembekuan ( Bab.49 ) akan ditentukan.

PENGUMPULAN SPESIMEN UNTUK PEMERIKSAAN KOAGULASI

Pertimbangan Pemantapan Mutu

Bagian ini berfokus pada aspek proses mengeluarkan darah yang secara khusus

berlaku untuk mendapatkan dan memproses spesimen darah untuk hemostasis.

Venipuncture nontraumatic adalah tujuan setiap saat spesimen darah yang

dikumpulkan, tetapi penting untuk mendapatkan hasil yang valid dari pengujian

hemostasis. Perhatian utama adalah penghapusan aktivasi prematur dari proses

koagulasi sebelum spesimen dapat dievaluasi dalam prosedur pengujian tersebut.

penyebab aktivasi tersebut termasuk kontaminasi spesimen dengan tromboplastin

jaringan, kontainer, suhu yang tidak tepat, dan hemolisis.

Tromboplastin jaringan adalah gumpalan-mengaktifkan zat ampuh ditemukan dalam

cairan yang melarikan diri dari sel terluka dan ruang jaringan. ketika jaringan

mengalami trauma atau pembuluh darah terganggu atau dipotong, zat ini

mengaktifkan koagulasi jalur ekstrinsik (chap.47) dan menyebabkan hasil tes

erronous. bahkan sedikit kontaminasi dengan tromboplastin jaringan sudah cukup

untuk mempengaruhi hasil. hemolisis adalah pelepasan hemoglobin dari sel darah

merah pecah ke dalam plasma. sel darah merah hemolyzed bertindak seperti

tromboplastin jaringan untuk mengaktifkan faktor pembekuan plasma. ketika

hemolisis terjadi dalam darah, masalah teknis dengan proses pengumpulan biasanya

penyebabnya. efek permukaan kaca pada hemostasis yang terkenal. faktor kontak

(prekalikrein-fletcher, XII dan XI) diaktifkan prematur melalui kontak dengan kaca,

menyebabkan pemendekan waktu koagulasi tes yang digunakan untuk menilai baik

intrinsik dan ekstrinsik koagulasi jalur. bahan dianjurkan untuk mengumpulkan,

mengangkut, dan menyimpan spesimen darah untuk pengujian hemostasis adalah

plastik, polystyrene, atau kaca berlapis silicon.

Venipuncture yang buruk dapat menyebabkan hasil tes yang salah. Fakta bahwa

darah yang diperoleh dengan teknik pengumpulan yang salah, sering tidak

memuaskan untuk studi biokimia atau sitologi dapat menyebabkan phlebotomist

untuk percaya bahwa hal yang sama berlaku untuk studi untuk pembekuan darah .

idealnya , seseorang yang akrab dengan tes koagulasi harus mendapatkan darah untuk

studi pembekuan , atau anggota dari laboratorium koagulasi harus mengawasi koleksi.

Pilihan lain akan mengambil darah tersebut secara terpisah daripada sebagai bagian

dari koleksi besar untuk tes lainnya . karena pendekatan ini sering tidak praktis , dapat

diterima untuk spesimen untuk pengujian koagulasi yang bisa ditarik oleh personel

terlatih dan sebagai bagian dari kelompok spesimen asalkan standar dan pedoman

untuk koleksi tersebut khusus diikuti . disarankan agar darah kapiler dihindari untuk

metode tradisional pengujian koagulasi . kadang-kadang Namun , hanya darah kapiler

dapat diperoleh dari pasien . tes PT dilakukan pada darah seperti mungkin dapat

diandalkan disediakan spesimen diperoleh dengan cepat dan antikoagulan

immediatelly . kemajuan terbaru dalam pengujian perangkat samping tempat tidur

memungkinkan penggunaan spesimen tusuk kulit untuk pengujian koagulasi . saat

menggunakan perangkat ini petunjuk dari produsen harus diikuti

Oklusi vena atau stasis dapat terjadi selama pengumpulan spesimen jika tourniquet

diterapkan terlalu ketat atau untuk jangka waktu (lebih dari 1 menit). ketika aliran

arteri atau aliran balik vena terganggu, ada aktivasi sistem fibrinolitik dan faktor

pembekuan. untuk meminimalkan stasis tersebut dan hemokonsentrasi yang juga

berkembang, tourniquet harus dibebaskan segera setelah vena yang dimasukkan dan

darah mulai mengalir ke perangkat koleksi,

Peralatan

  Banyak jenis torniket dapat digunakan, tetapi karena peningkatan stasis adalah

kekhawatiran, yang tourniquet seraket (lihat di atas dan ara 2-1) atau sejenis

perangkat dianjurkan. penggunaan ukuran jarum yang tepat adalah penting, amall

jarum pengukur yang lebih mungkin menyebabkan hemolisis. ketika mengumpulkan

darah untuk tes koagulasi, jarum 20-gauge ini paling sering digunakan, tetapi ketika

lebih dari 20 ml darah yang akan ditarik, a 19 - gauge jarum dapat preffered. untuk

pasien anak atau orang-orang dengan pembuluh darah kecil, ukuran yang lebih kecil

(21 gauge) mungkin dipilih. jarum harus dari jenis sekali pakai dan dilapisi dengan

silikon polimer. jarum ini membuat penetrasi kulit dan masuk vena halus dengan rasa

sakit yang minimal, trauma, atau aktivasi faktor koagulasi. spesimen untuk tes

koagulasi harus dikumpulkan dalam tabung dievakuasi dilapisi silikon atau suntik

plastik untuk meminimalkan efek dari aktivasi kontak koagulasi. tabung dievakuasi

dilapisi silikon yang mengandung sitrat antikoagulan trisodium dapat digunakan

setiap kali sitrat plasma diperlukan.

Pengumpulan sampel

Venipuncture cepat bersih mencegah tromboplastin jaringan atau udara masuk

spesimen. jika ada kesulitan dalam melakukan venipuncture itu, upaya harus

dibatalkan, situs baru harus digunakan. untuk tes koagulasi umum seperti tes PT dan

PTT, koleksi tabung dievakuasi rutin memuaskan selama kontaminasi dengan cairan

jaringan dihindari. darah untuk pengujian koagulasi tidak boleh tabung pertama

dikumpulkan karena tromboplastin jaringan dari tusukan awal dapat mencemari

spesimen dan membatalkan hasil koagulasi. jika hanya tes koagulasi yang

diperintahkan, "teknik dua Syring" dijelaskan di bawah ini dianjurkan.

Teknik 2 spuit

Metode dua jarum suntik koleksi darah meminimalkan pengenalan tromboplastin

jaringan spesimen. istilah ini mengacu pada praktek menggambar sejumlah kecil

darah ke dalam jarum suntik atau tabung dievakuasi dan perubahan untuk jarum

suntik kedua atau tabung dievakuasi ditentukan untuk tes koagulasi yang akan

dilakukan. ini bilasan jarum cairan jaringan yang mungkin telah diperkenalkan selama

venipuncture tersebut. Jarum kupu-kupu dianjurkan bukannya pakai standar karena

penggunaan jarum kupu-kupu kurang cenderung mengakibatkan penghapusan

disengaja jarum dari vena saat beralih perangkat pengumpulan. penggunaan jarum

kupu-kupu juga dianjurkan ketika darah harus ditarik langsung ke jarum suntik yang

mengandung antikoagulan atau beberapa solusi beracun lainnya, seperti formalin

digunakan dalam beberapa prosedur untuk mengevaluasi hiperaktif platelet. Pipa

panjang yang menghubungkan mencegah infus disengaja solusi tersebut ke dalam

vena, fasilitas prosedur dan mengurangi pissibility disengaja tusukan jarum untuk

phlebotomist.

Prosedur menggunakan tabung dievakuasi

Untuk spesimen koagulasi, sistem dievakuasi pengumpulan darah adalah lebih baik

untuk jarum suntik karena darah berjalan langsung dari vena ke tabung dan segera

dicampur dengan antikoagulan, sehingga mengurangi kemungkinan spesimen beku

(gbr. 2-2). Ini merupakan faktor penting ketika mengumpulkan darah untuk

pemeriksaan hemostatik yang mencakup evaluasi trombosit dan faktor pembekuan

dan memerlukan sebanyak 30 sampai 50 ml darah. jika spesimen untuk pengujian

selain hemostasis yang diperlukan, urutan disarankan menarik untuk tabung

dievakuasi dibahas sebelumnya harus diikuti. Luer adaptor multi-sampel (fig 2-1)

harus digunakan. setelah jarum masuk vena, tourniquet dilepaskan dan sistem

dibersihkan dari tromboplastin jaringan dengan menggambar 5 ml darah ke

dalam tabung dievakuasi non-aditif. darah ini dapat digunakan untuk tes lain yang

membutuhkan serum, atau mungkin dibuang. spesimen untuk tes yang

membutuhkan palsma citrated diambil berikutnya. Jika tes fungsi platelet yang

diperintahkan, bevel jarum masih dalam vena, pipa yang terjepit untuk

menghentikan aliran darah, pemegang jarum dan Luer adaptor dikeluarkan dari

adaptor kupu-kupu tabung, dan jarum suntik plastik terpasang. Darah ditarik ke dalam

jarum suntik ini dan dibagikan ke tabung yang sesuai.

Prosedur menggunakan jarum suntik

Ketika spesimen yang sedang ditarik langsung ke jarum suntik, tourniquet dilepaskan

dan sekitar 5 ml darah ditarik ke dalam jarum suntik pertama setelah vena

dimasukkan. sebelum jarum suntik yang diaktifkan, kasa steril ditempatkan di bawah

hub jarum untuk menyerap darah yang mungkin melarikan diri. Dengan jarum di

pembuluh darah, jarum suntik pertama dengan hati-hati terlepas dari jarum dan

diganti dengan jarum suntik kedua. Untuk pengujian koagulasi darah yang masuk ke

dalam alat suntik ini dan ditransfer segera ke dalam tabung yang sesuai.

untukmenghindari gelembung udara dan buih dari spesimen, jarum harus aman fifted

pada jarum suntik. Ketika darah sedang disedot dengan jarum suntik, plunger harus

ditarik pada tingkat yang sama dengan aliran darah. Jika angka ini lebih dari yang

dibutuhkan untuk aspirasi darah, gelembung udara akan masuk jarum suntik dan

menyebabkan hemolisis. Aspirasi dipaksa juga dapat menyebabkan pembuluh darah

runtuh dan mengakibatkan pelepasan tiba-tiba gas dari sel darah merah, juga

mengakibatkan hemolisis. karena ada risiko memerciki darah menggunakan teknik

ini, pelindung wajah dianjurkan.

Memindahkan Dan Pencampuran Spesimen

Untuk menghindari buih dan hemolisis dari spesimen, darah tidak boleh dikeluarkan

melalui jarum. segera setelah venipuncture selesai, jarum harus aman dan hati-hati

dihapus dari jarum suntik. darah secara perlahan diusir ke dalam tabung koleksi

dengan memungkinkan untuk lari ke sisi tabung. spesimen dipindahkan ke tabung

yang mengandung antikoagulan harus tutup dan dengan hati-hati dicampur dengan

lembut membalik tabung 5 sampai 10 kali. darah diambil langsung ke tabung

dievakuasi sebagian dicampur dengan antikoagulan ketika darah memasuki tabung,

tetapi untuk memastikan pencampuran yang menyeluruh, tabung harus lembut

terbalik 5 sampai 10 kali segera setelah pengangkatan dari pemegang jarum.

Pengolahan Dan Penyimpanan Spesimen Hemostasis

Perubahan yang terjadi setelah rentang darah dikumpulkan dari aktivasi permukaan

koagulasi (yang mengakibatkan mempersingkat waktu pembekuan) peningkatan

labilitas faktor V dan VIII (yang dapat memperpanjang waktu pembekuan).

perubahan tersebut menjadi sumber signifikan dari kesalahan dalam pengujian jika

tidak ada tindakan yang dilakukan untuk mengurangi dan mengendalikan mereka saat

memproses dan menyimpan specimen.

Pengaruh pH

Perubahan ph spesimen, dimediasi oleh hilangnya karbondioksida, dapat

mempengaruhi hasil dengan menyebabkan perpanjangan waktu pembekuan. karbon

dioksida hilang, pH meningkat specimen meningkat . Solusi sitrat yang terkandung

dalam buffer tabung dievakuasi melindungi spesimen terhadap kehilangan tersebut

untuk jangka waktu tertentu. juga, sel darah merah memiliki efek penyangga yang

membantu menstabilkan pH spesimen darah. untuk mempertahankan efek ini,

spesimen harus tetap dalam tabung yang belum dibuka jika pengujian tidak

dilakukan segera. Spesimen yang normal dikumpulkan dalam tabung dievakuasi dan

disimpan dibuka pada suhu kamar selama 6 jam tidak menunjukkan perubahan

signifikan dalam PT atau hasil PTT.

Pengaruh Suhu

Jika spesimen yang tersisa pada suhu kamar untuk waktu yang panjang (lebih dari 6

jam), faktor V dan VIII cenderung memburuk. di sisi lain, faktor VII dan XI

cenderung prematur diaktifkan pada suhu lemari es (4derajat celcius). Namun, untuk

tes koagulasi umum seperti PT, spesimen cukup stabil hingga 12 jam dikumpulkan

dalam buffered natrium sitrat.

Sentrifugasi

Untuk sebagian besar pengujian koagulasi, trombosit plasma miskin (PPP)

diperlukan. PPP dibuat dengan pemusingan darah antikoagulan pada 2000x g selama

10 menit. plasma harus segera dihapus dengan plastik atau dipipet dan disimpan

dalam plastik tutup atau tabung berlapis silikon berlapis silikon. hanya atas tiga

perempat dari lapisan plasma harus aspireted. untuk beberapa tes khusus, sentrifugasi

spesimen pada suhu 2-4°C disarankan. Untuk proses ini, sentrifus didinginkan

atau centrifuge kecil yang ditempatkan dalam lemari es diperlukan.

Efect penyangga sel darah merah hilang setelah spesimen disentrifugasi dan plasma

terkena udara. Pemeriksaan harus segera dilakukan pada spesimen disentrifugasi, atau

plasma harus disimpan pada suhu 4°C untuk sementara waktu tidak melebihi 2

jam.

Sampel Beku

Spesimen harus tidak dibekukan apabila pengujian dapat dilakukan dalam waktu 2

jam setelah pengumpulan. jika pembekuan diperlukan, hal itu harus dilakukan dengan

cepat pada suhu -20°C atau lebih rendah. pembekuan lambat menyebabkan

partikel es untuk membentuk yang mungkin denaturasi protein pembekuan. jika benar

beku, fibrinogen stabil setidaknya selama 4 jam setelah thawing dan bertahan

refreezing dan pencairan

Spesimen Persiapan Untuk Pemeriksaan Fungsi Platelet

Pengambilan

Hemolisis harus dihindari di alltimes karena sel darah merah mengandung adenosin

difosfat (ADP), Yang jika dilepaskan ke plasma, prematur dapat mengaktifkan

trombosit. pH spesimen sangat penting dan paling baik dikendalikan dengan Buffered

natrium sitrat antikoagulan.

Sentrifugasi

Spesimen yang dikumpulkan untuk studi fungsi trombosit (Bab.56) harus segera

diproses. Untuk mempersiapkan platelet kaya-plasma (PRP), spesimen anti koagulan

disentrifugasi pada 60 dan 100 xg selama 10 menit pada suhu kamar. plasma adalah

removex segera dengan plastik atau dilapisi silikon pipet dan dipindahkan ke tabung

reaksi tutup atau dilapisi silikon. kontaminasi sel darah merah harus dihindari dengan

menghapus hanya sebanyak PRP yang diperlukan dari bagian atas spesimen. studi

agregasi platelet juga membutuhkan PPP. ini diperoleh recentrifuging spesimen

tersisa. untuk beberapa tes fungsi platelet, seperti beta-thromboglobulin (beta TG) dan

faktor trombosit 4 (PF4), spesimen harus disentrifugasi pada 2-4°Celcius

Pengaruh Waktu

Trombosit yang stabil dan paling responsif antara 30 menit dan 3 jam setelah darah

diambil. Setelah itu, fungsi trombosit berkurang secara signifikan dan hasil tes tidak

dapat diandalkan. Respon platelet terhadap berbagai agen diagregasi berbeda dan

bervariasi sebagai fungsi waktu. Pengujian agregasi ristocetin harus dilakukan segera

setelah spesimen diproses, karena respon trombosit untuk ristocetin menurun sebagai

ph perubahan plasma. Di sisi lain, agregasi dengan epinefrin harus dilakukan terakhir

karena respon trombosit untuk agen ini terus-menerus meningkat dengan waktu.

Agregasi konsisten atau maksimal dengan epinefrin tercapai setelah prp telah di ruang

suhu untuk tentang 60 menit

Pengaruh Suhu

suhu penyimpanan PRP disiapkan untuk studi functiion platelet memiliki pengaruh

yang signifikan pada tingkat dan derajat respon trombosit dalam tes. platelet disiapkan

untuk studi agregasi dan disimpan pada suhu kamar lebih sensitif terhadap berbagai

agen diagregasi dari trombosit disimpan pada 37 derajat celcius. penyimpanan

trombosit pada suhu rendah (0-4 derajat celcius) meningkatkan kecenderungan untuk

agregat platelet spontan. karena variabilitas aktivitas platelet pada suhu ini, spesimen

dikumpulkan dan dipersiapkan untuk studi fungsi platelet, agregasi platelet

khususnya, harus tetap pada suhu kamar sampai pengujian

Spesimen Defibrinated

Tes hematologi tertentu, seperti kerapuhan osmotik (BAB.17) dan uji serum asam

(BAB.19), memerlukan spesimen defibrinated. defibrination melibatkan penghapusan

fibrin dari spesimen darah secara keseluruhan. te phlebotomist harus mempersiapkan

spesimen Defibrinated di samping tempat tidur pasien sebelum darah diperbolehkan

untuk membeku. segera setelah venipuncture menggunakan jarum suntik, seluruh

darah lembut ditambahkan ke labu erlenmeyer yang berisi manik-manik kaca atau

klip kertas. setelah kasa atau kapas ditempatkan di bagian atas botol untuk mencegah

spesimen ontamination, labu diputar selama sekitar 10 menit sampai bads (atau klip)

ditutupi dengan fibrin dan tidak lagi membuat suara berderak. untuk beberapa tes

tabung steril dan manik-manik yang diperlukan.

PERSIAPAN SEDIAAN APUS PREPARAT DARAH

1. Panduan Film darah persiapan:

- Metode coverslip

- Teknik wedge

2. Apus darah otomatis

3. Buffycoat persiapan

- Teknik mikrohematokrit

- Evaluasi persiapan buffycoat

- Cytocentrifuged buffycoat

4. Artefak dari persiapan film darah

5. Pewarnaan film darah

- Noda Romanowsky

- Metode pewarnaan manual

- Metode pewarnaan otomatis

6. Kriteria untuk noda yang baik

7. Masalah noda troubleshooting

- fiksasi

- pewarnaan

- Bilas atau mencuci

- pengeringan

- Noda endapan

Preparasi Blood film Manual (Clinical Hematology-Lippincolt 2nd Edition)

A. Metode Coverslip

Kesulitan untuk melakukan spreading untuk tetesan darah diantara 2 coverslip kaca

telah dicegah dengan metode coverslip untuk pemeriksaan rutin sediaan darah tepi.

Namun teknik tersebut digunakan secara luas untuk persiapan pemeriksaan sumsum

tulang.

Keuntungan dan Kerugian

Salah satu keuntungan yang penting pada persiapan dengan coverslip adalah

pendistribusian leukosit superior. Selain itu, pemeriksaan hitung jenis leukosit

dikerjakan pada preparat coverslip dan sangat jarang terjadi kesalahan oleh karena

distribusi leukosit yang kurang.

Terdapat beberapa kerugian, salah satunya yaitu kesulitan dalam mempelajari

tekniknya. Kedua, kesulitan menjamin darah terdistribusi merata, coverslip harus

dibersihkan secara manual dari kotoran, debu, minyak, dan bekas sidik jari. Ketiga,

kesulitan dalam melabel, mengirim dan melakukan pengecatan pada kaca coverslip

yang kecil dan mudah pecah. Coverslip tersebut harus diletakkkan pada kaca slide

ukuran 3x1 inch untuk pemerikaaan mikroskopik. Keempat, kedua coverslip yang

digunakan untuk membuat film pada metode ini harus tepat terpasang , digunakan

untuk estimasi jumlah trombosit, karena trombosit bisa tidak terdistribusi merata

diantara 2 coverslip. Yang terakhir tidak ada area spesifik untuk memeriksa sel yang

jarang ditemukan.

Teknik

1. Pegang Coverslip No 1,5 yg bersih (22x22 mm) pada dua sudut yang berdekatan

diantara ibujari dan jari telunjuk tangan yang sama.

2. Tempatkan tetesan kecil darah (kira-kira diameternya 2mm) pada bagian pusat dari

permukaan atas coverslip. Tempatkan coverslip bersih lainnya pada puncak arah

silang-menyilang sehingga kedua coverslip menyerupai bintang dengan 8 titik

(Gambar dibawah ini). Catatan jika menggunakan darah kapiler, tetesan darah yang

keluar pertama harus dibersihkan / dilap, kemudian gunakan tetesan darah yang masih

segar pada coverslip. Hindari memegang dengan tangan. Letakkan coverslip tersebut

pada puncak dari coverslip lainnya untuk membuat bintang dengan 8 titik seperti yang

telah dijelaskan di atas.

3. Sebaiknya tetesan darah dimulai dengan menyebar ke segala arah oleh aktivitas

kapiler. Ketika penyebarannya hampir komplit, tarik kedua coverslip dengan lembut

ke arah lateral secara bersamaan agar terpisah (gambar D)

4. Pastikan coverslip tetap berpasangan dan alirkan udara kering secara cepat.

5. Setelah pengecatan, pemberian udara kering, dan peninggian dengan blood film,

kemudian letakkan pada kaca slide 3x1 inch, kemudian beri label pada slide.

Modifikasi metode coverslip merupakan pengganti dari kedua slide kaca ukuran 3x1 inch

untuk coverslip. Puncak slide diganti langsung ke slide yang berisi tetesan darah pada

pusatnya (lihat gambar di bawah ini). Keuntungan modifikasi ini adalah didapatkan area

pemeriksaan yang luas. Penggunaan slide tidak rusak seperti halnya coverslips dan pada

kasus melabel blood film.

Pemecahan Masalah

1. Menilai ukuran tetesan darah.

2. Penting untuk mengatur waktu dan kecepatan pemisahan coverslip. Penarikan

coverslip agar terpisah sebelum waktunya atau terlalu cepat dapat membuat

penyebaran tidak merata. Penundaan pemisahan coverslip menyebabkan coverslip

menjadi bertebaran satu dengan lainnya, terbentuk gumpalan trombosit

(clumping) atau terjadi penyebaran leukosit yang tidak merata.

3. Pemisahan coverslip dilakukan dengan lembut. Tarikan yang sedikit-sedikit

berhenti atau melakukan variasi pada level horizontal akan menyebabkan

distribusi yang tidak merata pada elemen-elemen sel.

4. Menilai kualitas pengecatan. Kesulitan untuk mencampur pengecatan dan bufer

secara adekuat karena area permukaan coverslip kecil seperti halnya saat

membersihkan larutan pengecatan.

B. Teknik Wedge

Berbagai variasi dari teknik Wedge secara luas digunakan untuk preparasi

blood film. Hasilnya dikenal dengan istilah wedge, spreader slide, atau push blood

film .

Beberapa keuntungan yaitu tekniknya mudah, dijual sudah bersih, slide tidak

mudah rusak, mudah untuk dilabel, dikirim dan dilakukan pengecatan, tidak

membutuhkan coverslip, blood film segera dapat disimpan, kombinasi tersebut di atas

menjadikan preparat menjadi lebih mahal serta mudah menemukan sel yang abnormal

karena sel yang lebih besar cenderung tinggal pada tepi film. Kerugian mayor teknik

wedge yaitu distribusi yang kurang pada sel yang berinti. Neutrofil dan monosit

memiliki kecenderungan untuk tampak pada tepi area yang tampak berbulu pada

preparat dalam area pemeriksaan. Hal ini mengakibatkan tampak adanya peningkatan

jumlah limfosit dan penurunan neutrofil dan jumlah monosit ketika mengerjakan

hitung jenis. Kerugian lainnya yaitu adanya trauma yang besar pada sel selama

pembuatan blood film. Hal ini menyebabkan ditemukannya sejumlah besar sel

smudge atau sel basket (leukosit yang ruptur), khususnya pada penyakit

limfoproliferatif.

Teknik Wedge

1. Tempatkan objek glass yg bersih ukuran 3 x 1 inch pada permukaan yang datar

(stationary slide)

2. Teteskan darah diameter 2-3 mm ke objek glass kira-kira ¼ inch dari area akhir atau

kaca pada sisi yang sama seperti tangan menulis (lihat pada gambar). Darah berisi

antikoagulan seharusnya dilakukan pencampuran dengan baik sebelum dikirim ke

laboratorium.

3. Pegang pada ujung slide yang diam, yang bukan ujung terdekat dari tetesan darah,

menggunakan tangan yang tidak biasa dipakai untuk menulis (Gambar 3.3A)

4. Posisikan slide spreader pada kemiringan sudut 25° – 35° dari slide yang diam serta

geser ke arah tetesan darah (Gambar 3-3B dan C).

5. Biarkan tetesan darah menyebar sepanjang ujung slide spreader (Gambar 3.3D).

6. Dorong slider spreader dengan segera ke arah depan dengan gerak yang cepat dan

lembut, pertahankan kemiringan sudut yang sama serta menggunakan sedikit tekanan.

Darah akan berjalan dibelakang slide spreader (Gambar 3.3 E).

7. Jika kemiringan sudut slide spreader tepat, kecepatan gerak akan cukup cepat, serta

ukuran tetesan darah tepat, darah akan menyebar sepanjang ½ - ¾ slide yang diam

8. Udara kering segera mengenai darah tetapi butuh didiamkan beberapa menit sebelum

dilakukan pengecatan. Hal ini dapat dilakukan secara manual atau dengan kipas angin

listrik atau aliran udara dingin.

9. Beri nama, nomor, dan tanggal pengerjaan pada label di ujung preparat setelah

preparat kering.

Slide Spreader

Sifat khusus slide spreader mempengaruhi distribusi leukosit dan

berhubungan dengan akurasi hitung jenis. Slide spreader seharusnya lebih sempit

daripada objek glass yang diam (stationary slide). Tepi penyebaran seharusnya

tampak bersih, halus, kilap, dan tipis, tanpa cacat atau goresan. Spreader yang bagus

adalah coverglass hemositometer (20 x 26 x 0,4 – 0,6 mm). Ukuran panjang tepi

spreader adalah 20 mm.

Karakteristik Wedge Film yang Benar

Beberapa karakteristik persiapan preparat yang baik (gambar 3-4), yaitu :

1. Preparat menutupi minimal ½ dari panjang objek glass. Film yang diwarna melalui

instrumentasi otomatis tipe platen / rol mesin tulis (Ames Hema – Tek Stainer, Miles

Laboratory, Elkhart, IN) seharusnya minimal diakhiri ½ inchi sebelum mencapai

ujung slide.

2. Film preparat seharusnya lebih sempit daripada objek glass / slidenya sehingga sisi

tepi preparat dapat diperiksa dengan mikroskop.

3. Penyebaran yang homogen seharusnya ditunjukkan dengan transisi yang berangsur-

angsur dari area tebal ke area tipis dengan tidak ada gelombang, corengan, lubang,

palungan, atau gelembung.

4. Preparat seharusnya diakhiri dengan ujung yang berbentuk peluru dengan garis-garis

yang lurus atau ramping (Gambar 3.5). Preparat berbentuk peluru (Gambar 3.5)

cenderung memiliki akumulasi leukosit yang tinggi sepanjang sisi dan tepi ekor

preparat daripada preparat gengan ujung yang lurus (Gambar 3.6). Bentuk peluru

dihasilkan karena penyebaran darah dilakukan sebelum tetesan darah menyebar secara

penuh disepanjang slide spreader.

5. Preparat harusnya cukup tipis untuk melakukan fiksasi yang baik selama melakukan

prosedur pengecatan. Area tebal tampak hijau gelap / abu-abu atau tercuci selama

pewarnaan.

6. Preparat seharusnya memiliki minimal 10 lapang, power yang rendah sebesar 50 %,

tidak terjadi overlapping erirosit. Sisanya dapat terjadi sedikit overlap (2 kali lipat

atau 3 kali lipat). Satu sel darah merah seharusnya memiliki sentral pallor.

Pemecahan Masalah

Seringkali preparat tebal dihasilkan karena penggunaan tetesan darah yang

terlalu banyak, penyebaran darah terlalu cepat atau sudut slide spreader terlalu tinggi

(lihat gambar 3.4 C & 3.7). Pada beberapa preparat, kelebihan plasma menyebabkan

sel berinti menyusut dan pengecatan tebal sehingga sulit mengidentifikasinya

(Gambar 3.4 C). Bentuk sel darah merah lebih rouleaux pada area tebal dan tidak

dapat dievaluasi.

Seringkali preparat yang tipis (Gambar 3.7) disebabkan oleh penggunaan

tetesan darah yang terlalu kecil, penyebaran terlalu lambat, atau menggunakan sudut

slide spreader yang terlalu kecil. Smudge cell meningkat dan sel darah merah

menyerupai sferoid dengan bentuk distorsi (Gambar 3-4 A). Terdapat kecenderungan

sel-sel berinti terbawa ke tepi preparat akibat spreading yang terlalu lambat dan

mempengaruhi keakuratan hitung jenis (Gambar 3.6).

Penampakan berpasir pada area ekor mengindikasikan akumulasi dari sel – sel berinti

yang berasal dari sejumlah besar leukosit, spreading yang terlalu lambat atau

penundaan spreading (lihat gambar 3.8). Hal ini disebabkan oleh penggunaan hanya

sebagian dari tetesan darah (Gambar 3.8 B). Tepi spreader yang kasar atau kotor akan

menghasilkan preparat yang berpasir atau kasar. Beberapa antikoagulan akan

menyebabkan akumulasi dari leukosit pada ujung yang tampak kasar.

Banyak laboratorium hematologi membuat ketetapan untuk menentukan

prosedur tertentu karena leukosit kurang terdistribusi pada preparat wedge. Misalnya,

jika hitung jenis leukosit menunjukkan lebih dari 40 % limfosit, maka perhitungan

tersebut seharusnya diulangi ke slide lainnya. Demikian juga jika jumlah monosit,

eosinofil atau basofil melebihi referensi nilai normal, 100 sel 1 menit

didiferensiasikan pada slide yang sama dan angka rata – rata dilaporkan. Pemeriksaan

yang paling efisien yaitu dengan inspeksi dengan power yang rendah pada area perifer

(slide dan ujung yang kasar) untuk sejumlah netrofil yang tidak proporsional.

Preparat Otomatis

Metode otomatis untuk preparasi preparat telah diperkenalkan oleh beberapa

manufaktur lebih dari beberapa tahun. Saat ini, satu-satunya market yang tersisa

adalah Autoprep (Barret Healthcare Coporation, Tucker, GA). Ini merupakan

instrumentasi portabel semiautomatik yang menstimulasi teknik manual tipe –

spreader (Gambar 3.9). Alat ini terdiri dari dua bagian spreader yang letaknya tinggi

pada sudutnya yang bergerak secara mekanik sepanjang objek glass 3 x 1 inchi yang

berisi tetesan darah. Operator harus menempatkan slide – slide pada mesin, menaruh

tetesan darah pada tiap slide dan menekan pengungkit untuk memulai pergerakan

spreader, kecepatan dapat diganti – ganti menurut hematokrit. Keuntungan dan

kerugian preparat wedge otomatis, sama dengan preparat wedge manual dengan

keuntungan tambahan yaitu lebih konsisten jika dibandingkan dengan preparat

manual.

Gambar 3.9.

Instrumentasi otomatis lainnya yang telah dipaparkan, menggunakan teknik

sentrifugal (memperkenalkan sentrifugasi untuk menyebarkan whole blood monolayer

pada objek glass ukuran 3 x 1 inchi).

Preparasi Buffy Coat

Sel–sel berinti dan trombosit-trombosit akan melapisi bagian atas dari sel-sel

darah merah selama sentrifugasi (lihat gambar 3.10). Fraksi dari sel-sel berinti ini

disebut sebagai “buffy coat” karena berwarna kekuningan atau kecoklatan. Lapisan

putih bagian atas adalah akumulasi trombosit di atas sel-sel berinti. Buffy coat dapat

dibuang, dicampur, dan digunakan untuk persiapan preparat. Preparasi buffy coat

merupakan prosedur yang sederhana yang menyediakan informasi diagnostik dan

mengurangi kebutuhan yang berlebihan, baik waktu dan biaya yang dikeluarkan.

Indikasi preparat buffy coat untuk mendeteksi adanya sel yg reaktif, imatur, dan

abnormal (rare blast / mast sel), terutama pada pansitopenia. Jumlah sel-sel eritrosit

berinti megaloblastik atau peningkatan jumlah netrofil pada anemia megaloblastik, sel

plasma yang abnormal, sirkulasi sel tumor dalam darah, serta adanya bakteri atau

parasit. Contohnya sel-sel darah merah yang matur mengandung parasit malaria,

terkonsentrasi pada lapisan atas sel darah merah.

Teknik Pembuatan Buffy Coat

1. Isi tabung hematokrit Wintrobe dengan campuran darah antikoagulan EDTA.

2. Sentrifugasi pada 1000 x g selama 6 menit. Kekuatan sentrifugasi yang kurang tidak

menyebabkan perubahan bentuk sel.

3. Dengan menggunakan pipet kapiler, buang plasma dari tabung sedikit sampai tinggal

tersisa sejumlah plasma yang sedikit lebih besar dari buffy coat.

4. Aspirasi plasma yang tersisa, lapisan buffy coat, dan lapisan paling atas sel darah

merah matur (kira-kira 1%) dan tuangkan campuran ini ke objek glass yang bersih.

5. Bilas dengan lembut kaliber dari pipet kapiler beberapa kali kemudian campur dan

buang semua sel yang melekat pada kaca.

6. Campur sampel dengan menggerakkan batang kaca. Pindahkan tetesan dari campuran

tersebut ke objek glass yang bersih / coverlips dan membuat preparat seperti yang

telah dijelaskan di atas.

7. Biarkan kering kemudian lakukan pewarnaan.

Penggunaan konsentrat ganda dapat membantu kita pada situasi dimana

jumlah leukosit di bawah 3 x 103/L. Beberapa tabung yang berisi spesimen, dilakukan

sentrifugasi seperti di atas. Dua-pertiga plasma dibuang. Plasma yang tersisa, buffy

coat, dan ¼ inchi lapisan sel darah merah dibuang dari semua tabung, campurkan

semua, dan tempatkan pada tabung lainnya untuk disentrifugasi yang kedua kemudian

dilanjutkan ke langkah 3 sampai langkah 7 dari prosedur.

Teknik Mikrohematokrit

Ketika hanya sejumlah kecil darah yang tersedia misalnya pengambilan darah

melalui tusukan kulit, beberapa tabung mikrohematokrit digunakan untuk

memusatkan pada sel-sel berinti. Antikoagulan yang dipilih adalah EDTA.

1. Isi tabung minimal ¾ dengan darah

2. Tutup salah satu ujung tabung dan tempatkan pada sentrifugasi mikrohematokrit.

Sentrifugasi selama 2 – 3 menit (kurang dari waktu sentrifugasi yang normal).

3. Hitung masing-masing tabung tepat di bawah lapisan buffy coat (lihat gambar 3.11A)

dengan pensil penanda kaca.

4. Patahkan tabung pada lokasi penanda. Pakai sarung tangan dan hati-hati pada fragmen

kaca.

5. Pegang bagian tabung yang berisi plasma, buffy coat, dan sedikit fraksi sel darah

merah, diantara jari jempol dan jari tengah dengan jari telunjuk berada di ujung

tabung untuk mengontrol aliran cairan.

6. Sentuhkan tabung pada objek glass yang bersih dan biarkan sel darah merah, buffy

coat, dan sejumlah plasma mengalir ke atas objek glass (gambar 3.11 B). Campur

secara menyeluruh dan buat preparat Wedge, keringkan, lakukan pengecatan dan

periksa. Ulangi pada tiap-tiap tabung lainnya.

Jika tabung mikrohematokrit berisi antikoagulan heparin, maka cenderung

akan terjadi aglutinasi sel darah putih dan trombosit, pewarnaan yang kuat pada sel

darah putih memberikan warna biru – keunguan, dan oranye kemerahan pada sel

darah merah.

Evaluasi Preparasi Buffy Coat

Pembuatan buffy coat yang baik harus mewakili populasi sel berinti secara

umum pada sampel darah. Akantetapi, akibat adanya manipulasi pada spesimen dan

sentrifugasi, akurasi hitung jenis tidak dapat dicapai. Demikian juga morfologi sel

darah merah yang matang tidak dapat dievaluasi serta trombosit tidak dapat dihitung.

Pelaporan preparasi buffy coat mencakup gambaran populasi utama leukosit dan

catatan adanya beberapa sel imatur dan sel berinti yang abnormal, inti sel, atau

penemuan sel tambahan laninnya. Pada kasus leukopenia atau kondisi dengan jumlah

leukosit yang normal, pemeriksaan preparat buffy coat beberapa menit secara hati-hati

akan menemukan sejumlah sel-sel berinti pada pemeriksaan rutin preparat darah

beberapa kali, dan seringkali dijumpai kondisi abnormal. Ketika memeriksa sebuah

preparat Wedge, periksa secara teliti pada tepi dan ujung yang bentunya memutar

karena leukosit imatur dan abnormal serta sel-sel darah merah berinti bisa ditemukan

pada area tersebut.

Sel-sel netrofil imatur yang langka (metamielosit dan mielosit) serta fragmen-

fragmen inti megakariosit dapat ditemukan pada preparat buffy coat pada seseorang

yang sehat. Kelompok besar monosit dapat ditemukan pada preparat buffy coat. Sel

darah merah berinti tidak ditemukan pada orang dewasa yang normal.

Sebagai tambahan, jika spesimen darah dengan antikoagulan EDTA

setidaknya telah satu jam, maka perubahan morfologi sel lebih tampak pada preparat

buffy coat jika dibandingkan dengan preparat darah. Smudge cells dan sel nekrotik

(sel mati) akan banyak ditemukan.

Citosentrifugasi Buffy Coat

Citosentrifugasi telah digunakan pertama kali untuk memadatkan sel-sel

berinti pada spesimen cairan tubuh. Terdapat dua laporan tentang penggunaan

citosentrifugasi untuk preparasi buffy coat. Beberapa laboratorium melakukan

percobaan-percobaan dengan metodologi-metodologi namun tidak ada hasil evaluasi

yang dipublikasikan. Salah satu prosedur mencakup satu atau dua konsentrasi

menggunakan tabung Wintrobe seperti yang telah dijelaskan di atas, penambahan

normal salin (0,85%) dan 22% bovine albumin ke dalam konsentrat buffy coat dan

dilakukan sentrifugasi (Bab 30). Keseimbangan harus dijaga pada tiap-tiap sampel

antara kebanyakan saline (terlalu encer) dan kebanyakan albumin (dark cells dengan

artefak pseudopods). Teknik eksperimental lainnya yang telah dipublikasikan,

memerlukan inkubasi dengan agen pembuat lisis eritrosit sebelum disentrifugasi.

Sama halnya pada preparasi citosentrifugasi cairan tubuh, perubahan bentuk

morfologi (indentasi nukleus dan segmentasi, terlokalisir atau granulasi sitoplasma

prominen, vakuolisasi) telah diperkenalkan. Metode citosentrifugasi buffy coat tidak

diragukan lagi menjadi perbaikan untuk dimasa mendatang.

Artefak – artefak Pada Preparat Darah

Kebanyakan preparat darah disiapkan dari sampel darah dengan antikoagulan

EDTA. Pemilihan antikoagulan yang tepat ini sesuai dengan rasio darah, morfologi

sel pada sampel darah yang segar.

Bentuk sel-sel normal dapat dilihat dengan puas dalam waktu lima jam.

Akantetapi, sel-sel reaktif dan patologis diasumsikan berubah dalam waktu satu jam

sehingga sulit untuk diidentifikasi dengan tepat. Penyimpanan pada suhu ruangan

dapat mempercepat perubahan ini.

Perubahan pada monosit terjadi segera pada sampel EDTA. Vakuolisasi lazim

terjadi (lihat gambar 3.12). Limfosit reaktif (varian) secara cepat berkembang,

sitoplasma bervakuola dan berbelit atau nukleus berbentuk daun clover (sejenis

kacang-kacangan, Gambar 3.12 E dan F), sama halnya dengan sel blas patologik

(Gambar 3.12 C). Netrofil toksik menjadi bervakuola (autofagositosis). Nekrobiotik

atau leukosit yang mati (Gambar 3.12D) sering ditemukan pada kondisi pembuatan

preparat yang tertunda, khususnya pada sampel yang berisi sel reaktif dan patologis

dan penting untuk membedakannya dengan sel-sel darah merah berinti. Granulasi

sitoplasma netrofil yang berwarna merah keunguan berguna untuk membuat

perbedaan. Beberapa sel nekrobiotik memiliki banyak fragmen berbentuk bulat atau

penonjolan vakuola.

Eritrosit normal mempertahankan ukurannya, warna, dan bentuknya dalam

enam jam, setelah itu akan tampak spikula atau krenasi. Pada pemeriksaan darah yang

sudah sehari, banyak dijumpai sel-sel krenasi dan sferosit dengan sangat jelas

(Gambar 3.12A). Awal kelainan eritrosit ditemukan penampakan berspikula dalam

waktu satu jam dari saat pengumpulan darah, dan dalam waktu 2–4 jam perubahan ini

menjadi signifikan. Basophilic stippling yang kasar dan badan Döhle pada

penggunaan antikoagulan EDTA, dapat tidak ditemukan.

Pemakaian EDTA mempengaruhi distribusi trombosit, ukuran dan granula-

granula. Trombosit lebih terdistribusi merata pada preparat dengan darah EDTA

daripada darah yang diambil dari kapiler (tusukan kulit) atau jarum titik. Trombosit

cenderung akan membengkak dan berbentuk sferis, serta granula-granulanya tersebar,

sebagai akibat dari pewarnaan yang lebih terang daripada yang biasa dilakukan pada

preparat darah kapiler. Autoaglutinin trombosit telah dilaporkan, menyebabkan

trombosit clumping dengan keberadaan EDTA. Satellitism merupakan kecenderungan

trombosit melekat ke netrofil pada penggunaan antikoagulan EDTA, hal ini sering

disalah-interpretasikan sebagai trombositopenia oleh alat hitung partikel dan hanya

dapat diketahui dengan evaluasi preparat secara visual.

Persiapan darah Wedge dari darah EDTA yang telah lama (berhari-hari) akan

menampakkan distribusi tidak merata dengan banyak sel-sel berinti terbawa ke bagian

yang menonjol atau area ekor (Gambar 3.14). Sampel ini tidak dapat dievaluasi

dengan akurat.

Aliran udara yang kering pada pada preparat darah yang segar dapat

menyebabkan timbulnya artifak pada sel darah merah yang lembab, tampak berbulu

pada sitoplasma dari limfosit yang normal dan penyusutan dari leukosit normal.

Artefak yang kering menyebabkan sel darah merah tampak hipokromik, akantetapi

perubahan yang tajam lebih membantu dalam mengindentifikasi artifak ini daripada

perubahan yang perlahan-lahan diantara lingkaran hemoglobin dan senter yang jelas

(lihat gambar 3.15). Terkadang sel-sel perifer mengalami krenasi atau tampak seperti

binatang ngengat yang sedang makan. Artifak kering ini memiliki beberapa penyebab

antara lain:

Anemia berat, dimana kelebihan jumlah plasma mengakibatkan kesulitan saat

mengeringkan preparat, tanpa melihat tekniknya. Preparat dibuat pada lingkungan

yang lembab. Fiksasi yang dilakukan tidak adekuat, dapat dihindari dengan

melakukan fiksasi sebelum pewarnaan preparat. Kontaminasi air dengan larutan

perekat atau pewarna. Kelebihan buffer pada larutan pewarna.

Area preparat darah dapat mempengaruhi morfologi leukosit. Efek area tipis

pada objek glass yaitu memperbesar penyebaran leukosit. Pada area tebal, plasma

meningkat, menyebabkan penyusutan dan pembentukan tiga dimensi dari leukosit-

leukosit yang tersisa dengan sitoplasma yang sedikit.

Bahkan pada preparat darah Wedge yang baik, sedikit disintegrasi atau sel

smudge dapat ditemukan (lihat color plate 37.1). Smudge cell mewakili rupturnya

leukosit selama persiapan preparat darah. Pada alat hitung sel otomatis, smudge cell

terbaca sebagai leukosit karena smudge cell ini utuh sebelum dilakukan persiapan

preparat darah. Ketika jumlah smudgecell meningkat pesat (lebih dari 20 per 100

leukosit), jumlah smudge cell harus dilaporkan pada hitung jenis leukosit secara

manual sebagai jumlah per 100 leukosit. Penambahan satu tetes dari 22% albumin

menjadi lima tetes dari whole blood sebelum persiapan preparat darah, akan

menurunkan jumlah smudge cell. Granulosit-granulosit yang hancur sering dikelilingi

oleh granul-granul yang hancur sehingga sulit mengidentifikasi. Umumnya limfosit-

limfosit yang hancur tampak hanya sebuah sel smudge (corengan), nukleus yang tidak

berbentuk dengan sitoplasma yang larut dalam plasma. Terkadang sisa-sisa nukleus

yang berkembang, menampakkan anyaman longgar yang disebut dengan “sel basket”.

Sel-sel imatur yang rusak dapat mempertahankan pewarnaan dengan inti berwarna

biru.

Pewarnaan Preparat Darah

Pengecatan Romanowsky

Pewarnaan Romanowsky terdiri atas metilen blue, produk oksidatif dari

metilen blue (azures, lihat gambar 3.16), dan pewarnaan eosin. Pengecatan Wright /

Wright – Giemsa polikromatik adalah modifikasi pewarna Romanowsky yang umum

digunakan di Amerika. Jenis lainnya yang lebih terkenal yaitu Leishman, May –

Grünwald, dan pengecatan Jenner, nama-nama tersebut diberikan berdasarkan orang

yang mengembangkannya. Perbedaan modifikasi dari rasio komponen pewarna dan

metode-metode manufaktur, digunakan untuk mengkoreksi metilen blue. Pewarnaan

Romanowsky dikombinasi dengan dengan penggunaan Giemsa, yang terdiri atas

pewarna azure, untuk memperjelas ciri-ciri nukleus atau azurofilik dan granulasi

toksik. Penggunaan giemsa sendiri tidak adekuat untuk mewarnai sel darah merah,

trombosit, dan sitoplasma leukosit.

Gambar 3.16 : Oksidasi metilen blue dan contoh produk oksidasi

Pertama sel-sel pada objek glass harus difiksasi secara kimia murni dengan

metanol yang bebas aseton, pada langkah ini tidak terjadi pewarnaan. Setelah

dilakukan fiksasi, penambahan larutan buffer merubah pH larutan dan mengionisasi

reaktan untuk inisiasi proses pewarnaan pH-dependen. Pada elemen-elemen selular

yang asam seperti nukleoprotein, asam nukleat, dan protein sitoplasma tertentu

bereaksi dengan pewarna dasar, metilen blue, dan merupakan hasil dari oksidasi serta

variasi penegcatan berwarna biru. Istilah basofilik digunakan untuk elemen-elemen

yang bersifat asam serta menandakan aktifitas mereka atau “love” (Greek, philic)

untuk pewarnaan dasar. Elemen dasar selular seperti molekul hemoglobin di dalam sel

darah merah dan beberapa unsur-unsur pokok sitoplasma leukosit bereaksi dengan

pewarna asam eosin, dan menghasilkan variasi warna yaitu dari oranye sampai

kemerahan. Mereka disebut sebagai asidofilik atau eosinofilik.

Istilah netrofil berarti bahwa karakteristik sel bersifat netral pada pewarnaan

antara warna asam yang terang (merah) dan basa (biru). Beberapa organela sel

memadukan warna-warna yang berbeda seperti warna ungu, merupakan kombinasi

kelompok molekular asam dan basa. Azures (Gambar 3.16) menghasilkan warna

merah-keunguan dan merupakan kemampuan mereka dalam memberikan warna

primer atau granula-granula nonspesifik pada kebanyakan sel-sel mieloid, oleh karena

itu diberi istilah granula azurofilik.

Pewarnaan Romanowsky selalu bisa berubah secara tiba-tiba. Dahulu, tes

terbaik pada kualitas tiap pewarna adalah “percobaan lari” dengan buffer dan waktu

yang berbeda. Metode analitik yang rumit baru-baru ini, banyak membutuhkan

analisis elemen-elemen pewarna utama. Seperti yang dipaparkan pada gambar 3.16,

demetilasi (pembuangan kelompok –CH3) metilen blue pada larutan alkohol

menghasilkan berbagai produk-produk teroksidasi yang dinamakan azure (A sampai

C). Proses ini berlanjut sebagai larutan pewarna Wright yang lama, menyebabkan

timbulnya variasi pada kualitas pewarnaan. Penyimpanan pada lemari es akan

menghambat perubahan ini dan beberapa produsen merekomendasikan penyimpanan

dalam suhu 4°C. Akantetapi campuran-campuran lainnya pada pewarnaan akan

dirusak oleh suhu yang dingin dan harus disimpan pada suhu ruangan. Paket-paket

penyisipan disediakan untuk penyimpanan. Demikian juga, paparan terhadap suhu

dingin selama pengiriman merusak larutan pewarna. Beberapa manufaktur

menambahkan elemen-elemen logam untuk bekerja sebagai stabilizer larutan untuk

memperpanjang umur pemakaian larutan tersebut, tetapi keberadaannya dapat

mengubah kualitas pewarna. Penggantian 50% metanol oleh gliserol akan

menghambat proses oksidasi, akantetapi kondisi tersebut menghasilkan larutan

pewarna yang kental dan lengket sehingga sulit untuk mencampurnya dengan buffer

dan sulit untuk melakukan pengecatan.

Beberapa peneliti yang meneliti “efek Romanowsky - Giemsa”, menyediakan

dasar empiris untuk standardisasi pewarnaan dengan jenis Romanowsky. Fungsi

utama metilen blue untuk menyediakan produk oksidasi, azure. Azure B lebih

superior daripada azure lainnya. Pewarnaan polikromatik baru yang telah

dikembangkan yaitu azure B murni dan eosin yang telah diukur jumlahnya.

Standardisasi kualitas pewarnaan telah didapat karena oksidasi komplit pada larutan-

larutan tersebut serta tambahan pewarna dan elemen-elemen dibuang . Walaupun

terdapat kemajuan dalam produksi dan pemeriksaan, namun tetap dianjurkan untuk

melakukan tes pada setiap larutan pewarna.

Beberapa pewarnaan yang cepat telah dikembangkan untuk digunakan pada

laboratorium-laboratorium kecil. Walaupun cukup untuk menilai morfologi sel

normal , secara umum pewarnaan yang cepat tersebut tidak bisa memeriksa sel-sel

abnormal dengan puas. Waktu fiksasi yang pendek menyebabkan kurangnya penetrasi

dari pewanaan, dan waktu paparan pengecatan yang pendek, menghasilkan warna

yang tidak seperti biasanya. Sebagai tambahan, ada banyak variasi dari preparat satu

ke preparat lainnya.

Metode Pengecatan Manual

Dua jenis metode yang umum yaitu metode Rack dan Dip

Metode Rack

Metode Rack menggunakan batang-batang yang diletakkkan di atas tempat

pencucian atau piring yang cekung (dish) yang memegang objek glass pada posisi

horizontal selama pengecatan (lihat gambar 3.17 A). Sumbat karet yang kecil di

setting di bagian dalam dish, digunakan saat melaukan persiapan mewarnai coverslip

(Gambar 3.17B).

Gambar 3.17 Metode Rack pada pengecatan preparat manual. (A) Batang-batang

menampung objek glass 3 x 1 inchi. (B) Sumbat karet digunakan untuk persiapan

pewarnaan coverslip

Teknik Metode Rack

1. Preparat dibiarkan kering dengan udara sekitar beberapa menit.

2. Larutan pewarna wright disebarkan di atas slide dengan meneteskannya melalui botol

atau pipet hingga membanjiri permukaan slide. Tepi slide tidak boleh bersentuhan

satu dengan lainnya untuk mencegah larinya larutan pewarna dari slide. Dilakukan

fiksasi sel-sel ke slide karena alkohol merupakan unsur pokok dari larutan pewarna.

Minimal dibutuhkan satu menit untuk fiksasi karena dianggap preparatnya tipis

dengan jumlah sel yang normal atau menurun. Spesimen – spesimen dengan

peningkatan jumlah leukosit yang besar atau pembuatan preparat sum-sum tulang

membutuhkan waktu fiksasi yang lebih lama.

3. Larutan buffer fosfat ditambahkan padatiap-tiap slide dengan jumlah yang sama.

Kualitas pewarnaan dipengaruhi oleh pH buffer, rentang pH optimum antara 6,4 – 6,8.

Larutan buffer untuk pewarnaan dicampurkan ke atas slide secara lembut dengan

menyemburkannya. Warna kehijauan seperti kilau logam mengindikasikan pewarnaan

sudah tepat (rasio buffer). Pewarnaan 4 – 6 menit (tergantung dari keputusan

laboratorium dan penelitian dengan pewarna khusus).

4. Campuran pewarna dialirkan dengan cepat dari slide dengan aliran air yang diteteskan

atau deionisasi hingga semua pewarna dibuang. Tidak boleh terlalu banyak dibilas.

Air yang dipakai mencuci harus memiliki pH netral untuk mencegah perubahan warna

pengecatan.

5. Sisa-sisa pewarna pada bagian bawah slide dibersihkan dengan tissue laboratorium

atau kasa, kemudian spesimen dikeringkan.

Walaupun kebanyakan laboratorium-laboratorium membeli secara komersial

pembuatan preparat dengan larutan pewarna Wright, larutan tersebut dapat disiapkan

secara manual dengan mencampur 1 gram bubuk biologis Wright per 500 ml zat

kimia murni , metanol bebas aseton. Pewarna diinkubasi selama satu minggu pada

suhu 37°C, kemudian disimpan pada suhu ruangan atau suhu lemari es. Lama

inkubasi dapat diperpendek dengan menambah 0,1 gram bubuk giemsa per 500 ml

pewarna. Botol-botol polietilen bersifat lebih stabil daripada botol kaca untuk

penyimpan pewarna. Pewarna harus disaring terlebih dahulu sebelum digunakan.

Larutan buffer dibuat dengan melarutkan garam buffer atau tablet-tablet di

dalam air sulingan atau yang di-deionisasi. Larutan buffer juga dibuat dengan

menggabungkan potasium fosfat monobasic dan sodium fosfat dibasic dalam air s

ulingan menurut pH yang diinginkan. Petunjuk spesifik untuk membuat buffer fosfat

tersedia dalam berbagai penerapan kimia secara manual. Sebelum digunakan, pH

larutan dievaluasi dengan pHmeter.

Penggunaan metode Rack untuk pemeriksaan sejumlah kecil preparat akan s

angat menghemat biaya karena metode ini menggunakan larutan pewarna yang

minimal pada tiap slide. Satu atau beberapa slide dapat diwarnai secara bersamaan.

Kerugian metode Rack yaitu mudah terjadi presipitat (granul-granul biru-hitam atau

filamen pada preparat), sulit dalam pengaturan waktu, dan ketidaksamaan dalam

kualitas pengecatan berhubungan dengan variasi sejumlah pewarna dan larutan buffer

tiap slide dan pengaturan waktu tiap langkah pengerjaan.

Metode Dip (Inkubasi)

Beberapa dish diperlukan (wadah cukup besar untuk tempat pemegang slide

yang portabel serta larutan).

Teknik metode Dip

1. Preparat difiksasi 1-2 menit pada dish dengan metanol. Wadah untuk meletakkan slide

harus kering untuk menghindari kontaminasi air.

2. Slide diletakkan pada dish yang berisi pewarna Wright yang encer selama 4 menit.

3. Slide ditempatkan ke dish lain dengan pewarna Wright 75 ml dan buffer 325 ml (pH

6,4) selama 4 menit.

4. Slide kemudian dipindahkan ke sebuah dish dengan larutan Giemsa 20 25 ml dan 200

ml air deionisasi selama 4 menit.

5. Slide dibilas dalam waktu singkat pada dua dish dengan air suling dan dikeringkan

dengan udara sekitar.

Keuntungan dari metode ini, kualitas pewarnaan lebih konsisten, penetrasi

warna lebih baik dengan hasil warna yang terang serta endapan sedikit, hemat biaya

untuk sejumlah slide yang banyak, dan mudah adaptasi dengan dip otomatis.

Kerugian metode ini yaitu dibutuhkan waktu untuk menyiapkan larutan-larutan

pewarna dan memindahkan slide dari dish yang satu ke dish lainnya, serta adanya

kestabilan yang terbatas (maksimal 4 jam) pada buffer Wright dn larutan pewarna

Giemsa, hal ini menyebabkan mahalnya penggunaan metode ini pada preparat yang

jumlahnya sedikit.

Metode Mewarnai yang Otomatis

Jenis Platen (Silinder)

Pewarna slide “Ames Hema-Tek” mempersembahkan pewarna jenis platen.

Objek glass ditempatkan di atas platen dengan film darah di sisi bawah serta

dipindahkan oleh pengangkut berbentuk spiral melalui pelarut eosin-metilen blue

polikromasi, pelarut buffer, dan larutan pembilas, masing-masing didapatkan dari kit

reagen yang tersedia komersil, dialirkan melalui pompa tabung (lihat gambar 3.18).

Jenis Carousel (Korsel)

Instrumen lainnya yaitu Pewarna Slide Hematologi Aerospray (Wescor, Inc.,

Logan, UT). Instrumen semprot ini mengukur sejumlah reagen-reagen warna ke atas

preparat darah, dimana reagen-reagen warna tersebut diangkut oleh korsel. Rincian

cara kerja disediakan oleh produsen. Keuntungan dari pewarna jenis silinder dan

korsel otomatis ialah :

- Tidak membuang waktu. Satu kali slide dikerjakan dengan instrumen, tidak perlu

ditunggu oleh operator, waktu pewarnaan kurang dari 10 menit

- Kualitas pewarnaan konsisten dari satu film ke film lainnya.

- Harganya murah karena penggunaan reagen pewarna yang sedikit jika dibandingkan

dengan teknik pewarnaan lainnya.

- Film stat dapat ditambahkan dan diwarnai kapan saja dengan pewarna slide Hema-

Tek.

Kerugian mencakup :

- Perawatan yang tinggi. Platen harus disimpan dalam keadaan bersih untuk mencegah

presipitasi dari pewarna ke dalam preparat. Tabung harus diperiksa setiap hari untuk

melihat adanya ebdapan dan diganti minimal tiap tiga bulan sekali.

- Seringkali dibutuhkan waktu prefiksasi yang pendek dengan metanol, khususnya

ketika jumlah leukosit meningkat.

- Reagen pewarna harus dibeli dan kemungkinan lebih mahal dari “buatan sendiri”.

Pendinginan atau pemanasan dapat mempengaruhi kualitas pewarnaan.

- Instrumentasi tidak serbaguna untuk memodifikasi jumlah pewarna yang terkirim,

keasaman buffer, serta pembilasan dan waktu yang diperlukan pada tiap-tiap langkah

pengerjaan.

Paket Giemsa harus dibeli untuk menambah pewarnaan nukleus-nukleus dan

granula-granula yang membutuhkan pewarna Giemsa. Granula toksik dan basofilik

tidak akan terwarnai jika Giemsa tidak ditambahkan pada sistem pewarnaan. Slide

harus bersih dan tidak boleh bengkok untuk melakukan pewarnaan pada instrumentasi

jenis platen (silinder). Instrumentasi aerospray menggunakan larutan warna untuk

korsel yang penuh / komedi putar yang penuh (12 slide) tanpa mempedulikan slide

yang ada dimana akan mengurangi biaya.

Instrumentasi Jenis Dip

Beberapa instrumen otomatis menggunakan dip atau teknik pewarnaan imersi

yang sama dengan pewarnaan histologi secara tradisional. Sejumlah film dipindahkan

dari satu dish ke dish lainnya pada interval waktu tertentu (lihat gambar 3.19)

Keuntungannya mencakup :

- Menghemat waktu instrumentasi operator

- Lebih serbaguna dalam jenis dan jumlah larutan pewarna, waktu yang dihabiskan tiap

langkah pengerjaan, keasaman buffer dan larutan pembila, serta kemampuan untuk

membuat reagen-reagen pewarna daripada membelinya.

- Jika larutan pewarna diganti secara reguler, kualitas pewarnaan distandarisasi.

- Hasil penetrasi warna lebih baik dan pewarnaan elemen-elemen selular lebih intens,

khususnya bila ada penambahan Giemsa.

- Kemungkinan untuk terjadinya presipitat / endapan lbh kecil jika dibandingkan

dengan jenis platen.

Kerugian mencakup :

- Pewarnaan slide lebih panjang daripada jenis platen

- Persiapan larutan pewarna dibutuhkan setiap hari atau dua kali sehari karena

pengecatan mempunyai batas waktu tertentu

- Lebih mahal

PEMECAHAN MASALAH

Fiksasi

• Fiksasi inadekuat, blood film ikut tercuci à pemeriksaan tidak jelas, pengecatan

granul kurang khususnya basofil, kontaminasi air à drying artifact

• Persiapan film seharusnya dikeringkan 5 menit utk mencegah drying artifact

• objek glass hrs bersih sblum digunakan

• Kualitas pengecatan yang bagus memperhatikan keseimbangan asam basa

• Lama fiksasi minimal 1 menit

Pengecatan

• Larutan buffer memiliki waktu kerja yg terbatas hanya beberapa jam.

• Air saringan tidak dpt dipercaya à adanya kontaminasi & dapat mengabsorbsi CO2

à bersifat asam

• Hasil yang baik didapatkan dg minimal 2 kali pengecatan

Pencucian

• Terlalu semangat dan lama mencuci à sel terlepas dr film yg tidak terfiksasi, bs

menyebabkan nuclear clumping, & film terlalu tipis

• Kurang pencucian à blue film & presipitasi

Pengeringan

• Pengeringan yg cepat dan kuatà mengubah intensitas warna film dengan

memperpendek waktu paparan pencucian.

Sumber : Lippincolt-