LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

PEMBUATAN PREPARAT DAN PENGECATAN

OLEH:

NAMA : ANNISA DWI CAHYA

NIM : J1E111052

KELOMPOK : 1 (SHIFT 3)

ASISTEN : RADEN DWI T. R.

KEMENTRIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN NASIONAL

UNIVERSITAS LAMBUNG MANGKURAT

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

PROGRAM STUDI S-1 FARMASI

BANJARBARU

2013

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Tinjauan Pustaka

Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada

tahun 1884. Dengan metode ini, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua,

yaitu bakteri gram positif dan gram negatif yang didasarkan dari reaksi atau

sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan

oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bisa

dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti

Mycoplasma sp. (Dwijoseputro, 2005).

Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan

terjadinya dua kemungkinan : mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna

ungu atau bakteri menjadi tidak berwarna. Safranin merupakan pewarna

tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali

sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan

alkohol. Dengan kata lain , memberikan warna pada mikroorganisme non

target (Wahyuningsih , 2008).

Pewarnaan Sederhana (Pewarnaan Positif). Sebelum dilakukan

pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass yang kemudian difiksasi.

Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat, tapi jika suspensi

bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri

dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan

melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya

(Campbell dan Reece, 2005).

Bakteri kontaminan adalah yang berada di sekitar kita baik pada

tanah, udara, debu, air yang keberadaanya sangat tidak menguntungkan.

Mikroorganisme yang tersuspensikan dengan udara dan dapat mengendap

bersama debu pada berbagai macam permukaan seperti pakaian, meja, lantai

dan benda – benda lain. Ukuran sel mikroorganisme yang sedemikian kecil

dan ringan menyebabkan mudah terhembuskan oleh aliran udara. Keberadaan

mikroorganisme dapai. menyebabkan kontaminasi, hal ini sangat berpengaruh

pada ruang yang seharusnya terjaga keseterililanya misal ruang operasi,

laboratorium dan lainya (Ariyadi & Dewi, 2009).

Dalam ruangan labortorium sering ditemukan mikroorganisme

kontaminan yang dapat ikut tumbuh dalam suatu media nutrient agar. Bakteri

kontaminan yang sering ditemukan diantaranya adalah Bacillus sp,

Streptococcus sp, Staphylococcus, Pseudomonas dan Sarcina. Dari

mikroorganisme tersebut, yang paling sering menyebabkan kontaminasi

adalah Bacillus subtilis. Bacillus subtilis adalah kuman berbentuk batang,

gram negatif dan mempunyai spora, fakultatif anaerob dapat bergerak

dengan flagella yang peritrika. Mikroorganisme ini sering sebagai indikator

terhadap kontaminasi karena ketahananya dalam mempertahankan diri

dengan terbungkus oleh spora tadi (Ariyadi & Dewi, 2009)

Nama bakteri berasal dari kata “bakterion” (bahasa Yunani) yang

berarti tongkat atau batang. Sejalan dengan pertambahnya pengetahuan,

sekarang bakteri digunakan untuk mikroorganisme bersel satu, berkembang

biak dengan pembelahan diri, serta memiliki ukuran mikron sehingga hanya

tampak dengan mikroskop. Bakteri aerob merupakan bakteri yang

membutuhkan O2 untuk pertumbuhannya. Sistem enzimnya membutuhkan

O2 sebagai elektron aseptor pada proses fosforilasi oksidatifnya. Contoh

bakteri areob adalah Bacillus sp., Escherichia coli, dan Streptococcus

(Puspitasari, 2012).

Proteus vulgaris adalah sel berbentuk batang, Gram-negatif, dan tidak

membentuk spora. Bergerak sangat aktif dengan menggunakan bulu-bulu

cambuk disekeliling tubuhnya (flagel peritrih). Mudah tumbuh pada berbagai

pembenihan dalam keadaan anaerob. Dapat menghasilkan urease, yang

menyebabkan hidrolisis cepat dari urea, dengan melepaskan amonia. Pada

infeksi saluran kemih, air kemih dapat menjadi sangat alkali sehingga dapat

merangsang pembentukan batu (Yanti, 2004).

Bakteri proteolitik adalah bakteri yang mampu mendegradasi protein,

karena memproduksi enzim protease ekstraseluler. Protease merupakan enzim

proteolitik yang mengkatalisis pemutusan ikatan peptida pada protein. Untuk

menentukan kemampuan mikroorganisme dalam mensekresikan protease

yang dapat mendegradasikan protein, maka pada medium disertakan susu

skim yang mengandung kasien. Kasein merupakan protein utama susu, suatu

mikromolekul yang tersusun atas sub unit asam amino yang dihubungkan

dengan ikatan peptida. Kasein berfungsi sebagai substrat bagi enzim protease.

Pada umumnya bakteri proteolitik adalah bakteri dari genus Bacillus,

Pseudomonas, Proteus, Streptobacillus, Staphylococcus, Streptococcus

(Puspitasari, 2012).

1.2 Tujuan Praktikum

Tujuan dari praktikum ini adalah dapat melakukan pembuatan

preparat dari bahan yang berasal dari penderita biak dengan media cair dan

padat, serta dapat melakukan pengecatan bakteri khususnya dapat

membedakan bakteri Gram positif dan negatif.

BAB II

METODE PRAKTIKUM

2.1. Waktu dan tempat

Kegiatan praktikum dilaksanakan pada hari sabtu tanggal 15 Maret

2013 bertempat di Laboratorium Mikrobiologi, Laboratorium Dasar Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lambung Mangkurat,

Banjarbaru.

2.2. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah ose, pembakar

Bunsen, kaca objek dan pipet tetes

Bahan yang digunakan dalam praktikum ini cat gram A, cat gram B,

cat gram C, cat gram D, alkohol, dan akuades.

2.3. Prosedur Kerja

1. Diambil kaca objek dan disterilisasi dengan dipanaskan diatas nyala

bunsen

2. Diambil ose bulat dan disterilisasi dengan dipanaskan pada bunsen

3. Ditetesi sedikit akuades pada kaca objek

4. Diambil sedikit koloni bakteri, kemudian di letakkan pada kaca objek

5. Diratakan koloni yang ada di kaca objek sampai tipis

6. Dipanaskan kaca objek dan koloni

7. Diteteskan beberapa tetes cat Gram A, didiamkan selama 1 menit, dan

dicuci dengan akuades

8. Diteteskan beberapa tetes cat Gram B, didiamkan selama 1 menit

kemudian dicuci dengan akuades

9. Diteteskan beberapa tetes cat Gram C, didiamkan selama ½ menit

kemudian dicuci dengan akuades

10. Diteteskan beberapa tetes cat Gram D, didiamkan, kemudian dicuci

dengan akuades

11. Diamati hasil yang didapat dengan mikroskop

BAB III

HASIL DAN PEMBAHASAN

3. 1. Hasil

Tabel hasil Pengecatan Gram

No. Spesies Gambar Keterangan1 Basillus

Perbesaran : 10 x 100

Bentuk : Batang

Warna : Ungu

Gram : Positif (+)

2 Basillus

Perbesaran : 10 x 100

Bentuk : Batang

Warna : Ungu

Gram : Positif (+)

3 Proteus

Perbesaran : 10 x 100

Bentuk : Coccus

Warna : Merah

Gram : Negatif (-)

4 Proteus

Perbesaran : 10 x 100

Bentuk : Coccus

Warna : Merah

Gram : Negatif (-)

3.2. Pembahasan

Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk

mengelompokan bakteri gram positif dan gram negatif. Perbedaan zat warna

ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya.

Pewarna yang digunakan dalam pewarnaan gram antara lain : crystal violet,

alkohol, safranin, dan iodine atau iodium.

Crystal Violet memberi warna ungu dan merupakan pewarna primer

(utama). Crystal Violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel

mikroorganisme yang bersifat asam, dengan begitu sel mikroorganisme yang

transparan akan terlihat berwarna (Ungu). Iodium merupakan pewarna

Mordan, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang

diserap mikroorganisme target. Pemberian iodium pada pengecatan Gram

dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri.

Alkohol berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat

warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Pemberian alkohol pada

pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu

mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi

tidak berwarna. Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna

sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah

kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata

lain , memberikan warna pada mikroorganisme non target (Wahyuningsih,

2008).

Zat-zat warna tersebut dapat berikatan dengan komponen dinding sel

bakteri dalam waktu singkat. Karena itulah rentang waktu pemberian zat

warna yang satu ke yang lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi

bakteri berlangsung cepat (efisiensi waktu). Prosedur (tahap) diatas dapat

dilakukan sesuai dengan waktu yaitu waktu 30 detik – 1 menit untuk

pewarnaan dengan larutan crystal violet kemudian dibilas dengan air mengalir

selama 2 detik. Pewarnaan selama 1 menit bertujuan agar cat ini dapat

melekat sempurna pada dinding bakteri. Waktu 1 menit untuk penambahan

larutan Yodium kemudian juga dibilas dengan air yang mengalir , dilakukan

selama 1 menit agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi lebih kuat. Waktu

1 menit dilakukan pembilasan dengan alkohol kemudian dibilas dengan air

yang mengalir , dilakukan selama 1 menit agar zat warna dapat luntur secara

sempurna dan tidak ada yang tersisa. Waktu 30-60 detik dilakukan

penambahan larutan safranin, kemudian dibilas dengan air yang mengalir

(Prescott, 2002).

Gram negatif dengan pencucian alkohol yang memungkinkan

kompleks zat pewarna iodium dapat disingkirkan dari sel, akibatnya sel

menjadi tidak berwarna. Pada saat ditetesi lugol iodine, sel tetap berwarna

ungu dan terbentuk kompleks crystal violet-iodine di dalam sel. Namun

hilang ketika pencucian dengan alkohol karena pori-pori mengembang dan

kompleks ungu crystal violet-iodine keluar dari sel dan akhirnya menyerap

warna merah safranin.

Dinding sel bakteri Gram negatif lebih tipis dan mengandung lipid,

lemak atau substansi seperti lemak dalam presentase lebih tinggi daripada

yang dikandung bakteri Gram positif. Hal inilah yang menyebabkan daya

rembes atau permeabilitas dinding sel Gram negatif lebih besar karena

banyak lipid yang terekstraksi ketika bereaksi dengan alkohol, sehingga

organisme gram negatif akan kehilangan warna dari kompleks crystal violet-

iodine yang telah terbentuk pada proses sebelumnya.

Setelah melakukan berbagai proses pengecatan diatas maka bakteri

dapat dibagi menjadi dua katagori utama yaitu bakteri Gram positif dan

bakteri Gram negatif. Bakteri Gram positif adalah bakteri yang tahan terhadap

alkohol sehingga tetap mengikat warna cat pertama dan tidak mengikat zat

kontras sehingga bakteri akan berwarna ungu. Sedangkan bakteri Gram

negatif adalah bakteri yang tidak tahan terhadap alkohol sehingga warna cat

pertama dilunturkan dan bakteri mengikat warna kontras sehingga tampak

merah.

Pada praktikum ini dilakukan pengecatan bakteri Basillus dan Proteus

yang selanjutnya diamati dengan mikroskop dengan perbesaran 10x100.

Didapatkan hasil sel Basillus yang terlihat bertumpuk. Bacillus memiliki

strukutur morfologis yang berbentuk batang (basil), dan susunan bakterinya

adalah berantai. Selain itu warna setelah dilakukan menunjukkan warna ungu

yang menandakan Basillus merupakan bakteri Gram positif. Selanjutnya, sel

Proteus yang diamati dengan mikroskop juga bertumpuk. Proteus memiliki

strukutur morfologis yang berbentuk bulat (coccus) dengan susunan

bakterinya adalah berantai. Selain itu warna setelah dilakukan menunjukkan

warna merah yang menandakan Proteus merupakan bakteri Gram negatif.

BAB IV

PENUTUP

4.1 Kesimpulan

Kesimpulan yang dapat diambil dari pengamatan dan praktikum ini

adalah:

1. Pengecatan Gram dapat digunakan sebagai salah satu cara untuk

mempermudah dalam mengamati morfologi sel bakteri.

2. Pengecatan Gram dilakukan dengan pewarna berasal dari crystal violet,

lugol iodin, aseton alkohol, dan safranin.

3. Basillus hasil pengamatan memiliki strukutur berbentuk batang (basil) dan

berwarna ungu yang menandakan Basillus merupakan bakteri Gram

positif.

4. Proteus hasil pengamatan memiliki strukutur morfologis yang berbentuk

bulat (coccus) dan berwarna merah yang menandakan Proteus merupakan

bakteri Gram negatif.

5. Bakteri Gram positif tahan terhadap alkohol sehingga tetap mengikat

warna cat pertama dan tidak lagi menyerap cat warna selanjutnya,

sehingga tampak berwarna ungu dari cat crystal violet.

6. Bakteri Gram negatif dengan pencucian alkohol yang memungkinkan

kompleks zat warna sebelumnya dapat luntur, sehingga sel menjadi tidak

berwarna dan menyerap warna merah safranin yang terakhir diteteskan.

4.2. Saran

Agar praktikum selanjutnya berjalan tepat waktu dan lebih teratur.

DAFTAR PUSTAKA

Ariyadi, T & Dewi, S. S.. 2009. Pengaruh Sinar Ultra Violet Terhadap Pertumbuhan Bakteri Bacillus Sp. Sebagai Bakteri Kontaminan. Jurnal Kesehatan Vol.2, No.2 Desember 2009

Campbell, N. A. & Reece, J. B., 2005. Biologi Jilid 2. Erlangga. Jakarta

Dwidjoseputro, D.  2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Jakarta

Prescott, H. K., 2002. Microbiology. Mc Graw Hill. New York

Puspitasari, F.D, et al. 2012. Isolasi Dan Karakterisasi Bakteri Aerob Proteolitik Dari Tangki Septik. Jurnal Sains dan Seni ITS Vol. 1, No. 1, (Sept. 2012) ISSN: 2301-928X

Yanti, A. 2004. Penetrasi Bakteri Pada Mahkota Gigi Terbuka. Jurnal Kesehatan Gigi Vol. 3, No.4

Wahyuningsih. 2008. Pengecatan Gram. Universitas Jenderal Soedirman. Purwokerto.