pengecatan gram

37
ACARA IX PEWARNAAN BAKTERI A. TUJUAN Tujuan percobaan ini adalah : 1. Mempelajari dasar-dasar kimia pewarnaan Gram dan pewarnaan spora 2. Mempelajari prosedur untuk membedakan bakteri menjadi golongan Gram positif dan Garam negatif 3. Mempelajari prosedur membedakan bakteri antara pembentuk spora dan sel vegetatif Hari/tanggal : Senin, 2 Mei 2011 Tempat : Laboratorium Biologi FKIP Universitas Mataram B. LANDASAN TEORI Bakteri memiliki beberapa bentuk seperti basil, kokus dan spirilum. Bakteri berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi bebrapa macam yaitu basil tunggal, diplobasil dan tripobasil. Demikian juga bakteri berbentuk coccus terbagi atas monococus, diplococus samapi staphylococcus. Untuk mengidentifikasi jenis- jenis bakteri tersebut maka dilakukan suatu metode yang disebut pewarnaan gram (Arif, 2011). Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk mebedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar yaitu gram positif dan gram negative berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel bakteri. Bakteri Gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metal ungu pada metode pewarnaan Gram, sedangkan bakteri Gram postif akan mempertahan kan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol. Pada uji pewarnaan gram, suatu pewarna penimbal ditambahkan setelah metal ungu yang menyebabkan semua bakteri gram negative menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berfungsi untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding selnya (Junaidi, 2010).

Upload: ade-pertiwi

Post on 06-Feb-2016

192 views

Category:

Documents


0 download

DESCRIPTION

gram positif dan negatif

TRANSCRIPT

Page 1: Pengecatan Gram

ACARA IXPEWARNAAN BAKTERI

A.    TUJUANTujuan percobaan ini adalah :

1.      Mempelajari dasar-dasar kimia pewarnaan Gram dan pewarnaan spora2.      Mempelajari prosedur untuk membedakan bakteri menjadi golongan Gram positif dan Garam

negatif3.      Mempelajari prosedur membedakan bakteri antara pembentuk spora dan sel vegetatif

Hari/tanggal : Senin, 2 Mei 2011Tempat : Laboratorium Biologi FKIP

Universitas Mataram

B.     LANDASAN TEORIBakteri memiliki beberapa bentuk seperti basil, kokus dan spirilum. Bakteri berbentuk

tongkat maupun kokus dibagi menjadi bebrapa macam yaitu basil tunggal, diplobasil dan tripobasil. Demikian juga bakteri berbentuk coccus terbagi atas monococus, diplococus samapi staphylococcus. Untuk mengidentifikasi jenis-jenis bakteri tersebut maka dilakukan suatu metode yang disebut pewarnaan gram (Arif, 2011).

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk mebedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar yaitu gram positif dan gram negative berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel bakteri. Bakteri Gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metal ungu pada metode pewarnaan Gram, sedangkan bakteri Gram postif akan mempertahan kan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol. Pada uji pewarnaan gram, suatu pewarna penimbal ditambahkan setelah metal ungu yang menyebabkan semua bakteri gram negative menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berfungsi untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding selnya (Junaidi, 2010).

Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu (pengecatan Gram) dapat digunakan untuk identifikasi awal. Supaya bakteri dapat dilihat dengan mudah dan dipalajari maka tingkat sel kontras itu dapat ditingkatkan dengan cara pewarnaan. Yang dimaksud dengan pewarnaan disini adalah perlakuan dengan zat warna yang mengikat secara selektif baik seluruh sel maupun komponen sel tertentu, sehingga dapat menghasilkan penyerapan cahaya yang jauh lebih besar. Kebanyakan perlakuan pewarnaan dapat membunuh sel oleh karena itu sebelum sel itu difiksasi dengan perlakuan memakai zat kimia yang bertujuan untuk mengurangi perubahan struktur sel yang telah mati Zat untuk fiksasi yang biasa digunakan adalah asam osmat dan aldehid, erutam glutar aldehid. Salah satu bakteri yang sering diamati dengan menggunakan pewarnaan adalah bakteri gram. Warna yang terlihat di mikroskop adalah menunjukkan jenis bakteri gram tersebut positif atau negative (Agushna, 2011).

Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa. Pewarna asam dapat terjadi

Page 2: Pengecatan Gram

karena bila senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif, sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel, maka sel tidak berwarna. Pewarna asam ini disebut pewrna negatif. Contoh pewarna asam misalnya : tinta cina, larutan Nigrosin, asam pikrat, eosin dan lain-lain. Pewarnaan basa bisa terjadi biasenyawa pewarna bersifat positif, sehingga akan diikat oleh dinding sel bakteri dan sel bakteri jadi terwarna dan terlihat. Contoh dari pewarna basa misalnya metilin biru, kristal violet, safranin dan lain-lain (Anonim, 2011).

Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah memilen biru, krisdal violet dan karbol fuehsin (Caray, 2008).

Kebanyakan sel bakteri tidak berwarna, sehingga jika dilarutkan dalam air dan diperlihatkan di bawah mikroskop tidak memperlihatkan warna kontras dengan medium disekelilingnya. Beberapa zat yang digunakan untuk mengamati struktur bagian dalam sel. Dalam pewarnaan mikroba, dapat digunakan satu jenis warna, cara ini disebut pewarnaan sederhana. Zat-zat warna yang biasa digunakan untuk pewarnaan bekteri dapat dibedakan atas beberapa golongan yaitu: pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial, pewarnaan strukturan dan pewarnaan untuk menguji adanya komponentertentu di dalam sel (Arif, 2011).Pewarnaan Sederhana (Pewarnaan Positif). Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass yang kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat, tapi jika suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya (Campbell dan Reece, 2005)).

Pewarna yang digunakan pada umumnya berbentuk senyawa kimia khusus yang akan memberikan reaksi kalu mengenai bagian tubuh jasad. Karena pewarnaan tersebut berbentuk ion yang bermuatan positif ataupun negative. Sel bakteri bermuatan mendekati negatif kalau dalam keadaan pH mendekati netral. Sehingga kalau kita memberikan pewarnaan yang bermuatan positif ataupun negative. Adapun jenis jenis zat untuk pewarnaan gram adalah: (Suriawiria, 1985)1. Gram A (violet) : a. Kristal violet b. Alkohol c. Ammonium oksalat d. Aquades 2. Gram B (cokelat) a. Iodium b. Kalium iodide c. Aquades 3. Gram Ca. Aseton b. Alcohol 4. Gram D (merah) a. Safranin

Page 3: Pengecatan Gram

b. Alcohol

Proses pewarnaan diferensial ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bilakomponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar.Bakteri hidup sulit untuk dilihat dengan mikroskop cahaya terang biasa karena bakteri itu tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri, walaupun biakannya secara keseluruhan mungkin berwarna. Bakteri sering diamati dalam keadaan olesan terwarnai daripada dalam keadaan hidup. Yang dimaksud dengan bakteri terwarnai adalah oganisme yang telah diwarnai dengan zat pewarna kimia agar mudah dilihat dan dipelajari (Volk dan Whleer, 1998).

Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah sebagai berikut (Irawan, 2008):

a.       Fase yang paling kritis dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi yang mengakibatkan CV-iodine lepas dari sel. Pemberian ethanol jangan sampai berlebih yang akan menyebabkan overdecolorization sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam penetesan etanol (underdecolorization) yang tidak akan melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif.

b.      Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV), khususnya pada gram positif. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur. Walaupun ada beberapa species yang memang bersifat gram variabel seperti pada genus Acinetobacter dan Arthrobacter.

Spora bakteri adalah bentuk bekteri yang sedang dalam usaha mengamankan diri terhadap pengaruh buruk dari luar. Spora bakteri mempunyai fungsi yang sama seperti kista amoeba, sebab bakteri dalam bentuk spora dan amoeba dalam bentuk kista merupakan suatu fase dimana kedua mikroorganisme itu berubah bentuk untuk melindungi diri terhadap faktor luar yang tidak menguntungkan. Sepanjang pengetahuan yang kita miliki sekarang, hanya golongan basillah yang dapat membentuk spora, akan tetapi tidak semua basil mampu berbuat demikian. Beberapa spesies Bacillus yang aerob dan beberapa spesies Clostridium yang anaerob dapat membentuk spora. Spora ini lazim disebut endospora, dikarenakan spora itu dibentuk di dalam sel (Musyaraffalah, 2010).

Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas. Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (kedua-duanya transparan, sel vegetatif berwarna), sehingga diperlukan teknik pewarnaan endospora. Berikut merupakan beberapa tipe endospora dan contohnya (Irawan, 2008):

Tabel B.1. bentuk dan jenis BakteriNo. Bentuk Contoh Jenis1. Coccus (sphere) Neisseria, Veillonella, Enterococcus

Page 4: Pengecatan Gram

2. Coccobacilli Moraxella, Acinetobacter3. Bacilli (rod), rounded ends Escherichia, Lactobacilus, clostridium4. Vibrio (curved) Vibrio, Bdellovibrio, Anycylobacter5. Bacilli (Rod), blunt end Bacillus6. Helical (spirillum) Spirochaeta, Spirillum, Campylobacter7. Diplococcus Neisseria, Moraxella8. Streptococcus Streptococcus9. Streptobacillus Bacillus, Mycobacterium10. Staphylococcus Staphylococcus11. Tetrad (Gaffkya) Deinococci, Pediococcus, Micrococcus12. Sarcina (cuboid packets) Sarcina

Endosopora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya, tetapi sekali

diwarnai, zat warna tersebut akan sulit hilang. Hal inilah yang menjadi dasar dari metode

pengecatan spora secara umum. Pada metode Schaeffer-Fulton yang banyak dipakai dalam

pengecatan endospora, endospora diwarnai pertama dengan malachite green dengan proses

pemanasan. Larutan ini merupakan pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi ke dalam

endospora. Setelah perlakuan malachite green, biakan sel dicuci dengan air lalu ditutup dengan

cat

safranin. Teknik ini akan menghasilkan warna hijau pada endospora dan warna merah muda pada sel vegetatifnya (Prescott, 2002)

Berikut merupakan beberapa tipe endospora dan contohnya :Gambar B.1 Tipe Endospora

Contoh bakteri Gram positif adalah Streptococcus, Bacillus, Stapilococcus, Clostridia, Corynebacterium dhypteriae, Peptococcus, Peptostreptococcus, dll. Contoh bakteri Gram negatif adalah Neisseria, Klebesiella, Vellonella, Shigella, Salmonella, Hemophillus, dll.

Gambar B.2 Berbagai Bentuk Bakteri.

Page 5: Pengecatan Gram

E. coli merupakan bakteri berbentuk batang dengan panjang sekitar 2 micrometer dan diamater 0.5 micrometer. Volume sel E. coli berkisar 0.6-0.7 micrometer kubik. Bakteri ini termasuk umumnya hidup pada rentang 20-40 derajat C, optimum pada 37 derajat. Kita mungkin banyak yang tidak tahu jika di usus besar manusia terkandung sejumlah E. coli yang berfungsi membusukkan sisa-sisa makanan. Dari sekian ratus strain E. coli yang teridentifikasi, hanya sebagian kecil bersifat pathogen, misalnya strain O157:H7. Bakteri yang namanya berasal dari sang penemu Theodor Escherich yang menemukannya di tahun 1885 ini merupakan jenis bakteri yang menjadi salah satu tulang punggung dunia bioteknologi. Hampir semua rekayasa genetika di dunia bioteknologi selalu melibatkan E. coli akibat genetikanya yang sederhana dan mudah untuk direkayasa. Riset di E. coli menjadi model untuk aplikasi ke bakteri jenis lainnya. Bakteri ini juga merupakan media cloning yang paling sering dipakai. Teknik recombinant DNA tidak akan ada tanpa bantuan bakteri ini (Yalun, 2008).

Staphylococcus aureus (S. aureus) adalah bakteri gram positif yang menghasilkan pigmen kuning, bersifat aerob fakultatif, tidak menghasilkan spora dan tidak motil, umumnya tumbuh berpasangan maupun berkelompok, dengan diameter sekitar 0,8-1,0 µm. S. aureus tumbuh dengan optimum pada suhu 37oC dengan waktu pembelahan 0,47 jam. S. aureus merupakan mikroflora normal manusia[. Bakteri ini biasanya terdapat pada saluran pernafasan atas dan kulit. Keberadaan S. aureus pada saluran pernafasan atas dan kulit pada individu jarang menyebabkan penyakit, individu sehat biasanya hanya berperan sebagai karier. Infeksi serius akan terjadi ketika resistensi inang melemah karena adanya perubahan hormon; adanya penyakit, luka, atau perlakuan menggunakan steroid atau obat lain yang memengaruhi imunitas sehingga terjadi pelemahan inang (Anonim, 2010).

Bacillus cereus merupakan bakteri Gram-positif, aerob fakultatif, dan dapat membentuk spora. Selnya berbentuk batang besar dan sporanya tidak membengkakkan sporangiumnya. Sifat-sifat ini dan karakteristik-karakteristik lainnya, termasuk sifat-sifat biokimia, digunakan untuk membedakan dan menentukan keberadaan B. cereus , walaupun sifat-sifat ini juga dimiliki oleh B. cereus var. mycoides , B. thuringiensis dan B. anthracis . Organisme-organisme ini dibedakan berdasarkan pada motilitas/gerakan (kebanyakan B. cereus motil/dapat bergerak), keberadaan kristal racun (pada B. thuringiensis ), kemampuan untuk menghancurkan sel darah merah (aktivitas hemolytic ) ( B. cereus dan lainnya bersifat beta haemolytic sementara B. anthracis tidak bersifat hemolytic ), dan pertumbuhan rhizoid (struktur seperti akar), yang merupakan sifat khas dari B. cereus var. mycoides . dipaparkan bahwa bakteri bacillus cereus yang terdapat di tanah sangat senang menempel pada biji-bijian seperti beras.Untuk itu, sebaiknya nasi yang tidak dimakan, disimpan saja dalam lemari es. Selain itu, dalam artikel ini dijelaskan bahwa produk-produk seperti chicken nugget, daging giling, daging olahan, ataupun ayam, juga perlu diperhatikan, mulai dari proses pembelian, penyimpanan, dan juga saat pengolahan. Karena, apabila kita salah mengelola proses-proses tersebut, bukan tidak mungkin akan menyebabkan keluhan dalam pencernaan kita (Anggraini, 2009).

C.    ALAT DAN BAHAN1.      Alat-alat yang digunakan adalah :a)      Kaca objek bersihb)      Pembakar Bunsen/spiritusc)      Jarum inokulasi

Page 6: Pengecatan Gram

d)     Mikroskop e)      Hot platef)       Bak pewarna2.      Bahan-bahan yang digunakan adalah :a)      Pewarna kristal violet, larutan iodium, alcohol-aceton, malakit hujaub)      Minyak imersic)      Air sulingd)      Isolat / biakan : Bakteri Stapilococcus aureus, Bakteri Bacillus cereus, E. coli, dan Isolat X

D.    CARA KERJA1.      PEWARNAAN GRAMa)      Membersihkan 2 (dua) kaca objekb)      Meneteskan aquades diatas kaca objekc)      Membuat apusan bakteri e.coli dan Stapilococcus aureus dengan teknik sterild)     Membiarkan apusan mengering diudarae)      Melakukan fiksasi panas diatas nyala Bunsen beberapa kalif)       Mengaliri apusan dengan pewarna kristal violet dan diamkan selama 60 detik (1 menit)g)      Mendekolorisasi dengan alcohol 95%. Tambahkan reagen setetes demi setetes hingga kristal

violet tidak tercuci lagi dari apusanh)      Megaliri dengan air yang mengaliri)        Memberi pewarna kontras dengan safranin, diamkan selama 30 detikj)        Mencuci dengan air yang mengalirk)      Mengeringkan diatas kertas saring, amati dibawah mikroskop

2.      PEWARNAAN SPORAa)      Membersihkan kaca objek dari lemak dan kotoranb)      Membuat apusan bakteri Bacillus cereus dengan teknik asepticc)      Membiarkan mengering diudarad)     Mengaliri apusan dengan pewarna Malachite green dan letakkan diatas pemanas selama 60 detik

(1 menit). Jika pewarna mulai mengering, kembali meneteskan. e)      Mengambil preparat dari pemanas, mendinginkan dan mencuci dengan air mengalir.f)       Mewarnai dengan pewarna kontras safranin selama 30 detik.g)      mengeringkan diatas kertas isap, dan mengamati dibawah mikroskopE.     HASIL PENGAMATAN1.      Pewarnaan Gram

No.

Nama Bakteri Bentuk

1. E. Coli       Bentuk batang

pendek       Bakteri gram negatif

2. Stapilococcus aureus       Bentuk coccus

rantai       Bakteri gram positif

3. Isolat X

Page 7: Pengecatan Gram

       Bentuk batang        Bakteri gram positif

Page 8: Pengecatan Gram

2.      Pewarnaan Spora

No. Nama Bakteri Bentuk1. Bacillus cereus

Bentuk batang dan berspora

2. Isolat XBentuk batang dan berspora

Page 9: Pengecatan Gram

F.     PEMBAHASAN

Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidoglikan yang tebal (25-50 nm) sedangkan bakteri negatif lapisan peptidoglikan gennya tipis (1-3 nm).

Reagen-reagen yang digunakan dalam pengecatan gram adalah:1.      Larutan violet kristal sebagai cat utama yang akan diikat oleh peptidoglikan bakteri.2.      Lugol sebagai mordan untuk mengintensifkan cat utama3.      Ethanol 95% (secukupnya sampai cat utama luntur), sebagai bahan peluntur untukk melunturkan

cat utama4.      Safranin (1 tetes) sebagai cat penutup untuk mewarnai kembali sel-sel yang sudah kehilangan

warna cat utamanya. Pada saat pemberian larutan cat kristal violet, bakteri gram positif dan negatif sama-sama berwarna ungu. Saat ditetesi iodin, pada gram positif terbentuk kompleks iodin kristal violet sehingga sel berwarna biru, demikian juga gram negatif. Namun setelah pencucian dengan etanol warna ungu yang diikat oleh bakteri gram negatif luntur, sedangkan pada bakteri gram positif tidak. Pada gram negatif lemak terekstraksi dari dinding sel sehingga pori membesar dan kompleks violet kristal-iodin keluar sel, sedangkan pada gram positif dinding sel dehidrasi, pori berkerut dan permeabilitas rendah sehingga kompleks violet kristal-iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma sehingga sel tetap biru/ungu. Saat penambahan safranin, bakteri gram negatif mengikatnya sedangkan gram positif melewatkannya.

Page 10: Pengecatan Gram

Hasil pengamatan pada bakteri yang diberi pewarnaan menunjukkan : 1.      Bakteri E. coli

Hasil pewarnaan terhadap bakteri E. coli mennjukkan bahwa pada saat ditetesi dengan larutan Kristal violet maka berwarna ungu artinya bahwa zat tersebut terikat oleh peptidoglikan bakteri. Selanjutnya diberi lugol yang bertujuan untuk mengintensifkan cat utama (Kristal violet), kemudian ditetsi dengan akohol yang bertujuan untuk melunturkan cat utama. Pengamatan pada bakteri E. coli, etanol mampu melunturkan cat utama sehingga pada saat pengecatan dengan safranin sel menyerap warna tersebut. Hal ini berarti bahwa bakteri E.coli memiliki membran yang dilapisi oleh peptidoglikan yang lebih tipis. Dari ciri yang diperoleh pada pengamatan tersebut maka disimpulkan bahwa bakteri E. coli merupakan bakteri gram negatif. Pada gram negatif lemak terekstraksi dari dinding sel sehingga pori membesar dan kompleks violet kristal-iodin keluar sel, hal tersebutlah yang menyebabkan hilangnya warna ungu pada sel tersebut. Selanjutnya pengamatan dibawah mikroskop menunjukkan bahwa bentuk bakteri E. coli adalah batang pendek.

2.      Bakteri Stapiloccocus AureusPada pengecatan bakteri ini menunjukkan bahwa pengecatan dengan Kristal violet memberikan warna ungu, kemudian dengan lugol yang berfungsi untuk mengintensifkan cat utama. Selanjutnya bakteri tersebut ditetesi alcohol yang bertujuan untuk melunturkan cat utama. Dan yang terakhir pengecatan dilakukan dengan safranin untuk mewarnai kembali sel-sel yang sudah kehilangan warna cat utamanya. Pengecatan dengan alkohol tidak dapat melunturkan cat utama (sel tetap berwarna ungu) sehingga pada saat pangecatan dengan safranin sel tidak akan menyerap warna tersebut. Dari ciri tersebut maka dapat disimpulkan bahwa Stapiloccocus Aureus adalah bakteri gram positif. Pada bakteri garm positif dinding sel dehidrasi, pori berkerut dan permeabilitas rendah sehingga kompleks violet kristal-iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma sehingga sel tetap biru/ungu. Saat penambahan safranin, bakteri gram negatif mengikatnya sedangkan gram negatif melewatkannya. Selanjutnya dengan menggunakan mikroskop, dapat ditentukan bentuk bakteri tersebut. Bakteri ini berbebtuk coccus berantai.

3.      Bakteri Basilus Cereus (Pewarnaan Endospora)Endospora adalah struktur spesifik yang ditemukan pada beberapa jenis bakteri. Karena

kandungan air endospora sangat rendah bila dibandingkan dengan sel vegetatifnya, maka

endospora berbentuk sangat padat dan sangat refraktil bila dilihat di bawah mikroskop.

Endospora sangat sukar diwarnai dengan pewarna biasa, sehingga harus digunakan pewarna

spesifik dan yang biasa digunakan adalah malachite green.

Endosopora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya, tetapi sekali diwarnai,

zat warna tersebut akan sulit hilang. Hal inilah yang menjadi dasar dari metode pengecatan spora

secara umum. Pada metode Schaeffer-Fulton yang banyak dipakai dalam pengecatan endospora,

endospora diwarnai pertama dengan malachite green dengan proses pemanasan. Larutan ini

merupakan pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi ke dalam endospora. Setelah perlakuan

malachite green, biakan sel dicuci dengan air lalu ditutup dengan cat safranin. Teknik ini akan

menghasilkan warna hijau pada endospora dan warna merah muda pada sel vegetatifnya.

Page 11: Pengecatan Gram

Hasil pengamatan dengan menggunakan mikroskop pada pewarnaan spora terhadap bakteri Bacillus cereus, diperlihatkan bahwa bakteri Bacillus cereus memiliki spora yang berupa endospora, yaitu spora yang dihasilkan di dalam sel vegetatif. Pada pewarnaan ini, spora dari bakteri Bacillus cereus berwarna hijau, dan tampak berbentuk oval. Sel vegetative bakteri berwarna merah.

4.      Isolat XIsolat X adalah isolate yang berasal dari lingkungan yang telah diisolasi pada percobaan sebelumnya (berasal dari telapak tangan).Dengan menggunakan prosedur yang sama seperti di atas, pada pewarnaan gram terhadap isolat X menunjukkan bahwa sel pada isolate tersebut merupakan bakteri gram positif, meskipun hasil pengamatan dengan mikroskop terlihat bahwa sel tersebut transparan. Hal ini dapat saja terjadi akibat dari pelunturan warna cat karena membiarkan alcohol terlalu lama pada isolate tersebut. Sedangkan pada pewarnaan spora terlihat bahwa bakteri pada isolat tersebut memiliki spora dan bentuk sel berupa batangan.

G.    KESIMPULAN

Berdasarkan tujuan percobaan dan pengamatan yang telah dilakukan, maka dapat disimpulkan hal-hal sebagai berikut:

1.      Pewarnaan struktur sel bakteri (pewarnaan gram) dilakukan dengan cat Kristal violet sebagai cat utama, lugols iodine yang mengintensifkan cat utama, alcohol sebagai peluntur dan safranin,

2.      Pada pewarnaan spora digunakan malachite green.3.      Bakteri e.coli termasuk bakteri gram negatif dan bakteri Stapilococcus aureus termasuk bakteri

gram positif4.      Sel bakteri Stapilococcus aureus berbentuk coccus yang berantai (stapilococcus), dan sel

bakteri E. coli, B. sereus bertebntuk batang.5.      Bakteri Bacillus cereus mempunyai spora yang berbentuk oval.6.      Bentuk isolat X adalah batang, merupakan bakteri garam positif dan mempunyai spora.

Page 12: Pengecatan Gram

DAFTAR PUSTAKA

Anggraini. D. 2009. Bakteri penyebab diare. . http://id.shvoong.com/medicine-and-health di akses pada 4 Mei 2011

Anonim. 2011. Petunjuk Praktikum Biologi. Program Magister Pendidikan IPA. Universitas Mataram. Mataram

Anonim, 2010. Stapiloccocus. http://id.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus_aureus di akses pada 4 Mei 2011

Arif, P. 2011. Pengecatan Gram. http://parahrif.blogspot.com/011/04/pengecatan-gram.html. diakses pada 4 Mei 2011

Campbell, N. A. Dan Reece, J. B., 2005. Biologi Jilid 2. Erlangga. Jakarta

Caray. 2008. Pewanaan Bakteri. http://makalahdanskripsi.blogspot.com. Di akses pada 4 Mei 2011

Irawan, 2008. Teknik Pewarnaan Mikroba. http://wordbiology.wordpress.com. Diakses pada 4 Mei 2011

Junaidi. W. 2010. Pewarnaan gram. http://wawan-junaidi.blogspot.com. Di akses pada 4 Me1 2011Musyappalaf, R. 2010. Pewarnaan spora bakteri. http://ripanimusyaffalab.blogspot.com di akses pada

4 Mei 2011

Suriawiria, U. 1985. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Gramedia. Jakarta.

Volk, W. A. dan Margareth F. W., 1998. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta : Erlangga.

Yalun. 2008.Mengenal Bakteri E.coli. http://yalun.wordpress.com/2008 diakses pada 4 mei 2011

Pengecatan GramKebanyakan sel bakteri tidak berwarna, sehingga jika dilarutkan dalam air dan diperlihatkan di bawah mikroskop tidak memperlihatkan warna kontras dengan medium disekelilingnya. Beberapa zat yang digunakan untuk mengamati struktur bagian dalam sel. Dalam pewarnaan mikroba, dapat digunakan satu jenis warna, cara ini disebut pewarnaan sederhana. Zat-zat warna yang biasa digunakan untuk pewarnaan bekteri dapat dibedakan atas beberapa golongan yaitu: pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial, pewarnaan strukturan dan pewarnaan untuk menguji adanya komponentertentu di dalam sel (Anonim, 2007)Karakteristik taksonomi penting bakteri adalah reaksi mereka terhadap pewarnaan gram. Pewarnaan gram menjadi penting karena reaksi gram berhubungan dengan sifat morfologi lain dalam bentuk hubungan filogenik. Organisme yang berpotensi gram positif mungkin hanya dapat dilihat dengan pewarnaan gram pada kondisi lingkungan yang sesuai dan pada biakan muda. Prosedur pewarnaan gram

Page 13: Pengecatan Gram

dimulai dengan pemberian pewarna basa, kristal violet. Larutann iodine kemudian ditambahkan; semua bakteri akan diwarnai biru pada fase ini. Sel kemudian diberi alkohol. Sel gram positif akantetap mengikat senyawa kristal violet-iodine, tetap berwarna biru; sel gram negatif warnanya hilang oleh alkohol. Sebagai langkah terakhir, counterstain (misalnya Safranin pewarna merah) ditambahkan, sehingga sel gram negatif yang tidak berwarna, akan mengambil warna kontras; sedangkan sel gram positif terlihat dalam warna biru (Jawetz, etc. 2001).

BAB IPENDAHULUAN

1.1  Latar Belakang

Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram, pada tahun 1884. Dengan metode pengecatan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. Bakteri yang dapat mengikat cat, menjadi berwarana violet jika dilihat dengan mikroskop, adalah bakteri gram positif. Bakteri yang lain yang tidak dapat mengikat cat adalah bakteri gram negatif dan nampak berwarna merah muda.

Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatan yang dikerjakan di laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme. Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu (pengecatan Gram) dapat digunakan untuk identifikasi awal. Pemeriksaan ini dapat dilakukan dengan cepat dan biaya murah serta, dalam kasus tertentu, dapat membantu dokter untuk memulai terapi suatu penyakit tanpa menunggu hasil kultur.

1.2  Tujuan Praktikum         Mahasiswa dapat mengetahui dan memahami morfologi bakteri dengan cara melakukan

pengecatan.         Mahasiswa dapat mengetahui cat yang umum dipakai dalam pengecatan bakteri yaitu

pengecatan Gram.         Mahasiswa dapat mengetahui perbedaan antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif.

Page 14: Pengecatan Gram

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Berdasarkan tehnik pengecatan gram, dibagi menjadi bakteri gram positif (dinding sel peptidoglikan tebal) dan gram negatif ( dinding sel peptidoglikan tipis dan tertutup oleh sebuah lapisan lipopolisakarida). Christian gram, bakteriolog Denmark, pada tahun 1843 mengelompokkan bakteri menjadi dua golongan berdasarkan reaksi pengecatan. Kedua golongan tersebut, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Bakteri gram positif adalah bakteri yang tidak dapat dihilangkan warnanya dengan etil alkohol 95% setelah pengecatan dengan violet dan iodine menghasilkan warna ungu. Bakteri gram negatif adalah bakteri yang warnanya mudah dihilangkan dengan cara sama sehingga sulit dilihat oleh mikroskop, oleh karena itu perlu pengecatan counterstain untuk memunculkan warna merah sehingga dapat dilihat oleh mikroskop (Sudjino, 2007).

Sel bakteri secara keseluruhan atau bagian dari sel memungkinkan untuk di cat dengan berbagai cat atau warna. Kemampuannya untuk mengikat cat tergantung atas spesies bakteri. Cat yang umum dipakai adalah cat Gram. Bakteri yang dapat mengikat cat, menjadi warna violet jika dilihat dengan mikroskop adalah bakteri Gram positif, bakteri yang lain yang tidak dapat mengikat cat adalah bakteri Gram negatif dan Nampak berwarana merah muda (Gaman, 1992).

BAB III

Page 15: Pengecatan Gram

MATERI DAN METODE PRAKTIKUM

3.1 Materi PraktikumA. Alat Praktikum

Adapun alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah :1.      Tabung Reaksi2.      Pipet3.      Cawan petri4.      Kertas label5.      Incubator6.      Kapas7.      Slide Glass8.      Ose9.      Lampu Bunsent10.  Mikroskop Cahaya11.  Jembatan Pengecatan

B. Bahan PraktikumAdapun bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah :

1.      NACL2.      Media NA3.      Sampel (Kuning telur yang sudah di pasteurisasi dengan suhu 37O C selama 5 menit)4.      Crystal Violet (Cat Dasar)5.      Cairan Lugol (Cat Penguat)6.      Etanol 96%7.      Vuchen

3.2 Metode Praktikum

1.      Siapkan alat dan bahan2.      Ambil satu tetes NaCl fisiologis dengan memakai pipet kemudian teteskan pada slide.3.      Ambil biakan bakteri atau mikroba (satu mata ose) kemudian campur dengan merata dengan

NaCl, kemudian setelah tercampur lakukan fiksasi (pemijaran) di atas api, panaskan sampai mengering agar mikroba mati.

4.      Setelah itu lakukan pengecatan dengan:

Page 16: Pengecatan Gram

a.       Gentian violet atau Kristal violet yang berguna sebagai cat dasar Caranya:

  preparat yang sudah kering letakkan pada jembatan pengecatan, dan teteskan 1 tetes kemudian ratakan dan diamkan selama satu menit

  lakukan pencucian dengan air mengalir dan tiriskanb.      pengecatan dengan lugol sebagai cat penguat dengan cara yang sama seperti pada pengecatan

pertama.c.       Pengecatan dengan Etanol 96 % sebagai cat peluntur dengan cara yang sama seperti pada

pengecatan sebelumnya dengan waktu 15 detikd.      Pengecatan dengan vuchin dengan cara sama seperti pengecatan sebelumnya dengan waktu 90

detik atau 2 menit5.      Lakukan pengeringan dengan diangin-anginkan sampai kering6.      Lakukan pemeriksaan warna morfologi morfologi di bawah mikroskop cahaya dengan

pembesaran 100x oil emertion sebanyak satu tetes untuk memperjelas objek.7.      Bersihkan dan kembalikan alat dan bahan pada tempatnya.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil PraktikumHasil pengamatan dengan mikroskop (pembesaran 100 x dan ditambahkan oil imersil

sebanyak satu tetes).

Page 17: Pengecatan Gram

4.2 PembahasanDalam praktikum ini dilakukan percobaan mengenai Pengecatan Gram. Metode

pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram, pada tahun 1884. Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatan yang dikerjakan di laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme. Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu (pengecatan Gram) dapat digunakan untuk identifikasi awal.

Dalam pewarnaan mikroba, dapat digunakan satu jenis zat pewarna, cara ini disebut pewarna sederhana. Zat-zat warna yang biasa digunakan untuk pewarna sederhana misalnya biru methilen. Pewarna bakteri dapat dibedakan atas beberapa golongan yaitu : pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial, pewarnaan structural, dan pewarnaan untuk menguji adanya komponen tertentu di dalam sel. Dalam praktikum ini dilakukan empat kali pengecatan yaitu: cristal violet yang berfungsi sebagai cat dasar, setelah itu pengecatan dilakukan dengan cairan lugol yang berfungsi sebagai cat penguat kemudian dengan etanol 96% sebagai cat peluntur dan pengecatan dengan vuchin yang berfungsi sebagai cat penutup. Sel bakteri secara keseluruhan atau bagian dari sel memungkinkan untuk di cat dengan berbagai cat atau warna. Kemampuannya untuk mengikat cat tergantung atas spesies bakteri. Cat yang umum dipakai adalah cat Gram. Dengan metode pengecatan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp.

Setelah melakukan praktikum dan diamati dengan mikroskop dengan pembesaran 100 x dan ditambahkan oil imertion sebanyak satu tetes untuk memperjelas objek pada mikroskop sehingga dihasilkan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Bakteri yang dapat mengikat cat menjadi berwarana violet jika dilihat dengan mikroskop, adalah bakteri gram positif. Bakteri yang lain yang tidak dapat mengikat cat adalah bakteri gram negatif dan nampak berwarna merah muda.

Page 18: Pengecatan Gram

BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

Berdasarkan praktikum yang sudah dilaksanakan dapat disimpulkan beberapa hal sebagai berikut:

1.      Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap pengecatannya.

2.      Bakteri yang dapat mengikat cat, menjadi warna violet jika dilihat dengan mikroskop adalah bakteri Gram positif dan bakteri yang lain yang tidak dapat mengikat cat adalah bakteri Gram negatif dan nampak berwarana merah muda.

5.2 Saran

Untuk mendapatkan hasil praktikum yang baik diharapkan kepada semua praktikan datang tepat waktu, mengikuti praktikum sesuai dengan arahan dari co. assisten dan tata tertib yang ada dan memperhatikan keselamatan kerja selama kegiatan praktikum berlangsung.

Page 19: Pengecatan Gram

DAFTAR PUSTAKA

Gaman, P.M. 1992. Pengantar Ilmu Pangan Nutrisi dan Mikrobiologi. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press

Sudjino, dkk. 2007. Biologi. Jakarta: Intan Pariwara

BAB IIACARA II

PENGECATAN BAKTERIA. Pendahuluan1. Latar BelakangSeorang mikrobiologiwan apabila akan mendiagnosis suatu penyakit haruslahmemeriksa suatu mikroorganisme secara amat terperinci. Untuk memerinci suatumikroorganisme tersebut maka dapat dilakukan dengan pengecatan bakteri.Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatan yang dikerjakan dilaboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme.Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang khasterhadap pengecatan tertentu (pengecatan Gram) dapat digunakan untuk identifikasiawal.Supaya bakteri dapat dilihat dengan mudah dan dipalajari maka tingkat selkontras itu dapat ditingkatkan dengan cara pewarnaan. Yang dimaksud denganpewarnaan disini adalah perlakuan dengan zat warna yang mengikat secara selektifbaik seluruh sel maupun komponen sel tertentu, sehingga dapat menghasilkanpenyerapan cahaya yang jauh lebih besar. Kebanyakan perlakuan pewarnaan dapatmembunuh sel oleh karena itu sebelum sel itu difiksasi dengan perlakuan memakaizat kimia yang bertujuan untuk mengurangi perubahan struktur sel yang telah mati.Zat untuk fiksasi yang biasa digunakan adalah asam osmat dan aldehid, terutam glutaraldehid. Salah satu bakteri yang sering diamati dengan menggunakan pewarnaanadalah bakteri gram. Warna yang terlihat di mikroskop adalah menunjukkan jenisbakteri gram tersebut positif atau negative

2. Tujuan praktikumTujuan dilaksanakannya praktikum ini adalah untuk mengetahui carapengecatan gram dan mengamati bentuk serta sifat bakteri terhadappengecatan gram.

Page 20: Pengecatan Gram

B. Tinjauan pustakaKebanyakan sel bakteri tidak berwarna, sehingga jika dilarutkan dalam air dandiperlihatkan di bawah mikroskop tidak memperlihatkan warna kontras denganmedium disekelilingnya. Beberapa zat yang digunakan untuk mengamati strukturbagian dalam sel. Dalam pewarnaan mikroba, dapat digunakan satu jenis warna, caraini disebut pewarnaan sederhana. Zat-zat warna yang biasa digunakan untukpewarnaan bekteri dapat dibedakan atas beberapa golongan yaitu: pewarnaansederhana, pewarnaan diferensial, pewarnaan strukturan dan pewarnaan untukmenguji adanya komponentertentu di dalam sel (Anonim, 2007)Karakteristik taksonomi penting bakteri adalah reaksi mereka terhadappewarnaan gram. Pewarnaan gram menjadi penting karena reaksi gram berhubungandengan sifat morfologi lain dalam bentuk hubungan filogenik. Organisme yangberpotensi gram positif mungkin hanya dapat dilihat dengan pewarnaan gram padakondisi lingkungan yang sesuai dan pada biakan muda.Prosedur pewarnaan gram dimulai dengan pemberian pewarna basa, kristalviolet. Larutann iodine kemudian ditambahkan; semua bakteri akan diwarnai birupada fase ini. Sel kemudian diberi alkohol. Sel gram positif akantetap mengikatsenyawa kristal violet-iodine, tetap berwarna biru; sel gram negatif warnanya hilangoleh alkohol. Sebagai langkah terakhir, counterstain (misalnya Safranin pewarnamerah) ditambahkan, sehingga sel gram negatif yang tidak berwarna, akanmengambil warna kontras; sedangkan sel gram positif terlihat dalam warna biru(Jawetz, etc. 2001).

Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatan yang dikerjakan dilaboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme.Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang khasterhadap pengecatan tertentu (pengecatan Gram) dapat digunakan untuk identifikasiawal. CatGram yang digunakan terdiri dari 4 macam yang masing-masingmempunyai komposisi dan fungsi yang berbeda, yaitu:1. Cat Gram ACat Gram A berwarna ungu (karena mengandung kristal violet). Cat Gram Amerupakan cat primer yang akan memberi warna mikroorganisme target. Pada saatdiberi cat ini, semua mikroorganisme akan berwarna ungu sesuai warna cat Gram A.2. Cat Gram BCat Gram B berwarna coklat. Cat Gram B merupakan cat Mordan, yaitu catatau bahan kimia yang berfungsi memfiksasi cat primer yang diserap mikroorganismetarget. Akibat pemberian cat Gram B, maka pengikatan warna oleh bakteri akan lebihbaik (lebih kuat).3. Cat Gram CCat Gram C tidak berwarna. Cat ini berfungsi untuk melunturkan catsebelumnya. Akibat pemberian cat C akan terjadi 2 kemungkinan yang pertanamamikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu, karena tahan terhadap alkohol.

Page 21: Pengecatan Gram

Ikatan antara cat dengan bakteri tidak dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifatdemikian disebut bakteri Gram positif. Sedangkan bakteri akan tidak berwarna,karena tidak tahan terhadap alkohol. Ikatan antara cat dengan bakteri dilunturkan olehalkohol. Bakteri yang bersifat demikian dikelompokkan sebagai bakteri Gram negatif.4. Cat Gram DCat ini berwarna merah. Cat ini merupakan cat sekunder atau kontras. Cat iniberfungsi untuk memberikan warna mikroorganisme non target. Cat sekundermempunyai spektrum warna yang berbeda dari cat primer. Akibat pemberian catGram D, akan terjadi 2 kemungkinan yang pertama bakteri Gram positif akan tetapberwarna ungu, karena telah jenuh mengikat cat Gram A sehingga tidak mampu lagi

mengikat cat Gram D. Sedangkan yang kedua bakteri Gram negatif akan berwarnamerah, karena cat sebelumnya telah dilunturkan oleh cat Gram C maka akan mampumengikat cat Gram D.pengecatan gram mempunya kelebihan dimana pengecatan Gram pentingsebagai pedoman awal untuk memutuskan terapi antibiotik, sebelum tersedia buktidefinitif bakteri penyebab infeksi (kultur dan tes kepekaan bakteri terhadapantibiotik). Hal ini karena bakteri Gram positif dan negatif mempunyai kepekaanyang berbeda terhadap berbagai jenis antibiotika. Selain itu kadang-kadang morfologibakteri yang telah dicat Gram mempunyai makna diagnostik. Misalnya padapemeriksaan Gram ditemukan Gram negatif diplococci intraseluler dari spesimen pus(nana) uretral, maka memberikan presumptive diagnosis untuk penyakit infeksigonore. Disamping itu pengecatan gram juga mempunyai kekurangan dimanapengecatan Gram memerlukan mikroorganisme dalam jumlah banyak yakni lebih dari104 per ml. Sampel yang cair dengan jumlah kecil mikroorganisme misalnya cairanserebrospinal, memerlukan prosedur sentrifuge dulu untuk mengkonsentrasikanmikroorganisme tersebut. Pellet (endapan hasil sentrifuge) kemudian dilakukanpengecatan untuk diperiksa secara mikroskopis (http://septa-ayatullah.blogspot.com)Untuk memberi ciri pada beragai kelompok bakteri perlu dipahami bahwasemua cirri tidak sama pentingnya bagi semua kelompok. Sebagai contoh, peaksipewarnaan gram penting bagi bakter batang dan kokus tetapi bukanlah cirri pembedabagi Spiroketa. Ada tidaknya flagella serta penataannya penting bagi beberapakelompok sedang bagi yang lain tidak. Untuk beberapa kelompok , sifat-sifatbiokimia lebih berarti daripada sifat morfologi. Karena itu, untuk mencirikankelompok bakteri, janganlah mengharapkan adanya sifat-sifat yang sama (Peltzar,1986).Bentuk bakteri bermacam-macam. Ada yang bulat (tipe kokus) dengan garistengah 0,15-1mikorn. Ada yang berbentuk batang atau slindris panjang atau pendek(tipe basil) dan ada yang berbentuk slindris, spiral panjang atau pendek (spirillum)yang garis tengahnya 0,3-3 mikron, sedangkan panjangnya 1 sampai lebih dari 6

Page 22: Pengecatan Gram

mikron. Umumnya bakteri bersel tunggal tidak mempunyai klorofil serta berkembangbiak dengan cara membelah dan spora. Tiap sel dikelilingi oleh dinding sel ataumembrane yang menyerupai lendir. Jika berkelompok, wujudnya seperti lendir yangkental dan berbentuktidak teratur, ada yang panjang, bulat, atau lapisan tipis sepertibuih. Bakteri itu ada yang inaktif atau tidak dapat bergerak. Ada pula bakteri yangbisa berenang atau bergerak akibat adanya bulu-bulu yang bisa bergetar (Pracaya,2008).Ada kalanya suatu sediaan perlu diwarnai dua kali. Setelah zat warna yangpertama (ungu) terserap, maka sediaan dicuci degnan alcohol, kemudian ditumpangidengan zat warna yang berlainan, yaitu dengan zat warna merah. Jika sediaan itukemudian kita cuci dengan air, lalu dengan alcohol, maka dua kemungkinan akanterjadi. Pertama, zat warna tambahan terhapus, sehingga yang menampak ialah zatwarna yang asli (ungu). Dalam hal ini sediaan (bakteri) kita sebut gram positif.Kedua, zat warna tambahan (merah) bertahan hingga zat warna asli tidak nampak.Maka sediaan (bakteri) kita katakan gram negative. Adapula zat bakteri pada usiatertentu berubah dari gram positif menjadi gram negative atau sebaliknya. Bekteriyang demikian itu disebut dengan gram variable (Dwidjoseputro, 1985).

C. Metodelogi praktikum1. Waktu dan Tempat PraktikumPraktikum ini dilaksanakan pada hari Rabu, 27 April 2010 diLaboratorium Mikrobiologi Fakultas Pertanian Universitas Mataram.2. Alat dan Bahan PraktikumAlat-alat yang digunakan adalah:1. Pipet tetes2. Gelas benda3. Jarum ose4. Mikroskop5. Lampu bunsen6. Pipet tetes7. Tabung reaksi8. Tissue, dan emberBahan-bahan yang dibutuhkan adalah:1. Isolate bakteri dari hasil purifiksi2. Air steril3. Alcohol 70%4. Cat nigrosin atau tinta cina (Gram A),5. Larutan Mordan (Gram B)6. Larutan pluntur (Gram C)7. Cat penutup (Gram D)

Page 23: Pengecatan Gram

3. Cara Kerjaa. Gelas benda yang akn digunakan dibersihkan terlebih dahulu denganalcoholb. Diambil suspensi biakan murni masing-masing bakteri secara aseptisdengan ose dan diletakkan pada permukaan gelas benda.c. Ditambahkan satu tetes larutan cat nigrosin atau tinta cina (Gram A) padasuspensi bakteri tersebut dan campurkan dengan batang gelas hinggamerata. Ratakan campuran tersebut dengan batang gelas sehinggaberbentuk lapisan tipis. Preparat selanjutnya dikering anginkan.d. Setelah dibiarkan beberapa saat, dilakukan pencucian dibawah air dandikering anginkan.e. Diteteskan larutan Mordan (Gram B) dan didiamkan selama 1-2 menit,kemudian dicuci di air mengalir din dikering anginkan.f. Diteteskan larutan pluntur (Gram C) dan dibiarkan selama 20-30 detik,kemudian dicuci di air mengalir dan dikering anginkan.g. Diberi cat penutup (Gram D) dan dibiarkan selama 2 menit, kemudiandicuci di air mengalir dan dikering anginkan.h. Diamati dibawah mikroskop dan diamati perbedaan antara bakteri Grampositif dengan Gram negative.

D. Hasil pengamatanTable 2. Pengamatan bakteri hasil pengecatan meliputi: warna dan bentuknyadibawah mikroskopSampelTanahBakteri/SeriPengenceranBentuk Warna KeteraganTanah Kebun 10-6 : A: BStreptobasil Merah Gram negatifStreptococcus Merah Gram negatif10-7 : A: BStreptococcus Merah Gram negatifStreptobasil Ungu Gram positifTanah TPA 10-6 : A: B: C10-7 : A

Page 24: Pengecatan Gram

Streptococcus Ungu Gram positifStreptococcus Ungu Gram positifStreptobasil Ungu Gram positifStreptococcus Merah Gram negatifTanah Sawah 10-6 : A Streptococcus Merah Gram negatifE. PembahasanPengecatan bakteri yang didapat dari hasil purifikasi pada acara I dilakukanpada tanggal 27 april 2010. Dari hasil pengecatan bakteri yang dilakukan dapatdijelaskan bahwa pada bakteri yang diisolasi dari tanah kebun dengan seripengenceran 10-6 ulangan I, diperoleh bakteri berbentuk basil (batang) yang berderetseperti rantai (streptobacil) berwarna merah yang menunjukkan bahwa bakteritersebut gram negative. Sedangkan pada ulangan II didapat bakteri berbentuk bulatberantai seperti tasbih (streptococus) dan berwarna merah yang menunjukkan bahwabakteri tersebut gram negative. Sementara dari seri pengenceran 10-7 ulangan Idiperoleh bakteri berbentuk streptococcus yang berwarna merah (gram negatif).Sedangkan pada ulangan II diperoleh bakteri berbentuk strepto bacil yang berwarnaungu pula (gram positif).

Pada bakteri yang diisolasi dari tanah disekitar tempat pembuangan akhir(TPA) dengan seri pengenceran 10-6 ulangan I, diperoleh bakteri berbentuk cocus(bulat) yang menyerupai tasbih (streptococus) berwarna ungu yang menunjukkanbahwa bakteri tersebut gram positif. Pada ulangan II didapat bakteri dengan bentukyang sama yaitu bulat berantai seperti tasbih (streptococus) yang berwarna ungumenunjukkan bahwa bakteri tersebut gram positif. Sedangkan pada ulangan IIIdidapatkan bakteri dengan bentuk streptobacil yang berwarna ungu (gram positif).Sementara dari seri pengenceran 10-7 ulangan I diperoleh bakteri berbentukstreptococcus yang berwarna merah (gram negatif).Pengamatan menggunakan alat bantu mikroskopseperti kegiatan diatasdilakaukn pula pada bakteri yang diisolasi dari tanah sawah dengan seri pengenceran10-6 makandiperoleh bakteri berbentuk cocus (bulat) yang menyerupai tasbih(streptococus) berwarna merah yang menunjukkan bahwa bakteri tersebutgramnegatif.F. KesimpulanDari pengamatan yang dialakukan dapt disimpulkan bahwa:1. Bentuk bakteri yang bersifat soil born pada tanaman umumnya berantaipanjang2. Bakteri yang paling banyak dijumpai pada semua sampel tanah yangdigunakan (tanah sawah, tanah kebun dan TPA) adalah bakteri yangberbentuk strptococus gram negative.3. Kebanyakan bakteri yang berifat soil born akan menyerap cat penutup padaproses pengecatannya (gram negatif)

Page 25: Pengecatan Gram

  Pengecatan Gram. Pengecatan ini pertama kali dikemukan oleh Cristian Gram (1884). Dengan

pengecatan ini film bakteri mula-mula dilapisi dengan larutan zat warna karbol gentinviolet

(karbol violet, karbol metal violet) dan didiamkan beberapa lama, kemudian disiram dengan

larutan iodium dan dibiarkan terendam dalam waktu yang sama, sampai tingkat pengecatan ini

selesai, semua bakteri akan berwarna ungu, selanjutnya preparat di dekolorisasi dengan alkohol

atau campuran alkohol dengan aseton sampai semua zat warna tampak luntur dari film. Setelah

dicuci dengan air, preparat diberi warna kontras (counterstan), seperti safranin korbol tuksin

encer, air tuksin, tengguli bismack, dan lain-lain. Diantara bermacam-macam bakteri yang dicat,

ada yang dapat menahan zat warna ungu (metil violet, kristal violet, gentian violet) dalam

tumbuhnya meskipun telah didekolorisasi dengan alkohol atau aseton. Dengan demikian tubuh

bakteri itu tetap berwarna ungu meskipun disertai dengan pengecatan oleh zat warna kontras,

warna ungu itu tetap dipertahankan. Bakteri yang memberi reaksi semacam itu dinamakan

bakteri gram positif, sebaliknya,  bakteri tidak dapat menahan zat warna setelah dikolorisasi

dengan alkohol akan kembali menjadi tidak berwarna dan bila diberikan pengecatan dengan zat

kontras, akan berwarna sesuai dengan zat warna kontras. Bakteri yang memperlihatkan reaksi

semacam ini dinamakan bakteri gram negatif (Irianto, 2006).