penentuan kadar histamin

Jasa Laboratorium Sucofindo

Penentuan Kadar Histamin Mulai berlaku : 29 September 2003 PO/MM/25 Revisi : 01 Halaman : 1 dari 7

1.0. Tujuan

Menentukan tingkat kebusukan dan kemunduran kualitas produk laut. 2.0. Ruang Lingkup

Metode ini dapat digunakan untuk menentukan kadar histamin dalam produk makanan laut.

3.0. Prinsip Analisa

Contoh di ekstrak dengan methanol 75 % (v/v). Hasil ekstraksinya dilewatkan pada kolom penukar ion, larutan orto phthaldialdehida yang ditambahkan ke eluat untuk menghasilkan turunan histamin yang dapat berfl uoresen. Intensitas fluoresen dari derivatnya ditentukan dengan fluorometer dan histaminnya ditentukan dengan menggunakan standar eksternal.

4.0. Referensi

AOAC Method 977.13. 5.0. Peringatan Keselamatan dan kesehatan Kerja

5.1. Asam Phosphat. H3PO4

Bila bekerja dengan asam fospat cegah terbentuknya uap atau mist. Beri cukup ventilasi. Jauhkan alat alat yang mudah terkorosi. Asam Fospat harus disimpan dalam wadah gelas atau yang tahan korosi. Jaga jangan sampai pecah atau bocor. Gudang harus berventilasi. Agar tidak mengkristal, Asam Fospat 85 % larutannya disimpan dalam suhu minimal 21 oC, dan untuk yang 80 % larutan disimpan dalam suhu minimal 40 oC. Gunakan respirator dengan udara tekan, SCBA untuk melindungi pernafasan, kaca mata dan perisai muka untuk melindungi mata serta sarung tangan (PVC, karet alam, neoprene) untuk melindungi kulit.

5.2. Asam Klorida, HCl Jika bekerja dengan asam klorida harus dalam lemari asam, Simpan di tempat dingin dan berventilasi. Lantai gedung harus tahan asam. Jauhkan dari bahan oksidator dan bahan alkali, serta sianida, sulfida, formaldehida, logam natrium, merkuri sulfat dan ammonium hidroksida. Periksa kebocoran wadah asam. Gunakan respirator kimia penyerap HCl atau respirator udara untuk melindungi pernafasan. Gunakan kaca mata dan perisai muka untuk melindungi mata dan muka dan gunakan sarung tangan (neoprene, nitrile) untuk melindungi kulit.

5.3. Ortho - phthaldialdehyde, C8H6O2

Jauhkan phthaldialdehyde dari cahaya. Simpan dalam wadah bertutup rapat, kering dan dingin (dibawah + 15 oC)



Gunakan baju kerja pada daerah kerja, tergantung dari konsentrasi dan jumlah isobutanol yang digunakan. Ketahanan baju kerja terhadap bahan kimia harus diuji oleh supplier. Gunakan respirator untuk melindungi pernafasan jika terbentuk uap atau aerosol. Gunakan pelindung mata dan sarung tangan jika diperlukan.

5.4. Natrium Hidroksida, NaOH Bila bekerja dengan NaOH cegah jangan sampai terbentuk kabut dan debu. Jaga dari kontak dengan air atau uap air. Bila melarutkan, tambahkan NaOH ke dalam air sedikit demi sedikit agar tidak memercik. Simpan dalam wadah yang rapat, berlabel dan di tempat yang dingin. Tempat penyimpanan harus tahan korosi. Pisahkan dari asam kuat, senyawa organohalogen dan nitro. Inspeksi periodik terhadap kebocoran wadah, sebab dapat merusak lantai. Gunakan respirator (filter debu) untuk melindungi pernafasan (bila terdapat debu). Gunakan kaca mata atau perisai muka untuk melindungi mata dan muka. Dan untuk melindungi kulit gunakan sarung tangan (karet, neoprene, PVC, PE) dan sediakan air pencuci tangan dan mata.

5.5. Methanol, CH3OH Gunakan sedikit bahan. Hindari terbentuknya uap. Ruang kerja harus berventilasi. Jauhkan nyala api dari sumber pemanas dari tempat bekerja dengan methanol. Wadah-wadah perlu digrounding untuk mencegah listrik statis pada waktu pengaliran bahan. Simpan dalam wadah tertutup rapat dalam ruang yang dingin, kering , berventilasi, bebas dari panas, loncatan api dan bara. Bahan inkompatibel : oksidator kuat dan basa kuat. Untuk melindungi pernafasan pergunakan respirator dengan penyerap uap organik, respirator dengan suplai udara atau SCBA,. Untuk melindungi kulit pergunakan sarung tangan (karet butil, karet alam dan neoprene). Untuk melindungi muka / mata pergunakan kacamata goggles dan perisai muka.

6.0. Kualifikasi Personil Personil yang melakukan pengujian harus lulusan minimal Sekolah Menengah Analis Kimia dan telah mendapatkan pelatihan mengenai prosedur ini.

7.0. Alat & Bahan Kimia

7.1. Alat Cuci semua peralatan yang terbuat dari plastik dan gelas dengan HCl (1 + 3) dan H2O sebelum digunakan. 7.1.1. Kolom kromatografi ukuran diameter dalamnya 200 x 7 mm dan

terbuat dari polietilen dan dihubungkan dengan kontes No. K 422372 kel F Hubs dan tabung teflon 45 cm. Atur kecepatan aliran sehingga lebih besar dari pada 3 mL/ menit dengan cara mengatur ketinggian dari pada kolom terhadap tabung outlet. Sebagai alternatif, dapat digunakan keran dua arah yang terdapat dalam tabung.



7.1.2. Flourometer

Dilengkapi dengan lampu Hg tekanan sedang dan dengan eksitasi pada 350 nm dan pengukuran flouresen pada 444 nm

7.1.3. Pipet gondok 1 mL dan 5 mL.

7.2. Bahan Kimia 7.2.1. Resin penukar ion 50 100 mesh ( Biorad) atau biorad AG 1 x8

Atau Dowex 1 X8, mesh 50 100. Tambahkan 15 mL NaOH untuk mengkonversikan ke bentuk OH. Aduk dengan menggoyangkan secara memutar dan diamkan selama 30 menit. Dekantir cairannya dan ulangi penambahan basa tersebut. Cuci resin dengan H2O melalui kertas saring. Buat resin yang segar setiap minggunya dan simpan dalam air. Masukkan glass wool ke dalam dasar kolom dan tuangkan resin sampai setinggi 8 cm. Jagalah volume air yang ada di atas resin jangan sampai kering. Cuci kolom dengan 10 mL H2O sebelum malakukan ekstraksi

7.2.2. Asam fosfat 3,57 N Encerkan 121,8 mL 85% H3PO4 menjadi 1 L. Untuk H3PO4 yang berbeda konsentrasinya, perhitungannya adalah :

)POH%xPOHDensity(17493

N57,3POHLiter14343

43 =

Standarisasi larutan ini dengan mengambil 5 mL dan titrasi dengan NaOH 1,00 N indikator fenolftalein.

7.2.3. Larutan orto ftalatdikarboksilaldehida ( OPT ) 0,1 % (w/v) Larutkan 100 mg OPT dalam 100 mL metanol. Simpan dalam botol amber pada lemari pendingin, siapkan larutan segar setiap minggu.

7.2.4. Larutan standar histamin (simpan larutan ini dalam lemari pendingin). 7.2.4.1. Larutan stok 1 mg/ mL sebagai basa bebas

Timbang teliti 169,1 mg histamin. 2 HCl (98 %), masukkan ke dalam labu takar 100 mL, larutkan dan encerkan tepat 100 mL dengan larutan HCl 0,1 M. Persiapkan larutan ini segar setiap minggu.

7.2.4.2. Larutan antara 10 mg/ mL Pipet 1 mL larutan stok ke dalam labu takar 100 mL dan encerkan dengan HCl 0,1 M. Persiapkan larutan segar setiap minggu.

7.2.4.3. Larutan kerja 0,5 ; 1,0 dan 1,5 mg/ 5 mL Pipet 1 , 2 dan 3 mL larutan antara ke dalam labu takar 100 mL dan encerkan dengan HCl 0,1 M. Persiapkan larutan segar setiap hari.

7.2.5. Methanol 75 % (v/v) Pipet 75 mL MeOH (yang didestilasi dalam gelas) ke dalam labu 100 mL. Larutkan dengan H2O sampai tanda batas. Goyang goyangkan labu pada saat penambahan H2O



8.0. Rincian Prosedur Operasional

8.1. Pembuatan kurva standar 8.1.1. Pipet 5 mL masing-masing duplo larutan kerja ke dalam labu

erlenmeyer gelas atau polipropilen 50 mL. Pipet 10 mL HCl 0,1 M ke dalam labu-labu tersebut dan kocok. Pipet 3 mL NaOH 1 M kocok. Dalam waktu 5 menit pipet 1 mL larutan OPT dan kocok. Sesudah tepat 4 menit, pipet 3 mL larutan H3PO4 3,57 N. pada masing-masing penambahan sangat penting untuk mengocok larutan tersebut.

8.1.2. Persiapkan larutan blanko dengan menggunakan larutan 5 mL HCl 0,1 M sebagai pengganti larutan histamin.

8.1.3. Dalam 1 jam catat intensitas fluorosensi (I) dari larutan kerja dengan menggunakan air dalam sel pembanding. Gunakan panjang gelombang eksitasi 350 nm dan panjang gelombang emisi 444 nm. Plot I (dikoreksi terhadap blanko) terhadap mg histamin/ 5 mL larutan.

8.2. Penentuan

8.2.1. Timbang 10 gr contoh dan tambahkan 50 mL metanol, hancurkan hingga homogen dengan blender. Pindahkan ke dalam labu takar 100 mL dan bersihkan blender dengan metanol dan tuangkan ke dalam labu takar tersebut. Panaskan dalam waterbath pada suhu 60 C dan diamkan selama 15 menit .

8.2.2. Dinginkan pada suhu 25 oC, encerkan dengan metanol dan saring melalui kertas lipat. Filtrat ini tahan selama beberapa minggu.

8.2.3. Bilas 4 5 mL H2O ke dalam kolom kromatografi dan buang eluatnya. Pipet 1 mL filtrat contoh di atas ke dalam kolom dan tambahkan 4 5 mL H2O. Buka kran kolom dan alirkan eluatnya ke dalam labu takar 50 mL yang berisi 5 mL larutan HCl 1,00 M. Bila tinggi cairan di atas resin telah turun sampai ketinggian kira-kira 2 mm, tambahkan lagi 5 mL H2O dan biarkan eluatnya terus mengalir.

8.2.4. Lanjutkan penambahan H2O sampai didapat eluatnya sebanyak 35 mL. Hentikan aliran, encerkan eluat dalam labu takar sampai batas volume dengan H2O, tutup dan kocok. Dinginkan eluat ini dalam refrigerator.

8.2.5. Pipet 5 mL eluat ke dalam erlenmeyer 50 mL dan pipet 10 mL larutan HCl 0,1 N. kerjakan dengan prosedur yang sama dengan pembuatan kurva standar mulai dari kalimat "Pipet 3 mL larutan NaOH 1 M"

8.2.6. Bila contoh mengandung lebih dari 15 mg histamin/ 100 gr ikan, pipet 1 mL campuran contoh - OPT ke dalam gelas beaker 10 mL yang mengandung tepat 2 mL campuran blanko - OPT dan kocok kuat - kuat. Baca intensitas fluorosensi larutan. Bila perlu encerkan larutan dengan campuran blanko - OPT sedemikian rupa agar dicapai pembacaan yang dapat diukur. Pendekatan ini menunjukkan bahwa pengenceran yang sesuai diperlukan sebelum reaksi OPT kedua dibutuhkan untuk kuantitas contoh yang bisa dipercaya.

8.2.7. Alternatif lain gunakan sensitivitas "range control" dari fluorometer (bila tersedia pada instrumen) untuk memperkirakan



pengencerannya. Bila pendekatan - pendekatan tersebut digunakan, persiapkan pengenceran eluat dengan larutan 0,1 N HCl dan kerjakan dengan prosedur yang sama dalam pembuatan kurva standar dimulai dari kalimat "pipet 3 mL larutan NaOH 1 N..".

9.0. Pelaporan

Perhitungan : Plot I terhadap mg histamin/ 5 mL. Kurva harus garis lurus dengan kemiringan :

mg Histamin/ 100 gr ikan = (10) (F) (1/ m) (Is)

g histamin / gr Ikan = 10 x (mg histamin / 100 gr ikan) Dimana : Is, Ia, Ib dan Ic = Fluoresensi dari contoh 1,5 ; 1,0 dan 0,5 mg standar. F = Faktor pengencer m = Kemiringan

Jika kurva kalibrasi yang dihasilkan tidak linear, gunakan kurva standar yang mendekati. Masing masing sub bagian

mg Histamin/ 100 gr Ikan = (10) (F)(W) g histamin / gr Ikan = 10 x (mg histamin / 100 gr ikan)

W = mg Histamin/ 5 mL larutan yang ditentukan dari kurva

standard.

10.0. Catatan Perubahan

Penarikan Penambahan No. Tgl

Bab Hal Revisi Bab Hal Revisi

1. 29/09/03 Perubahan Total 00 Perubahan Total 01

( )3

Ic 2 Ib 1,5Ia

m)++

=(



11.0. Lampiran

11.1. Penentuan Kadar Histamin PO/MM/25-1



Lampiran 11.1.

PENENTUAN KADAR HISTAMIN PO/MM/25 1

Methode : AOAC Method 977.13. No. Lab : Nama contoh : Tanggal masuk : Tanggal selesai : Kode alat yang digunakan :

Simplo Duplo

Fluoresensi contoh 1,5 mg standar Ia Fluoresensi contoh 1,0 mg standar Ib Fluoresensi contoh 0,5 mg standar Ic Faktor pengencer F mg Histamin / 5 mL larutan yang ditentukan dari kurva std W Kadar Histamin Rata - rata

Perhitungan :

Kemiringan/ m : [ (Ia/1,5) + Ib + 2 Ic] / 3

mg histamin/ 100 gr ikan = (10) (F) (1/m) (Is) Atau jika tidak linear, digunakan rumus : mg histamin/ 100 gr ikan = (10) (F) (W)

Analis : Diperiksa Oleh :

Disetujui Oleh :

Rev.01 Mulai berlaku : 29 September 2003

SUCOFINDO

penentuan kadar histamin

Documents