penelitian zainul

PENGARUH GRANULOCYTE-MACROPHAGE COLONY STIMULATINGFACTOR DAN STEROID TERHADAP PERTUMBUHAN KERATINOSITSERTA NEOVASKULARISASI PADA PROSES PENYEMBUHAN LUKA

TESIS

Peneliti

ZAINUL NAM

Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Guna Memperoleh Gelar Spesialis BedahProgram Pendidikan Dokter Spesialis-1DEPARTEMEN ILMU BEDAHFAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS SUMATERA UTARAMEDAN2011

iTesis : PENGARUH GRANULOCYTEMACROPHAGE COLONY STIMULATINGFACTOR DAN STEROID TERHADAPPERTUMBUHAN KERATINOSIT SERTANEOVASKULARISASI PADA PROSESPENYEMBUHAN LUKA

Nama PPDS : Zainul NamNomor CHS : 17414Bidang Ilmu : Kedokteran/ Ilmu BedahKategori : Bedah Plastik

TESIS INI TELAH DIPERIKSA DAN DISETUJUI OLEH

Pembimbing :

Dr. Eddy Sutrisno, SpBP Dr. Frank Bietra Buchari, SpBPNIP : 140 201 785 NIP: 140 377 549

Ketua Departemen Ilmu Bedah, Ketua Program Studi Ilmu Bedah,

Dr. Emir T Pasaribu, SpB(K) Onk Dr. Marshal, SpB. SpBTKV.NIP: 195 203 041 980 021 00 NIP: 196 103 161 986 111 001Tanggal Persetujuan : Oktober 2011

ii

SURAT KETERANGAN

Sudah diperiksa tesis penelitian

JUDUL PENGARUH GRANULOCYTE MACROPHAGECOLONY STIMULATING FACTOR DAN STEROIDTERHADAP PERTUMBUHAN KERATINOSITSERTA NEOVASKULARISASI PADA PROSESPENYEMBUHAN LUKA

PENELITI : Dr. ZAINUL NAIM

DEPARTEMEN : ILMU BEDAH

INSTITUSI : FAKULTAS KEDOKTERANUNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN, SEPTEMBER 2011KONSULTAN METODOLOGI PENELITIAN

FAKULTAS KEDOKTERAN USU

PROF. DR. H. AZNAN LELO, PhD, SpFK

NIP. 1951 1202 197902 1 001

iii

TESIS PENELITIAN

JUDUL : PENGARUH GRANULOCYTE COLONYSTIMULATING FACTOR DAN STEROIDTERHADAP PERTUMBUHAN KERATINOSITSERTA NEOVASKULARISASI PADA PROSESPENYEMBUHAN LUKA

PENELITI : Dr. ZAINUL NAIM

NO. CHS : 17414

DEPARTEMEN : ILMU BEDAH

INSTITUSI : FAKULTAS KEDOKTERANUNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN, SEPTEMBER 2011SEKSI ILMIAH

DEPARTEMEN ILMU BEDAH USU

PROF. DR. A. GOFAR SASTRODININGRAT,SpBS(K)NIP. 19440507 197703 1 001

vUCAPAN TERIMAKASIH

In order to be effective truth must penetratelike an arrow---and that is likely to hurt....( Wei Wu Wei)

Segala Puji Bagi Allah SWT atas segala limpahan rezeki dan rahmatNyaserta shalawat dan salam atas Rasulullah SAW, sehingga saya dapat menyelesaikantesis ini, sebagai salah satu syarat dalam Program Pendidikan Dokter Spesialis bidangIlmu Bedah di Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara Medan.

Rasa terimakasih saya sampaikan kepada semua pihak yang telah dengantulus ikhlas membantu saya selama menjalani pendidikan dibidang ilmu bedah.

Kepada Ayahanda dan Bunda, Naimuddin DP dan Salmiah Lubis,terimakasih dan hormat ananda persembahkan, atas limpahan kasih sayang,kesabaran, pengorbanan, didikan, nasehat, inspirasi dan do tiada henti buat ananda.Buat Ayah dan Ibu mertua, H. Darwis dan Hj. Asiar ,serta Abangda Ir. H. Mohd.Hidayat, terimakasih atas pengertian dan segala bantuannya.

Kepada Abangda Dr. Frank Bietra Buchari. Sp.BP selaku pembimbingdalam tesis ini, terimakasih atas dukungan, masukan, bimbingan, nasehat dankesabarannya selama saya belajar dan mengerjakan tesis ini.

Kepada Dr. Edy Sutrisno, SpBP selaku pembimbing, saya ucapkan terimakasih atas kesediaannya sehingga saya dapat melaksanakan penelitian ini.

Buat Dr. Utama A. Tarigan, Sp.BP, terima kasih atas masukan teknikpelaksanaan penelitian dan juga buat diskusinya. Ucapan terimakasih untuk Dr. M.Djailani, Sp.BP---yang mengatakan pada saya, dalam mencoba sesuatu hal, jangantakut gagal---terimakasih atas dorongan moril dan semangat selama saya menjalanipendidikan.

Kepada yang terhormat Prof. Dr. H. Aznan Lelo, PhD, SpFK sebagaipembimbing dan konsultan statistik serta Dr. H. Soekimin, Sp.PA (K) sebagaipembimbing dan konsultan bidang histopatologi, saya ucapkan terima kasih atasbimbingan dan segala dukungan.

Ucapan terima kasih untuk Dr. Gino Tann, PhD, SpPK atas seluruhmasukan, ide, perbincangan mengenai blood progenitor stem cell transplant dan

vi

fetomathernal microchimerism haploidentical stem cell transplant yang sangatmenyenangkan. Demikian pula untuk DR. Dr. Rosita Sembiring, SpPK terimakasih atas segala usaha dan sikap rendah hati beliau dalam menanggapi pertanyaanpertanyaan saya mengenai peripheral blood stem cell collection. Buat Prof. Dr.Herman Hariman PhD, SpPK dan Prof. Dr. H. Achmad Effendi, AAI terimakasih atas pelajaran dan perhatiannya. Semoga di hari depan kita bisa lebih suksesdalam mengerjakan prosedur stem cell transplantasi ini, suatu kehormatan bagi sayamengenal dan belajar dari Dokter sekalian.

Rasa hormat dan terima kasih saya sampaikan kepada para guru saya ;Prof. Dr. Bachtiar Surya SpB.KBD. Dr. Syahbudin Harahap SpB. Prof. Dr.Hafas Hanafiah SpB, SpOT(K), FICS. Prof. DR. Dr. Iskandar Djapardy SpBS.Prof. Dr. Gofar Sastrodiningrat SpB,SpBS. Prof. Dr. Nazar Moesbar SpB,SpOT(K). Dr. Asmui Yosodihardjo SpB,SpBA. Dr. Harry SoedjatmikoSpB,SpBTKV. Prof. Dr. Adril Arsyad Hakim SpBS(K), SpS. Dr. BungaranSihombing SpU. Dr. Djafar Tarigan SpB.KBD. Dr. Azwarto Lubis SpB. Dr.Ramotan Purba SpB, Dr. Mahyono SpB,SpBA. Dr. Suhelmi SpB. Dr. M.Manan SpOT, Dr. Liberti Sirait SpB,KBD. Dr. Adi Muradi Muhar SpB.KBD.Prof. Dr. Usul M Sinaga SpB (alm), Prof. Dr. Buchari Kasim SpB,SpBP (alm).Dr. Djeni Bijantoro SpB,SpBA. Dr. A. Rasjidi Siregar SpB. Dr. RiahsyahDamanik SpB(K)Onk. DR. Dr. Humala Hutagalung SpB(K)Onk. Dr.GerhardST Panjaitan SpB(K)Onk, Dr.Suyatno SpB(K)Onk. Dr. Otman Siregar,SpOT(K)spine. Dr.Chairiandi Siregar SpOT. Dr. Albiner SimarmataSpB(K)Onk. Dr. Doddy Prabisma SpBTKV. Dr. Ridha Dharmajaya SpBS Dr.Syah Mirsya Warli SpU. Dr. Budi Irwan SpB.KBD. Dr. Aswadi TanjungSpB.SpBV. Dr. Suzy Sp.BS dan lain-lain yang tidak dapat saya sebutkan satupersatu, yang telah memberikan koreksi dan bimbingan selama saya menjalanipendidikan.

Saya ucapkan terima kasih kepada yang terhormat Dr. Emir Taris PasaribuSpB(K)Onk selaku Kepala Bagian Departemen Ilmu Bedah FK USU/RS HAM. DrMarshal SpB. SpB TKV selaku Ketua Program Pendidikan Dokter Spesialis IlmuBedah FK USU/RS HAM. Dr. Erjan Fikri SpB. SpBA selaku SekretarisDepartemen Ilmu Bedah FK USU/RS HAM. Dr. Asrul Simangunsong SpB.KBDselaku Sekretaris Program pendidikan Dokter Spesialis Ilmu Bedah FK USU/RSHAM.

Kepada sahabat seperjuangan Dr. Samson Sembiring, Dr. BambangPrayugo dan Dr. Edwin S Siregar , terimakasih atas ikatan persaudaraan, bela rasa

vii

dan rasa senasib serta sepenanggungan selama menjalani proses pendidikan ini. Padaseluruh senior yang telah lebih dahulu menyelesaikan pendidikan dan sejawat residenpeserta program ilmu bedah saat ini, saya ucapkan banyak terima kasih. Untuk adindaDr. Heldrian, terimakasih atas bantuan program SPSS dan waktu editingnya.

Kepada seluruh dokter, dokter muda dan para medik di instalasi bedah RSUP.H. Adam Malik Medan, RSU. Dr. Pirngadi Medan, RSUD Sipirok, RSUDPanyabungan dan RSUD Blangkejeren, saya ucapkan terimakasih atas kerjasamanyademikian pula staf SMF Bedah RSUP. HAM/RSPM dan laboratorium PatologiAnatomi FK USU, saya ucapkan terima kasih.

Untuk kesabaran, pengorbanan, kesetiaan, pengertian dan segenap rasa cintadari yang terkasih ..., istriku Dr. Siti Chadijah,------so much thank you for saving allyour love for me, with your hand resting in mine, I feel the power so divine...------rasasyukur dan terima kasih yang tak terhingga ku ucapkan. Demikian pula buat dua putrikecil ku, Nawan------Sayangku, demikian bangganya Ayah karena mempunyai putrisepertimu------dan Sophie------ apapun adanya dirimu Sayangku, dengan segenapjiwa, Ayah sangat mencintaimu, ini dari Ayah,....untuk Sophie.....------ku ucapkanterima kasih, untuk segalanya.

Tak lupa pula untuk kedua adikku Khairun Naim S.H dan Hafizah NaimSPd, ku ucapkan terima kasih atas dorongan semangat yang diberikan.

Akhirnya, kepada semua pihak yang telah membantu saya, yang tak dapatsaya sebutkan, saya mengucapkan terima kasih. Semoga Allah memberikan limpahanrahmatNya. Insya Allah.

Medan, September 2011Penulis

viii

DAFTAR SINGKATAN

AP : Activator protein.C : Complement.CD : Cluster differentiated.DNA : Deoxyribonucleic acid.EGF : Epidermal growth factor.FGF : Fibroblast growth factor.G-CSF : Granulocyte-colony stimulating factor.GM-CSF : Granulocyte-macrophage colony stimulating factor.HE : Hematoxyllin-eosin.IFN : Interferon.IGF : Insulin like growth factor.IL : Interleukin.M-CSF :Macrophage-colony stimulating factor.MMPs :Metallomatrixproteinase.mRNA :Mesenger Ribonucleic acid.NF : Nuclear factor.PDGF : Platelet derived growth factor.rh : Recombinant human.STAT : Signal transduction and activation of transcription.TGF : Transforming growth factor.TIMPs : Tissue inhibitor matrix proteinase.VEGF : Vascular endothelial growth factor.

ix

DAFTAR ISIHalaman

LEMBAR PENGESAHAN TESIS .................................................................................. iLEMBAR PERNYATAAN ............................................................................................. ivUCAPAN TERIMAKASIH ............................................................................................. vDAFTAR SINGKATAN................................................................................................... viiiDAFTAR ISI ..................................................................................................................... ixDAFTAR GAMBAR ........................................................................................................ xiABSTRAK ........................................................................................................................ xiiBAB 1. PENDAHULUAN ............................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang ................................................................................................ 11.2 Perumusan Masalah ......................................................................................... 31.3 Hipotesis .......................................................................................................... 31.4 Tujuan Penelitian ............................................................................................ 31.5 Kontribusi Penelitian ...................................................................................... 4

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA ..................................................................................... 52.1 Luka ................................................................................................................ 52.2 Penyembuhan Luka ........................................................................................ 52.3 Tahapan Penyembuhan Luka ........................................................................... 52.4 Peranan Sitokin ............................................................................................... 72.5 GM-CSF .......................................................................................................... 92.6 Keratinosit dan Proses Penyembuhan Luka ..................................................... 102.7 Inhibitor GM-CSF ........................................................................................... 12

BAB 3. METODOLOGI PENELITIAN .......................................................................... 153.1 Rancangan Penelitian ....................................................................................... 153.2 Lokasi dan Waktu Penelitian ......................................................................... 153.3 Objek Penelitian ............................................................................................... 15

x3.4 Kriteria Inklusi, Ekslusi dan Drop out .............................................................. 163.5 Identifikasi Variabel Penelitian ........................................................................ 163.6 Pelaksanaan Penelitian ..................................................................................... 173.7 Besar Sampel ..................................................................................................... 193.8 Analisa Data ...................................................................................................... 193.9 Definisi Operasional ........................................................................................... 193.10 Kerangka Konsep ............................................................................................. 203.11 Alur Penelitian ................................................................................................. 20

BAB 4. HASIL PENELITIAN ........................................................................................... 214.1 Pertumbuhan Keratinosit .................................................................................. 214.2 Pertumbuhan Pembuluh Darah .......................................................................... 22

BAB 5. PEMBAHASAN .................................................................................................... 30BAB 6. KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................................. 37

6.1. Kesimpulan ....................................................................................................... 376.2 Saran .................................................................................................................. 37

DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................................... 38LAMPIRAN ..........................................................................................................................

xi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Grafik rata-rata pertumbuhan keratinosit antar kelompok ......................... 21Gambar 2. Grafik rata-rata pertumbuhan neovaskular antar kelompok ....................... 22Gambar 3. Gambar histologi keratinosit pada kelompok rhGM-CSF ........................ 23Gambar 4. Gambar histologi keratinosit pada kelompok dexamethasone .................. 24Gambar 5. Gambar histologi keratinosit pada kelompok kontrol ..................... 25Gambar 6. Gambar histologi neovaskular pada kelompok rhGM-CSF ............ 26Gambar 7. Gambar histologi neovaskular pada kelompok dexamethasone ...... 27Gambar 8. Gambar histologi neovaskular pada kelompok kontrol ................... 28

xii

ABSTRAK

Latar belakang : Granulocyte-macrophage colony stimulating factor adalah faktorpertumbuhan multipoten yang memainkan peranan penting dalam proses penyembuhan luka.Merupakan kelompok sitokin yang berperan dalam regulasi proliferasi, komunikasi dandiferensiasi berbagai sel agar mempunyai kapasitas dan fungsi terspesialisasi, GM-CSFbertanggung jawab atas proliferasi granulosit dan makrofag yang mengawali prosespenyembuhan luka.Objektif : Tujuan dari penelitian ini adalah untuk melihat pengaruh pemberian rhGM-CSFperilesi pada luka artifisial guna mengakselerasi kecepatan penyembuhan luka denganpembanding dexamethason dan kelompok kontrol.Metode : Mencit (Mus musculus) dengan luka artifisial full thickness dibagi dalam 3 kelompok:A (n=4) menerima rhGM-CSF 10g/kg, B (n=4) menerima dexamethason 10 mg/kg dan C(n=5) sebagai kontrol. Rekombinan GM-CSF dan dexamethason diberikan selama 6 hari,danpada hari ke 7 kesemua hewan coba dieuthanasia. Luka dieksisi pada batas 4 mm dari pinggirluka kemudian dilakukan pemeriksaan histologis untuk perhitungan keratinosit dan neovaskular.Hasil : Data yang didapat menunjukkan hasil pengaruh positif pemberian rhGM-CSF peri lesisubkutan terhadap pertumbuhan keratinosit dan neovaskular (p=0.001) dibanding dexamethasondan kontrol. Tidak didapat perbedaan signifikan antara kelompok dexamethason dan kontroldalam pertumbuhan keratinosit (p=0,085) serta pertumbuhan neovaskular (p=0,935).Kesimpulan : Terdapat pertumbuhan keratinosit dan neovaskular yang lebih nyata pascapenyuntikan rhGM-CSF dibanding pasca penyuntikan dexamethason dan kontrol serta tidakdijumpai perbedaan pertumbuhan keratinosit dan neovaskular pada kelompok dexamethason dankontrol.Kata kunci : GM-CSF, Dexamethason, Keratinosit, Neovaskular

xiii

ABSTRACT

Background: The granulocyte-macrophage colony stimulating factor is a multipotent growthfactor that plays an important role in wound healing process. It is a group of cytokines that play arole in the regulation of proliferation, and differentiation of various cell communication in orderto have the capacity and specialized functions, GM-CSF is responsible for the proliferation ofgranulocytes and macrophages that initiate the wound healing process.Objective: The purpose of this study was to see the effect of rhGM-CSF perilesionsubcutaneously on artificial wounds in order to accelerate the speed of wound healing bycomparison dexamethason and control groups.Methods: Mice (Mus musculus) with artificial wounds full thickness divided into 3 groups: A (n= 4) received rhGM-CSF 10g/kg, B (n = 4) received dexamethason 10 mg / kg and C (n = 5) ascontrol. Recombinant GM-CSF and dexamethason given for 6 days, and at day 7 all these animaleuthanized. Wounds excised at 4 mm from the edge of the wound was then performed forhistologic examination and calculation neovascular and keratinocytes.Results: The data obtained showed a positive effect of rhGM-CSF on the growth neovascularand keratinocytes (p = 0.001) than dexamethason and control. Not obtained significantdifferences between dexamethason and control groups in growth of keratinocytes (p = 0.085)and neovascular (p = 0.935).Conclusion: There is growth of keratinocytes and neovascular more tangible after the injectionof rhGM-CSF compared to post-injection dexamethason and control and found no difference inthe growth of keratinocytes and neovascular on dexamethason and control groups.

Key words: GM-CSF, Dexamethason, Keratinocytes, Neovascular

1BAB 1PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Luka yang tidak sembuh dalam waktu yang lama, dengan berbagai etiologimerupakan masalah yang sering ditemukan dalam berbagai disiplin ilmu kedokteran.Kejadian ini salah satu sumber utama morbiditas, meningkatkan angka mortalitas,penyebab kerusakan psikologis bagi para penderita, meningkatkan anggaran biayapengobatan, kehilangan jam kerja pada penderita dalam usia produktif.

Penyembuhan luka secara perdefinisi adalah perbaikan atau penyusunankembali jaringan/organ yang rusak, terutama kulit. Adanya luka akan mengaktifkanproses sistemik yang merubah fungsi fisiologi yang dapat melampaui kondisi lokalpada daerah yang mengalami luka.

Penyembuhan luka pada kulit merupakan kondisi yang kompleks, mencakupberbagai respon terhadap cedera. Secara umum penyembuhan luka menunjukkanrespon organisme terhadap kerusakan fisik jaringan /organ serta usaha pengembaliankondisi homeostasis sehingga tercapai kestabilan fisiologi jaringan atau organ yangditandai dengan terbentuknya epitel yang fungsional diatas daerah luka.(Gurtner,2007; Mann .dkk.,2001).

2Sebagai sebuah proses yang terkoordinasi, proses penyembuhan lukamelibatkan komponen selular dan ekstraselular yang pada akhirnya terjadipenyusunan kembali jaringan yang cedera. Diawali dari serangkaian proses pentingyaitu koagulasi, inflamasi, proliferasi dan migrasi sel, angiogenesis, sintesis matriks,remodeling dan kontraksi luka (Martin 1997, Stadelmann dkk.,1998; Baker Leaper,2000; Mann .dkk 2006).

Berbagai sel terlibat dalam penyembuhan luka yaitu makrofag, limfosit,fibroblas, sel endotelial, dan sel dendritik yang mensintesis granulocyte-macrophagecolony stimulating factor (GM-CSF). GM-CSF merupakan sitokin dan faktorpertumbuhan multipoten yang berperan penting selama proses penyembuhan luka,memberikan pengaruh pada tahap inflamasi, reepitelisasi, dan neovaskularisasi.Kegagalan pada salah satu proses ini akan mengakibatkan kegagalan penyembuhanluka (Gurtner., 2007, Hunt .,2003; Mann . dkk.,2001;Mann .,2006). Stagno (1999)menunjukkan GM-CSF memberi efek yang menguntungkan ketika diberikan padaulkus kronik. Kaplan (1992) melaporkan pemberian GM-CSF intradermal padapenderita lepra dengan lesi kulit memberi efek percepatan penyembuhan luka danmeningkatkan jumlah lapisan keratinosit. Amrit Mann (2006) melaporkan efek positifGM-CSF pada tikus trans genik.

Steroid yang diberikan secara topikal dapat menghambat GM-CSF (AlHomsi,2007). Amrit Mann dkk (2006), menunjukkan berkurangnya mitosis padalapisan basal pada interfolikular epidermis, berkurangnya neovaskularisasi danmeningkatkan fibrosis pada hewan percobaan tikus setelah aplikasi GM-CSF

3antagonis. Berbagai preparat glukokortikoid dapat menghambat pelepasan GM-CSF,diantaranya fluticason propionate, budixicort, budesonid dan dexamethason. Adcock(1999) mendapatkan bahwa fluticasone propionate dan budesonid adalah inhibitoryang lebih poten dari dexamethason dalam menghambat GM-CSF.

1.2. Perumusan Masalah

Apakah penyembuhan luka dapat dipengaruhi dengan pemberian injeksiperilesi sediaan rhGM-CSF dan dexamethasone pada hewan percobaan tikus yangdibuat luka artifisial dan dapat menghambatnya?

1.3. Hipotesis

Pemberian injeksi perilesi sediaan rhGM-CSF dapat mempercepatpenyembuhan luka dengan menggalakkan pertumbuhan keratinosit danneovaskularisasi, sedang dexamethason dapat menghambat penyembuhan padahewan percobaan tikus.

1.4. Tujuan Penelitian

Untuk melihat perbedaan kecepatan penyembuhan pada luka yang diberikaninjeksi perilesi sediaan rhGM-CSF dengan yang tidak diberikan.

41.5. Kontribusi Penelitian

Dari penelitian ini diharapkan dapat memahami fisiologi penyembuhan lukasecara lebih baik sehingga dapat dilakukan usaha percepatan penyembuhan luka yangpada gilirannya angka morbiditas akibat luka dapat diturunkan .

5BAB IITINJAUAN KEPUSTAKAAN

2.1. Luka

Luka adalah terputusnya kontinuitas atau hubungan anatomis jaringan sebagaiakibat dari ruda paksa. Luka dapat merupakan luka yang sengaja dibuat untuk tujuantertentu, seperti luka insisi pada operasi atau luka akibat trauma seperti luka akibatkecelakaan (Hunt,2003; Mann ,2001).

2.2. Penyembuhan luka

Respon organisme terhadap kerusakan jaringan/organ serta usahapengembalian kondisi homeostasis sehingga dicapai kestabilan fisiologis jaringanatau organ yang pada kulit terjadi penyusunan kembali jaringan kulit ditandai denganterbentuknya epitel fungsional yang menutupi luka (Regauer,Compton; 1990,Stricklin dkk,1994).

2.3. Tahapan penyembuhan luka

Tanpa memandang penyebab, tahapan penyembuhan luka terbagi atas :

Fase koagulasi : setelah luka terjadi, terjadi perdarahan pada daerah luka yang diikutidengan aktifasi kaskade pembekuan darah sehingga terbentuk klot hematoma. Prosesini diikuti oleh proses selanjutnya yaitu fase inflamasi.

6Fase inflamasi : Fase inflamasi mempunyai prioritas fungsional yaitu menggalakkanhemostasis, menyingkirkan jaringan mati, dan mencegah infeksi oleh bakteri patogenterutama bakteria. Pada fase ini platelet yang membentuk klot hematom mengalamidegranulasi, melepaskan faktor pertumbuhan seperti platelet derived growth factor(PDGF) dan transforming growth factor (TGF), granulocyte colony stimulatingfactor (G-CSF), C5a, TNF, IL-1 dan IL-8. Leukosit bermigrasi menuju daerah luka.Terjadi deposit matriks fibrin yang mengawali proses penutupan luka. Proses initerjadi pada hari 2-4.

Fase proliperatif : Fase proliperatif terjadi dari hari ke 4-21 setelah trauma.Keratinosit disekitar luka mengalami perubahan fenotif. Regresi hubungandesmosomal antara keratinosit pada membran basal menyebabkan sel keratinbermigrasi kearah lateral. Keratinosit bergerak melalui interaksi dengan matriksprotein ekstraselular (fibronectin,vitronectin dan kolagen tipe I). Faktorproangiogenik dilepaskan oleh makrofag, vascular endothelial growth factor (VEGF)sehingga terjadi neovaskularisasi dan pembentukan jaringan granulasi.

Fase remodeling : Remodeling merupakan fase yang paling lama pada prosespenyembuhan luka,terjadi pada hari ke 21-hingga 1 tahun. Terjadi kontraksi luka,akibat pembentukan aktin myofibroblas dengan aktin mikrofilamen yang memberikankekuatan kontraksi pada penyembuhan luka. Pada fase ini terjadi juga remodelingkolagen. Kolagen tipe III digantikan kolagen tipe I yang dimediasi matriksmetalloproteinase yang disekresi makrofag, fibroblas, dan sel endotel. Pada masa 3

7minggu penyembuhan, luka telah mendapatkan kembali 20% kekuatan jaringannormal (Hunt,2003; Mann ,dkk;2001, Ting,dkk;2008).

2.4. Peranan Sitokin.

Sel-sel yang bersirkulasi dalam darah manusia mempunyai masa hidup yangpendek dan memerlukan proses pergantian yang terus menerus. Proses pembentukansel dalam darah yang dinamakan hematopoiesis melibatkan proses yang sangatkompleks dikarenakan berbagai macam jenis sel yang harus dibentuk. Hematopoiesisjuga mempunyai kemampuan penyesuaian yang sangat cepat dalam pengaturancampuran komposisi sub-set selular yang beredar dalam darah manakala tubuhberhadapan dengan berbagai kondisi seperti infeksi, kondisi sitotoksik akibat efeksamping obat-obatan dan lain sebagainya. Kesemua berbagai jenis sel ini muncul darisekumpulan kecil sel induk pluripoten yang bereaksi terhadap rangsangan spesifik.Proses diferensiasi sel induk menjadi berbagai jenis sel yang mempunyai fungsiterspesialisasi mempunyai ketepatan dan kontrol selular multipoint yang sangat tinggidan bekerja secara tumpang tindih. Gangguan pada mekanisme ini mengakibatkanberbagai kondisi klinis dari anemia hingga leukemia.

Sel induk pluripoten yang bereaksi terhadap berbagai rangsangan spesifik,akan membelah, berdiferensiasi dan mengalami proses kematangan menjadi sub setsel dewasa dengan kemampuan yang terspesialistik. Berbagai bahan yang bekerjauntuk stimulasi dibentuk oleh sel dibawah pengaruh berbagai situasi dan kondisistress untuk mempertahankan kondisi homeostasis dalam sistem imunitas. Bahan

8bahan yang disekresi oleh sel-sel ini secara umum dinamakan sitokin dan mempunyaiaksi secara autokrin maupun parakrin. Spektrum yang luas dari berbagai bahan initelah dibuat dan diklasifikasikan berdasarkan pada jenis sel yang dipengaruhi bahanini untuk memproduksi fungsi yang diinginkanseperti interleukin yang bekerjamempengaruhi leukosit dan limfokin yang disekresi oleh limfosit dan monokin yangberhubungan dengan monosit dan makrofag.

Aksi sitokin sangat luas dalam mengatur intensitas dan durasi respon imunitasdengan cara aktivasi dan inhibisi, proliferasi dan/atau diferensiasi sel yang terlibatdalam pembentukan respon imunitas dan juga dalam proses sekresi antibodi ataupunjenis sitokin lainnya.

Sitokin yang membantu pertumbuhan dan proliferasi koloni sel hematopoietikdalam sel-sel darah dinamakan colony stimulating factor (CSF). CSF adalahglikoprotein asidik dan telah diklasifikasikan berdasar tipe sel matur yang dihasilkankoloni, yaitu :

a. Interleukin 3 (IL-3)menstimulasi stem sel untuk memproduksi semuabentuk sel hematopoietik.

b. Macrophage colony stimulating factor (M-CSF)beraksi pada jalur selmakrofag.

c. Granulocyte colony stimulating factor (G-CSF)---beraksi pada jalur selgranulosit.

9d. Granulocyte-Macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) ---mempengaruhi proliferasi dan diferensiasi jalur eritroid, megakariositik danmyeloid.

Rentang masa hidup kebanyakan sel-sel darah sangat singkat. Apabila tubuhtidak dapat membentuk sel darah baru yang sehat pada kecepatan yang dibutuhkan,infeksi yang mengancam jiwa, perdarahan atau anemia berat dapat terjadi. Kondisiseperti ini dapat juga terjadi akibat kemoradiasi kanker, transplantasi sum-sum tulangmaupun kondisi buruk lainnya. Aktifitas dari berbagai faktor stimulasi pertumbuhanini akan menjadi lebih luas bila berinteraksi dengan faktorlainnya.(Ghosh,K.P.,2007).

2.5. GM-CSF

Merupakan faktor pertumbuhan berupa polipeptida dengan berat 20 kDa yangpada mulanya diidentifikasi sebagai regulator penting pada proliferasi, maturasi, danaktifasi fungsional granulosit neutrofilik. Diproduksi secara luas oleh berbagai jenissel seperti monosit, sel vaskular endotelial, fibroblas dan sel mesotel. Pada orangdewasa yang sehat, kadar GM-CSF yang bersirkulasi < 30 pg/ml. Bagaimanapunpada keadaan stress biologi seperti infeksi sistemik GM-CSF mencapai kadar 2000pg/ml. Rekombinan GM-CSF sekarang secara rutin digunakan bagi kepentinganklinik untuk meningkatkan jumlah leukosit yang bersirkulasi setelah kemoterapi ataumemobilisasi sel progenitor pada transplantasi sum-sum tulang (Brem,dkk;2000.,Ting dkk;2008)

10

Pada proses penyembuhan luka, GM-CSF disekresi pada lapisan basalepidermis oleh keratinosit berfungsi mengakselerasi reepitelisasi kulit. Stagno dkk,(1999) menunjukkan GM-CSF memberikan efek yang menguntungkan ketikadiberikan pada pasien yang mengalami ulkus kronik. Pemberian GM-CSFintradermal pada penderita lepra dengan lesi kulit memberi efek percepatanpenyembuhan luka dan meningkatkan jumlah dan lapisan keratinosit (Kaplandkk,1992). Efek yang menguntungkan dari aplikasi GM-CSF adalah peningkatanproliferasi keratinosit. Amrit Mann dkk (2006), menunjukkan efek positif GM-CSFpada tikus trans genik yang diberikan GM-CSF (Kaplan dkk;1992,Gurtner,2007;Hunt,2003, Mann. dkk,2001). Ure (1998) menyatakan GM-CSF tidak memberikanefek yang menguntungkan ketika diberikan pada luka yang menunjukkanpenyembuhan normal.

2.6. Keratinosit dan proses penyembuhan luka

Keratinosit adalah sel epitel bertanduk. Terdapat pada stratum korneum kulit.Stratum korneum mengandung sel-sel tanduk pipih tanpa inti yang sitoplasmanyaterisi oleh skleroprotein filamentosa birefringent keratin. Protein ini terdiri atasrantai protein panjang yang kaya akan ikatan disulfida, terdapat dalam berkas-berkas7-8 nm kelompokan filamen yang tertanam dalam matriks amorf padat. Keratinosityang kehilangan organel sitoplasmanya akibat proses hidrolitik disebut keratin(Junqueira, Carneiro 1991). Terputusnya integritas epidermis mengaktifkan responyang melibatkan aksi biokimia dan interaksi berbagai macam jenis sel dan komponenmatriks yang diperantarai sitokin, faktor pertumbuhan berikut reseptor-reseptornya.

11

Dampak dari peningkatan atau penurunan aktifitas beberapa molekul signal ataukomponen transduksi signal pada penyembuhan luka telah dievaluasi in vivo padabinatang transgenik atau knockout. Pengujian ini meliputi transforming growth factor (TGF-), superfamili TGF-, superfamili fibroblast growth factor , interleukin(ILs), chemokine, dan reseptor-reseptornya.

Platelet-derived growth factor sangat sedikit digunakan pada setting klinik.Hal ini sangat berbeda pada GM-CSF yang telah menunjukkan efek yangmenguntungkan ketika diaplikasi pada ulkus kronik dengan berbagai etiologinya.Ketika terjadi aktifasi pada epidermis akibat luka, GM-CSF mRNA terkumpul dalamkeratinosit dalam beberapa jam. GM-CSF karenanya merupakan respon awal dariaktifitas gen dan mengakibatkan terjadinya serangkaian proses yang pada akhirnyamenutupi luka dan remodeling jaringan. GM-CSF merupakan mitogen yang potenuntuk keratinosit pada konsentrasi nanogram permilliliter, dan secara langsungmenstimulasi migrasi dan proliferasi sel-sel endotel serta perkembangan selkeratinosit manusia secara in vitro (Hancock dkk,1998; Bussolino dkk,1989 dalamMannA dkk,2001). Sebagai tambahan, telah diduga bahwa GM-CSF mempengaruhiproliferasi, maturasi, dan rekrutmen sel seperti keratinosit, fibroblas, sel endotel,monosit, makrofag, dan sel-sel dendritik setidaknya dengan cara modulasi pelepasansitokin seperti IL-1, IL-6, tumor necrosis factor (TNF-), TGF-, interferon-(IFN-) dan M-CSF dimana yang pada gilirannya mempengaruhi prosespenyembuhan luka.

12

Migrasi keratinosit juga difasilitasi oleh serum protein sepertithrombospondin, fibronectin, epibolin dan co-epibolin. Jembatan epitel parafolikularterlihat pada beberapa hewan percobaan yang diberikan epidermal growth factor(EGF) yang telah diketahui menstimulasi migrasi keratinosit dan ekspansi maksimalpada kultur keratinosit manusia.

Neovaskularisasi luka merupakan hal yang sangat penting bagi pengirimankomponen vital yang diperlukan untuk proses penyembuhan. Peningkatanneovaskularisasi pada tikus dengan overekspresi GM-CSF berkorelasi denganpeningkatan penyembuhan luka. (Mann dkk.,2001). Pada hewan percobaan denganoverekspresi antagonis GM-CSF terjadi penurunan jumlah pembuluh darah mikrodan peningkatan kegagalan penyembuhan luka, sehingga dapat diduga hubunganlangsung antara GM-CSF dan neovaskularisasi. Aktifasi enzim IB yang tergantungGM-CSF mengakibatkan aktifasi selanjutnya dari NFB yang merupakan faktorpenting bagi proliferasi sel endotelial. Defisiensi GM-CSF mengakibatkan perubahankomposisi matriks kolagen vaskular yang berguna bagi integritas dinding pembuluhdarah dan daya tahannya.

2.7. Inhibitor GM-CSF

Berbagai sitokin, seperti IL- 1, tumor necrosis factor- (TNF-) dan GM-CSF, di lepaskan secara terkoordinasi dan memainkan peranan penting pada inflamasikronik. Pola-pola ekspresi sitokin secara luas menentukan sifat ilmiah dan persistensirespon inflamasi. Sitokin memproduksi efek selularnya dengan aktifasi dari berbagai

13

faktor transkripsi seperti protein aktifator-1 (AP-1), nuclear factor B (NF-B), danfamili signal transduction and activation of transcription (STAT). Ekspresi berbagaisitokin berikut reseptornya juga diupregulasi oleh faktor-faktor transkripsi ini.Peningkatan ekspresi beberapa faktor ini mungkin bertanggung jawab ataspemanjangan inflamasi. AP-1 dan NF-B dapat diinduksi oleh berbagai mediatorseperti NO, histamine dan eicosanoid.

Glukokortikoid telah lama dikenal mempunyai efek anti inflamasi yang palingefektif. Reseptor glukokortikoid secara predominan terletak pada epithel danendothel, karenanya menjadi lokasi aksi anti inflamasi steroid. Secara klasikglukokortikoid berikatan pada, dan mengaktifasi sitosolik reseptor glukokortikoid.Setelah teraktifasi, reseptor glukokortikoid mengalami dimerisasi untuk selanjutnyaterjadi translokasi pada inti sel. Dalam inti, reseptor glukokortikoid berikatan padaelemen spesifik DNA dalam promoter dari gen yang responsif (transaktifasi) atauinhibisi aktifitas faktor-faktor transkripsi seperti AP-1 dan NF-B (transrepresi).

Glukokortikoid mempunyai kemampuan inhibisi pelepasan GM-CSF yangdiinduksi IL-1. Adcock dkk (1999), menunjukkan efek inhibisi glukokortikoidterhadap ekspresi GM-CSF yang diinduksi IL-1, dan aktifitas NF-B. Fluticasonpropionate dan budesonid tampak sebagai inhibitor yang lebih poten dibandingdexamethason. Meskipun kesemua ligan ini mempunyai aksi pada reseptor yangsama, fluticasone propionate dan budesonid kira-kira 5 kali lebih poten pada targetreseptor dari afinitas ikatan yang diperkirakan. Kemampuan fluticason propionate,

14

budesonid dan dexamethason untuk menginhibisi B reseptor berhubungan denganinhibisi pelepasan GM-CSF (Adcock. dkk, 1999).

15

BAB IIIMETODOLOGI PENELITIAN

3.1. Rancangan Penelitian

Penelitian ini adalah penelitian eksperimental pada hewan percobaan mencit(Mus musculus) yang dibagi atas 3 kelompok, 2 kelompok perlakuan dan 1 kelompokkontrol.

3.2. Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan di bagian bedah FK USU pada bulan Desember danJanuari 2010.

3.3. Objek Penelitian

Sampel : Hewan percobaan yang digunakan adalah mencit (Mus musculus)dengan berat 40-60 gram. Dibagi atas 3 kelompok dengan 2 kelompok perlakuan dan1 kelompok kontrol. Kelompok I diberikan injeksi perilesi sediaan GM-CSF,kelompok II diberikan steroid dan kelompok III tidak diberi perlakuan sebagaikontrol.

16

3.4. Kriteria inklusi, ekslusi dan drop out

Kriteria inklusi : Mencit jantan dengan berat 40-60 g dan sehat.

Kriteria eksklusi : Sampel dengan berat kurang dari 40 g danmenunjukkan adanya lesi pada kulit.

Drop out : Mencit yang mati sebelum hari ke lima.

3.5. Identifikasi Variabel Penelitian

Variabel bebas : Granulocyt Macrophage Colony Stimulating

Factor

Steroid

Perlukaan artifisial.

Variabel tergantung : Pertumbuhan keratinosit secara mikroskopis

Pertumbuhan neovaskularisasi secara

mikroskopis

17

3.6. Pelaksanaan Penelitian

3.6.1. BAHAN DAN ALAT

3.6.1.1. Bahan :

1. GM-CSF (filgastrim, rHuG-CSF) 33.6x106 IU 263 microgram( Leucogyn(R)Kalbe Farma,no batch :2127,fab/mfg :12 09, exp : 11 11)

2. Dexamethasone injeksi.3. Ketamin4. Alkohol 70%5. Povidone iodine 10 %

3.6.1.2. Alat :

1. Pisau scalpel no. 222. Surgical gloves3. Syringe 1 cc4. Syringe 10 cc

3.6.2. Cara kerja :1. Lima belas ekor mencit dibagi atas 3 kelompok dipersiapkan 1 minggu

sebelumnya untuk beradaptasi dalam kandang berukuran 30x30x30 cm.Kandang ditempatkan dalam suhu kamar dan cahaya menggunakan sinarmatahari secara tidak langsung. Makanan diberikan ad libitum.

2. Sebelum perlakuan tikus ditimbang berat badannya.

18

3. Dilakukan narkose dengan ketamin 0,05mg untuk setiap 20mgBBtransperitoneal. Dilakukan pencukuran bulu.

4. Desinfeksi dengan iodine 10% dan alkohol 70%5. Dilakukan perlukaan pada daerah punggung para vertebra diameter 5 mm, full

thickness dengan menggunakan skalpel.6. Luka dirawat terbuka7. Kelompok I diberikan injeksi GM-CSF peri lesional 10 mikrogram/kg BB

pada hari 1-6.8. Kelompok II diberikan dexamethasone 0,5/kg BB injeksi sebagai inhibitor

GM-CSF.9. Kelompok III sebagai kontrol.10. Mencit dieuthanasia dan sampel kulit masing-masing kelompok diambil pada

hari ke 7 dengan cara yang sama, dan sampel kulit di awetkan dalamformaldehid 10%.

11. Sampel dibenamkan dalam blok paraffin dan dilakukan pemotongan secaralongitudinal ,untuk selanjutnya dilakukan pewarnaan prefarat dengan pewarnahematoxyllin-eosin.

12. Jumlah keratinosit dihitung dengan menggunakan handy taller dibawahmikroskop cahaya dengan pembesaran 400x oleh blind pathologis.

13. Selanjutnya dilakukan analisa data dengan perangkat komputer SPSS denganuji statistik one way ANOVA untuk memperlihatkan kemaknaan antarkelompok.

19

3.7. Besar Sampel

Besar sampel dihitung menurut rumus Feederer : (np-1)-(p-1)p2. Dariperhitungan didapat besar sampel masing-masing kelompok adalah 4 ekor.

3.8. Analisa Data

Data yang terkumpul akan diolah dan dianalisa dengan perangkat SPSS, untukanalisa besar perbedaan statistik antar kelompok digunakan uji one way ANOVA .Nilai P

20

e. Perlukaan artifisial adalah luka buatan pada kulit hewan percobaan denganketebalan penuh (full thickness)

3.10. Kerangka konsep

3.11. Alur penelitian

Perlukaan kulitsecara artifisial

Sampel dibagi 3 kelompok

Perlukaan kulit artifisial

Kelompok I. injeksi GM-CSF. Kelompok II. injeksidexamethason. Kelompok III. kontrol.

Eksisi kulit pada hari ke 7 dan di lakukan pemeriksaanmikroskopik keratinosit dan struktur mikrovaskular

Analisa data

20




Pemberian : I.GM-CSF. II.

Dexamethason.III. Kontrol.

Jumlahkeratinosit dan

strukturmikrovaskular

Sampel dibagi 3 kelompok

Perlukaan kulit artifisial

Kelompok I. injeksi GM-CSF. Kelompok II. injeksidexamethason. Kelompok III. kontrol.


Analisa data

20




Jumlahkeratinosit

pada kelompokI>kelompok

III>kelompok II.


21

BAB 4HASIL PENELITIAN

Subjek penelitian berupa 15 ekor mencit jantan wildtype yang dibagi atas 3kelompok. Selama masa penelitian 2 ekor mencit mati, 1 ekor dari kelompok yangdiberikan GM-CSF dan 1 ekor dari kelompok kontrol. Keseluruhan mencit yanghidup selama penelitian berlangsung menjadi objek penelitian.

Tiga belas ekor mencit yang diberi luka artifisial terbagi atas 3 kelompok, 4ekor diberikan injeksi peri lesi GM-CSF, 4 ekor diberi injeksi peri lesi dexamethasondan 5 ekor kelompok kontrol.

4.1 . Pertumbuhan Keratinosit

Rata-rata jumlah pertumbuhan keratinosit pada kelompok GM-CSFmenunjukkan nilai 186 ( 50) sel perlapangan pandang besar, sedang pada kelompokdexamethason dan kontrol menunjukkan nilai 25 (10) dan 47 (16) sel perlapanganpandang besar. Perbedaan kemaknaan antar kelompok dengan one way ANOVAmenunjukkan pertumbuhan keratinosit pada pemberian injeksi perilesi sediaan GM-CSF dijumpai pertumbuhan keratinosit yang bermakna (p=0.001) dibandingkanpemberian steroid dan kelompok kontrol. Sedangkan pada kelompok steroiddibandingkan kelompok kontrol tidak dijumpai pertumbuhan keratinosit yangbermakna (p= 0.085). (gambar.1)

22

Gambar 1. Grafik rata-rata pertumbuhan keratinosit antar kelompok

Grafik diatas menunjukkan pertumbuhan keratinosit yang bermakna antarapemberian rhGM-CSF dibanding kelompok dexamethason dan kontrol.

4.2. Pertumbuhan Pembuluh Darah

Pada pertumbuhan struktur neovaskular didapati hasil rata-rata 48 (17)pembuluh darah perlapangan pandang besar pada kelompok GM-CSF sedang padakelompok dexamethason dan kontrol didapati jumlah 8 (6) dan 7 (5) pembuluhdarah perlapangan pandang besar. Uji kemaknaan one way ANOVA antar masing-masing kelompok menunjukkan pemberian injeksi perilesi sediaan GM-CSFmenunjukkan pertumbuhan pembuluh darah yang bermakna (p=0.001) dibandingkanpemberian steroid dan kelompok kontrol. Sedangkan pada kelompok steroid

020406080

100120140160180200

GM-CSF

22





GM-CSF Steroid Kontrol

22





23

dibandingkan kelompok kontrol tidak dijumpai pertumbuhan pembuluh darah yangbermakna (p= 0.935)

Gambar 2. Grafik rata-rata pertumbuhan neovaskular antar kelompok

Grafik diatas menunjukkan rata-rata pertumbuhan struktur neovaskular antarapemberian rhGM-CSF dibanding dexamethason dan kontrol.

05

101520253035404550

GM-CSF

23




GM-CSF Steroid Kontrol

23




24

Gambar 3. Gambar histologi keratinosit pada kelompok rhGM-CSF.

Gambaran histologi epitelisasi kulit (gambar 3) mencit hari ke-7 pascapenyuntikan rhGM-CSF. Gambar 3 memperlihatkan bahwa susunan epitelisasi lebihteratur, keratinosit tampak berupa sel keratin berinti (hematoxyllin-eosin denganpembesaran 400x ).

25

Gambar 4. Gambar histologi keratinosit pada kelompok dexamethasone.

Gambar 4. Memperlihatkan gambaran histologi epitelisasi kulit mencit padahari ke-7 dengan penyuntikan dexamethason. Pertumbuhan keratinosit danneovaskular lebih sedikit dijumpai.( Hematoxyllin-eosin dengan pembesaran 400x ).

26

Gambar 5. Gambar histologi keratinosit pada kelompok kontrol

Gambar 5 memperlihatkan pertumbuhan epitelisasi pada mencit kontrol harike-7. Tidak dijumpai perbedaan jumlah keratinosit dan struktur neovaskulardibanding dengan penyuntikan dexamethasone. (Hematoxyllin-eosin denganpembesaran 400x ).

27

Gambar 6. Gambar histologi neovaskular pada kelompok rhGM-CSF

.

Gambar 6 memperlihatkan gambaran histologi struktur neovaskularisasikelompok rhGM-CSF. Terdapat pertumbuhan jumlah bermakna dengan kelompokdexamethason dan kontrol. (pewarnaan hematoxyllin-eosin, pembesaran 400X).

28

Gambar 7. Gambar histologi neovaskular pada kelompok dexamethasone.

Gambar 7 memperlihatkan gambaran histologi struktur neovaskularisasikelompok dexamethason. Tidak ada perbedaan jumlah neovaskular yang bermaknadengan kelompok kontrol (pewarnaan hematoxyllin-eosin, pembesaran 400x).

29

Gambar 8. Gambar histologi neovaskular pada kelompok kontrol.

Gambar 8 memperlihatkan gambaran histologi struktur neovaskularisasi padakelompok kontrol. Tidak ada perbedaan bermakna dengan kelompok dexamethason.(pewarnaan hematoxyllin-eosin, pembesaran 400x)

30

BAB 5PEMBAHASAN

Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor merupakan salah satufaktor pertumbuhan dalam proses hematopoiesis yang paling banyak diteliti untukkepentingan terapeutik. Berperan dalam proses proliferasi dan diferensiasi sel-selprogenitor myeloid sum-sum tulang, GM-CSF diketahui menggalakkan fungsimakrofag matur yang menginduksi sekresi berbagai sitokin termasuk IL-6 dan TNF-dalam darah. GM-CSF merupakan adjuvan yang efisien dan mempunyai profiltoksisitas yang rendah. Untuk pengobatan kanker, GM-CSF meningkatkan jumlahmonosit dan makrofag dan menunjukkan kemampuan melisiskan tumor. PenggunaanGM-CSF dan erythropoietin pasca hepatectomy juga memungkinkan akselerasiregenerasi liver pada hewan coba.(Ghosh.dkk; 2007., Vassilou.dkk;2010).

Pada jaringan epidermal GM-CSF telah diketahui mempunyai potensimitogenik untuk keratinosit serta menstimulasi migrasi dan proliferasi sel-selendotelial. Akselerasi penyembuhan luka telah pula diamati pada hewan coba tikusyang mengalami peningkatan proliferasi keratinosit, menunjukkan overekspresisitokin jenis ini. Sebagai tambahan, pembentukan struktur neovaskular dan jaringangranulasi juga bertambah. (Cornelissen L.H;2004). Robson dkk (2000)membandingkan penutupan luka pada ulkus dekubitus yang diterapi dengan GM-CSFdan Fibroblast Growth Factor beta (bFGF) secara bersamaan, pemberian tunggalGM-CSF dan bFGF, dan plasebo. Sebanyak 85% pasien yang menerima kombinasi

31

terapi sitokin mengalami penurunan volume ulkus dibanding plasebo setelah hari ke-35 pengobatan.

Recombinant human GM-CSF (rhGM-CSF) adalah satu produk agen biologikyang paling sukses diterapkan untuk kepentingan klinis. Penggunaan sargamogastrim(rhGM-CSF yang diturunkan dari jamur) dan Molgramostim (rhGM-CSF yangditurunkan dari bakteria) telah dipakai untuk mengatasi kondisi neutrophenia akibatinduksi kemoterapi dalam acute myelogenous leukemia (AML) untuk mempercepatpemulihan netrofil dan menurunkan insiden kondisi yang mengancam jiwa akibatinfeksi. Penggunaan rhGM-CSF juga memberi efek menguntungkan pada pasien-pasien yang menjalani transplantasi sum-sum tulang secara autologus maupunallogenik dan juga berperan dalam memobilisasi serta membantu proses engrafmentpasca transplantasi sel-sel progenitor darah.

Aplikasi rhGM-CSF mengalami peningkatan penggunaan dalam pengobatanberbagai penyakit termasuk kanker dan komplikasi kemoradiasi seperti mukositis,stomatitis dan diare pasca kemoradiasi. Penggunaan rhGM-CSF topikal diketahuimempercepat proses penyembuhan luka dengan meningkatkan pembentukan jaringangranulasi. Injeksi intradermal dari rhGM-CSF menyebabkan pembesaran danpeningkatan jumlah keratinosit, penebalan epidermis dan percepatan penyembuhan.Penggunaan rhGM-CSF dalam jangka pendek di daerah subkutan secara efektifmempromosi pertumbuhan pertumbuhan struktur pembuluh darah dan rhGM-CSFtelah pula dipergunakan dalam usaha memperbaiki gejala dari penyakitCrohn.(Ghosh,dkk 2007).

32

Pada penelitian ini, kami memberikan rhGM-CSF dan dexamethason yangdiadministrasi secara subkutan dengan kontrol pada hewan coba mencit yangdilakukan perlukaan artifisial. Recombinant human GM-CSF dan dexamethasondiberikan dari hari ke-1 hingga hari ke-6. Dosis rhGM-CSF dan dexamethasonmasing-masing adalah 10g/kgBB dan 10 mgBB, dilakukan titrasi dosis denganaquabidest untuk menyesuaikan dosis dengan berat badan masing-masing hewancoba. Dosis rhGM-CSF 10g/kgBB secara subkutan dapat memobilisasi selprogenitor granulosit (cells bearing CD 34+) dari sum-sum tulang ke darah periferdari hari ke-4 sampai hari ke-7 penyuntikan dan dosis dexamethason 10 mg/kg BBmemberikan efek inhibisi terhadap GM-CSF. (Lane.A.Thomas;2000,Adcockdkk;1999). Jumlah keratinosit dan stuktur neovaskular dinilai secara histologisdengan pewarnaan hematoxylin-eosin dan dihitung dibawah mikroskop cahaya(pembesaran 400x) dengan handy taller. Keratinosit ditandai dengan struktur selkeratin yang mempunyai inti, tampak berwarna biru gelap pada inti denganpewarnaan H.E, struktur neovaskular dikenali secara tidak langsung melalui sel-seleritrosit yang terperangkap dalam lumen pembuluh darah. Untuk membedakannyadengan struktur pembuluh darah dewasa struktur neovaskular tidak menunjukkanstruktur endotel yang nyata.

Jumlah rata-rata keratinosit pada hewan coba yang diberikan rhGM-CSF 186(50) sel perlapangan pandang besar dan dibawah 25 (10) dan 47 (16) selperlapangan pandang besar pada kelompok hewan coba yang diberikan dexamethasondan kelompok kontrol. Pada pengamatan dengan mikroskop cahaya sel keratinosit

33

tampak lebih tersusun teratur dibagian basal-- yang terkesan sel-sel mempunyaivolume lebih besar-- hingga mencapai stratum transisi walaupun tidak ditemukan sel-sel keratin seperti yang biasa didapat pada stratum korneum pada kelompok yangdiberikan rhGM-CSF. Struktur keratinosit lebih sedikit dijumpai pada kelompokkontrol dan kelompok yang diberikan dexamethason. Hal ini membuktikan faktabahwa administrasi rhGM-CSF secara subkutan memberi efek positif padapertumbuhan keratinosit. Bagaimanapun, tidak dijumpainya perbedaan yangbermakna secara statistik antara kelompok kontrol dan kelompok yang diberikandexamethasone memberikan dugaan bahwa dexamethasone bukan inhibitor GM-CSFyang poten. Adcock (1999) dkk. melakukan penelitian terhadap berbagai ageninhibitor terhadap GM-CSF dan mendapatkan fluticason propionate merupakaninhibitor GM-CSF yang paling poten. Akan tetapi sulit memastikanketidakbermaknaan dexamethason dibanding kontrol pada penelitian ini dikarenakanmasing-masing hewan coba memiliki GM-CSF endogen yang segera beredar dalamdarah setelah perlukaan dan juga tidak dihitungnya penanda mitosis keratinosit yangterdapat pada lapisan basal interfolikular epidermis. Amrit Mann (2006)menunjukkan efek GM-CSF antagonis pada tikus double transgenic Tg2-Ant denganoverekspresi GM-CSF dan antagonis GM-CSF dengan hewan coba wildtype sebagaikontrol. Antagonis GM-CSF mampu menekan hyperproliferasi keratinosit yangtergantung GM-CSF, dimana pada kondisi normal, transgenic antagonis GM-CSFtidak menunjukkan adanya perubahan penanda mitosis epidermis dibandingkelompok kontrol. Penelitian lebih lanjut dengan menggunakan hewan coba

34

transgenic dan teknik pewarnaan immunohistokimia serta perhitungan penandamitosis dapat mengkonfirmasi hasil penelitian ini.

Migrasi dan proliferasi keratinosit dari daerah pinggir luka bersamaan denganpeningkatan sintesis metallomatrixproteinase (MMPs) akan mengakibatkan migrasikeratinosit lebih jauh menutupi seluruh permulaan luka. Manakala keratinosit yangbermigrasi telah saling bertemu, kecepatan proliferasi epitelial menurun hingga tigasampai empat kali kecepatan normal untuk selanjutnya sel-sel epidermal akankembali pada fungsi dan morfologi normal. Pengekalan ekspresi faktor pertumbuhanbersamaan dengan lingkungan luka yang abnormal seperti penurunan kelembaban,iskemia dan trauma berulang, akan mengakibatkan aktifasi sel-sel proinflamasi secaraterus menerus. Infiltrasi neutrofil yang eksesif diikuti dengan melimpahnya selmakrofag akan mencetuskan ekspresi TNF dan IL-1. Sitokin-sitokin ini adalahkemoattraktan bagi fibroblas dan sel inflamasi yang mengekalkan proteinmetallomatrix, inhibisi MMPs akibat penurunan tissue inhibitor matrix protein(TIMPs) yang mendegradasi matriks selular, faktor pertumbuhan dan penurunanreseptor faktor pertumbuhan sehingga keterlambatan ataupun kegagalanpenyembuhan terjadi ( Cornelissen L.H.2004 )

Hasil yang sama didapati pada perhitungan struktur neovaskular pada masing-masing kelompok. Pada kelompok rhGM-CSF jumlah struktur neovaskular rata-rata48 (17) pembuluh darah perlapangan pandang besar, dan jumlah untuk kelompokdexamethason dan kontrol adalah 8 (6) dan 7 (5) pembuluh darah perlapanganpandang besar. Perbedaan yang bermakna antara kelompok rhGM-CSF dibanding

35

kedua kelompok lainnya menyokong efek positif rhGM-CSF bagi prosespenyembuhan luka. Diketahui GM-CSF merupakan faktor penting dalam prosesproliferasi endotel (Mann. A,2001, Ebner dkk,2003). Plenz dkk (2003) menunjukkandefisiensi GM-CSF mengakibatkan perubahan komposisi matriks kolagen vaskularyang mendukung faktor penting GM-CSF dalam hal mempertahankan integritas dandaya tahan struktur pembuluh darah. Akan tetapi, ekspresi berbagai macam sitokinterjadi pasca perlukaan dan overekspresi satu jenis sitokin akan merangsang ekspresijenis sitokin lainnya baik secara parakrin maupun autokrin. Efek sinergistik sitokin-sitokin ini akan memainkan peranan dalam proses penyembuhan luka. Vascularendothelial growth factor (VEGF) merupakan stimulator poten bagi prosesangiogenesis dan trauma menginduksi ekspresi gen VEGF dengan makrofag sertakeratinosit sebagai produser utama. Reduksi VEGF akan menggagalkanpenyembuhan luka. Demikian pula faktor pertumbuhan lainnya seperti plateletderived growth factor yang mengontrol pembentukan fibroblas yang tergantungkoloni makrofag bersama transforming growth factor beta (bTGF), fibroblast growthfactor (FGF) dan insulin like growth factor (IGF) (Cornelissen L.H,2004). Kurangnyastruktur neovaskular kelihatannya terletak pada penurunan jumlah koloni makrofagyang diawali oleh translokasi neutrofil pada daerah luka ketimbang efek antagonistikdexamethason yang meluas pada berbagai sitokin -- sehingga dexamethason jugamerupakan inhibitor bagi VEGF,bTGF, PDGF,IGF dan FGF -- yang kesemuanyamerupakan faktor pertumbuhan yang terlibat dalam proses penyembuhan luka.Perkiraan efek antagonistik dexamethason terhadap pertumbuhan strukturneovaskular pada proses penyembuhan luka ini memerlukan penelitian lebih lanjut.

36

Sebagai tambahan, kemungkinan peningkatan jumlah sel progenitor (cellsbearing CD 34+) pasca induksi rhGM-CSF dalam darah perifer yang dapat diisolasidan dimurnikan (purified cells bearing CD 34+ ) membuka peluang investigasimengenai kemampuan sel progenitor darah tepi yang dapat digunakan bagi terapitarget sel (cells targeted therapy)karena sifat unik sel ini ; differentiate and selfrenewal---bagi beberapa kondisi klinis tertentu seperti chronic skin ulcers, unhealingwound, atau kondisi penyakit kulit inherited seperti epidermolysis bulosa. Kesemuakemungkinan ini membutuhkan penelitian lebih lanjut.

37

BAB 6KESIMPULAN DAN SARAN

6.1. KESIMPULAN

1. Terdapat pertumbuhan keratinosit dan neovaskular yang bermakna denganpenyuntikan rhGM-CSF dibandingkan pertumbuhan keratinosit denganpenyuntikan dexamethason dan kontrol.

2. Tidak terdapat pertumbuhan keratinosit dan neovaskular yang bermakna padakelompok mencit dengan penyuntikan dexamethason dibanding kelompokkontrol.

6.2. SARAN

1. Perlu dilakukan penelitian lanjutan mengenai peranan rhGM-CSF dalamproses penyembuhan luka dengan menggunakan mencit transgenic dan teknikpewarnaan immunohistokimia.

2. Dapat dilakukan pemeriksaan penanda mitosis untuk melihat efek inhibisidexamethason terhadap pertumbuhan dan migrasi keratinosit sertapertumbuhan struktur neovaskular.

38

DAFTAR PUSTAKA

Adcock M Ian, Nasuhara Y, Stevens AD, Barnes JP. Ligand-induced differentiationof glucocorticoid receptor (GR) trans-repression and transactivation: preferentialtargeting of NF-B and lack of I-B involvement. British Journal of Pharmacology.1999;127,1003-1011.

Al Homsi AS . Cytokine Modulation of Hematopoietic Stem Cell Phenotype. In: HoAnthony D, Haas R, Champlin ER,editors. Hematopoietic Stem CellTransplantation., New York-Basel: Marcel Dekker. 2000; p47-61.

Baker EA, Leaper DJ. Proteinases, their inhibitors, and cytokines profiles in acutewound fluid. Wound Repair Regen. 2000; 8:392-8

Brem H, Balledux J, Bloom T, Kerstein MD, Hollier L. Healing of Diabetic Foot andPressures Ulcers With Human Skin Equivalent. Arch Surg. 2000;135:627-634

Cornelissen LH. Wich Molecules of Initial Phase of Wound Healing may be Used asMarkers for Early Detection of Skin Damage? Eindhoven: Technische Universiteit.2004; p9-16.

Ebner K, Bandion A, Binder BR, de Martin R, Schmid JA. GM-CSF activates NF-kappaB via Direct Interaction of the GM-CSF receptor with IkappaB kinase beta.Blood. 2003; 102:192-9

Gurtner CG. Wound Healing : Normal and Abnormal. In: Thorn HC et al. GrabbPlastic Surgery. 6th Ed., Wolters Kluwer-Lippincot William and Wilkins,Philadelphia. 2007; p15-22

Ghosh K.P.,Bhardwaj D, Karnik R. Human Granulocyte-Macrophage ColonyStimulating Factor: The Proteins and Its Current and Emerging Applications. IndianJournal of Biotechnology. 2007; vol 6, pp 435-448

39

Hunt KT. Wound Healing. In: Doherty MG. Current Surgical Diagnosis andTreatment. 12thEd., McGraw-Hills, USA. 2003; p75-87

Junqueira CL, Carneiro J. Histologi Dasar. Ed 3. EGC, Jakarta. 1991; 378- 390

Kaplan G: Recent Advance in Cytokine Therapy in Leprosy. J Infect Dis.1993;167:S18-S22

Lane A.T., Law P. Mobilization of Pheripheral Blood Stem Cells from NormalDonors In: Ho Anthony D, Haas R,Champlin ER. Hematopoietic Stem CellTransplantation., Marcel Dekker, New York-Basel. 2000; p333-351

Mann A, Breuhahn K, Schirmacher P, Blessing M. Keratinocyte-Drived Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor Accelerates Wound Healing: Stimulation ofKeratinocyte Proliferation, Granulation Tissue Formation, and Vascularization. JInvest Dermatol.2001; 117:1382-1390

Mann A, Niekisch K, Schirmacher P, Blessing M. Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Is Essential for Normal Wound Healing. Sj.Jjdsymp.2006;5650013, 11, 87-92. doi:10.1038

Martin P. Wound healing aiming for perfect skin regeneration. Science.1997;276:75-81

Plenz G, Eschert H, Beissert S, Arps V, Sindermann JR, Robenek H et al. Alterationin the Vascular Extracellular Matrix of Granulocyte Macrophage-Colony StimulatingFactor (GM-CSF) Defficient Mice. FASEB J.2003; 17:1451-7

Regauer S, Compton CC . Cultured Keratinocyte Sheet Enhance Spontaneous Re-Epithelization in a Dermal Explant Model of Partial-Thickness Wound Healing. JInvest Dermatol.1990; 95:341-346

Robson M.C., Hill D.P., Smith P.D., Wang X, Meyer-Siegler K, Ko F, VandebergJ.S., Payne W.G., Ochs D, Robson LE. Sequential Cytokine Theraphy for PressureUlcer: clinical and mechanistic respons. Ann. Surg.2000; 231(4):600-611

40

Stadelmann WK, Digenis AG, Tobin GR. Impediment to wound healing. Am JSurg.1998; 176:39S-47S

Stagno F, Guglielmo P, Consoli U, Fiumara P, Russo M, Giustolisi R. Successfulhealing of hydroxyurea-related leg ulcers with topical granulocyte-macrophagecolony-stimulating factor. Blood.1999; 94:1479-80

Stricklin PG, Li L, Nanney BL. Localization of mRNAs Representing InterstitialCollagenase, 72-kDa Gelatinase, and TIMP in Healing Porcin Burn Wounds. J InvestDermatol.1994; 103:352-358

Ting EA, Mays RW, Frey RM, Hof vW, Madicetty S, Deans R . Therapeutic Pathwayof Adult Stem Cells Repair. Critical Review in Oncology and Hematology., Elsevier,Ireland.2008; p.81-93

Ure I, Partsch B, Wolff K, Petzelbauer P: Granulocyte/Macrophage colonystimulating factor increased wound-fluid interleukin 8 in normal subjects but does notaccelerate wound healing. Br J Dermatol.1998; 138:277-282

Vassiliou , Lolis E, Nastos C, Tympa A, Theodosopoulos T,et al . The CombinedEffect of Erythropoietin and Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor onLiver Regeneration after Mayor Hepatectomy in Rats., World Journal SurgicalOncology.2010; 8:75

1LampiranAnalisis statistik data pertumbuhan keratinosit dan neovascular dengan SPSS 17

1. Analisis data pertumbuhan keratinosit

ANOVAKeratinosit

Sum of Squares df Mean Square F Sig.Between Groups 67564.464 2 33782.232 165.360 .000Within Groups 2247.250 11 204.295Total 69811.714 13

Multiple ComparisonsDependent Variable:keratinosit

(I)bahan

(J)bahan

MeanDifference (I-

J) Std. Error Sig.95% Confidence Interval

Lower Bound Upper BoundTukey HSD GMCSF Steroid 161.250* 9.226 .000 136.33 186.17

Kontrol 139.250* 10.107 .000 111.95 166.55steroid GMCSF -161.250* 9.226 .000 -186.17 -136.33

Kontrol -22.000 9.226 .085 -46.92 2.92kontrol GMCSF -139.250* 10.107 .000 -166.55 -111.95

Steroid 22.000 9.226 .085 -2.92 46.92Scheffe GMCSF Steroid 161.250* 9.226 .000 135.21 187.29

kontrol 139.250* 10.107 .000 110.73 167.77steroid GMCSF -161.250* 9.226 .000 -187.29 -135.21

kontrol -22.000 9.226 .101 -48.04 4.04kontrol GMCSF -139.250* 10.107 .000 -167.77 -110.73

steroid 22.000 9.226 .101 -4.04 48.04*. The mean difference is significant at the 0.05 level.

2Keratinosit

bahan NSubset for alpha = 0.05

1 2Tukey HSDa,,b steroid 6 25.50

kontrol 4 47.50GMCSF 4 186.75Sig. .096 1.000

Scheffea,,b steroid 6 25.50kontrol 4 47.50GMCSF 4 186.75Sig. .114 1.000

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 4.500.b. The group sizes are unequal. The harmonic mean of the group sizes isused. Type I error levels are not guaranteed.

StatisticsGMCSF Steroid Kontrol

N Valid 4 6 4Missing 10 8 10

Mean 186.7500 25.5000 47.5000Median 191.5000 25.0000 46.0000Std. Deviation 25.27680 5.04975 8.22598Variance 638.917 25.500 67.667Skewness -.904 1.573 .701Std. Error of Skewness 1.014 .845 1.014Kurtosis .172 3.546 -1.653Std. Error of Kurtosis 2.619 1.741 2.619Range 58.00 15.00 18.00Minimum 153.00 20.00 40.00Maximum 211.00 35.00 58.00

3Pembuluh Darah

ANOVApembuluh darah

Sum of Squares df Mean Square F Sig.Between Groups 4552.219 2 2276.110 81.713 .000Within Groups 278.550 10 27.855Total 4830.769 12

Multiple ComparisonsDependent Variable:pembuluh darah

(I) bahan (J) bahanMean Difference

(I-J) Std. Error Sig.95% Confidence Interval

Lower Bound Upper BoundTukey HSD GMCE steroid 39.950* 3.540 .000 30.24 49.66

kontrol 41.250* 3.732 .000 31.02 51.48steroid GMCE -39.950* 3.540 .000 -49.66 -30.24

kontrol 1.300 3.540 .929 -8.41 11.01kontrol GMCE -41.250* 3.732 .000 -51.48 -31.02

steroid -1.300 3.540 .929 -11.01 8.41Scheffe GMCE steroid 39.950* 3.540 .000 29.81 50.09

kontrol 41.250* 3.732 .000 30.56 51.94steroid GMCE -39.950* 3.540 .000 -50.09 -29.81

kontrol 1.300 3.540 .935 -8.84 11.44kontrol GMCE -41.250* 3.732 .000 -51.94 -30.56

steroid -1.300 3.540 .935 -11.44 8.84*. The mean difference is significant at the 0.05 level.

4pembuluh darah

Bahan NSubset for alpha = 0.051 2

Tukey HSDa,,b Kontrol 4 7.50Steroid 5 8.80GMCE 4 48.75Sig. .931 1.000

Scheffea,,b Kontrol 4 7.50Steroid 5 8.80GMCE 4 48.75Sig. .937 1.000

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 4.286.b. The group sizes are unequal. The harmonic mean of the group sizes is used. Type I errorlevels are not guaranteed.

Statistics

GMCSF Steroid KontrolN Valid 4 5 4

Missing 9 8 9Mean 48.7500 8.8000 7.5000Std. Error of Mean 4.26956 1.39284 1.32288Median 47.5000 10.0000 7.0000Mode 40.00a 5.00a 5.00aStd. Deviation 8.53913 3.11448 2.64575Variance 72.917 9.700 7.000Range 20.00 7.00 6.00Minimum 40.00 5.00 5.00Maximum 60.00 12.00 11.00Sum 195.00 44.00 30.00a. Multiple modes exist. The smallest value is shown

1. PENGARUH GRANULOCYTE.pdf2. LEMBARAN PENGESAHAN Tesis.pdf3. EC b zainul.pdf4. UCAPAN TERIMAKASIH.pdf5. DAFTAR ISI.pdf6. DAFTAR GAMBAR.pdf7. ABSTRAK betul.pdf8. isi HASIL PENELITIAN.pdf9. Lampiran.pdf

penelitian zainul

Documents